CZ306357B6 - Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci - Google Patents

Abstract

Rostlina ozimé řepky olejky, semeno, buňka nebo pletivo rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1 a/nebo MS-BN1. Dále je popsán způsob identifikace transgenní rostliny obsahující tuto elitní událost a souprava k provádění tohoto způsobu.

Description

Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci

Oblast techniky

Tento vynález se týká rostlin ozimé řepky olejky, konkrétně dvojice rostlin ozimé řepky olejky, která je obzvláště vhodná pro produkci hybridních semen. Konkrétněji, jedna rostlina je charakterizována tím, že je to rostlina se samčí sterilitou, díky přítomnosti genu samčí sterility v jejím genomu, zatímco druhá je charakterizována tím, že nese gen obnovující fertilitu, který je schopný zabránit aktivitě genu samčí sterility. Pár rostlin ozimé řepky olejky podle vynálezu spojuje schopnost vytvářet hybridní semena s optimálním celkovým agronomickým výkonem, genetickou stabilitou a adaptabilitou k různému genetickému pozadí.

Všechny dokumenty citované v tomto textu jsou formou odkazu součásti předkládaného popisu.

Dosavadní stav techniky

Fenotypová exprese transgenu v rostlině je určena jak strukturou genu samotného, tak jeho lokalizaci v rostlinném genomu. Současně přítomnost transgenu v odlišných místech genomu ovlivňuje celkový fenotyp rostliny odlišným způsobem. Agronomicky nebo průmyslově úspěšné vnesení komerčně zajímavých znaků do rostliny metodami genových manipulací může být značně zdlouhavý postup závislý na mnoha různých faktorech. Skutečná transformace a regenerace geneticky transformovaných rostlin jsou pouze prvními kroky v celé řadě selekčních kroků, která zahrnuje extenzivní genetickou charakterizaci, další šlechtění a vyhodnocení v polních pokusech.

Řepka olejka (Brassica napus, AACC, 2n=38) je přírodní hybrid vzniklý mezidruhovou hybridizací mezi brukví zelnou (Brassica oleracea, CC, 2n = 18) a brukví tuřínem (Brassica campestris, AA, 2n = 20). Ozimá řepka olejka se vysévá v průběhu posledních 10 dnů srpna a prvních deseti dnů září a sklízí se následující rok v červenci, neboť vyžaduje období s nízkou teplotou pro vernalizaci. Rychleji rostoucí jarní řepky se sejí na konci března až začátku dubna a sklizeň probíhá od poloviny srpna do září. Hlavní typy řepky olejky pěstované v současnosti jsou odrůdy s nízkým a vysokým obsahem erukové kyseliny. Tzv. dvojitě nízké (00) odrůdy obsahují nízkou (typicky méně než 1 %) hladinu erukových kyselin (které jsou pro člověka obtížně stravitelné) a nízké hladiny glukosinolátů (které činí vedlejší produkty nestravitelné pro zvířata). Běžné využití „00“ odrůd přestavuje olej pro lidskou spotřebu a krmivo pro zvířata s vysokým obsahem proteinů. K průmyslovému využití patří také základní suroviny pro léčiva a hydraulické oleje. Odrůdy řepky s vysokým obsahem erukové kyseliny (HEAR) jsou pěstované specificky pro jejich obsah erukové kyseliny - typicky 50 až 60 % oleje. Hlavním konečným použitím HEAR je výroba erukamidu, což je „kluzné činidlo“ používané při výrobě polyethanu. Malý podíl se využívá při výrobě behenylalkoholu, který se přidává k voskovitým surovým minerálním olejům pro zlepšení jejich tekutosti.

Rostliny řepky olejky jsou bisexuální a typicky ze 60 až 70 % samosprašné. Produkce hybridů a vnášení genetické variability jakožto základu pro selekci byly tradičně závislé na adaptaci v přírodě se vyskytujícího jevu jako je například self-inkompatibilita a cytoplazmatická samčí sterilita. Metody umělé kontroly opylení jako je například ruční sterilizace (emaskulace) nebo použití gametocidních látek nebyly ve šlechtění řepky více rozšířeny vzhledem k jejich omezené praktické použitelnosti a vysokým finančním nákladům.

Byly vyvinuty transgenní metody pro vytvoření samčí nebo samičí sterilní rostliny, které poskytují zajímavé alternativy k tradičním technikám.

- 1 CZ 306357 B6

EP 0 344 029 popisuje systém pro získání jaderné samčí sterility, přičemž rostliny jsou transformovány genem samčí sterility, který obsahuje například DNA kódující bamázu, který je řízen promotorem specifickým pro tapetum (specifické pletivo prašníků), PTA29, který po vnesení do rostliny zajišťuje selektivní destrukci buněk tapeta. Transformace rostlin tabáku a řepky olejky takovým chimérickým genem vedlo k rostlinám, u kterých bylo zcela zabráněno tvorbě pylu (Mariáni et al. 1990, Nature 347: 737-741).

Pro obnovu fertility v potomstvu rostlin se samčí sterilitou byl vytvořen systém, kdy je samčí sterilní rostlina křížena s transgenní rostlinou nesoucí gen obnovující fertilitu, který je po expresi schopen snížit nebo zcela zrušit aktivitu genu samčí sterility (viz US 5 689 041, US 5 792 929). Takový gen obnovující fertilitu je umístěn pod kontrolu promotoru řídicího expresi alespoň v buňkách toho typu, kde je gen samčí sterility exprimován. Mariani et al. (1992. Nature 384387) prokázali, že u řepky olejky sterilita kódovaná genem pTA29-barnáza může být obnovena chimérickým genem pTA29-barstar.

Cytochemická a histochemická analýza vývoje prašníků u rostlin Brassica napus obsahujících samotný chimérický gen pTA29:bamáza nebo pTA29:barstar je popsána v publikaci De Block a De Brouwer (1993, Planta 189:218-225).

Úspěšné transformace rostlin druhů Brassica bylo dosaženo řadou metod včetně infekce užitím Agrobacterium (jak bylo popsáno například v EP 0 116 718 a EP 0 270 882), ostřelováním mikročásticemi - biobalistickou metodou (jak bylo popsáno například Chen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 88:187-192) a pomoci přímého příjmu DNA (jak bylo popsáno například De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914:694-701, Poulsen 1996, Plant Breeding 115:209225).

Avšak žádná z citovaných publikací nepopisovala ani nenavrhovala řešení popsané v předkládané přihlášce.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká rostliny ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma příměry majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, přičemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.

Dále se předkládaný vynález týká shora uvedené rostliny, semene, rostlinné buňky nebo pletiva, které dále obsahují elitní událost MS-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma příměry majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejich buněk nebo pletiv, obsahujících elitní událost MS-BN1, který zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. C. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejich buněk nebo pletiv obsahujících elitní událost RF-BN1, který zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. C. 23 a SEKV. ID. Č.41.

-2CZ 306357 B6

Vynález se také týká soupravy pro identifikaci transgenní rostliny, jejich buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, přičemž tato souprava obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2 a další rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, pro použití v PCR identifikačním protokolu.

Dále se vynález týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BN1 v biologických vzorcích, která obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS—BN1 v SEKV. ID. Č. 18.

Vynález se také týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, tato souprava obsahuje alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (neboje komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 a 100 % se specifickým úsekem MS-BN1 a/nebo alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem RF-BN1. Výhodně sekvence sondy odpovídá specifickému úseku obsahujícímu část 5' nebo 3' sousedícího úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1. Nejvýhodněji specifická sonda má (neboje komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 a 100 % s rostlinnou DNA sekvenci v SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BN1 nebo s rostlinnou DNA sekvenci v SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1.

Výhodně souprava podle vynálezu obsahuje, kromě primeru, který specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BN1 a/nebo RF-BN1, druhý primer, kteiý specificky rozpoznává sekvenci z MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, pro použití v PCR identifikačním protokolu. Výhodně, souprava podle vynálezu obsahuje dva (nebo více) specifické primery, jeden, který rozpoznává sekvenci ve 3' hraničním úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1, nejvýhodněji sekvenci v rostlinné DNA úseku SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BN1 nebo v rostlinné DNA sekvenci SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1 a další, který rozpoznává sekvenci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, v daném pořadí. Obzvláště výhodně primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 19. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19 a primer rozpoznávající cizorodou DNA MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 12, popsáno v tomto textu. Obzvláště výhodně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku RF-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 41 a primer rozpoznávající cizorodou DNA z RF-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 23, popsáno v tomto textu.

Způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro odlišné účely, jako jsou například, ale bez omezení, následující: k identifikaci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v rostlinách, rostlinném materiálu nebo v produktech, jako jsou například, ale bez omezení, potraviny nebo krmné produkty (čerstvé nebo zpracované) obsahující nebo pocházející z rostlinného materiálu, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k identifikaci transgenního rostlinného materiálu pro účely segregace mezi transgenním a netransgenním materiálem, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k určování kvality (tj. procento čistého materiálu) rostlinného materiálu obsahujícího MS-BN 1 a/nebo RF-BN1.

Je třeba mít na mysli, že konkrétní provedení vynálezu jsou popsána závislými patentovými nároky.

-3 CZ 306357 B6

Objasnění výkresů

Následující detailní popis vynálezu uváděný jako příklad, aniž by omezoval vynález na popsaná specifická provedení, může/mohou být lépe pochopen ve spojení s doprovázejícími obrázky, jejichž seznam je následující:

Obr. 1. Plazmidová mapa pVEl 13

Obr. 2. Restrikční mapa získaná po štěpení MS-BN1 genomové DNA

Sekvence analyzované metodou „Southern blot“: dráha 1, MS-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 2, MS-BN1 DNA štěpená EcoRV, dráha 3, MS-BN1 DNA štěpená Hpal, dráha 4, MS-BN1 DNA štěpená AfUII, dráha 5, MS-BN1 DNA štěpená Ndel, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 7, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHW107 štěpená BamHI.

Obr. 3. Restrikční mapa získaná po štěpení RF-BN1 genomové DNA

Sekvence analyzované metodou „Southern blot“: dráha 1, RF-MS1 DNA štěpená BamHI, dráha 2, RF-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 3, RF-BN1 DNA štěpená EcoRV, dráha 4, RF-BN1 DNA štěpená HindlII, dráha 5, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHWl 18 štěpená BamHI.

Obr. 4. PCR analýza odlišných linií s použitím MS-BN 1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující transgenní událost MS-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrola (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík“).

Obr. 5. PCR analýza odlišných linii s použitím RF-BN1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující transgenní událost RF-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrol (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík“).

Detailní popis

Termín „gen“, jak se v tomto textu používá, se týká kterékoliv DNA sekvence obsahující několik operativně spojených DNA fragmentů, jako je například promotor a 5' netranslatovaný úsek (5'UTR), které spolu tvoří úsek promotoru, kódující úsek (který může nebo nemusí kódovat protein) a netranslatovaný 3' úsek (3'UTR) obsahující polyadenylační místo. Typicky v rostlinných buňkách 5'UTR, kódující úsek a 3'UTR jsou transkribovány na RNA, která, v případě genu kódujícího protein, je translatována na protein. Gen může obsahovat další DNA fragmenty, jako jsou například introny. Jak se používá v tomto textu, genetický lokus je poloha daného genu v genomu rostliny.

Termín „chimérický“ při popisu genu nebo DNA sekvence je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence obsahuje alespoň dva funkčně relevantní DNA fragmenty (jako je například promotor, 5'UTR, kódující úsek, 3'UTR, intron), které nejsou přirozeně spojeny jeden s druhým a pocházejí například z odlišných zdrojů.

Termín „cizorodý“ při popisu genu nebo DNA sekvence vzhledem k rostlinným druhům je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence není přirozeně nalézána v těchto rostlinných druzích

-4 CZ 306357 B6 nebo není přirozeně nalézána v tomto genetickém lokusu v těchto rostlinných druzích. Termín „cizorodá DNA“ je použit v tomto textu při popisu DNA sekvence, která byla vnesena do genomu rostliny jako výsledek transformace.

Termín „transformující DNA“, jak se v tomto textu používá, se týká rekombinantní DNA molekuly použité pro transformace. Transformující DNA obvykle obsahuje alespoň jeden „požadovaný gen“ (např. chimérický gen), který je schopen poskytnout transformované rostlině jednu nebo více specifických vlastností.

Termín „rekombinantní DNA molekula“ je použit jako příklad a tedy může zahrnovat izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která může být DNA a která může být získána rekombinantními nebo i dalšími postupy.

Termín „transgen“, jak se používá v tomto textu, se týká požadovaného genu, který byl vnesen do genomu rostliny. Termín „transgenní rostlina“ se týká rostliny obsahující alespoň jeden transgen v genomu všech svých buněk.

Cizorodá DNA přítomná v rostlinách podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje dva požadované geny, konkrétněji, buďto gen samčí sterility a gen rezistence k herbicidu, nebo gen obnovující fertilitu a gen rezistence k herbicidu.

Termín „gen samčí sterility“, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který po expresi v rostlině činí rostlinu neschopnou produkce fertilního, životaschopného pylu. Příkladem genu samčí sterility je gen obsahující DNA sekvenci kódující bamázu pod kontrolou promotoru směrujícího expresi do buněk tapeta. Konkrétněji, gen samčí sterility podle předkládaného vynálezu je gen „PTA29-barnáza“ popsaný v tomto textu.

Termín „gen obnovující fertilitu“, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který svou expresí v rostlině obsahující gen samčí sterility, je schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility, čili obnovit fertilitu rostliny. Konkrétněji gen obnovující fertilitu obsahuje DNA kódující protein nebo polypeptid schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility pod kontrolou promotoru směřujícího expresi alespoň do buněk, ve kterých je gen samčí sterility exprimován. Konkrétněji, gen obnovující fertilitu podle předkládaného vynálezu je gen „TA29-barstar“, jak je popsán v tomto textu.

Inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu je typicky výsledkem transformace buňky nebo pletiva (nebo dalších genetických manipulací). Konkrétní místo inkorporace je buďto náhodné, neboje v předem určené lokalizaci (pokud je použit způsob cílené integrace).

Cizorodá DNA může být charakterizována lokalizací a konfigurací v místě inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu. Místo v rostlinném genomu, kde byla vložena rekombinantní DNA, se také označuje jako „inzerční místo“ nebo „cílové místo“. Inzerce (vložení) transgenu do rostlinného genomu může být spojena s delecí rostlinné DNA, označovanou jako „delece cílového místa“.

