MXPA99008098A - Metodo de produccion de semillas hibridas utilizando esterilidad hembra condicional - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para la producción de semillas híbridas, el cual comprende producir una planta femenina estéril condicional que comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina, interplantar la planta femenina estéril condicional con una planta masculina estéril, aplicar la protoxina a la planta femenina estéril condicional, y producir semillas híbridas. Se impide la formación de semillas viables en la planta femenina estéril condicional como un resultado de la conversión de la protoxina a la toxina en las estructuras reproductoras femeninas, y se impide la producción de polen en la planta masculina estéril, permitiendo de esta manera interplantar a las dos progenitoras de la cruza híbrida con el objeto de proporcionar una transferencia de polen más eficiente. También se proporcionan casetes de expresiónútiles en la invención, plantas transformadas con el casete de expresión, y promotores preferenciales femeninas novedosos.

Description

ESTERILIDAD HEMBRA CONDICIONAL ár í Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos de Norteamérica Número 60/039,527, presentada el 3 de marzo de 1997. í P I CAMPO DE LA INVENCIÓN 10 La presente invención se refiere a la producción de semillas híbridas en plantas. En particular, la invención se refiere a un método de producción de semillas híbridas utilizando como un progenitor del híbrido, una planta transformada con un i* gen quimérico que, cuando se expresa en las estructuras reproductoras femeninas, produce una proteína que cataliza la conversión de una protoxina exógenamente aplicada a una toxina, haciendo de esta manera que la fertilización sea inefectiva. En la invención también se incluye el uso de las plantas fememinas estériles condicionales en combinación con plantas masculinas f 20 estériles condicionales para producir de una manera más eficiente semillas híbridas, genes quiméricos útiles para la invención, plantas transgénicas que comprenden a los genes quiméricos, y promotores novedosos útiles para su expresión en las estructuras reproductoras femeninas de una planta. 4 25 & ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN * La heterosis en las plantas de cultivo ha recibido una atención considerable debido a su notorio efecto sobre la mejora del rendimiento. La mayor productividad sobre la cruza de 5 diferentes cepas de maíz se observó primero a finales del Siglo XIX, y luego se desarrolló de acuerdo con los procedimientos i genéticos sistemáticos. El método usual para reproducir maíz híbrido es establecer muchas líneas endógamas, hacer intercruzas, y determinar cuáles híbridos son más productivos en una localidad dada . El éxito del maíz híbrido motivó a los reproductores de plantas para explorar la existencia y magnitud del vigor híbrido # en muchas otras especies con importancia económica. En general, los híbridos exhiben mayores rendimientos en comparación con las variedades no híbridas. Los híbridos normalmente son más eficientes en el uso de los factores de crecimiento, y dan un f mayor retorno por unidad para los factores de crecimiento, tales como agua y fertilizante. Ba o tensión, los híbridos son en general superiores a los cultivos progenitores, con un desempeño más estable sobre un amplio rango de medios ambientes. Con los híbridos, hay uniformidad en el producto y madurez que con t frecuencia facilita la cosecha e incrementa el valor del producto en el mercado . El híbrido también puede combinar caracteres que son difíciles o imposibles de combinar de otras maneras. Esto es particularmente cierto con muchos híbridos interespecíficos e intergenéricos. La conclusión general de la investigación es que el vigor híbrido, un fenómeno común en las plantas, es de suficiente magnitud para garantizar la explotación comercial si se pueden idear técnicas apropiadas . El vigor híbrido se ha reconocido como un fenómeno ampliamente extendido en las plantas y en los animales durante muchos años. Los híbridos comerciales se utilizan ahora extensamente en muchos cultivos, incluyendo maíz, sorgo, remolacha azucarera, y girasol. Otros cultivos de gran acreaje, tales como trigo, cebada, y arroz, todavía se cultivan primariamente como variedades endógamas . Se está conduciendo investigación sobre éstos y otros cultivos, que pueda permitir el uso ampliamente extendido de híbridos comerciales en el futuro, pero el factor limitante primario en el nuevo desarrollo de cultivos híbridos, es la falta de métodos de producción económicos de semillas híbridas en estos cultivos. Tradicionalmente, la producción de semillas híbridas a gran escala se realiza plantando filas o bloques separados de líneas progenitoras femeninas y líneas progenitoras masculinas para polinizarlas. Solamente las semillas producidas en las filas progenitoras femeninas son las que se cosechan. Para asegurar que estas semillas sean semillas híbridas no contaminadas con semillas auto-cruzadas, se deben implementar métodos de control de polinización sobre las plantas progenitoras femeninas, para asegurar que las semillas formadas en ellas resulten de la polinización cruzada y no de la auto-polinización. Los mecanismos de control de polinización conocidos son en general mecánicos, i? químicos, o genéticos. La eliminación del polen fértil de la progenitora 5 femenina se puede lograr mediante emasculación manual en algunas especies tales como maíz, una especie monoecia. Esta eliminación 1 del polen fértil se logra jalando o cortando la inflorescencia masculina (borla) de las plantas en la población progenitora femenina. Este simple procedimiento impide la auto-fertilización, desborlando mecánicamente las plantas femeninas antes de que se aloje el polen para prevenir la auto-cruza. Sin embargo, la mayoría de las plantas de cultivo de interés mayores tienen órganos masculinos y femeninos funcionales adentro de la misma flor, haciendo impráctica la emasculación. Inclusive donde es práctica, esta forma de producción de semillas híbridas es extremadamente intensa en mano de obra, y por consiguiente costosa. Para eliminar el laborioso desborlamiento que es 1 ,1 necesario para impedir la auto-fertilización en las cruzas híbridas, se han utilizado factores genéticos que producen esterilidad masculina en algunas especies. La esterilidad masculina en el progenitor femenino se puede controlar mediante genes nucleares, o mediante un sistema genético citoplásmico. La esterilidad masculina genético se controla mediante genes nucleares, en donde los alelos para la esterilidad generalmente son recesivos para los alelos de la fertilidad. La esterilidad masculina genética se presenta en muchas especies. Normalmente se controla mediante un solo gen recesivo que debe ser homocigato para ocasionar la esterilidad masculina. Los reproductores que utilizan esterilidad masculina I 5 genética para la producción de semillas híbridas normalmente desarrollan una línea femenina enotípicamente uniforme que i segrega el 50 por ciento de individuos masculinos estériles y el -i *- 50 por ciento de individuos masculinos fértiles. Las semillas l -4 para estas líneas se incrementan en aislamiento mediante la H 10 cosecha de las semillas de las plantas homocigotas para el gen de r la esterilidad masculina que son polinizadas por las plantas heterocigotas para el gen de la esterilidad masculina, y por Bf consiguiente, masculino fértiles. Para producir semillas híbridas '3 