Termíny „sousedící úsek“ nebo „sousedící sekvence“ („flanking region“ a „flanking sequence“), jak se v tomto textu používají, se týkají sekvence alespoň délky 20 bp, výhodně alespoň 50 až 5000 bp rostlinného genomu, která je lokalizována buďto v protisměru a je bezprostředně přiléhající, nebo po směru a je bezprostředně přiléhající k cizorodé DNA. Transformační postupy vedoucí k náhodné integraci cizorodé DNA poskytují transformanty s odlišnými sousedícími úseky, které jsou charakteristické a unikátní pro každou transformantu. Když je transgen vnesen do rostliny metodou tradičního křížení, jeho inzerční místo v rostlinném genomu nebo jeho sousedící úseky se obecně nezmění. Termín „inzerční úsek“, jak se v tomto textu používá, se týká úseku odpovídajícímu alespoň 40 bp, výhodně alespoň 100 bp až více než 10 000 bp, obsaženému v protisměru a po směru sousedících úsecích transgenu (tj. obklopujících transgen) v rostlinném

-5CZ 306357 B6 genomu (netransformovaném) včetně inzerčního místa (a případné delece cílového místa). S ohledem na malé rozdíly v rámci biologického druhu způsobeného mutacemi, inzerční úsek si zachová alespoň 85%, výhodně 90%, výhodněji 95% a nejvýhodněji 100% sekvenční identitu se sekvencí obsahující úseky v protisměru a po směru sousedící s cizorodou DNA v rostlině tohoto druhu.

Exprese požadovaného genu se týká skutečnosti, že gen uděluje rostlině jeden nebo více fenotypových znaků (např. tolerance k herbicidu), které byly zamýšleny, že budou přeneseny tím, že se vnese rekombinantní DNA molekula - transformující DNA - použitá při transformaci (na základě struktury a funkce části nebo všech požadovaných genů).

Termín „událost“ je definován jako (umělý) genetický lokus, který v důsledku genetické manipulace nese cizorodou DNA obsahující alespoň jednu kopii požadovaného genu. Typické alelové stavy události jsou přítomnost nebo absence cizorodé DNA. Jak se v tomto textu specificky používá „MS“ událost a „RF“ událost se týkají události nesoucí gen „TA2 9-barnázy“ a gen „TA29-barstar“, v uvedeném pořadí. Událost je charakterizována fenotypově expresí jednoho nebo více transgenu. Na genetické úrovni, událost je část genetické výbavy rostlin. Na molekulární úrovni je událost charakterizována restrikční mapou (např. určenou metodou Southern blotting) a/nebo v protisměru a/nebo po směru sousedící sekvenci transgenu a/nebo molekulární konfigurací transgenu. Obvykle transformace rostlin transformující DNA obsahující alespoň jeden požadovaný gen vede k mnohočetným událostem, z nichž každá je jedinečná.

Termín „elitní událost“, jak se v tomto textu používá, je událost, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří události, získané transformací stejnou transformující DNA nebo zpětným křížením s rostlinou získanou takovou transformací, na základě exprese a stability transgenu a jeho kompatibility s optimálními agronomickými charakteristikami rostlin, které ho obsahují. Tedy kritéria pro výběr elitní události jsou jedno nebo více, výhodně dvě nebo více, nejvýhodněji všechna následující:

a) přítomnost transgenu neohrožuje další požadované vlastnosti rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickým výkonem nebo komerční hodnotou,

b) událost je charakterizována dobře definovanou molekulární konfiguraci, která je stabilně děděna a pro kterou lze vyvinout vhodný diagnostický nástroj ke kontrole identity,

c) požadovaný gen (nebo geny) v transgenu projevuje správnou, vhodnou a prostorově i časově trvalou expresi fenotypu, jak při heterozygotním (nebo hemizygotním), tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.

Je výhodné, když je cizorodá DNA asociována s polohou v rostlinném genomu, která dovoluje introgresi do požadovaného komerčního genetického pozadí.

Status události jako elitní události je potvrzen introgresi elitní události do odlišného relevantního genetického pozadí a pozorováním shody s jedním, dvěma nebo všemi z výše uvedených kritérií a), b) a c).

Navíc pro transgeny kódující samčí sterilitu a obnovu fertility popsané výše v tomto textu, výběr elitní události je také určen kompatibilitou mezi těmito událostmi, konkrétně tím, že potomstvo pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí událost samčí sterility a rostlinou nesoucí událost obnovitele fertility, ve kterém jsou obě události přítomny, má následující vlastnosti:

a) adekvátní fenotypovou expresi fenotypu obnovitele fertility, tj. samci fertility, a £ _

b) fenotypovou expresi v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.

Termín „elitní událost“ se tedy týká genetického lokusu obsahujícího transgen, který odpovídá výše popsaným kritériím. Rostliny, rostlinný materiál nebo potomstvo, jako je například semeno, mohou obsahovat jeden nebo více elitních událostí ve svém genomu.

„Diagnostický nástroj“ vyvinutý k identifikaci elitní události rostlin nebo rostlinného materiálu obsahujících elitní událost, je založen na specifických genomových charakteristikách elitní události, jako je například specifická restrikční mapa genomového úseku obsahujícího cizorodou DNA a/nebo sekvence úseků sousedících s transgenem.

Termín „restrikční mapa“, jak se v tomto textu používá, se týká souboru „Southern blot“ profilů získaných po štěpení rostlinné genomové DNA konkrétním restrikčním enzymem nebo souborem restrikčních enzymů a hybridizaci se sondou sdílející sekvenční podobnost s transgenem v podmínkách standardní stringence. Podmínky standardní stringence, jak se v tomto textu používá, označují podmínky pro hybridizaci popsané zde nebo jako podmínky obvyklé pro hybridizaci jak byly popsány v příručce Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), které například mohou zahrnovat následující kroky: 1) imobilizace fragmentů rostlinné genomové DNA na filtru, 2) prehybridizace filtru po dobu 1 až 2 hodin v podmínkách: 42 °C v 50% formamidu, 5X SSPE, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS nebo po dobu 1 až 2 hodin v 68 °C v 6X SSC, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS, 3) přidáni hybridizační sondy, která byla označena, 4) inkubace po dobu 16 až 24 hodin, 5) promýváni filtru po dobu 20 minut při teplotě místnosti v IX SSC, 0,1% SDS, 6) promýváni třikrát po dobu 20 minut, vždy v 68 °C v 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 7) expozice filtru po dobu 24 až 48 hodin na rentgenový film v -70 °C s intenzifikačním stínítkem.

Vzhledem k přítomnosti (endogenních) restrikčních míst v rostlinném genomu před inkorporací cizorodé DNA, inzerce cizorodé DNA změní specifickou restrikční mapu tohoto genomu. Tedy, konkrétní transformanta nebo z ní pocházející potomstvo mohou být identifikovány pomocí jednoho nebo více specifických restrikčních profilů. Podmínky pro stanovení restrikční mapy události jsou popsány v „protokolu pro identifikaci restrikční mapy“. Alternativně, jakmile jeden nebo oba úseky sousedící s transgenem byly sekvencovány, mohou být vyvinuty PCR sondy, které specificky rozpoznávají tyto sekvence podle „PCR identifikačního protokolu“. Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující elitní událost mohou být identifikovány testováním podle PCR identifikačního protokolu použitím těchto specifických primerů.

Jak se používá v tomto textu, „biologický vzorek“ je vzorek rostliny, rostlinný materiál nebo produkty obsahující rostlinný materiál. Termín „rostlina“ zahrnuje také rostlinné pletiva, v jakémkoliv stadiu dospělosti, ozimé řepky olejky (Brassica napus), a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z takových rostlin, včetně, avšak bez omezení, jakýchkoliv semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů. „Rostlinný materiál“, jak se v tomto textu používá, se týká materiálu, který je získán nebo pochází z rostlin. Produkty obsahující rostlinný materiál jsou potraviny, krmivá, a nebo další produkty, které jsou vyráběny s použitím rostlinného materiálu nebo mohou být kontaminovány rostlinným materiálem. Je třeba rozumět, že v kontextu předkládaného vynálezu, takové biologické vzorky jsou výhodně testovány na přítomnost nukleových kyselin specifických pro MS-BN1 a/nebo RF-BN1, ukazujících na přítomnost nukleových kyselin ve vzorcích. Tedy metody označované zde jako metody pro identifikaci elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, se výhodně týkají identifikace nukleových kyselin, které obsahují elitní událost, v biologických vzorcích.

Termín „souprava“, jak se v tomto textu používá, se týká souboru reagencií pro účely provádění způsobu podle vynálezu, konkrétněji, identifikace elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1

- 7 CZ 306357 B6 v biologických vzorcích. Konkrétněji, výhodné provedení soupravy podle vynálezu obsahuje alespoň jeden nebo dva specifické oligonukleotidové primery, jak bylo popsáno výše. Volitelně, souprava může dále obsahovat jakékoliv další reagencie popsané v tomto textu v PCR identifikačním protokolu. Alternativně, podle dalšího provedení vynálezu, souprava může obsahovat specifické sondy, jak bylo popsáno výše, které specificky hybridizují s nukleovou kyselinou biologického vzorku k identifikaci přítomnosti MS-BN1 a/nebo RF-BN1 ve vzorku. Volitelně, souprava může ještě dále obsahovat jakékoliv další reagencie (jako je například, ale bez omezení, hybridizační pufr, značka) pro identifikaci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, s použitím specifických sond.

Souprava podle vynálezu může být použita a její složky mohou být specificky upraveny, pro účely kontroly kvality (např., čistota jednotlivých šarží semen), detekce elitní události v rostlinném materiálu nebo materiálu obsahujícím rostlinný materiál nebo pocházejícím z rostlinného materiálu, jako jsou například, ale bez omezení, potravinářské produkty nebo krmivá.

Předkládaný vynález se týká vývoje souboru elitních událostí u ozimé řepky olejky, MS-BNÍ a RF-BN1, rostlin, obsahujících tyto události, potomstva získaného křížením těchto rostlin a také rostlinných buněk nebo rostlinného materiálu získaného z těchto událostí. Rostliny obsahující elitní událost MS-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW107, jak bylo popsáno v příkladu 1. Rostliny obsahující elitní událost RF-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHWl 18, jak je také popsáno v příkladu 1.

Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události MS-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu bamázy pod kontrolou promotoru směrujícího expresi selektivně do buněk tapeta (nazvaná „TA29-bamáza“). TA29 promotor má „tapetum selektivní“ expresní profil u řepky olejky (De Block a Debrouwer, Planta 189:218-225, 1993). Exprese genu TA29-barnázy v rostlinách ozimé řepky olejky vede k destrukci tapeta, což činí rostliny sterilní - jde o rostliny se samčí sterilitou (Mariani et al, 1990, výše). Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události RF-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu barstar pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (nazvaná „PTA29-barstar“). Exprese genu TA29barstar v rostlinách ozimé řepky olejky v přítomnosti genu „TA29-barnázy“ zabraňuje aktivitě bamázy v buňkách tapeta, a tím zabraňuje destrukci tapeta, a tudíž obnovuje fertilitu těchto rostlin (Mariani et al. 1992, výše).

Obě rekombinantní DNA, které se užívají pro vytvoření elitní událost MS-BN1 a RF-BN1, navíc obsahují DNA sekvence kódující enzym fosfinotricinacetyltransferázu a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CMV), kde sekvence kódující fosfinotricinacetyltransferázu je pod kontrolou 35S promotoru (nazvaná „35S-bar“). 35S promotor má konstitutivní expresní profil u řepky olejky, což znamená významnou expresi ve většině buněčných typů v průběhu většiny životního cyklu rostliny. Exprese genu 35S-bar v rostlině řepky olejky poskytuje rostlině rezistenci k herbicidním sloučeninám fosfinotricinu, bialafosu nebo glufosinátu, nebo obecněji, inhibitorům glutaminsyntetázy nebo jejich solím nebo optickým izomerům.

Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující MS-BN1 může být identifikován podle protokol identifikace restrikční mapy popsaného pro MS-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stměné, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem několika (výhodně dvou až pěti) z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 3942 bp HindlII fragmentem plazmidu pTHW107 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym, který byl použit, se určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:

- EcoRI: jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden fragment více než 14 kbp,

-8CZ 306357 B6

- EcoRV: jeden fragment velikosti mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a jeden fragment více než 14 kbp,

- Hpal: jeden fragment velikosti mezi 1986 a 2140 bp, výhodně přibližně 1990 bp a jeden bp jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,

- AfUII: jeden fragment velikosti mezi 514 a 805 bp, výhodně přibližně 522 bp, jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden fragment velikosti mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

- Ndel: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp.

Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda. Fragment delší než 14 kbp byl určen jako fragment délky mezi 14 a 40 kbp, když extrakce DNA byla provedena způsobem podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p. 19-21).

Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, konkrétně s alespoň čtyřmi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikčními enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BN 1.

Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující MS-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro MS-BN 1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR (polymerázovou řetězovou reakci) s použitím příměrů, které specificky rozpoznávají sousední sekvence MS-BN1, výhodně rozpoznávající 5' nebo 3' sousední sekvence MS-BN1 popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. C. 19 a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. C. 12. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytne fragment mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, rostliny ozimé řepky olejky byly identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost MS-BN 1.

Rostliny obsahující MS-BN1 jsou fenotypové charakterizovány tím, že za absence genu obnovitele fertility v jejich genomu projevují samčí sterilitu. Rostliny se samčí sterilitou jsou definovány jako rostliny, které nejsou schopné vytvářet fertilní, životaschopný pyl.

Rostliny obsahující MS-BN1 mohou být například získány ze semen obsahujících MS-BN1 uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny pak mohou být dále množeny pro přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.

Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou být identifikovány podle protokolu identifikace restrikční mapy popsaného pro RF-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem (výhodně dvěma až čtyřmi) z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV a HindlII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWl 18 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym se pak určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:

- BamHI: jeden fragment délky mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden fragment délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden fragment délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně přibližně 6500 bp,

-9CZ 306357 B6

- EcoRI: jeden fragment délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden fragment délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp ajeden přibližně 10 kbp,

- EcoRV: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden přibližně 5,4 kbp a přibližně 8 kbp,

- HindlII: jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva fragmenty mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden přibližně 2565 bp ajeden přibližně 2635 bp,

Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda.

Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikčními enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BN 1.

Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro RF-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR s použitím primerů, který specificky rozpoznává sousední sekvence RF-BN1, výhodně 5' nebo 3' hraniční sekvence RF-BN1 popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 41, a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 23. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytuje fragment mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, rostliny ozimé řepky olejky jsou identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost RF-BN1.