comerciales con esterilidad masculina genética, se deben separar el 50 por ciento de las plantas femeninas, masculinas-fértiles, del campo, tan pronto como se pueda identificar su fertilidad. El trabajo asociado con la separación de las plantas fértiles de las , plantas femeninas se ha restringido mucho al uso de esterilidad masculina genética en la producción de semillas híbridas. Existen varios problemas asociados con este sistema para producir semillas híbridas comerciales. Primero, no es posible eliminar las plantas fértiles de las plantas masculinas estériles deseadas en la población femenina. Las plantas masculinas estériles genéticas se deben mantener copulándolas con individuos masculinos fértiles. La mitad de las plantas Fx de esta cruza # serían estériles, pero las plantas restantes serían fértiles. Por consiguiente, las plantas masculinas fértiles indeseadas en la Tí población femenina pueden diseminar el polen y reducir la efectividad del progenitor masculino deseado. ,i t 5 El uso exitoso de la esterilidad masculina citoplásmica para la producción de semillas híbridas comerciales requiere de un citoplasma masculino estéril estable, una fuente de polen adecuada, y un sistema efectivo para hacer que el polen pase desde el progenitor masculino hasta la progenitora masculina- 10 estéril. También, el sistema genético citoplásmico de esterilidad masculina requiere de tres líneas para producir un solo híbrido cruzado; la línea A (masculina estéril) , la línea B (mantenedor masculina fértil) , y la línea R (masculina fértil con genes restauradores) . Las cruzas de tres vías producidas con esterilidad masculina genética citoplásmica involucraron el mantenimiento y la producción de cuatro líneas, una línea A y B de un endógamo, y endógamos masculinos fértiles de las otras dos. Además, el marchitamiento de maíz del sur ocasionado por Helminthosporium maydis, Raza T, que atacaba severamente a todos los híbridos de maíz con citoplasma T masculino estéril citoplásmico, demostró la vulnerabilidad de una industria de producción de semillas híbridas basada en una sola fuente de citoplasma masculino estéril. Para el maíz híbrido, la mayoría de los productores de semillas han regresado a la emasculación manual o mecánica y a la polinización por el viento.

% También se pueden producir semillas híbridas mediante ? la utilización de productos químicos que bloqueen o aniquilen la *t formación de polen viable. Estos productos químicos, denominados gametocidas, se utilizan para impartir una esterilidad masculina 5 transitoria. Sin embargo, el gasto y la disponibilidad de los productos químicos, y la confiabilidad de las aplicaciones, limitan la producción de semillas híbridas a través del uso de gametocidas . También se han descrito métodos moleculares para la producción de semillas híbridas. Estos métodos transforman las plantas con construcciones que contienen ADN anti-sentido y otros genes que son capaces de controlar la producción del polen fértil í en las plantas . Estas plantas regeneradas son funcionalmente masculinas-estériles, y se utilizan para la producción de semillas híbridas mediante su cruza con polen de plantas i masculinas fértiles. Las deficiencias primarias de estos planteamientos surgen del hecho de que el gen de esterilidad masculina genéticamente diseñado, ya sea un anti-sentido o ARNsa, ! solamente se puede mantener en un estado heterocigótico. Son fundamentalmente iguales como masculinas estériles genéticos naturales, en que se deben mantener mediante la cruza con líneas masculinas fértiles isogénicas. Esto es más problemático en el campo de cruza híbrida, en donde el aereaje es grande y el rendimiento es crítico. El progenitor femenino heterocigótico, del cual solamente el 50 por ciento será masculino estéril, se i debe plantar en filas en seguida del progenitor masculino donador de polen, y se remueven el 50 por ciento de las progenitoras femeninas fértiles. Esto se hace más fácil en las plantas i masculinas estériles genéticas, diseñadas genéticamente, debido 5 a que se puede enlazar un gen de resistencia a herbicidas con el gen de esterilidad masculina, y se puede utilizar el rocío de herbicida para remover las plantas fértiles, pero esto todavía significa que se deben plantar filas de progenitores femeninos en una doble densidad con el objeto de obtener el mismo rendimiento por acre de nuestro sistema. Esto ocasionará alguna pérdida de rendimiento debido a la competencia. El rocío de herbicida también significa una pérdida de rendimiento, debido a que las plantas resistentes nunca son 100 por ciento inmunes al herbicida, y los costos del rociado con el producto químico son considerables. Un inconveniente de estos sistemas de producción de semillas híbridas tradicionales, es la necesidad de plantar filas o bloques separados de las líneas progenitoras masculinas y femeninas. La distancia física entre el donador de polen masculino y las plantas receptoras de polen femeninas, da como resultado una transferencia de polen menos eficiente, mal establecimiento de semillas en la progenitora femenina, la necesidad de dedicar más tierra de producción a las plantas f. donadoras de polen, y menos rendimiento de semillas híbridas por unidad de área de tierra. Este inconveniente es especialmente agudo en las especies de cultivo tales como trigo, que liberan pequeñas cantidades de polen, y el polen no es llevado efectivamente por el viento. Los métodos de producción de semillas híbridas tradicionales, cuando se aplican al trigo, han requerido de una tercera parte a dos terceras partes del campo de producción para dedicarse a las plantas donadoras de polen masculinas (Johnson y Schmidt, Adv. Agronomy 20:199-233 (1968); Wilson, Plant Breeding Reviews 303-309 (1989)). El resultado es que el costo de la producción de semillas de trigo híbridas es demasiado alto para sostener una industria, a pesar de la disponibilidad de técnicas de producción de semillas híbridas y de heterosis probada. Para lograr un sistema de producción de semillas híbridas más económico para el trigo y otros cultivos, es necesario mover las plantas progenitoras masculinas y femeninas más cerca entre sí, para efectuar una transferencia de polen más eficiente. En lugar de estar en bloques separados de filas, de tal manera que solamente se puedan cosechar las semillas de las plantas progenitoras femeninas, las plantas progenitoras masculinas y femeninas necesitan interplantarse en las mismas filas, significando que las plantas estén a centímetros, en lugar de a metros, de separación. Ya que sería impráctico cosechar las semillas de solamente las progenitoras femeninas cuando estén tan estrechamente separadas de las progenitoras masculinas, es necesario prevenir la formación de semillas viables en las plantas progenitoras masculinas en adición a prevenir la formación de polen viable en las plantas progenitoras femeninas . Un método para impedir la formación de semillas f viables, es el uso de plantas femeninas estériles. Se ha reportado esterilidad femenina que se presenta naturalmente en T r. varios cultivos (Honma y Phata , Journal of Heredity 55:143-145 (1964); Sniezdo y iniarczyk, Protoplasma 187:31-38 (1995); Justus y Meyer, Journal of Heredity 54:167-168 (1963); Hanna y Po ell, Journal of Heredity 65:247-249 (1974); Brown y Bingham, Crop Science 24:1207-1208 (1984)), pero existen problemas en el mantenimiento de estas líneas, y no se utilizan comercialmente. Se ha descrito un método para construir un gen para la *3 esterilidad femenina dominante (Patente Europea Número EP 412,006 Al (1990); Goldman y colaboradores, EMBO Journal 13:2976-2984 (1994) ) , pero nuevamente, el mantenimiento de una línea femenina estéril que contenga a este gen es problemático, debido a la incapacidad para crear una línea homocigota para el gen para la e esterilidad femenina. Se ha descrito un método para el mantenimiento y uso en la producción de semillas híbridas de este gen para la esterilidad femenina (Patente Europea Número EP 402,270 (1990)) . Sin embargo, requiere de la introducción de un gen para la esterilidad femenina, un gen restaurador de un primer gen para la esterilidad masculina, un segundo gen de esterilidad masculina, y dos genes de resistencia a herbicidas, en una serie f 25 compleja de transformaciones en secuencia para crear la línea progenitora masculina femenina-estéril, y se requiere la introducción de un primer gen para la esterilidad masculina, un gen restaurador del gen para la esterilidad femenina, y un gen de resistencia a herbicidas en una serie compleja de transformaciones en secuencia para crear la línea progenitora i femenina masculina-estéril . Se necesita tratamiento con ff herbicidas para seleccionar los genotipos correctos en cada ronda de multiplicación de líneas, y para producir las semillas híbridas, el campo de producción necesita tratarse con uno de los herbicidas con el fin de aniquilar los genotipos indeseables que sean un resultado del proceso. Aunque el sistema anterior podría proporcionar la ventaja económica de interplantar líneas masculinas y femeninas, es demasiado complejo para tener utilidad comercial . 15 De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad de un método simple y económico para la producción de semillas híbridas .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 20 La presente invención proporciona un método para la producción de semillas híbridas, el cual comprende producir una planta femenina estéril condicional que comprende un promotor 1 preferencial femenina operativamente enlazado con una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la i i 25 conversión de una protoxina a una toxina, interplantar la planta femenina estéril condicional con una planta masculina estéril, inducir la esterilidad femenina mediante la aplicación de la protoxina a la planta femenina estéril condicional, y producir semillas híbridas. En una modalidad preferida de la invención, la planta normalmente se ha auto-poliniza o normalmente se poliniza cruzadamente. En las modalidades particularmente preferidas, la planta se selecciona a partir del grupo que consiste en maíz, trigo, y cebada. La invención también proporciona semillas híbridas producidas mediante el método . La invención proporciona además un cásete de expresión que comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado con una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina. En una modalidad preferida comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado con la secuencia de codificación del gen argE . Las modalidades preferidas de los promotores preferenciales femeninos consisten en el promotor del clon B200Í4-2, del clon P26, o bien del clon P19. Una modalidad particularmente preferida comprende al promotor preferencial femenina a partir del clon B200Í4-2 o del P19, operativamente enlazado con la secuencia de codificación ar E. Las modalidades adicionales de secuencias de codificación útiles en la invención son aquellas obtenidas a partir del gen de monoxigenasa P450sul, y el gen pehA . También la invención proporciona plantas que comprenden el cásete de expresión que comprende un promotor preferencial femenina operativamente enlazado con una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina, y semillas de estas plantas. Otro objeto de la invención es el uso de una protoxina 4 en un método para inducir fertilidad femenina en una planta, el •% fe cual comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado con una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina, e inducir la esterilidad femenina mediante la aplicación de la protoxina a la planta. Todavía otro objeto de la invención es el uso de la secuencia de codificación a partir del gen argE , en un método para producir semillas híbridas, en donde la secuencia de codificación argE se enlaza operativamente con un promotor preferencial femenino que, cuando se expresa, cataliza la conversión de una protoxina a una toxina, induciendo de esta manera la esterilidad femenina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y Nomenclatura El término "estructura reproductora femenina", como se utiliza en la presente, significa las porciones de una planta que componen el carpelo, o ginecio (un término establecido antiguo utilizado con respecto al ginecio es el "pistilo") El carpelo de una flor de una planta incluye, pero no se limita a, un estigma, estilo, ovario, y células o tejidos que comprenden el estigma, el estilo, y el ovario. Un promotor "preferencial de femenino", como se utiliza en la presente, significa un promotor que tiene 5 actividad de transcripción solamente en, o primariamente en, una o más de las células o tejidos de una estructura reproductora femenina de una planta. "Cásete de expresión", como se utiliza en la presente, significa una secuencia de ADN que puede dirigir la expresión de un gen en células de plantas, que comprende un promotor operativamente enlazado con una región de codificación de aminoácidos que está operativamente enlazada con una región de terminación. El gen puede ser quimérico, significando que cuando menos un componente del gen es heterólogo con respecto a cuando menos otro componente del gen. El gen también puede presentarse naturalmente, pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la transformación genética de una planta. "Protoxina", como se utiliza en la presente, significa un producto químico con fítotoxicidad mínima que se pueda activar '1 •i 20 mediante la acción de una enzima para producir un producto de reacción que sea tóxico para las células de la planta, o altere las funciones celulares de la planta de una manera suficiente para retardar, suprimir, o prevenir el crecimiento normal, el desarrollo, o la actividad metabólica. El producto de reacción tóxico es referido en la presente como una "toxina" . En la invención, la protoxina se aplica exógenamente a la planta, lo cual se puede realizar mediante cualquier medio que facilite la absorción foliar, la absorción de la raíz, el contacto directo con las partes de las plantas dirigidas, o el movimiento 5 sistémico desde una parte de la planta hasta otra. "Fertilidad femenina", como se utiliza en la presente, significa que las estructuras reproductoras femeninas de una planta pueden soportar la formación de semillas viables cuando son polinizadas con polen funcional o viable. "Esterilidad femenina", como se utiliza en la presente, significa que las estructuras reproductoras hembras de una planta no son capaces de soportar la formación de semillas viables cuando se polinizan con polen funcional o viable. "Esterilidad femenina condicional", como se utiliza en la presente, significa que se produce la esterilidad femenina después de la aplicación exógena de una * ^w protoxina, que subsecuentemente se activa mediante una enzima para producir un producto de reacción tóxico. "Esterilidad masculina", como se utiliza en la presente, significa que las estructuras reproductoras machos de una planta son incapaces de producir viable o funcional.