Rostliny obsahující RF-BN1 jsou charakterizovány tím, že gen barstar je exprimován v buňkách tapeta. Produkce genu v buňkách tapeta rostlin nemá ani prospěšný ani škodlivý účinek na tvorbu pylu, jak bylo ukázáno (Mariani et al. 1992, výše). Tedy za absence genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar nemá za následek pozorovatelný fenotyp. V přítomnosti genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar poskytuje rostlinu s obnovenou fertilitou, tedy fertilní fenotyp. Fenotyp rostliny s obnovenou fertilitou je definován jako rostlina, která, i přes přítomnost genu samčí sterility ve svém genomu, je schopna produkce fertilního, životaschopného pylu.

Rostliny obsahující RF-BN 1 mohou být například získány ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny mohou být dále množeny a/nebo použity v obvyklých šlechtitelských postupech k přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.

Rostliny obsahující MS-BN1 a/nebo RF-BN 1 jsou také charakterizovány jejich toleranci ke glufosinátu, což v kontextu předkládaného vynálezu zahrnuje rostliny, které jsou tolerantní k herbicidu Liberty™. Tolerance k herbicidu Liberty™ je definována kritériem, že postřik rostlin ve stadiu tří až čtyřech listů (3V až 4V) dávkou alespoň 200 gramů účinné složky/hektar (g.a.i./ha), výhodně 400 g.a.i./ha a případně až 1 600 g.a.i./ha, nezahubí rostliny. Rostliny obsahující MSBN1 a/nebo RF-BN 1 mohou být dále charakterizovány přítomností fosfinotricinacetyltransferázy v buňkách, která se stanoví PAT testem (De Block et al, 1987, supra).

Rostliny ozimé řepky olejky podle vynálezu mohou být pěstovány obvyklým způsobem. Přítomnost genu 35S-bar zajišťuje, že jsou tolerantní ke glufosinátu. Tudíž plevele na polích, kde jsou tyto rostliny ozimé řepky olejky pěstovány, mohou být plevely hubeny aplikací herbicidů obsahujících glufosinát jako účinnou složku (jako je například Liberty™).

-10CZ 306357 B6

Rostliny obsahující MS-BN 1 a/nebo RF-BN1 jsou také charakterizovány tím, že mají agronomické vlastnosti, které jsou srovnatelné s komerčně dostupnými odrůdami ozimé řepky olejky v USA. Relevantní agronomické vlastnosti jsou: výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdomost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.

Bylo pozorováno, že přítomnost cizorodé DNA v inzerčních úsecích v genomu rostlin ozimé řepky olejky (Brassica napus) popsaných v tomto textu, konkrétněji v inzerčních místech genomu rostlin ozimé řepky olejky, poskytují zvláště zajímavé fenotypové a molekulární vlastnosti rostlinám, které obsahují tyto události. Konkrétněji, přítomnost cizorodé DNA v těchto konkrétních úsecích genomu těchto rostlin vede k trvalé fenotypové expresi transgenu, aniž by se významně zhoršil kterýkoliv z aspektů požadované agronomické výkonnosti rostliny, což činí tyto rostliny zejména vhodné pro produkci hybridní ozimé řepky olejky. Tedy, inzerční úseky odpovídající sekvencím SEKV. ID. Č. 22 a SEKV. ID. Č. 34, a v nich konkrétně inzerční místo MS-BN1 a RF-BN1, jsou zejména vhodné pro vnesení požadovaných genů. Konkrétněji, inzerční úseky MS-BN1 (SEKV. ID. Č. 22) a RF-BN1 (SEKV. ID. Č. 34) nebo inzerční místa MSBN1 a RF-BN1, v daném pořadí, jsou zvláště vhodná pro vnesení plazmidů obsahujících gen samčí sterility a gen obnovující fertilitu, v daném pořadí, a zajišťují optimální expresi každého z těchto genů nebo obou genů v rostlině aniž by se zhoršila její agronomická výkonnost.

Rekombinantní DNA molekula může být specificky vložena do inzerčního úseku metodou cílené inzerce. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a patří k nim například homologní rekombinace s použitím rekombinázy, jako například, ale bez omezení, FLP rekombináza ze Saccharomyces cervisiae (Patent US 5 527 695), CRE rekombináza z fága Pl Escherichia coli (publikovaná PCT přihláška WO 91/09 957, rekombináza z pSRI Saccharomyces rouxii (Araki et al. 1985, J. Mol. Biol. 182:191-203) nebo rekombinační systém fága lambda jak byl popsán například v patentu US 4 673 640.

Termín „sekvenční identita“, ve vztahu k nukleotidové sekvenci (DNA nebo RNA), se týká hodnoty počtu poloh s identickým nukleotidem děleného počtem nukleotidů v kratší ze dvou srovnávaných sekvencí. Porovnání dvou nukleotidových sekvencí se provádí algoritmem podle Wilbura a Lipmanna (Wilbur a Lipmann, 1983) s použitím parametrů: velikost okna 20 nukleotidů, délka slova 4 nukleotidy a penalta za mezeru 4. Počítačově prováděná analýza a interpretace sekvenčních dat, včetně srovnání sekvencí jak bylo popsáno výše, může být např. výhodně prováděna pomocí programů Intelligenetics™ Suite (Intelligenetics lne., CA). Sekvence jsou „v podstatě podobné“ když tyto sekvence mají sekvenční identitu alespoň přibližně 75 %, zejména alespoň přibližně 80 %, konkrétněji alespoň přibližně 85 %, a zvláště přibližně 90 %, obzvláště přibližně 95 %, a obzvláště přibližně 100 %, a zejména obzvláště jde o sekvence zcela identické. Je jasné, že kdyžjsou RNA sekvence v podstatě podobné, nebo mají jistý stupeň sekvenční identity s DNA sekvencí, thymin (T) v DNA sekvenci se považuje za shodný s uracilem (U) v RNA sekvenci.

Jak se používá v tomto textu, termín „obsahující“ je třeba chápat jako specifikující přítomnost dané vlastnosti, hodnoty, kroku nebo složky, což přitom nevylučuje přítomnost nebo přidání jedné nebo více dalších vlastností, hodnot, kroků nebo složek nebo jejich skupin. Tedy např. nukleová kyselina nebo protein obsahující sekvenci nukleotidů nebo aminokyselin může obsahovat více nukleotidů nebo aminokyselin, než které jsou uvedeny, tj. může být např. vložena ve větší nukleové kyselině nebo proteinu. Chimérický gen obsahující DNA sekvenci, která je funkčně nebo strukturně definována, může obsahovat ještě další DNA sekvence, atd.

Následující příklady popisují vývoj a charakteristické vlastnosti rostlin ozimé řepky olejky obsahující elitní události MS-BN1 a RF-BN1.

Pokud není uvedeno jinak, všechny techniky rekombinantní DNA byly prováděny podle standardních protokolů popsaných v příručce Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Labora

-11 CZ 306357 B6 tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, a nebo v dílech 1 a 2 příručky Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardní materiály a metody pro rostlinnou molekulární genetiku byly popsány v příručce Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, publikované v BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.

V popisu a příkladech se odvolává na následující sekvence:

SEKV. ID. Č. 1: plazmid pTHW107

SEKV. ID. Č. 2: plazmid pTHWl 18

SEKV. ID. Č. 3: primer 248

SEKV. ID. Č. 4: primer 249

SEKV. ID. Č. 5: primer 247

SEKV. ID. Č. 6: primer 250

SEKV. ID. Č. 7: primer 251

SEKV. ID. Č. 8: primer 254

SEKV. ID. Č. 9: primer 258

SEKV. ID. Č. 10: primer SP6

SEKV. ID. Č. 11: primer T7

SEKV. ID. Č. 12: primer 201 (BNA01)

SEKV. ID. Č. 13: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1

SEKV. ID. Č. 14: primer 611

SEKV. ID. Č. 15: primer 259

SEKV. ID. Č. 16: primer 260

SEKV. ID. Č. 17: primer 24

SEKV. ID. Č. 18: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1

SEKV. ID. Č. 19: primer 51 (BNA02)

SEKV. ID. Č. 20: primer 48

SEKV. ID. Č. 21: sekvence obsahující deleci cílového místa MS-BN 1

SEKV. ID. Č. 22: inzerční úsek MS-BN 1

SEKV. ID. Č. 23: primer 193 (BNA03)

SEKV. ID. Č. 24: sekvence obsahující 5' sousedící úsek 1ZP-BN1

SEKV. ID. Č. 25: primer 286

SEKV. ID. Č. 27: primer 315

SEKV. ID. Č. 28: primer 316

SEKV. ID. Č. 29: primer 288

SEKV. ID. Č. 30: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1

SEKV. ID. Č. 31: primer 269

SEKV. ID. Č. 32: primer 283

SEKV. ID. Č. 33: primer 284

SEKV. ID. Č. 34: integrační úsek RF-BN 1

SEKV. ID. Č. 35: primer 57

SEKV. ID. Č. 36: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN 1 v rostlině řepky olejky

SEKV. ID. Č. 37: primer 68

SEKV. ID. Č. 38: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky

SEKV. ID. Č. 39: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 v rostlině ozimé řepky olejky

-12CZ 306357 B6

SEKV. ID. Č. 40: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky

SEKV. ID. Č. 41: primer 268 (BNA04)

SEKV. ID. Č. 42: primer BNA05

SEKV. ID. Č. 43: primer BNA06

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Transformace rostlin Brassica napus genem samčí sterility a genem obnovitele fertility

a) konstrukce chimérické DNA obsahující gen bamázy pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (pTHW107).

Plazmid pTHW107 (SEKV. ID. Č. 1) byl v podstatě získán z intermediátního vektoru pGSVl. PGSV1 je sám odvozen z pGSC 1700 (Cornelissen a Vandewielle, 1989), ale obsahuje umělý Túsek, který tvoří levá a pravá hraniční sekvence TL-DNA formy pTiB6S3 a multilinker klonovacích míst umožňující inzerci chimérického genu mezi T-DNA hraniční repetice. Vektor PGSVl je poskytnut s genem barstar v hlavním čtecím rámci plazmidu, s regulačními signály pro expresi v E. coli.

Úplný popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW 107 je uveden v tabulce 1.

Tabulka 1: T-DNA plazmidu pTHW107

nt polohy	Orientace	Popis a odkazy
1-25		Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).
26-97		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
309-98	Proti směru	3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).
310-330		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

- 13 CZ 306357 B6

882-331	Proti směru	Kódující sekvence genu bar ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519- 2523) . Dva N-koncové kodony kódujícího úseku bar divokého typu byly substituovány kodony ATG a GAC, v daném pořadí.
2608-883	Proti směru	Promotor genu malé podjednotky ribulóza1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).
2609-2658		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
2919-2659	Proti směru	260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573).
2920-3031		3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od kódující sekvence barnázy z B. Amyloliquefaciens
3367-3032	Proti směru	Kódující úsek genu barnázy z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913915) .

- 14CZ 306357 B6

4877-3368	Proti směru	Promotorový úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403).
4878-4921		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
4922-4946		Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846).

b) Konstrukce chimérické DNA obsahující gen barstar pod kontrolou konstitutivního promotoru (pTHWl 18)

Plazmid pTHW118 (SEKV. ID. Č. 2) byl také v podstatě odvozen z intermediátního vektoru pGSV 1 (popsán výše). Kompletní popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHWl 18 je uveden v tabulce 2.

Tabulka 2: T-DNA plazmidu pTHWl 18

nt polohy	Orientace	Popis a odkazy
1-25		Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).
26-53		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

- 15 CZ 306357 B6

54-90		Reziduálni sekvence z TL-DNA v repetici pravé hranice.
91-97		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
309-98	Proti směru	3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).
310-330		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
883-331	Proti směru	Kódujicí sekvence genu rezistence k bialafosu (bar) ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). Dva kodony N-konce kódujícího úseku bar divokého typu byly nahrazeny kodony ATG a GAC, v daném pořadí.
2608-883	Proti směru	Promotor genu malé podjednotky ribulóza1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).
2609-2658		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

- 16CZ 306357 B6

2919-2659	Proti směru	260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573) .
2920-2940		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
2941-2980		3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od barstar kódující sekvence z Bacillus amyloliguefaciens
3253-2981	Proti směru	Kódující úsek genu barstar z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913915) .
4762-3254	Proti směru	Promotorový úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403).
4763-4807		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
4808-4832		Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846).

c) Transformace rostlin Brassica napus

Pro transformaci rostlin Brassica napus byl užit vektorový systém, který byl popsán v Deblaere et al. (1985, 1987). Vektorový systém sestává z kmene Agrobacterium a dvou plazmidových složek: 1) non-onkogenní Ti-plazmid (pGV400) a 2) intermediátní klonovací vektor založený na

- 17CZ 306357 B6 plazmidu pGSV 1. Non-onkogenní Ti-plazmid z něhož byla odstraněna T-oblast nese geny vir nezbytné pro přenos umělé T-DNA klonované do druhého plazmidu do rostlinného genomu. Kmeny Agrobacteria vzniklé triparentální konjugací mezi uvedenými složkami pak mohou být použity pro transformaci rostlin.

Selekce byla prováděna na fosfinotricinu (PPT) ve všech stadiích, s výjimkou regenerace rostlinek, která probíhala bez přítomnosti PPT, aby se urychlil růst. Tak byl připraven soubor primárních transformant (rostliny generace T_o).

Příklad 2

Vývoj genetických událostí

2.1. Charakterizace transgenní události

2.1.1. Analýza MS události metodou Southern blot

Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportar, 1, vol,3, p, 19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny bamázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:

Sonda „bamáza“: 478 bp Pstl-EcoRI fragment plazmidu pVEl 13

Sonda „bar“: 546 bp Ncol-BglII fragment plazmidu pDEl 10

Plazmidy pVEl 13 a pDEl 10 jsou popsány na obrázku 1 a v dokumentu WO 92/09 696, v uvedeném pořadí. Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza“ poskytla 12 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou „bar“ poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U obou událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce. To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho fokusu.

2.1.2. Analýza RF události metodou Southern blot

Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:

Sonda „bamáza“: 436 bp HindlII-Pstl fragment plazmidu pVEl 13

Sonda „bar“: 546 bp Ncol-BglII fragment plazmidu pDEl 10

Hybridizace MS událostí se sondou „bamáza“ poskytla 3 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U několika událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce.

To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.