Control de Fertilidad Femenina, en Plantas 4 Uno de los aspectos convenientes de la presente invención es su uso en el control de la formación de semillas viables en plantas bajo condiciones de campo, mediante el control de la fertilidad femenina. La fertilidad femenina se puede controlar mediante la obtención de una planta transgénica que comprenda una secuencia de nucleótidos quimérica o recombinante que codifique una enzima que catalice la conversión de una 5 protoxina a una toxina, que, cuando se exprese bajo el control de un promotor preferencial femenino, haga que las estructuras reproductoras femeninas sean incapaces de tener formación de semillas viables después de la aplicación exógena de la protoxina. Se dice que las plantas transgénicas son condicionales para la esterilidad femenina, debido a que se condiciona la aparición de la esterilidad femenina sobre la presencia de la protoxina. La conversión de una protoxina a una toxina en las í t estructuras reproductoras femeninas podría impedir la formación i de semillas viables a través de varios mecanismos, dependiendo de cuándo, y en qué células o tejidos, se active el promotor preferencial femenino. Estos incluyen, pero no se limitan a: 1) interrupción del desarrollo normal del pistilo, de tal manera que el pistilo ya no es competente para permitir la fertilización, 2) inhibición del crecimiento del tubo de polen mediante la toxina convertida, 3) interrupción del desarrollo de gametos viables, y 4) interrupción del desarrollo de semillas en seguida de la fertilización. En una modalidad de la presente invención, una protoxina se aplica exógenamente a plantas transgénicas bajo condiciones de campo, y la conversión de la protoxina a la toxina I í se presenta en la estructura reproductora femenina . La formación x de semillas viables se impide mediante la acción de la toxina en la estructura reproductora femenina. }| 5 SECUENCIAS DE CODIFICACIÓN Y PROTOXINAS ÚTILES EN LA INVENCIÓN Las secuencias de codificación útiles para la invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier secuencia que codifique una proteína capaz de convertir una protoxina a una toxina. Estas secuencias de codificación pueden ser de origen homólogo, o bien heterólogo . En una modalidad preferida, la secuencia de codificación a„partir del gen argE se enlaza operativamente con un promotor preferencial femenino. La expresión de este gen quimérico en una planta transgénica da como resultado la t esterilidad femenina condicional en la presencia de la protoxina fosfinotricina N-acetílica (PPT N-acetílica) . El producto genético del gen argE es la desacetilasa de N-acetil-L-ornitina de E. coli , que tiene una amplia especificidad para la hidrólisis de sustratos del tipo Ri-CO-NH-CH ( (CH2) -R2) -COOH. Como resultado de esta actividad, el producto genético argE cataliza la conversión de la protoxina fosfinotricina acetílica a la toxina fosfinotricina (PPT) (Kiete y colaboradores, The Plant Journal 9:809-818 (1996) ) . 25 En otra modalidad preferida, la secuencia de í ? 1 i- codificación del gen para la mono-oxigenasa de P450sul, CPY105A1, se enlaza operativamente con un promotor preferencial femenino. Esta expresión da como resultado la esterilidad femenina condicional en la presencia de una protoxina de sulfonamida. La mono-oxigenasa de Strepto yces griseolus P450sul, cuando se dirige al cloroplasto, media la N-desalquilación del compuesto de urea sulfonílica R7402 (1,1-dióxido de 7-sulfonamida de 2-metiletil-2 , 2 -dihidro-N- [ (4 , 6-dimetoxipirimidin-2-il) aminocarbonil] -1,2-benzotiazol, y lo convierte en una toxina (O-'Keefe y colaboradores, Plant Physiology 105:473-482 (1994)). En todavía otra modalidad preferida, la secuencia de codificación del gen pehA se enlaza operativamente con un promotor preferencial femenino, y esta expresión da como resultado la esterilidad femenina condicional en la presencia de la protoxina, glifosato de glicerilo. El producto genético del gen pehA del Burkholderia caryophili PG2982, es una hidrolasa de monoéster de fosfonato hidrolasa que cataliza la conversión de la protoxina glifosato de glicerilo a la toxina glifosato (Dotson y colaboradores, Plant Journal 10:383-392 (1996)). Los ejemplos anteriores se dan a manera de ilustración y no de limitación. En la invención se puede utilizar cualquier secuencia de codificación que codifique una enzima que catalice la conversión de una protoxina a una toxina, en el entendido de que se enlace operativamente con un promotor preferencial femenino.

PROMOTORES ÚTILES EN LA INVENCIÓN Con el objeto de practicar la invención, es deseable que las secuencias de nucleótidos anteriores, que codifiquen una enzima que catalice la conversión de una protoxina a una toxina, se enlacen operativamente con una secuencia reguladora 5 ' que dirija su expresión de una manera que sea preferencial para las estructuras reproductoras femeninas de una planta. Esta especificidad en la expresión asegura que se ejerza el efecto de la enzima expresada solamente en aquellos tejidos o células que sean necesarios para la formación de semillas viables, y no sean perjudiciales para la planta más allá de su efecto sobre la fertilidad. Los promotores preferenciales femeninos útiles en la presente invención en las plantas incluyen, pero no se limitan a, promotores de dicotiledóneas, tales como el promotor S13 modificado (Dzelkalns y colaboradores, Plant Cell 5:855 (1993)), el promotor Stigl de tabaco (Goldman y colaboradores, EMBO J. 13:2976-2984 (1994)), el promotor AGL5 (Savidge y colaboradores, Plant Cell 7:721-733 (1995)), y el promotor de tabaco TTS1 (Cheung y colaboradores, Cell 82:383-393 (1995)) . Los promotores anteriores se han probado todos, y han demostrado que son funcionales en plantas transgénicas . Los promotores derivados de monocotiledóneas incluyen al promotor del gen ZAG2 específico de carpelo de maíz (Thiessen y colaboradores, Gene 156:155-166 (1995) ) .