-18CZ 306357 B6

2.1.3. Obecný fenotyp a agronomické výkonnost rostlin

Rostliny T] generace u obou událostí MS a RF byly vyhodnoceny na řadu fenotypových znaků, jako je např. výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdomost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.

Linie byly hodnoceny jako podobné (nebo zlepšené) v uvedených agronomických charakteristikách ve srovnání s netransformovanou odrůdou a také s řadou kultivarů řepky olejky. V některých případech rostliny segregovaly z důvodu somaklonální variace projeden nebo více z výše uvedených znaků. Pokud to nevedlo k vnesení komerčně zajímavého fenotypového znaku, takové rostliny byly odstraněny.

2.2. vývoj linií nesoucích znaky MS nebo RF

Různé hemizygotní rostlinky T_o generace („Ms/-„ nebo „Rf/“) byly přeneseny z pletivových kultur do půdy ve skleníku. Přítomnost transgenu a počet genových kopií byly kontrolovány Southern blot analýzou, jak bylo popsáno výše. Rostliny byly ponechány do květu, a pak byla vyhodnocena sterilita nebo fertilita květů. Rostliny TO generace byly kříženy s rostlinami divokého typu rostliny (-/-) pro vytvoření TI semen (MsTl a RfTl). TI semena byla vyseta a dále pěstována ve skleníku. Rostliny byly pak hodnoceny na toleranci ke glufosinátu amonnému. Ms-Tl rostliny byly také hodnoceny na segregaci sterility/fertility (u nepostříkaných rostlin), zatímco Rf-Tl rostliny byly kontrolovány na fertilitu květů.

Ms-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami homozygotními pro gen obnovující fertilitu (Rf/Rf), pro produkci MsRf-Fl semen. Tato semena (Ms/-, Rf/- a -/-, Rf/-) byla vyseta ve skleníku a ošetřena postřikem Liberty™. Zbylé F1 potomstvo bylo vyhodnoceno na segregaci fertility/sterility pro ověření toho, zda znak samčí sterility může být adekvátně obnoven u Brassica napus (fertilita blízká 100 %).

Nejlepší události byly vybrány pro další testování. Ms-Tl rostliny byly kříženy s homozygotním obnovitelem fertility a semena byla vyseta na poli. Rostliny pak byly hodnoceny na toleranci k herbicidu Liberty™ (800 gramů účinné složky na hektar (g.a.i./ha), přičemž doporučená dávka pro rolníky je 400 g.a.i./ha), segregaci fertility/sterility a na obecné fenotypové vlastnosti. Linie, u kterých došlo ke 100% obnovení fertility a u kterých nebyly pozorovány žádné negativní změny ve fenotypu nebo agronomické výkonnosti (podrobně viz (d)) ve srovnání s isogenní kontrolou divokého typu, byly selektovány.

Rf-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami obsahujícími gen samčí sterility (Ms/-) pro produkci F1 semen. Tato semena byla pěstována ve skleníku, postříkána herbicidem Liberty™ a pak byla vyhodnocena obnova fertility (blízko ke 100 %).

Mezitím byl Rf-Tl rostliny samosprášeny pro získání generace SI. SI rostliny byly pěstovány ve skleníku, ošetřeny postřikem herbicidu Liberty™ a opět samosprášeny pro vytvoření generace S₂, z S₂ pak byly vybrány homozygotní rostliny.

2.3. Kombinace událostí MS a RF.

Vybrané Ms-Tl rostliny byly kříženy s vybranými Rf-S₂ událostmi ve skleníku pro otestování obnovy fertility. Semena byla vyseta ve skleníku, na rostliny byl aplikován postřik Liberty™ a byla kontrolována fertilita květů.

- 19CZ 306357 B6

2.4. Testování MS a RF události v odlišném genetickém základu a v odlišné lokalizaci

Vybrané události byly vneseny do dvou odlišných genetických základů, které jsou heteroticky odlišné, k prokázání toho, že MS a RF události jsou plně funkční a neměly žádné negativní účinky na výnos nebo kvalitu u žádného z testovaných základů.

Současně byly vybrané MS a RF události testovány ve čtyřech až pěti odlišných prostředích ke zjištění toho, zda není negativní interakce mezi prostředím a MS nebo RF událostí.

V dalším stadiu byla produkce hybridních semen s použitím vybraných MS a RF událostí testována extenzivněji v polních podmínkách. Vybraná MS událost ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech byly kříženy s vybranou RF událostí, také ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech. F1 hybridi byly hodnoceni na rezistenci k herbicidu Liberty™, fertilitu a také celkovou agronomickou výkonnost (výnos a kvalita).

2.5. Selekce elitní události

Výše popsaný postup selekce při vývoji transgenních MS linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, fenotyp samčí sterility a schopnost kompletní obnovy fertility s homozygotní obnovitelskou linií, konkrétně s vybranou RF elitní událostí.

Výše popsaný selekční postup při vývoji transgenních RF linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, a schopnost obnovy fertility Fl, když se kříží s rostlinou nesoucí gen samčí sterility, konkrétně s vybranou MS elitní událostí.

Příklad 3

Vnesení vybraných kandidátních elitních událostí do rostlin ozimé řepky olejky

Několik MS a RF elitních událostí, které byly vyvinuty u rostlin B. napus, jak bylo popsáno výše, bylo vneseno do kultivaru ozimé řepky olejky opakovaným zpětným křížením rostlin odrůdy Drakkar.

Rostliny byly vyšetřeny a bylo zjištěno následující:

a) Přítomnost cizorodé DNA nijak nepoškozuje další požadované charakteristiky rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickou výkonností nebo komerční hodnotou,

b) událost byla charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která byla trvale děděna,

c) požadované geny v cizorodé DNA vykazují správnou, vhodnou a trvalou prostorovou i časovou fenotypovou expresi, jak v heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni a v rozsahu environmentálních podmínek, kterým rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vystaveny při jejich normálním agronomickém použití.

Dále, rostliny byly vyhodnoceny na jejich agronomicky významné vlastnosti a výkonnost ve srovnání s divokým typem ozimé řepky olejky.

-20CZ 306357 B6

Extenzivní testování v polních podmínkách ukázalo, že určité kandidátní elitní události u jarní řepky olejky, když byly přeneseny na ozimé řepky olejky, vedly ke vzniku rostlin, které vykazovaly adekvátní expresi požadovaných genů v cizorodé DNA ve spojení s optimální agronomickou výkonností. Tyto události byly vybrány jako MS a RF elitní události u ozimé řepky olejky a byly nazvány MS-BN1 a RF-BN1, v uvedeném pořadí.

Příklad 4

Charakterizace elitních událostí MS-BN1 a RF-BN1

Jakmile byly jednou události MS-BN1 a RF-BN1 identifikovány jako elitní události, kdy exprese požadovaných transgenů a také celková agronomické výkonnost byly optimální, lokusy transgenů byly analyzovány podrobněji na molekulární úrovni. To zahrnovalo detailní analýzu metodou Southern blot (s použitím vícečetné sady restrikčních enzymů) a sekvencování úseků sousedících s transgenem.

4.1. Southern blot analýza s použitím více restrikčních enzymů

Pletivo listů bylo odebráno z transgenních a kontrolních rostlin. Celková genomová DNA byla izolována z pletiva listů metodou podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol. 3, p, 19-21). DNA koncentrace každého preparátu pak byla určena měřením optické denzity na spektrofotometru při vlnové délce 260 nm.

pg genomové DNA bylo štěpeno restrikčním enzymem v reakci o celkovém objemu 40 a sice v podmínkách podle doporučení výrobce enzymu. Doba štěpení a/nebo množství restrikčního enzymu byly upraveny tak, aby bylo zajištěno úplné štěpení vzorků genomové DNA bez nespecifické degradace. Po štěpení bylo k naštěpené DNA přidáno 4 μΐ nanášecího barviva a vzorky byly naneseny na 1% agarózový gel.

Následující kontrolní DNA byly také naneseny na gel:

- negativní kontrola s genomovou DNA připravenou z netransgenní rostliny Brassica. Tato negativní kontrola je použita k potvrzení absence pozadí hybridizace.

- DNA pozitivní kontrola: s heterozygotní integrací jedné kopie transgenu do genomu Brassica napus, 10 pg genomové DNA má stejný počet molekul jako přibližně 19 pg DNA 1501 bp Pvul-HindlII fragmentu pTHW118 (velikost diploidního genomu Brassica napus: 0,8x109 bp). Množství představující jednu kopii plazmidu na celý genom bylo přidáno k 1 pg naštěpené DNA z netransgenní Brassica napus. Takto rekonstituovaný vzorek byl použit k ukázání toho, že hybridizace jsou prováděny v podmínkách umožňujících hybridizaci sondy s cílovou sekvencí.

DNA fága Lambda (kmen Clind 1 ts 857 Sam 7, Life Technologies) štěpený Pstl byl zahrnut jako velikostní standard.

Po elektroforéze byly DNA vzorky (štěpená genomová DNA Brassica, kontroly a DNA sloužící jako velikostní standard) přeneseny na nylonovou membránu pomoci kapilárního blottingu trvajícího 12 až 16 hodin.

DNA templáty použité pro přípravu sond pro MS-BN1 událost byly připraveny restrikčním štěpením PTW107 enzymem HindlIL Tak byl vyštěpen 3942 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní část transformující DNA (část PSSUARA, 3' nos, bamáza, PTA29).

-21 CZ 306357 B6

DNA templáty použité pro přípravu sondy pro RF-BN1 události byly připraveny restrikčním štěpením PTW118 enzymem Hpal. Tak byl vyštěpen 2182 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní části transformující DNA (část PSSUARA, 3'nos, barstar, PTA29).

Po purifikaci byly DNA fragmenty značeny standardním postupem a byly použity k hybridizaci na membráně.

Hybridizace byla prováděna v podmínkách standardní stringence: značená sonda byla denaturována zahříváním po dobu 5 až 10 minut ve vodní lázni na teplotu 95 až 100 °C a pak ochlazením na ledu po dobu 5 až 10 minut, a po té byla přidána k hybridizačnímu roztoku (6 X SSC (20 X SSC je 3,0 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0), 5 X Denhardtovo činidlo (100 X Denhardt = 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% bovinní sérový albumin), 0,5% SDS a 20 pg/ml denaturované nosičové DNA (jednořetězcová DNA z rybího spermatu, s průměrnou délkou 120 až 3000 nukleotidů). Hybridizace byly prováděny přes noc v 65 °C. Bloty byly promývány třikrát po dobu 20 až 40 minut v 65 °C, promývacím roztokem (2 X SSC, 0,1 SDS).

Autoradiografy byly elektronicky skenovány.

4.1.1. MS-BN1

Restrikční profil získaný po štěpení MS-BN1 genomové DNA s různými restrikčními enzymy je uveden na obrázku 2 a přehledně shrnut v tabulce 3.

-22CZ 306357 B6

Tabulka 3: Restrikční mapa MS-BN1

Číslo dráhy	Nanesená DNA	Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu	Určená délka hybridizujících DNA fragmentů
Větší než	Menší než
1	MS-BN1 - EcoRI	2140 14057	2450	2266 bp (*) >14 kbp
2	MS-BN1 - EcoRV	1159 14057	1700	1,4 kbp (*) >14 kbp
4	MS-BN1 - Hpal	1986 2140	2140 2450	1990 bp 2229 bp
5	MS-BN1 - AflIII	2450 2140 514	2838 2450 805	2477 bp (*) 2250 bp 552 bp (*)
6	MS-BN1 - Ndel	5077 5077	14057 14057	10 kbp 6510 bp
7	Netransgenní ozimé řepky olejky	—	—
8	Kontrolní Dlazmidová DNA - BamHI	1700 2450	1986 2838	1966 bp (*) 2607 bp (*)

(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107

4.1.2. RF-BN 1 io Restrikční profil získaný po štěpení RF-BN 1 genomové DNA s různými restrikčními enzymy je uveden na obrázku 3 a přehledně shrnut v tabulce 4.

-23 CZ 306357 B6

Tabulka 4: Restrikční mapa RF-BN1

Číslo dráhy	Nanesená DNA	Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu	Určená délka hybridizuj ících DNA fragmentů
Větší než	Menší než
1	MS-BN1 - BamHI	805 1700 2450 5077	1099 1986 2838 14057	814 bp 1849 bp (*) 2607 bp(*) 6580 bp
2	MS-BN1 - EcoRI	805 1986 5077 5077	1159 2450 14057 14057	1094 bp 2149 bp 7000 bp 10 kbp
3	MS-BN1 - EcoRV	5077 5077	14057 14057	5,4 kbp 8 kbp
4	MS-BN1 -HindlII	1700 2450 2450	2140 2838 2838	1969 bp 2565 bp 2635 bp
6	Netransgenní ozimé řepky olej ky			—
5	Kontrolní plazmid DNA - BamHI	1700 2450 5077	1986 2838 14057	1849 bp (*) 2607 bp (*) 8100 bp

(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107

4.2. Identifikace sousedící úseky

Sousedící úseky elitní události MS-BN1 a RF-BN1 byly nejdříve identifikovány pro jarní řepky olejky, ve kterých události byly vyvinuty, a pak kontrolovány u ozimé řepky olejky.

4.2.1. Identifikace úseků sousedících s MS-BN1

4.2.1.1. Pravý (5') sousedící úsek

Pro stanovení sekvence sousedícího úseku MS-BN1 na pravé hranici byla užita ligaci-zprostředkovaná polymerázová řetězová reakce (Mueller et al. 1989, Science 780-786, Marine et al., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75) s extenzním záchytem („extension capture“) (Tormanen et al., 1993, NAR 20:5487-5488).

-24CZ 306357 B6

Oligonukleotidy použité pro přípravu linkeru byly následující:

MDB248: (SEKV. ID. Č. 3)

5'CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.

GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTG

MDB249: (SEKV. ID. Č. 4)

5'CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.

CTG.GGT.CAG.GGC.ATG

Po přípravě linkeru následovala syntéza prvního řetězce z genomové MS-BN1 DNA štěpené Ncol, s použitím biotinylovaného genově specifického primerů:

	Sekvence (5' —>3')	Poloha v PTHW107
Biotinylovaný primer MDB247	CCG.TCA.CCG.AGA.TCT. GAT.CTC.ACG.CG (SEKV. ID. Č. 5)	322 <- 347

Linker pak byl ligován k prvnímu řetězci DNA, který pak byl kondenzován k magnetickým perličkám, ze kterých byl nebiotinylovaný řetězec eluován. Tato DNA byla použita pro PCR amplifikaci ve větším měřítku s použitím následujících primerů:

	Sekvence (5'->3')	Poloha v PTHW107
Linkerový primer MDB250	GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEKV. ID. Č. 6)
T-DNA primer MDB251	GGA.TCC.CCC. GAT. GAG.CTA.AGC. TAG.C (SEKV. ID. Č. 7)	293 <- 317

Tato PCR poskytla fragment přibližně 1150 bp. Tento fragment pravé hranice (RB) byl eluován z agarózového gelu a na 1 OOnásobně zředěné této DNA byla provedena sdružená („nested“) PCR s použitím následujících primerů:

	Sekvence (5'->3')	Poloha v PTHW107
„Nested linkerový primer MDB254	CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEKV. ID. Č. 8)
T-DNA primer MDB258	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9)	224 <- 243

-25 CZ 306357 B6

Tato reakce poskytla fragment velikosti přibližně 1000 bp, který byl eluován z agarózového gelu, purifikován a ligován do vektoru pGem®-T. Rekombinantní plazmidová DNA byla podrobena screeningu s použitím standardní PCR reakce s následujícími primery:

	Sekvence (5'->3')	Poloha v PTHW107
SP6 primer	TAA. TAC. GAC. TCA. CTA. TAG. GGC. GA (SEKV. ID. Č. 10)	(SP6 promotor ve vektoru PGem®-T)
T7 primer	TTT.AGG.TGA.CAC. TAT.AGA.ATA.C (SEKV. ID. Č. 11)	(T7 promotor ve vektoru PGem®-T)
T-DNA primer MDB201	gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12)	143 <- 163

Tak vznikly následující fragmenty:

SP6-T7: 1224 bp

SP6-MDB201: 1068 bp

T7-MDB201: 1044 bp

Fragment pravé hranice byl purifikován a sekvencován (SEKY. ID. Č. 13), což poskytlo výsledný 963 bp fragment, v němž polohy 1 až 867 odpovídají rostlinné DNA a úsek bp 868 až 953 odpovídá T-DNA z pTW 107.

4.2.1.2. Levý (3') sousedící úsek s MS-BN 1

Sekvence úseku levé hranice sousedícího s vloženým transgenem v MS-BN 1 události byly určeny s použitím metody TAIL-PCR („thermal asymmetric interlaced PCR“), který popsali Liu et al. (1995, Plant Journal 8(3): 457^463). Tento způsob užívá tři sdružené („nested“) specifické primery v následných reakcích společně s kratším arbitrámě degenerovaným (AD) primerem, takže relativní účinnosti amplifikace specifického a nespecifického produktu mohou být teplotně kontrolovány. Specifické primery byly vybrány pro nasednutí („annealing“) k hranici transgenu a na základě jejich podmínek pro nasednutí. Malé množství (5 μΐ) nepurifikovaných sekundárních a terciárních PCR produktů bylo analyzováno na 1% agarózovém gelu. Terciární PCR produkt byl použit pro preparativní amplifikaci, purifikován a sekvencován na automatickém sekvencovacím zařízení s použitím soupravy pro cyklovací sekvencování DyeDeoxy Terminátor.

Následující primery byly použity:

-26CZ 306357 B6

	Sekvence (5 * —>3’)	Poloha v PTHW107
Degenerovaný primer MDB611	NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (SEKV. ID. Č. 14)
Primární TAIL MDB259	gTg.Cag.ggA.AgC.ggT.TAA.CTg.g (SEKV. ID. Č. 15)	7164 —> 4186
Sekundární TAIL MDB260	CCT.TTg.gAg.TAA.ATg.gTg.TT g.g (SEKV. ID. Č. 16)	4346 -A 4366
Terciární TAIL HCA24	gCg.AAT.gTA. TAT.TAT.ATg.CA (SEKV. ID. Č. 17)	4738 -» 4757

Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T

Fragment amplifikovaný s použitím HCA24-MDB611 byl přibližně dlouhý 540 bp, z nichž bylo 537 bp sekvencováno (3' sousedící: SEKV. ID. Č. 18). Sekvence mezi 1 a 180 bp obsahovala pTHW107 DNA, zatímco sekvence mezi 181a 537 bp odpovídala rostlinné DNA.

4.2.1.3. Identifikace delece cílového místa

Užitím primerů odpovídajících sekvencím v sousedících úsecích transgenu bylo na DNA divokého typu z rostliny Brassica napus var. Drakkar jako templátu identifikováno inzerční místo transgenu.

Následující primery byly použity:

	Sekvence (5’—>3’)	Poloha v 5' sousedícím úseku	Poloha v 3' sousedícím úseku
		(SEKV. ID. Č. 13)	(SEKV. ID. Č. 18)
VDS51	TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (SEKV. ID. Č. 19)	733 -> 751
HCA48	GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (SEKV. ID. Č. 20)		189 <- 208

Tím byl připraven 178 bp fragment (SEKV. ID. Č. 21), ve kterém úsek 132 až 150 bp odpovídá deleci cílového místa.

4.2.1.4. Identifikace MS-BN1 inzerěního úseku

Na základě identifikace sousedících úseků a delece cílového místa mohl být určen inzerční úsek MS-BN1 (SEKV. ID. Č. 22):

1-822: 5' sousedící úsek bp 46-867 ze SEKV. ID. Č. 13

-27CZ 306357 B6

823-841: delece cílového místa bp 132-150 SEKV. ID. Č. 21

842-1198: 3'sousedící úsek bp 181-537 SEKV. ID. Č. 18

4.2.2. Identifikace sousedících úseků RF-BN1

Hraniční sousedící úseky RF-BN1 byly určeny pomocí „Vectorette-PCR“ (použití „Vectorette“ a „Subvectorette PCR“ pro izolaci DNA sousedící s transgenem - viz Maxine J. Allen, Andrew Collick a Alec J. Jeffreys, PCR Methods and Applications - 1994 (4) pages 71-75) s RF-BN1 genomovou DNA štěpenou HindlII jako templátem. „Vectorette“ linker byl vytvořen s použitím primerů MDB248 (SEKV. ID. Č. 3) a MDB249 (SEKV. ID. Č. 4) popsanými výše.

4.2.2.1. Pravý (5') sousedící úsek BN-RF1

Následující primery byly použity:

	Sekvence (5'->3')	Poloha v PTHW118
Vectorette primer MDB250	GCA. CTG.AGG.GCC.AAA.GCT.TGG.CTC (SEKV. ID. Č. 6)
Vectorette primer MDB254	CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (SEKV. ID. Č. 8)
T-DNA primer MDB251	GGA.TCC.CCC. GAT. GAG.CTA.AGC. TAG.C (SEKV. ID. Č. 7)	293 <-	317
T-DNA primer MDB193	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (SEKV. ID. Č. 23)	226 <-	243
T-DNA primer MDB258	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9)	224 <-	243
T-DNA primer MDB201	GCT.TGG.ACT.ATA.ΑΤΑ.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12)	143 <-	163

Tím byl získán 1077 bp fragment (SEKV. ID. Č. 24), ve kterém úsek 1 až 881 bp odpovídá rostlinné DNA a úsek 882 až 1077 bp odpovídá T-DNA z pTW 118.

4.2.2.2. Levý (3') sousedící úsek BN-RF1

Pro identifikaci 3' sousedícího úseku elitní událost BN-RF1, TAIL-PCR byla provedena jak bylo popsáno výše s použitím arbitrámě degenerovaného primeru a primerů lokalizovaných v T-DNA v blízkosti levé hranice.

Byly použity následující primery:

Arbitrámě degenerovaný primer:

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25)

-28CZ 306357 B6

Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T

T-DNA primery:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)

MDB3IS ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g (SEKV. ID. Č. 27)

MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg (SEKV. ID. Č. 28)

Byl získán fragment velikosti přibližně 2000 bp. Tento fragment byl klonován do vektoru pGem©-T vektor a použit jako templát pro další PCR reakci s použitím následujících primerů:

Primer pro rostlinnou DNA:

MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg (SEKV. ID. Č. 29)

T-DNA primer:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)

Takto byl získán fragment velikosti přibližně 1500 bp (SEKV. ID. Č. 30), kde úsek 1 až 166 bp odpovídá T-DNA z plazmidu pTWl 18 a úsek 167 až 1441 bp odpovídá rostlinné DNA.

4.2.2.3. Molekulární analýza delece cílového místa

Usek obsahující deleci cílového místa byl klonován pomocí TAIL-PCR (popsána výše) s použitím genomové DNA divokého typu a primerů specifických pro rostlinnou DNA v protisměru (upstream) od T-DNA inzertu směrem k inzertu:

Arbitrámě degenerovaný primer:

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25) kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T

Primeiy pro rostlinnou DNA:

MDB269

MDB283

MDB284 ggTTTTCggAggTCCgAgACg

CTTggACCCCTAggTAAATgC gTACAAAACTTggACCCCTAgg (SEKV. ID. Č. 31) (SEKV. ID. Č. 32) (SEKV. ID. Č. 33)

Byl získán fragment velikosti 1068 bp (SEKV. ID. Č. 34), ve kterém je:

53-83: 5'sousedící úsek

84-133: delece cílového místa

134-1055: 3' sousedící úsek

Po inzerci T-DNA bylo cílové místo velikosti 51 bp deletováno. Srovnáním sekvence lokusu divokého typu s lokusem R13 odhalilo přítomnost „výplňového“ úseku DNA ve spojovacím místě pravé hranici. „Výplňová“ sekvence TCTCG sekvence v pravé hranici sousedí se sekvencí TCA na 5' konci a sekvencí CGA na 3' konci. Tyto triplety byly také nalezeny na předělu delece cílového místa a T-DNA. Vyhledávání ve vzdálenějších rostlinných sekvencích odhalilo možný původ této „výplňové“ DNA. Sekvence TCA.TCTCG.CGA je také lokalizována v rostlinné DNA

-29CZ 306357 B6 na 3' konci delece cílového místa. Je to Jádrová“ sekvence dvou identických repetic velikosti 13 bp lokalizovaná 209 bp po směru (downstream) od předělu delece cílového místa.

Inzerční úsek pro RF-BN1 může být definován jako úsek obsahující levý sousedící úsek, deleci cílového místa a pravý sousedící úsek, a sice následovně:

1-881: 5' sousedící úsek (bp 1-881 SEKV. ID. Č. 24)

882-932: delece cílového místa (bp 84-133 SEKV. ID. Č. 34)

933-2207: 3’ sousedící úsek (bp 167-1441 SEKV. ID. Č. 30)

3. Genetická analýza lokusu

Genetická stabilita inzertů pro dvě události byla ověřována molekulární a fenotypovou analýzou v potomstvu rostlin po několik generací.

Analýzy metodou Southern blot rostlin generací To, Ti a T₂ byly srovnány pro obě události MSBN1 a RF-BN1. Bylo zjištěno, že získané profily byly identické pro každou z událostí v odlišných generacích. To dokazuje, že molekulární konfigurace transgenu v rostlinách obsahujících jak MS-BN1, tak i RF-BN1 je stabilní.

MS-BN1 a RF-BN1 události vykazují pro své odpovídající transgeny mendelovskou segregaci jako jediný genetický lokus v alespoň třech následných generacích, což ukazuje na to, že inzerty jsou stabilní.

Na základě výše popsaných výsledků byly MS-BN1 a MS-RF1 identifikovány jako elitní události.

4.4. Identifikace sousedících sekvencí událostí MS-BN1 a RF-BN1 u ozimé řepky olejky

Sousedící sekvence elitní události MS-BN1 a RF-BN1 u ozimé řepky olejky byly určeny s použitím primerů, které byly vyvinuty na základě sousedících sekvencí dané události u jarní řepky olejky.

Pravá (5') sousedící sekvence MS-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primerů lokalizovaného v MS-BN1 pravé hraniční rostlinné DNA:

VDS57: 5'-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3' (SEKV. ID. Č. 35)

To poskytlo fragment velikosti 909 bp (SEKV. ID. C. 36) se sekvenci v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 13 (počínajíc nukleotidem 98).

Levá (3') sousedící sekvence MS-BN 1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA příměrů (SEKV. ID. Č. 17) a primer lokalizovaného v MS-BN 1 levé hraniční rostlinné DNA:

HCA68: 5'-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3' (SEKV. ID. Č. 37)

To poskytlo fragment 522 bp (SEKV. ID. Č. 38) se sekvenci v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 18.

Pravá (5') sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA příměrů (SEKV. ID. Č. 12) a primerů lokalizovaného v RF-BN 1 pravé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 31). Tak vznikl fragment 694 bp (SEKV. ID. Č. 39) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 24 (nukleotidy 293 až 980).

-30CZ 306357 B6

Levá sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 26) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 levé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 29). Tak vznikl fragment 1450 bp, z něhož 1279 bp bylo sekvenováno (SEKV. ID. Č. 40). Bylo zjištěno, že tato sekvence je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 30 (nukleotidy 141 až 1421).

Tedy tím bylo potvrzeno, že pravá a levá sousedící sekvence elitní události MS-BN1 a RF-BN1 jsou v podstatě shodné pro jarní a ozimou řepku olejku.

Příklad 5

Vývoj diagnostických nástrojů pro kontrolu identity

Následující protokoly byly vyvinuty s cílem identifikovat jakýkoliv rostlinný materiál ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BN1.

5.1. MS-BN1 a RF-BN 1 Elitní událost restrikční mapa identifikace protokol

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BN1 mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu 4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétně s alespoň 4, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována s 3 942 bp HindlII fragmentem z plazmidu pTHWl 07. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 3 v Příkladu 4.1.1., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BN 1.

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost RF-BN1 mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu 4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV, HindlII 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWl 18. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 4 v příkladu 4.1.2., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost PF-BN1.

5.2. PCR identifikační protokol pro elitní události MS-BN1 a RF-BN1

Test protokolu, se všemi vhodnými kontrolami, musí být proveden ještě před screeningem neznámých vzorků. Předložený protokol by mohl vyžadovat optimalizaci složek, které se mohou obecně lišit mezi jednotlivými laboratořemi (příprava templátové DNA, Taq DNA polymeráza, kvalita primerů, dNTP, termocykler atd.).

Amplifíkace endogenní sekvence hraje v protokolu klíčovou roli. Je třeba dosáhnout takových podmínek PCR a cyklování teplot, aby se amplifikovaly v ekvimolámích množstvích endogenní a transgenní sekvence v templátu známé transgenní genomové DNA. Kdykoliv se cílový endogenní fragment neamplifikuje se stejnou intenzitou zjištěnou po elektroforéze na agarózovém gelu a obarvení ethidiumbromidem, optimalizace podmínek pro PCR je nezbytná.