Adicionalmente, se puede aislar ADN genómico que contenga secuencias promotoras, que correspondan a un ADNc conocido en la técnica por tener expresión preferencial femenina. Estos incluyen, pero no se limitan a, promotores para los genes Fbp7 y Fbpll de Arabidopsis (Angenent y colaboradores, Plant Cell 7:1569-1582 (1995)) y los ADNcs específicos de orquídeas femeninas O40, O108, 039, 0126 y 0141 (Nadeau y colaboradores, Plant Cell 8:213-239 (1996)). Se pueden clonar genes preferenciales femeninos útiles para especies de plantas específicas mediante el aislamiento de novedosos transcritas expresados en los tejidos hembras, utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Esto involucra aislar ARN de tejidos femeninos, tales como seda de maíz o pistilos de trigo, y seleccionar diferencialmente mediante técnicas tales como despliegue visual diferencial, selección con reacción en cadena de la polimerasa, sustracción de ADNc, y construcción sustractiva de biblioteca de ADNc para aislar clones de ADNc que se expresen preferencialmente en los tej idos femeninos y no en otras partes de la planta tales como la hoja, la raíz, o la espiga. La especificidad del tejido de estos ADNcs clonados se puede confirmar mediante análisis Northern. Entonces se pueden obtener secuencias promotoras para clones preferenciales femeninas mediante la utilización de los ADNcs novedosos aislados como sondas para la selección de la biblioteca genómica. Se pueden aislar clones genómicos que contengan secuencias reguladoras 5 ' y 3 ' necesarias para la expresión en el tejido femenino. Estas secuencias se pueden utilizar para construir casetes de expresión, para la expresión de genes quiméricos de una manera preferencial femenina.

OTROS ELEMENTOS REGULADORES ÚTILES EN LA INVENCIÓN La región reguladora 5 ' del cásete de expresión también puede incluir otras secuencias potenciadoras . Se ha encontrado que numerosas secuencias potencian la expresión del gen en plantas transgénicas. Por ejemplo, se sabe que un número de secuencias líder no trasladadas derivadas de virus potencian la expresión. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias líder de Virus de Mosaico de Tabaco (TMV) , la "secuencia W" ) , Virus Moteado Clorótico de Maíz (MCMV) , y Virus de Mosaico de Alfalfa (AMV) , son efectivas para potenciar la expresión (por ejemplo, Gallie y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:8693-8711 (1987), Skuzeski y colaboradores, Plant Molec. Biol . 15:65-79 (1990) ) . Otros líderes conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a: 20 Líderes de Picornavirus, por ejemplo líder de EMCV r (Región no Codificadora 51 de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., y Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130 (1989)) ; Líderes de Potivirus, por ejemplo líder de TEV (Virus Grabado de Tabaco) (Allison y colaboradores, (1986) ; líder de -f 25 MDMV (Virus de Mosaico Enano de Maíz); Virology, 154:9-20); Líder de proteína de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) , (Macejak, D.G., y Sarnow, P., Nature, 353:90-94 (1991)); Líder no trasladado del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) , (Jobling, S.A. y Gehrke, L. , Nature, 325:622-625 (1987)); Líder de virus de mosaico de tabaco (TMV) , (Gallie, D.R. y colaboradores, Molecular Biology of RNA, páginas 237-256 (1989)) ; y Líder de Virus Moteado Clorótico de Maíz (MCMV) (Lommel, S.A. y colaboradores, Virology, 81:382-385 (1991). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores, Plant Physiology, 84:965-968 (1987) ) . Se ha demostrado que diferentes secuencias de intrones potencian la expresión cuando se agregan a la región reguladora 5', particularmente en células monocotiledóneas . Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adhl de maíz potencian de una manera significativa la expresión del gen de tipo silvestre bajo su promotor conocido cuando se introducen en células de maíz (Callis y colaboradores, Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). En adición a los promotores, también está disponible una variedad de terminadores de transcripción 3 ' para utilizarse en la presente invención. Los terminadores de transcripción son responsables de la terminación de la transcripción, y corrigen la poliadenilación del ARNm. Los terminadores de transcripción apropiados, y aquellos que se sabe que funcionan en las plantas, incluyen el terminador 35S de CaMV, el terminador tml , el terminador de la napalina sintasa, el terminador rbcs E9 de chícharo, y otros conocidos en la técnica. Estos se pueden utilizar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas.

Transformación de la Planta Los casetes de expresión de la presente invención se pueden introducir en la célula de la planta en un número de maneras reconocidas en la técnica. Los expertos en la materia apreciarán que la elección del método podría depender del tipo de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para la transformación de células de plantas incluyen, pero no se limitan a microinyección (Crossway y colaboradores, BioTechniques 4:320-334 (1986)), electroporación (Riggs y colaboradores, Proc. Nati .