5.2.1. Templátová DNA

Templátová DNA se připravuje z listových terčíků nebo jednoho semena postupem podle Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p.1349, 1991). Když se používá DNA připravená

-31 CZ 306357 B6 jinými metodami, měl by se nejdříve provést test protokolu s různými množstvími templátu. Obvykle 50 ng genomové DNA jako templát poskytuje nejlepší výsledky.

5.2.2. Přiděleni pozitivní a negativní kontroly

Následující pozitivní a negativní kontroly by měly být zařazeny v každém běhu PCR:

- „Master Mix“ kontrola (DNA negativní kontrola). To je PCR, ve které není přidána do reakce žádná DNA. Pokud nastane očekávaný výsledek, tj. žádné PCR produkty, znamená to, že připravená reakční směs (Master Mix) pro PCR není kontaminovaná cílovou DNA.

- DNA pozitivní kontrola (vzorek genomové DNA obsahující transgenní sekvence). Úspěšná amplifikace této pozitivní kontroly demonstruje, že PCR podmínky v daném běhu PCR byly takové, že umožnily amplifíkaci cílové sekvence.

- kontrola DNA divokého typu. Toto je PCR, ve které je jako templát genomová DNA připravená z netransgenní rostliny. Když nastane očekávaný výsledek, tedy žádná PCR amplifikace produktu z transgenu, avšak jen amplifikace endogenního PCR produktu, to znamená, že není detekovatelné pozadí transgenu při amplifíkaci samotné genomové DNA.

5.2.3. Primery

Následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvence MS-BN1 byly použity:

BNA01: 5'-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3' (SEKV. ID. Č. 12) (MDB201) (cíl: transgen)

BNA02: 5'-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3' (SEKV. ID. Č. 19) (VDS51) (cíl: rostlinná DNA)

Pro identifikaci rostlinného materiálu obsahujícího RF-BN1 byly užity následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvenci RF-BN1:

BNA03: 5'-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3' (SEKV. ID. Č. 23) (MDB193) (cíl: transgen)

BNA04: 5'-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3' (SEKV. ID. Č. 41) (MDB268) (cíl: rostlinná DNA)

Primery zacílené na endogenní sekvence jsou vždy přítomny v PCR koktejlu. Tyto primery slouží jako vnitřní kontrola u neznámých vzorků a v pozitivní kontrole. Pozitivní výsledek s dvojicí endogenních primerů demonstruje, že je v preparátu genomové DNA přítomen dostatek DNA v odpovídající kvalitě, aby mohl být generován PCR produkt. Endogenní primery byly:

BNA05: 5'-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3' (SEKV. ID. Č. 42)

BNA06: 5'-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3' (SEKV. ID. Č. 43)

5.2.4 Amplifikované fragmenty

Očekávané amplifikované fragmenty v PCR reakci jsou:

-32CZ 306357 B6

Pro dvojici primerů BNA05-BNA06:

Pro dvojici primerů BNA01-BNA02:

Pro dvojici primerů BNA03-BNA04:

394 bp (endogenní kontrola)

280 bp (MS-BN1 elitní událost)

215 bp (RF-BN1 elitní událost)

5.2.5. Podmínky PCR

PCR reakční směs obsahuje v 50 μΐ reakci:

μΐ templátová DNA μΐ lOx Amplifikační pufr (dodávaný s Taq polymerázou) μΐ lOmMdNTP μΐ BNA01 (MS-BN1) nebo BNA03 (RF-BN 1) (10 pmol/μΐ) μΐ BNA02 (RF-BN 1) nebo BNA04 (RF-BN 1) (10 pmol/μΐ)

0,5 μΐ BNA05 (10 pmol/μΐ)

0,5 μΐ BNA06 (10 pmol/μΐ)

0,2 μΐ Taq DNA polymeráza (5 jednotek/μΐ) voda do 50 μΐ

Teplotní profil pro dosažení optimálních výsledků je následující:

minuty v 95 °C

Pak následuje:

minuta v 95 °C minuta v 57 °C minuty v 72 °C v 5 cyklech

Pak následuje:

sekund v 92 °C sekund v 57 °C minuta v 72 °C ve 22 až 25 cyklech

Pak následuje: 5 minut v 72 °C

5.2.6. Analýza na agarózovém gelu

Vzorky PCR o objemu 10 a 20 μΐ se nanášejí na 1,5% agarózový gel (Tris-borátový pufr) společně s vhodným standardem molekulární hmotnosti (např. 100 bp „žebřík“ PHARMACIA).

5.2.7. Validace výsledků

Data získaná pro vzorky DNA transgenní rostliny v jednom běhu PCR run a jednom PCR koktejlu nelze akceptovat, dokud 1) DNA pozitivní kontrola nevykazuje očekávané PCR produkty (transgenní a endogenní fragmenty), 2) DNA negativní kontrola je negativní pro PCR amplifikaci

-33 CZ 306357 B6 (žádné fragmenty) a 3) DNA kontrola divokého typu vykazuje očekávaný výsledek (amplifikován endogenní fragment).

Dráhy ukazující viditelná množství transgenního a endogenního PCR produktu očekávané veli5 kosti, jsou indikací toho, že odpovídající rostlina, ze které byla genomová templátová DNA připravena, zdědila MS-BN1 a/nebo RF-BN1 elitní událost. Dráhy bez viditelného množství obou transgenních PCR produktů avšak s viditelným množstvím endogenního PCR produktu indikují, že odpovídající rostliny, ze kterých byla genomová templátová DNA připravena, neobsahují elitní událost. Dráhy bez viditelného množství endogenního a transgenních PCR produktu jsou 10 výsledkem toho, že kvalita a/nebo kvantita genomové DNA nebyla dostatečná pro vznik PCR produktu. Tyto rostliny nemohou být vyhodnoceny. Genomová DNA by měla být znovu připravena a měl by být proveden nový běh PCR s příslušnými vhodnými kontrolami.

5.2.8. Použití protokolu diskriminační PCR k identifikaci MS-BN1 a RF-BN1

Rostlinný materiál z listů ozimé řepky olejky obsahující buďto MS-BN1, RF-BN1, nebo jinou transgenní událost, byl testován podle výše popsaného protokolu. Vzorky z ozimé řepky olejky divokého typu byly použity jako negativní kontroly. Výsledky PCR analýz jsou ilustrovány na obrázku 4 a 5.

Obrázek 4 ilustruje výsledek získaný pomocí identifikačního protokolu PCR pro elitní událost MS-BN1 na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 280 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje MS-BN 1.

Obrázek 5 ilustruje výsledek získaný pomocí PCR identifikačního protokolu pro elitní událost RF-BN1 na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 215 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje RF-BN1.

Příklad 6

Produkce hybridních semen s použitím MS-BN1 a RF-BN1 v rostlinách ozimé řepky olejky

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující MS-BN1, které vykazovaly samčí sterilitu, byly kříženy 35 s rostlinami ozimé řepky olejky homozygotními v RF-BN1. Hybridní semena byla sebrána z MS-BN1 a uložena ve sbírce ATCC pod přístupovým číslem ATCC PTA-730.

Tato hybridní semena byla znovu vyseta na pole. Bylo zjištěno, že rostliny byly 100% fertilní a projevovaly současně optimální agronomické vlastnosti. Hybridní rostliny obsahovaly buďto 40 obě události MS-BN1 a RF-BN1, nebo jen RF-BN/1 samotnou.

Příklad 7

Vnesení MS-BN 1 a RF-BN1 do výhodného kultivaru ozimé řepky olejky

Elitní události MS-BN1 a RF-BN 1 byly opakovaným zpětným křížením rostlin obsahujících událost MS-BN 1 nebo RF-BN 1, v daném pořadí, přeneseny na řadu agronomicky významných kultivarů ozimé řepky olejky.

Bylo pozorováno, že introgrese elitní události do těchto kultivarů nijak významně neovlivnila žádné požadované fenotypové nebo agronomicky významné charakteristiky těchto kultivarů (žádná vazba), když exprese transgenu, která byla určována jako tolerance ke glufosinátu, dosáhla komerčně přijatelné úrovně. To potvrdilo status události MS-BN1 a RF-BN 1 jako elitních 55 událostí.

-34CZ 306357 B6

V připojených nárocích se užívá termín „rostlina“ tak, že zahrnuje i jakákoliv rostlinná pletiva, v jakémkoliv stadiu zralosti, a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z rostlin, včetně, aniž by však byl výčet omezující, semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů.

Semena obsahující elitní událost MS-BN1 a elitní událost RF-BN1 nebo elitní událost RF-BN 1 samotnou byla uložena v Americké sbírce mikroorganismů a tkáňových kultur ATCC pod přístupovým číslem: PTA-730.

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 43 < 170> Patentln Ver. 2.0 < 210> 1 < 211> 4946 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHW107 <220>

< 221> různé vlastnosti <222> (964)..(4906) < 223> Hind III fragment < 400> 1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

-35 CZ 306357 B6 atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt180 gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt300 agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg360 gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg420 cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg480 cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc540 cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg600 ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt780 gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc840 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag960 aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct

1020 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080 aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500 acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740

-36CZ 306357 B6

ctatacacaa aacaagtcag 1800	ataaatctct	ttctgggcct	gtcttcccaa	cctcctacat
cacttcccta tcggattgaa 1860	tgttttactt	gtaccttttc	cgttgcaatg	atattgatag
tatgtttgtg aaaactaata 1920	gggttaacaa	tcgaagtcat	ggaatatgga	tttggtccaa
gattttccga gagctttcta 1980	gtagaaagcc	catcaccaga	aatttactag	taaaataaat
caccaattag gtttcttatt 2040	atgtgccaaa	ttcaatataa	ttatagagga	tatttcaaat
gaaaacgtat gaatgttatt 2100	agtaaatggt	caggtaagac	attaaaaaaa	tcctacgtca
gatattcaac tttaaaaatt 2160	cgatcagtgt	ggaattgtac	aaaaatttgg	gatctactat
atatatataa tgctttacaa 2220	cacttggatt	tttttttgga	ggctggaatt	tttaatctac
atatttgttt tggccatgca 2280	ccaactcatt	gtttagtgta	atactttgat	tttgtcaaat
atatgtgttc gtgtatattt 2340	gtataagaat	ttctttgacc	atatacacac	acacatatat
atatatatat atatattata 2400	tatcatgcac	ttttaattga	aaaaataata	tatatatata
tagtgcattt tttctaacaa 2460	ccatatatgt	tgcgattgat	ctgcaaaaat	actgctagag
taatgaaaaa tataatctat 2520	tgctgaaatt	atctcagatg	ttaagatttt	cttaaagtaa
attctttcaa attttagcta 2580	aaagtcttgt	aataactaaa	gaataataca	caatctcgac
cacggaaaaa aaacacataa 2640	taaatttgaa	tttcgaccgc	ggtacccgga	attcgagctc
ggtacccggg gatcttcccg 2700	atctagtaac	atagatgaca	ccgcgcgcga	taatttatcc
tagtttgcgc gctatatttt 2760	gttttctatc	gcgtattaaa	tgtataattg	cgggactcta
atcataaaaa cccatctcat 2820	aaataacgtc	atgcattaca	tgttaattat	tacatgctta
acgtaattca acagaaatta 2880	tatgataatc	atcgcaagac	cggcaacagg	attcaatctt
aagaaacttt attgccaaat 2940	gtttgaacga	tctgcttcgg	atcctctaga	gccggaaagt
gaaattgacc gatcagagtt 3000	tgaagaaaaa	tttattacac	actttatgta	aagctgaaaa
aaacggcctc cgcaggaagc 3060	cgtttttttc	gttatctgat	ttttgtaaag	gtctgataat

-37CZ 306357 B6

ggtccgttgt 3120	tttgtaaatc	agccagtcgc	ttgagtaaag	aatccggtct	gaatttctga
agcctgatgt 3180	atagttaata	tccgcttcac	gccatgttcg	tccgcttttg	cccgggagtt
tgccttccct 3240	gtttgagaag	atgtctccgc	cgatgctttt	ccccggagcg	acgtctgcaa
ggttcccttt 3300	tgatgccacc	cagccgaggg	cttgtgcttc	tgattttgta	atgtaattat
caggtagctt 3360	atgatatgtc	tgaagataat	ccgcaacccc	gtcaaacgtg	ttgataaccg
gtaccatggt 3420	agctaatttc	tttaagtaaa	aactttgatt	tgagtgatga	tgttgtactg
ttacacttgc 3480	accacaaggg	catatataga	gcacaagaca	tacacaacaa	cttgcaaaac
taacttttgt 3540	tggagcattt	cgaggaaaat	ggggagtagc	aggctaatct	gagggtaaca
ttaaggtttc 3600	atgtattaat	ttgttgcaaa	catggactta	gtgtgaggaa	aaagtaccaa
aattttgtct 3660	caccctgatt	tcagttatgg	aaattacatt	atgaagctgt	gctagagaag
atgtttattc 3720	tagtccagcc	acccacctta	tgcaagtctg	cttttagctt	gattcaaaaa
ctgatttaat 3780	ttacattgct	aaatgtgcat	acttcgagcc	tatgtcgctt	taattcgagt
aggatgtata 3840	tattagtaca	taaaaaatca	tgtttgaatc	atctttcata	aagtgacaag
tcaattgtcc 3900	cttcttgttt	ggcactatat	tcaatctgtt	aatgcaaatt	atccagttat
acttagctag 3960	atatccaatt	ttgaataaaa	atagctcttg	attagtaaac	cggatagtga
caaagtcaca 4020	tatccatcaa	acttctggtg	ctcgtggcta	agttctgatc	gacatggggt
taaaatttaa 4080	attgggacac	ataaatagcc	tatttgtgca	aatctcccca	tcgaaaatga
cagattgtta 4140	catggaaaac	aaaaagtcct	ctgatagaag	tcgcaaagta	tcacaatttt
ctatcgagag 4200	atagattgaa	agaagtgcag	ggaagcggtt	aactggaaca	taacacaatg
tctaaattaa 4260	ttgcattcgc	taaccaaaaa	gtgtattact	ctctccggtc	cacaataagt
tattttttgg 4320	cccttttttt	atggtccaaa	ataagtgagt	tttttagatt	tcaaaaatga
tttaattatt 4380	tttttactac	agtgcccttg	gagtaaatgg	tgttggagta	tgtgttagaa

-38CZ 306357 B6 atgtttatgt gaagaaatag taaaggttaa tatgatcaat ttcattgcta tttaatgtta 4440 aaatgtgaat ttcttaatct gtgtgaaaac aaccaaaaaa tcacttattg tggaccggag 4500 aaagtatata aatatatatt tggaagcgac taaaaataaa cttttctcat attatacgaa 4560 cctaaaaaca gcatatggta gtttctaggg aatctaaatc actaaaatta ataaaagaag 4620 caacaagtat caatacatat gatttacacc gtcaaacacg aaattcgtaa atatttaata 4680 .

taataaagaa ttaatccaaa tagcctccca ccctataact taaactaaaa ataaccagcg 4740 aatgtatatt atatgcataa tttatatatt aaatgtgtat aatcatgtat aatcaatgta 4800 taatctatgt atatggttag aaaaagtaaa caattaatat agccggctat ttgtgtaaaa 4860 atccctaata taatcgcgac ggatccccgg gaattccggg gaagcttaga tccatggagc 4920 catttacaat tgaatatatc ctgccg 4946 <210> 2 <211> 4832 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHWl 18 io <220>

< 221> různé vlastnosti < 222> (1883)..(4065) <223> Hpal fragment <400>2 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

-39CZ 306357 B6

atatttattg	ataaaataac	aagtcaggta ttatagtcca	agcaaaaaca	taaatttatt	180
gatgcaagtt	taaattcaga	aatatttcaa taactgatta	tatcagctgg	tacattgccg	240
tagatgaaag	actgagtgcg	atattatgtg taatacataa	attgatgata	tagctagctt	300
agctcatcgg	gggatcctag	acgcgtgaga tcagatctcg	gtgacgggca	ggaccggacg	360
gggcggtacc	ggcaggctga	agtccagctg ccagaaaccc	acgtcatgcc	agttcccgtg	420
cttgaagccg	gccgcccgca	gcatgccgcg gggggcatat	ccgagcgcct	cgtgcatgcg	480
cacgctcggg	tcgttgggca	gcccgatgac agcgaccacg	ctcttgaagc	cctgtgcctc	540
cagggacttc	agcaggtggg	tgtagagcgt ggagcccagt	cccgtccgct	ggtggcgggg	600
ggagacgtac	acggtcgact	cggccgtcca gtcgtaggcg	ttgcgtgcct	tccaggggcc	660
cgcgtaggcg	atgccggcga	cctcgccgtc cacctcggcg	acgagccagg	gatagcgctc	720
ccgcagacgg	acgaggtcgt	ccgtccactc ctgcggttcc	tgcggctcgg	tacggaagtt	780
gaccgtgctt	gtctcgatgt	agtggttgac gatggtgcag	accgccggca	tgtccgcctc	840
ggtggcacgg	cggatgtcgg	ccgggcgtcg ttctgggtcc	attgttcttc	tttactcttt	900
gtgtgactga	ggtttggtct	agtgctttgg tcatctatat	ataatgataa	caacaatgag	960
aacaagcttt 1020	ggagtgatcg	gagggtctag gatacatgag	attcaagtgg	actaggatct
acaccgttgg 1080	attttgagtg	tggatatgtg tgaggttaat	tttacttggt	aacggccaca
aaggcctaag 1140	gagaggtgtt	gagaccctta tcggcttgaa	ccgctggaat	aatgccacgt
ggaagataat 1200	tccatgaatc	ttatcgttat ctatgagtga	aattgtgtga	tggtggagtg
gtgcttgctc 1260	attttacttg	cctggtggac ttggcccttt	ccttatgggg	aatttatatt
ttacttacta 1320	tagagctttc	ataccttttt tttaccttgg	atttagttaa	tatataatgg
tatgattcat 1380	gaataaaaat	gggaaatttt tgaatttgta	ctgctaaatg	cataagatta
ggtgaaactg 1440	tggaatatat	atttttttca tttaaaagca	aaatttgcct	tttactagaa
ttataaatat 1500	agaaaaatat	ataacattca aataaaaatg	aaaataagaa	ctttcaaaaa
acagaactat 1560	gtttaatgtg	taaagattag tcgcacatca	agtcatctgt	tacaatatgt
tacaacaagt 1620	cataagccca	acaaagttag cacgtctaaa	taaactaaag	agtccacgaa
aatattacaa 1680	atcataagcc	caacaaagtt attgatcaaa	aaaaaaaaac	gcccaacaaa
gctaaacaaa	gtccaaaaaa	aacttctcaa gtctccatct	tcctttatga	acattgaaaa

-40CZ 306357 B6

1740

ctatacacaa 1800	aacaagtcag	ataaatctct	ttctgggcct	gtcttcccaa	cctcctacat
cacttcccta 1860	tcggattgaa	tgttttactt	gtaccttttc	cgttgcaatg	atattgatag
tatgtttgtg 1920	aaaactaata	gggttaacaa	tcgaagtcat	ggaatatgga	tttggtccaa
gattttccga 1980	gagctttcta	gtagaaagcc	catcaccaga	aatttactag	taaaataaat
caccaattag 2040	gtttcttatt	atgtgccaaa	ttcaatataa	ttatagagga	tatttcaaat
gaaaacgtat 2100	gaatgttatt	agtaaatggt	caggtaagac	attaaaaaaa	tcctacgtca
gatattcaac 2160	tttaaaaatt	cgatcagtgt	ggaattgtac	aaaaatttgg	gatctactat
atatatataa 2220	tgctttacaa	cacttggatt	tttttttgga	ggctggaatt	tttaatctac
atatttgttt 2280	tggccatgca	ccaactcatt	gtttagtgta	atactttgat	tttgtcaaat
atatgtgttc 2340	gtgtatattt	gtataagaat	ttctttgacc	atatacacac	acacatatat
atatatatat 2400	atatattata	tatcatgcac	ttttaattga	aaaaataata	tatatatata
tagtgcattt 2460	tttctaacaa	ccatatatgt	tgcgattgat	ctgcaaaaat	actgctagag
taatgaaaaa 2520	tataatctat	tgctgaaatt	atctcagatg	ttaagatttt	cttaaagtaa
attctttcaa 2580	attttagcta	aaagtcttgt	aataactaaa	gaataataca	caatctcgac
cacggaaaaa 2640	aaacacataa	taaatttgaa	tttcgaccgc	ggtacccgga	attcgagctc
ggtacccggg 2700	gatcttcccg	atctagtaac	atagatgaca	ccgcgcgcga	taatttatcc
tagtttgcgc 2760	gctatatttt	gttttctatc	gcgtattaaa	tgtataattg	cgggactcta
atcataaaaa 2820	cccatctcat	aaataacgtc	atgcattaca	tgttaattat	tacatgctta
acgtaattca 2880	acagaaatta	tatgataatc	atcgcaagac	cggcaacagg	attcaatctt
aagaaacttt 2940	attgccaaat	gtttgaacga	tctgcttcgg	atcctctaga	ccaagcttgc
gggtttgtgt 3000	ttccatattg	ttcatctccc	attgatcgta	ttaagaaagt	atgatggtga
tgtcgcagcc	ttccgctttc	gcttcacgga	aaacctgaag	cacactctcg	gcgccatttt

-41 CZ 306357 B6

3060

cagtcagctg 3120	cttgctttgt	tcaaactgcc	tccattccaa	aacgagcggg	tactccaccc
atccggtcag 3180	acaatcccat	aaagcgtcca	ggttttcacc	gtagtattcc	ggaagggcaa
gctccttttt 3240	caatgtctgg	tggaggtcgc	tgatacttct	gatttgttcc	ccgttaatga
ctgctttttt 3300	catcggtagc	taatttcttt	aagtaaaaac	tttgatttga	gtgatgatgt
tgtactgtta 3360	cacttgcacc	acaagggcat	atatagagca	caagacatac	acaacaactt
gcaaaactaa 3420	cttttgttgg	agcatttcga	ggaaaatggg	gagtagcagg	ctaatctgag
ggtaacatta 3480	aggtttcatg	tattaatttg	ttgcaaacat	ggacttagtg	tgaggaaaaa
gtaccaaaat 3540	tttgtctcac	cctgatttca	gttatggaaa	ttacattatg	aagctgtgct
agagaagatg 3600	tttattctag	tccagccacc	caccttatgc	aagtctgctt	ttagcttgat
tcaaaaactg 3660	atttaattta	cattgctaaa	tgtgcatact	tcgagcctat	gtcgctttaa
ttcgagtagg 3720	atgtatatat	tagtacataa	aaaatcatgt	ttgaatcatc	tttcataaag
tgacaagtca 3780	attgtccctt	cttgtttggc	actatattca	atctgttaat	gcaaattatc
cagttatact 3840	tagctagata	tccaattttg	aataaaaata	gctcttgatt	agtaaaccgg
atagtgacaa 3900	agtcacatat	ccatcaaact	tctggtgctc	gtggctaagt	tctgatcgac
atggggttaa 3960	aatttaaatt	gggacacata	aatagcctat	ttgtgcaaat	ctccccatcg
aaaatgacag 4020	attgttacat	ggaaaacaaa	aagtcctctg	atagaagtcg	caaagtatca
caattttcta 4080	tcgagagata	gattgaaaga	agtgcaggga	agcggttaac	tggaacataa
cacaatgtct 4140	aaattaattg	cattcgctaa	ccaaaaagtg	tattactctc	tccggtccac
aataagttat 4200	tttttggccc	tttttttatg	gtccaaaata	agtgagtttt	ttagatttca
aaaatgattt 4260	aattattttt	ttactacagt	gcccttggag	taaatggtgt	tggagtatgt
gttagaaatg 4320	tttatgtgaa	gaaatagtaa	aggttaatat	gatcaatttc	attgctattt
aatgttaaaa	tgtgaatttc	ttaatctgtg	tgaaaacacc	aaaaaatcac	ttattgtgga

- 4? CZ 306357 B6

4380

ccggagaaag 4440	tatataaata	tatatttgga	agcgactaaa	aataaacttt	tctcatatta
tacgaaccta 4500	aaaacagcat	atggtagttt	ctagggaatc	taaatcacta	aaattaataa
aagaagcaac 4560	aagtatcaat	acatatgatt	tacaccgtca	aacacgaaat	tegtaaatat
ttaatataat 4620	aaagaattaa	tccaaatagc	ctcccaccct	atkaettaaa	ctaaaaataa
ccagcgaatg 4680	tatattatat	gcataattta	tatattaaat	gtgtataatc	atgtataatc
aatgtataat 4740	ctatgtatat	ggttagaaaa	agtaaacaat	taatatagee	ggctatttgt
gtaaaaatcc 4800	ctaatataat	cgcgacggat	ccccgggaat	tccggggaag	cttagatcca
tggagccatt 4832	tacaattgaa	tatatcctgc	eg

<210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 248 <400> 3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 <210>4 <211> 60 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 249 <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60 <400> 5 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence

-43 CZ 306357 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 247 <400> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26 <210> 6 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24 <210>7 <211> 25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 251 <400> 7 ggatcccccg atgagctaag ctagc 25 <210>8 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g 21 <210>9 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 258

-44CZ 306357 B6 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg 20 <210> 10 <211> 23 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer SP6 < 400> 10 taatacgact cactataggg cga 23 <210> 11 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac 22 <210> 12 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c 21 <210> 13 <211> 953 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1 <220>

< 221> různé vlastnosti

-45 CZ 306357 B6 <222> (1)..(24) <223> pGEM®-T <400> 13 cccngccgcc atggccgcgg gattcttagc ctgggtcagg gcatgcatgg tgtgatccaa60 agactttctc ggcccaaata ctaatcatca caagtcatgc atgatctgct cgggatggcc120 aagaaaaatc gaacccatga caatattcac agttgtaagt tttttaccag tagacaaata180 ccacttggtt taacatattg taaacttaat atatagaaga tgttcctatt cagaaaataa240 tatatgtata tatataaaat tttattggcg actcgaggat gcacagaaat ataaaatgtt300 ggtcgcttag accatctcca atgtatttct ctatttttac ctctaaaata aaggagctct360 ataatagagg tgggttttgc tccaatgtat ttctttaaaa tagagatctc tacatataga420 gcaaaatata gaggaatgtt atttcttcct ctataaatag aggagaaaat agcaatctct480 attttagagg caaaaataga gatbsgttgg agtgattttg cctctaaatg ctattataga540 ggtagaaata gaggtgggtt ggagatgctc ttactatttt catagtaggt gaaaacttga600 aactagaaag ctttggagtg tacgagtgga aaacctctct ttgtagaaac atacacatgc660 catttagtta actagttgac atagattttt gagtcagata actttaagaa tatatatgtt720 tggatgagag tttgacactt tgagccactc gaaggacaaa ttttaaaaac ttgtgggatg780 ctgtggccat aaaccttgag gacvstttga tcatattcta ttaactacag tacgaatatg840 attcgacctt tgcaattttc tcttcaggta ctcggccgtc gaactcggcc gtcgagtaca900 tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg ttaattccca tcttgaaaga aat953 <210> 14 <211> 16 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 611 <400> 14 ngtcgaswgt ntwcaa <210> 15 <211> 22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 259

-46CZ 306357 B6 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg 22 < 210> 16 <211>22 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer 260 ίο < 400> 16 cctttggagt aaatggtgtt gg 22 < 210> 17 <211>20 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer 24 < 400> 17 gcgaatgtat attatatgca 2C < 210> 18 <2U>537 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>

< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 <400> 18

gcgaatgtat	attatatgca	taatttatat	attaaatgtg	tataatcatg	tataatcaat	60
gtataatcta	tgtatatggt	tagaaaaagt	aaacaattaa	tatagccggc	tatttgtgta	120
aaaatcccta	atataatcga	cggatccccg	ggaattccgg	gggaagctta	gatccatgga	180
tttgttatga	taaccaaaaa	caccctcctt	tttattataa	aggtagggat	agctaatctg	240
ttattcggtt	ttgattagag	atattaatcc	cgttttatca	agtacagttt	gatgtatttt	300
tttgttcgtt	ttcattacaa	tccaagacaa	gttaggttta	ttacatttta	ccaaaaaaaa	360
aggtttggtt	tattgtgaac	attgctgcgg	tttatttaaa	tttgattcta	ttcaaaggtc	420
aatccgtatt	taacaagtaa	actagtcttt	atataatctt	aaatctaacg	atctttgatt	480
tttaaattgc	atttanctat	gtcctctctg	gcgtatatgg	tctctttgaa	aacactc	537

-47CZ 306357 B6 < 210> 19 < 211> 19 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 51 <400> 19 tgacactttg agccactcg 19 <210> 20 <211>20 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer 48 < 400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 < 210> 21 <211>178 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci inzerěního místa MS-BN1 <400>21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc178 <210> 22 <211> 1198 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: inzerční úsek MS-BN1