Acad . Sci . EUA 83:5602-5606 (1986)), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee y colaboradores, Biotechnology 6:915-921 (1988)), transferencia genética directa (Paszkowski y colaboradores, EMBO J. 3:2727-2722 (1984)), y aceleración de partículas balísticas utilizando dispositivos disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and BioRad, Hercules, California (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,945,050; y McCabe y colaboradores, Biotechnology 6:923-926 (1988)). Ver también, Weissinger y colaboradores, Annual Rev. Genet . 22:421-477 (1988); Sanford y colaboradores, Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987) (cebolla); Christou y colaboradores, Plant Physiol . 87:671-674 (1988) (frijol de soya); McCabe y colaboradores, Bio/Technology 6:923-926 (1988) (frijol de soya); Datta y colaboradores, Bio/Technology 8:736-740 (1990) (arroz); Klein y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 85:4305-4309 (1988) (maíz); Klein y colaboradores, Bio/Technology 6:559-563 (1988) (maíz); Klein y colaboradores, Plant Physiol . 91:440-444 (1988) (maíz); Fromm y colaboradores, Bio/Technology 8:833-839 (1990) (maíz); y Gordon-Kamm y colaboradores, Plant Cell 2:603-618 (1990) (maíz); Svab y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 87:8526-8530 (1990) (cloroplasto de tabaco); Koziel y colaboradores, Biotechnology 11: 194-200 (1993) (maíz); Shimamoto y colaboradores, Nature 338:274-277 (1989) (arroz); Christou y colaboradores, Biotechnology 9:957-962 (1991) (arroz); Solicitud de Patente Europea Número EP 0,332,581, Horn y colaboradores (pasto de huerto y otras Pooideae) ; Vasil y colaboradores, Biotechnology 11:1553-1558 (1993) (trigo); Weeks y colaboradores, Plant Physiol . 102: 1077-1084 (1993) (trigo); Wan y Lemaux, Plant Physiol . 104, 37-48 (1994) (cebada) . Un conjunto particularmente preferido de modalidades para la introducción de los casetes de expresión de la presente invención en maíz mediante bombardeo de microproyectiles se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/008,374, incorporada a la presente como referencia en su totalidad. Una modalidad preferida adicional es el método de transformación del protoplasto para maíz, como se da a conocer en la Solicitud de Patente Europea Número EP 0,292,435, así como en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,350,689, incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. Un conjunto particularmente preferido de modalidades para la introducción de los casetes de expresión de la presente invención en trigo mediante bombardeo de microproyectiles, se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,610,042, incorporada a la presente como referencia en su totalidad. La transformación de plantas se puede emprender con una sola molécula de ADN, o con múltiples moléculas de ADN (es decir, co-transformación) , y ambas técnicas son adecuadas para utilizarse con los casetes de expresión de la presente invención. Hay numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y los casetes de expresión de esta invención se pueden utilizar en conjunto con cualquiera de estos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie blanco para la transformación. Hay muchos vectores disponibles para la transformación utilizando Agrobacterium tumefaciens . Estos llevan normalmente cuando menos una secuencia límite de ADN-T, e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucí . Acids Res . (1984)). En una modalidad preferida, los casetes de expresión de la presente invención se pueden insertar en cualquiera de los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 para utilizarse con Agrobacte ium. Estos casetes de vector para la transformación mediada por Agrobacterium se construyeron de la siguiente manera. Se creó pTJS75kan mediante digestión con NarI de pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, J". Bacteriol . 164:446-455 (1985)) permitiendo la separación del gen de resistencia a la tetraciclina, seguida por inserción de un fragmento AccT a partir de pUC4K que lleva un NPTII (Messing y Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304: 184-187 (1983); McBride y colaboradores," Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Se ligaron los enlazadores Xhol al fragmento EcoRV de pCIB7 que contiene los límites de ADN-T izquierdo y derecho, un gen quimérico nos/nptll seleccionable en plantas, y el polienlazador pUC (Rothstein y colaboradores, Gene 53:153-161 (1987)), y el fragmento digerido con Xhol se clonó en pTJS75kan digerido con Salí para crear pCIB200 (ver también la Patente Europea Número 0,332,104, ejemplo 19). pCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de polienlazador únicos: EcoRI, SstI, Kpnl, BglII, Xbal, y Salí. El plásmido pCIB2001 es un derivado de pCIB200 que fue creado mediante la inserción en el polienlazador de sitios de restricción adicionales. Los sitios de restricción únicos en el polienlazador de pCIB2001 son EcoRI, SstI, Kpnl, BglII , Xbal, Salí, Mlul, Bcll, Avrll, Apal, Hpal, y Stul. pCIB2001, en adición a contener estos sitios de restricción únicos, también tiene selección de kanamicina en plantas y bacterias, límites de ADN-T izquierdo y derecho para la transformación mediada por Agrobacterium, la función trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros hospederos, y las funciones OriT y OriV también a partir de RK2. El polienlazador pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas que contengan sus propias señales reguladoras. Un vector adicional útil para la transformación mediada con Agrobacterium es el vector binario pCIBlO, que contiene un gen que codifica resistencia a la kanamicina para la selección en plantas, secuencias límite derecha e izquierda del ADN-T, e incorpora secuencias a partir del plásmido de amplio rango de hospederos pRK252, que le permiten replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción es descrita por Rothstein y colaboradores, Gene 53:153-161 (1987). Se han construido diferentes derivados de pCIBlO que incorporan al gen para la higromicina B fosfotransferasa descrita por Gritz y colaboradores, Gene 25:179-188 (1983). Estos derivados hacen posible la selección de células de plantas transgénicas sobre higromicina solamente (pCIB743) , o higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717) . Los métodos que utilizan ya sea una forma de transferencia genética directa, o bien transferencia mediada por Agrobacterium, normalmente, pero no necesariamente, se emprenden con un marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, higromicina, o metotrexato) , o a un herbicida (por ejemplo, fosfinotricina) . La elección del marcador seleccionable para la transformación de plantas, sin embargo, no es crítica para la invención, a menos que la expresión de esta resistencia y su actividad bioquímica interfiera con la elección de la protoxina para la conversión de la toxina seleccionada para utilizarse en la creación de fertilidad condicional. Para ciertas especies de plantas, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibiótico o herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing y Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304:184-187 (1983) ) , el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores, Nucí . Acids Res 18:1062 (1990), Spencer y colaboradores, Theor Appl Genet 79:625-631 (1990) ) , el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931), el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y colaboradores, EMBO J. 2:1099-1104 (1983)), el gen de fosfato de manasa isomerasa, que permite la selección sobre mañosa como una fuente de carbono (Patente Europea Número EP 530,129 y Publicación Internacional Número WO 94/20627) . Un vector útil para las técnicas de transferencia genética directa en combinación con la selección por el herbicida Basta (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este vector se basa en el plásmido pCIB246, que comprende al promotor 35S de CaMV en fusión operativa con el gen GUS de E. coli , y el terminador de transcripción 35S de CaMV, y se describe en la solicitud publicada del TCP Número WO 93/07278, incorporada a la presente como referencia. Un gen útil para conferir resistencia a la fosfinotricina, es el gen bar a partir de Streptomyces hygroscopicus (Thompson y colaboradores, EMBO J. 6:2519-2523 (1987) ) . Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas que contengan sus propias señales reguladoras. Se debe observar, sin embargo, que el uso de bar como un marcador seleccionable, puede interferir con la operación de la presente invención si también se puede expresar en estructuras reproductoras femeninas. Este problema se puede superar mediante la utilización de promotores que controlen la expresión en cultivos de células o tejidos utilizados para la transformación, pero que no den como resultado la expresión del gen bar en las estructuras reproductoras femeninas . Otro vector de transformación es el vector pGL2 (Shimamoto y colaboradores, Nature 338, 274-176 (1989)), el cual contiene el gen de higromicina fosfotransferasa de (hpt) de Streptomyces operativamente enlazado con las secuencias del promotor 35S y del terminador 35S. Un vector de transformación adicional es el pSOG35, que utiliza la dihidrofolato de reductasa (DHFR) del gen de E. coli como un marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato. Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el promotor 35S (de aproximadamente 800 pares de bases) , el intrón 6 del gen Adhl de maíz (de aproximadamente 550 pares de bases) , y 18 pares de bases de la secuencia líder no trasladada de GUS a partir de pSOGlO. También se amplificó un fragmento de 250 pares de bases que codifica el gen de dihidrofolato reductasa tipo II de E. coli mediante reacción en cadena de la polimerasa, y estos dos fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa se ensamblaron con un fragmento Sal-PstI a partir de pBI221 (Clonetech) , que comprendía a la estructura base del vector pUC19 y al terminador de nopalina sintasa. El ensamble de estos fragmentos generó pSOG19 que contiene al promotor 35S en fusión con la secuencia del intrón 6, el líder GUS, el gen de dihidrofolato reductasa, y el terminador de nopalina sintasa. El reemplazo del líder GUS en pSOG19 con la secuencia líder de Virus Moteado Clorótico de Maíz (MCMV) generó el vector pSOG35. pS0G19 y pSOG35 llevan al gen derivado de pUC para la resistencia a la ampicilina, y tienen los sitios HindIII, Sphl , PstI, y EcoRI para la clonación de secuencias extrañas.