-48CZ 306357 B6 <400> 22 catggtgtga tccaaagact ttctcggccc aaatactaat catcacaagt catgcatgat60 ctgctcggga tggccaagaa aaatcgaacc catgacaata ttcacagttg taagtttttt120 accagtagac aaataccact tggtttaaca tattgtaaac ttaatatata gaagatgttc180 ctattcagaa aataatatat gtatatatat aaaattttat tggcgactcg aggatgcaca240 gaaatataaa atgttggtcg cttagaccat ctccaatgta tttctctatt tttacctcta300 aaataaagga gctctataat agaggtgggt tttgctccaa tgtatttctt taaaatagag360 atctctacat atagagcaaa atatagagga atgttatttc ttcctctata aatagaggag420 aaaatagcaa tctctatttt agaggcaaaa atagagatbs gttggagtga ttttgcctct480 aaatgctatt atagaggtag aaatagaggt gggttggaga tgctcttact attttcatag540 taggtgaaaa cttgaaacta gaaagctttg gagtgtacga gtggaaaacc tctctttgta600 gaaacataca catgccattt agttaactag ttgacataga tttttgagtc agataacttt660 aagaatatat atgtttggat gagagtttga cactttgagc cactcgaagg acaaatttta720 aaaacttgtg ggatgctgtg gccataaacc ttgaggacvs tttgatcata ttctattaac780 tacagtacga atatgattcg acctttgcaa ttttctcttc aggttttcta attcatatgg840 atttgttatg ataaccaaaa acaccctcct ttttattata aaggtaggga tagctaatct900 gttattcggt tttgattaga gatattaatc ccgttttatc aagtacagtt tgatgtattt960 ttttgttcgt tttcattaca atccaagaca agttaggttt attacatttt accaaaaaaa

1020 aaggtttggt ttattgtgaa cattgctgcg gtttatttaa atttgattct attcaaaggt 1080 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatctttgat 1140 ttttaaattg catttancta tgtcctctct ggcgtatatg gtctctttga aaacactc 1198 <210>23 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

io <223> Popis umělé sekvence: primer 193 <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc <210>24

-49CZ 306357 B6 <211>1077 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1)..(45) <223> pGEM®-T <220>

<221 > různé vlastnosti <222> (1061).. (1077) <223> pGEM®-T <400> 24 gagctctccc atatggtcga cctgcaggcg gccgcactag tgattcttag cctgggtcag60 ggcatggcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt cctgtttaaa gtgttaaaat120 cattttctga tggaactaaa tccagtttta agagtaactg acaagtacaa ttaagcacaa180 caatataata gtagtaattg gcatctttga ttgttaaata tcaaaacagt aaagttacaa240 aaaaaaatac caaaccaata atgaagactt ggcggagaca gtgccgtgcg aaggttttcg300 gaggtccgag acgagttcaa aaatacattt tacataatat atttttcata tatatatata360 tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct tcaccaaaat420 tttataaact aaatttttaa atcatgaaca aaaagtatga atttgtaata taaatacaaa480 gatacaaatt tttgattgaa atattggtag ctgtcaaaaa agtaaatctt agaatttaaa540 ttaactatag taaactatat attgaaaata ttataaattt ttatcaaatt ctcataaata600 tataaaataa atctaactca tagcatataa aaagaagact aatgtggatc aaaatattta660 cagtttttta gaagtagaat ctttatagtt ttatttaaaa tatagcaaaa atgatcacaa720 acctagttay ttaaggagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaat ctatctaaaa780 aaatatgtta actaccatgc aaaagtattt tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta840 caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt900 agatgttaat tcccatcttg aaagaaatat agtttaaata tttattgata aaataacaag960 tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa attcagaaat

1020 atttcaataa ctgattatat cagctggtac atcgccgtag aatcccgcgc catggcg 1077

-50CZ 306357 B6 <210> 25 <211> 16 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 <211>25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg 25 <210> 28 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 316 <400> 28 ccgataggga agtgatgtag gagg 24 <210> 29 <211> 21

-51 CZ 306357 Β6 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 288 <400> 29 atgcagcaag aagcttggag g <210> 30 <211> 1501 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN 1 <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1)..(16) <223> pGEM®-T <220>

<221 > různé vlastnosti <222> (1458).. (1501) <223> pGEM®-T <400> 30

ccatggccgc	gggattgtag	gaggttggga agacaggccc agaaagagat	ttatctgact	60
cgttttgtgt	atagttttca	atgttcataa	aggaagatgg	agacttgaga	agtttttttt	120
ggactttgtt	tagctttgtt	gggcgttttt	tttttttgat	caataacttt	gttgggctta	180
tggtcgataa	gcgtgcgcat	gtctgatggt	acatgctaaa	tgctatattt	ctgtttaaag	240
tgttaaaatc	attttctgat	ggaactaaat	ccagttttaa	gagtaactga	caagtacaat	300
taagcacaac	aataaaatag	tagtaattgg	catctttgat	tgttaaatat	caaaacaata	360
aagttacaaa	aaaaaatacc	aaaccaataa	tgaagacttg	gcggagacag	tgccgtgcga	420
aggttttcgg	aggtccgaga	cgagttcaaa	aatacatttt	acataatata	tttttcatat	480
atatatatat	atataacatt	caaaagtttg	aattattaca	taaacgtttt	ctaaattttc	540
ttcaccaaaa	ttttataaac	taaaattttt	maatcatgaa	caaaaagtat	gaatttgtaa	600
tataaatacm	aagatacaaa	tttttgattg	aaatattggt	agctgtcaaa	aaagtaaatc	660
ttagaattta	aattaactat	agtaaactat	atatggaaaa	tattataaat	ttttatcaaa	720

ttctcataaa tatataaaat aaatctaact catagcatat aaaaagaaga ctaatgtgga 780 tcaaratatt tacagttttt tagaagtaga atctctatag ttttatttaa aatatagcaa 840 aaatgatcac aaacctagtt actttaacca gaagtccaat tcaaaatcaa ataaaaataa 900 aaatctatct aaaaaaatat gttaactacc atgcaaaagt attttttttt gtaattagaa 960 accctgaaat ttgtacaaaa cttggacccc taggtaaatt ccctagaaag tatcctatta 1020 gcgtcgacaa actgttgctc atatttttct ctccttactt tatatcatac actaatatan 1080 gnagatgatc taattaatta ttcatttcca tgctagctaa ttcaagaaaa agaaaaaaaa 1140 ctattatcta aacttatatt cgagcaacac ctcggagata acaggatata tgtcattaat 1200 gaatgcttga actcatctcg cgaactcatc tcgcatcgct tatagccaca aagatccaac 1260 ccctctcttc aatcatatat cagtagtaca atacaaatag atattgtgag cacatatgcc 1320 gtctagtact gatgtgtaca tgtagaggag ccgcaaatgt ttagtcactc caacaaatga 1380 gcatgaccac gcatcttctg atgatgtaca gccgtccctt ttgctctctc aaatatcctc 1440 caagcttctt gctgcataaa tcactagtgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1500

150 <210> 31 < 211> 21 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer 269 <400>31 ggttttcgga ggtccgagac g < 210> 32 < 211> 21 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer 283

-53 CZ 306357 B6 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c 21 <210> 33 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 284 <400> 33 gtacaaaact tggaccccta gg 22 <210> 34 <211> 1068 <212> DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci cílového místa RF-BN1 < 400> 34 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca300 acacctcgga gataacagga tatatgttat taatgaatgc ttgaactcat ctcgcgaact360 catctcgcat cgcttatagc cacaaagatc caacccctct cttcaatcat atatcagtag420 tacaatacaa atagatattg tgagcacata tgccgtctag tactgatgtg tatatgtaga480 gganngcaaa tgtttagtca ctccaacaaa tgagcatgac nacgcatctt ctgatgatgt540 acagccgtcc cttttgctct ctcaaatatc ctccaagctt cttgctgcat ggaatcttct600 tcttggtgtc tttcatgata acaaaatcta acgagagaga aacccttagt caagaaaaaa660 caaataaaac tctaacgaga gtgtgtgaga aagtagagag tatgtgtgag tgacggagag720 aaagtgagac cataaagatg ttgtgcaaag agagcaagac ttaacctata tatactcaca780 tacacgtaca catcataccc attanagata ataaaaagga aaaaggaaca actaacaagg840 gaactgtatc ccatacttta tctcatcata catgatgcat aatatattct ttcgtatatc900

- 54CZ 306357 B6 aagaaaaatg agcctgatat ttttttattt ttagagatag tgccatgtca aatttctaag 1020 caaccccacg cgcattgtgt tcatttctct 1068 cgaaactaaa agagtgtcta tttctctctc 960 aagtagcaag atttacaaag gaatctaaag cgaccatccc gcggccat <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211> 909 < 212> DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky < 400> 36 tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta60 agttttttac cagtagacaa ataccacttg gtttaacata ttgtaaactt aatatataga120 agatgttcct attcagaaaa taatatatgt atatatataa aattttattg gcgactcgag180 gatgcacaga aatataaaat gttggtcgct tagaccatct ccaatgtatt tctctatttt240 tacctctaaa ataaaggaac tctataatag aggtgggttt tactccaatg tatttcttta300 aaatagagat ctctacatat agagcaaaat atagaggaat gttatttctt cctctataaa360 tagaggagaa aatagcaatc tctattttag aggcaaaaat agagatgggt tggagtgatt420 ttgcctctaa atgctattat agaggtagaa atagaggtgg gttggagatg ctcttactat480 tttcatagta ggtgaaaact tgaaactaga aagctttgga gtgtacgagt ggaaaacctc540 tctttgtaga aacatacaca tgccatttag ttaactagtt gacatagatt tttgagtcag600 ataactttaa gaatatatat gtttggatga gagtttgaca ctttgagcca ctcgaaggac660 aaattttaaa aacttgtggg atgctgtggc ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat720 tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca gtactcggcc780 gtcgaactcg gccgtcgagt acatggtcga taagaaaagg caatttgtag atgttaattc840

-55CZ 306357 B6 ccatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattggataa aataacaagt caggtattat 900 agtccaagc 909 <210> 37 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 68 <400> 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 <211> 522 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 38 gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat60 gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta120 aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga180 tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg240 ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt300 tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa360 aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt420 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga480 tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg522 <210> 39 <211> 694 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct120 tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat180 ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct240 tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat300 tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat360 caaaatattt acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa420 aatgatcaca aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa480 aatctatcta aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa540 ccctgaaatt tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag600 aaaaggcaat ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt660 gataaaataa caagtcaggt attatagtcc aagc694 <210> 40 <211> 1279 <212>DNA <213> Umělá sekvence ίο <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 40 gggggttttt ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtcgataag cgtgcgcatg60 tctgatggta catgctaaat gctatatttc tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg120 gaactaaatc cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt180 agtaattggc atctttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac240 ccaataatga agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg tccgagacga300 gttcaaaaat acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa360 aagtttgaat tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa420 aatttttaaa tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt480 ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt540 aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa600 tctaactcat agcatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag660

- 57 CZ 306357 B6 aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact720 ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt780 aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt840 ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata900 tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc960 atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg

1020 agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080 aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140 gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200 tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210>41 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>

< 223> Popis umělé sekvence: primer BNA05 < 400> 42 aacgagtgtc agctagacca gc <210> 43 <211>22 <212>DNA

-58CZ 306357 B6 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer BNA06 <400> 43 cgcagttctg tgaacatcga cc

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, přiěemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
2. 2. Rostlina, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 215 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. C. 23 a SEKV. ID. C. 41.
3. 3. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 1, dále obsahující elitní událost MS-BN 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
4. 4. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 3, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 280 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
5. 5. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, které mohou být získány křížením rostliny s rostlinou ozimé řepky olejky získanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
6. 6. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde se jedná o hybridní rostlinu, semena nebo hybridní rostlinné buňky nebo pletiva.
7. 7. Rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, rostlinné buňky nebo pletivo, obsahující elitní událost MS-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, přičemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
8. 8. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 7, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 280 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
9. 9. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv, obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím

   -59CZ 306357 B6 polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu velikosti 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
11. 11. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 1, další rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 18, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
12. 12. Souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že primer rozpoznávající cizorodou DNA sekvenci MS-BN1 rozpoznává cizorodou sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo v SEKV. ID.Č. 18.
13. 13. Souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje PCR primery obsahující nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
14. 14. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv obsahujících elitní událost RF-BN 1, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID.Č. 41.
15. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
16. 16. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN 1, vyznačující se tím, že souprava obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2 a další rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
17. 17. Souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že primer rozpoznávající cizorodou DNA sekvenci RF—BN 1 rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF—BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
18. 18. Souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že PCR primery obsahují nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
19. 19. Souprava pro identifikaci elitní události MS-BN1 v biologických vzorcích, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID.Č. 18.
20. 20. Souprava podle nároku 19, vyznačující se tím, že PCR primer nebo sonda rozpoznávající 5' sousedící sekvenci MS-BN1 obsahuje sekvenci SEKV. ID. C. 19.

    -60CZ 306357 B6
21. 21. Souprava podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává cizorodou DNA sekvenci MS-BN 1 v sekvenci SEKV. ID.Č. 1.
22. 22. Souprava podle nároku 21, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda rozpoznává cizorodou DNA sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 18.
23. 23. Souprava podle nároku 21, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 12.
24. 24. Způsob pro potvrzení čistoty osiva, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro MS-BN1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. C. 18, ve vzorcích semen.
25. 25. Způsob screeningu osiva na přítomnost MS-BN1, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro MS-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 18, ve vzorcích šarže osiva.
26. 26. Souprava pro identifikaci elitní události RF-BN1 v biologických vzorcích, vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
27. 27. Souprava podle nároku 26, vyznačující se tím, že PCR primer nebo sonda rozpoznávající sekvenci 5' sousedící sekvenci RF-BN 1 obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 41.
28. 28. Souprava podle nároku 26 nebo 27, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2.
29. 29. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že druhý primer nebo sonda rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
30. 30. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 23.
31. 31. Způsob potvrzení čistoty osiva, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro RF-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící úsek RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící úsek RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, ve vzorcích semen.
32. 32. Způsob screeningu osiva na přítomnost RF-BN 1, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro RF-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící úsek RF-BN1 obsažený v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící úsek RF-BN 1 obsažený v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, ve vzorcích šarže osiva.