Producción de Semillas Híbridas Utilizando Esterilidad Femenina Condicional Con el objeto de producir semillas híbridas no contaminadas con semillas producidas mediante auto-polinización, se deben implementar métodos de control de polinización para impedir la auto-polinización de la progenitora femenina, y asegurar la polinización cruzada por la progenitora masculina. Esto se realiza normalmente mediante métodos mecánicos, esterilidad masculina genética, o agentes de hibridación química (CHAs) . Por ejemplo, en el maíz, la práctica actual es el desborlamiento mecánico de la progenitora femenina (o semilla) , el cual es un proceso tardado y laborioso. En el trigo, es impráctico el control de la fertilidad mediante elementos mecánicos a una escala de producción de semillas, y no hay fuentes genéticas de esterilidad masculina comercialmente establecidas. Los métodos de producción de semillas híbridas basados solamente en el control de la polinización requieren que los bloques de plantas parentales machos estén físicamente separados de los bloques de plantas progenitoras masculinas, ya que las plantas progenitoras masculinas producirán semillas de la auto-polinización. El uso de la presente invención en la producción de semillas híbridas ofrece las ventajas de confiabilidad, facilidad de uso, y más importante, permitirá interplantar plantas progenitoras masculinas y femeninas, dando como resultado una transferencia de polen más eficiente, la necesidad de menos plantas progenitoras masculinas, y una producción de semillas híbridas más económica. Con el objeto de producir semillas híbridas utilizando la invención, se requiere una planta progenitora transgénica que exprese una enzima que catalice la conversión de una protoxina a una toxina de una manera preferencial femenina. Anteriormente se describe la obtención de plantas transgénicas que poseen este genotipo. Las plantas transgénicas que contienen los genes quiméricos o recombinantes de la presente invención se pueden hacer homocigotas, y se pueden mantener indefinidamente utilizando metodologías de reproducción de plantas normales. También, para la producción de semillas híbridas de acuerdo con la invención, se requiere una planta progenitora que sea masculina estéril. La esterilidad masculina es el fracaso o la incapacidad para producir polen viable o funcional. La esterilidad masculina puede resultar de alteraciones que conduzcan a la falta de formación de polen, o a la falta de capacidad funcional en el polen cuando se forma. Por consiguiente, ya sea que no se forme el polen, o si se forma, no es viable o es incapaz de tener una fertilización efectiva bajo condiciones normales . Se conocen muchas fuentes de esterilidad masculina para utilizarse en la producción de semillas híbridas (Kaul, Male Sterility in Higher Plants, Springer-Verlag (1988) ) . Se han descrito genes de esterilidad masculina citoplásmicos que se presentan naturalmente, y su uso para maíz (Levings, Science 250:942-947 (1990)), trigo (Toriyama y colaboradores, Jpn. J. Breed. 43:517-524 (1993)), tabaco (Gerstel y colaboradores, Genetics 89:157-169 (1978)), centeno (Steinborn y colaboradores, Theor. Appl. Genet. 85:822-824 (1993)), girasol (Crouzillat y colaboradores, Plant Mol . Biol . 16:415-426 (1991)), frijol de soya (Davis, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,763,441 (1988)), Brassica (Grelon y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 243:540-547 (1994)), zanahoria (Kitagawa y colaboradores, Sex. Plant Reprod. 7:41-50 (1994)), sorgo (Chen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 28:799-809 (1995)), arroz (Kadowaki y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 224:10-16 (1990)), y cebada (Kaul y Singh, Cytobios 66:71-85 (1991)). También se conoce la construcción de genes de esterilidad masculinas quiméricos o recombinantes. Se ha demostrado que un gen que codifica una ß-1, 3-glucanasa, cuando se expresa desde un promotor activo solamente en las células tapétales de la antera, ocasiona esterilidad masculina en plantas transgénicas (Worrall y colaboradores, Plant Cell 4:759-771 (1992) ) . Se ha demostrado que un gen que codifica para un gen mitocondrial atp9 no editado del trigo, ocasiona esterilidad masculina cuando se expresa a partir del promotor 35S de CaMV constitutivo en plantas transgénicas (Hernould y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:2370-2374 (1993)). Se ha demostrado que un gen que codifica para una enzima ARNsa ocasiona esterilidad masculina cuando se expresa desde un promotor activo solamente en células tapétales de la antera en plantas transgénicas (DeBlock y colaboradores, Planta 189:218-225 (1993); Patente Europea Número EP 344,029; Mariani y colaboradores, Nature 347:737-741 (1990)). Se ha demostrado que la expresión de un ARN anti-sentido complementario para un gen crítico para la formación de polen, ocasiona esterilidad masculina en plantas transgénicas (Patente Europea Número EP 513,884). Adicionalmente, existen muchos otros promotores específicos masculinos que son bien conocidos en la materia, y se podrían utilizar en la construcción de genes quiméricos de esterilidad masculina. Estos incluyen secuencias promotoras para la expresión en polen, el tapeto u otras estructuras en la antera. Los ejemplos de los promotores específicos de machos incluyen, pero no se limitan a, el promotor LAT52 (Twell y colaboradores, Dev. 109:705-13 (1989)), el promotor A127 de jitomate (Dotson y colaboradores, Plant J. 10, 383-392 (1996)), el promotor Zmg de maíz (Hamilton y colaboradores, Sex. Plant Reprod. 2:208-212 (1989)), el promotor CDPK de maíz (Guerro y colaboradores, Mol . Gen Genet . 224:161-168 (1990)), los promotores ant32 y ant43D de específicos de la antera dados a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,477,002, incorporada a la presente como referencia en su totalidad. Adicionalmente, se pueden clonar secuencias promotoras para ADNcs específicos de la antera mediante el aislamiento de las secuencias de ADN genómico correspondientes, y definiendo las regiones reguladoras del promotor, por ejemplo, aislando secuencias promotoras para el P450 específico del tubo del polen de orquídea (Nadeau y colaboradores, Plant Cell 8:213-239 (1996) ) , y el Bcpl de Arabidopsis (Xu y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . 92:2106-2110 (1995)). De una manera similar, se pueden aislar genes novedosos que son masculino específicos mediante una variedad de técnicas, tales como despliegue virtual diferencial, sustracción de ADNc con selección de reacción en cadena de la polimerasa, y selección de biblioteca de ADNc diferencial. Una vez identificadas, se pueden aislar las secuencias genómicas correspondientes, se pueden caracterizar las regiones promotoras, y estas secuencias se pueden utilizar luego como regiones promotoras para construir casetes de expresión expresados de una manera masculino específica. Los genes de esterilidad masculina artificiales anteriores tienen el inconveniente de que su acción es incondicional y dominante. Una vez que se crea la planta transgénica, siempre es masculina estéril, haciendo difícil el mantenimiento de líneas de plantas, y haciendo imposible crear una línea de planta homocigota de reproducción verdadera. Se ha descrito otra categoría de genes de esterilidad masculina, en donde el fenotipo masculino estéril es condicional. En esta categoría, la fertilidad masculina se altera solamente siguiendo la aplicación de una protoxina química. En un ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un gen que codifica para una N-acetil-L-ornitina desacetilasa que cataliza la conversión de la protoxina N-acetil-L-fosfinotricina en la toxina herbicida L-fosfinotricina (Kriete y colaboradores, Plant Journal 9:908-818 (1996); EP 531,716 A2 (1992)). Las plantas transgénicas que expresaban este gen en las células tapétales de la antera se hicieron masculinas-estériles solamente cuando se trataron con la protoxina N-acetil-L-fosfinotricina. En otro ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un gen que codifica para un citocromo bacteriano P450 que cataliza la conversión de una protoxina de urea sulfonílica R7402 en una toxina herbicida (Publicación Internacional Número WO 91/03561; O'Keefe y colaboradores, Plant Physiology 105:473-482 (1994)). Las plantas transgénicas que expresaban este gen en las células tapétales de la antera se hicieron masculinas-estériles solamente cuando se trataron con la protoxina R7402. En otro ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un gen que codifica para una monoéster de fosfonato hidrolasa que cataliza la conversión de la protoxina glifosato de glicerilo en la toxina herbicida glifosato (Dotson y colaboradores, Plant J. 10:383-392 (96) ) . Las plantas transgénicas que expresaban este gen en las células tapétales de la antera se hicieron masculinas-estériles solamente cuando se trataron con la protoxina glifosato de glicerol . En la presente invención se podrían emplear cualquiera de las fuentes de esterilidad masculina descritas anteriormente o conocidas en la técnica. Esto incluye cualquier sistema genético masculino estéril que se presente naturalmente, o mediante la transformación de un gen quimérico o recombinante en la línea parenteral femenina de interés. De acuerdo con la invención, se previene una formación de semillas viables en la planta femenina estéril condicional (planta progenitora masculina) como un resultado de la conversión de la protoxina a la toxina en las estructuras reproductoras femeninas, y se impide la producción de polen en la planta masculina estéril (planta progenitora femenina) . Para obtener semillas híbridas, se interplantas semillas homocigotas de la progenitora masculina y la progenitora femenina en un campo de producción, permitiendo de esta manera una transferencia eficiente de polen. En un ejemplo de utilización de la presente invención para producir semillas híbridas, la progenitora femenina es masculina-estéril por cualquier medio, y la progenitora masculina se diseña para ser femenina-estéril en la presencia de una protoxina apropiada exógenamente aplicada. Después de la aplicación de la protoxina en el tiempo apropiado durante el desarrollo de la planta, la única producción de semillas viables será un resultado del polen de la progenitora masculina (femenina-estéril) que fertilice a los óvulos de la progenitora femenina (masculina-estéril) . En el modo preferido de utilización de la presente invención, la progenitora femenina se diseña para ser masculina-estéril después de la aplicación de una protoxina, mientras que la progenitora masculina se diseña para ser femenina-estéril en la presencia de la misma protoxina. Para producir semillas híbridas, se interplantan las dos líneas progenitoras, y después de la aplicación de la protoxina en el tiempo apropiado durante el desarrollo de la planta, solamente se obtienen semillas híbridas. Por este medio, se pueden producir cualesquiera semillas híbridas deseadas. Para producir semillas de trigo híbridas, la progenitora masculina se diseña para ser femenina-estéril en la presencia de una protoxina adecuada exógenamente aplicada, y la progenitora femenina se diseña para ser masculina-estéril en la presencia de la misma protoxina. Ambas líneas progenitoras transgénicas se hacen homocigotas, y las semillas se multiplican mediante prácticas convencionales de la industria. Para la producción de semillas híbridas, se interplantan semillas homocigotas de las líneas progenitoras masculina y femenina diseñadas en una proporción de masculinas a femeninas determinada para garantizar una polinización eficiente. En un tiempo apropiado durante el desarrollo de la planta, se aplica la protoxina al campo de producción. En seguida de la maduración de las semillas, se cosecha todo el campo de producción, produciendo solamente semillas híbridas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los materiales y métodos utilizados en la realización de la invención, y los resultados subsecuentes . Se ofrecen a manera de ilustración, y su texto no debe considerarse como una limitación de la invención reivindicada.

Ejemplo 1 : Plantas de Tabaco que son Condicionales para la Esterilidad Femenina Se construyó el plásmido pSH58 que contenía al promotor ?S13 (-339 a -79 del promotor SLG13 condensado con -46 a +8 del promotor 35S de CaMV, Dzelkalns y colaboradores, Plant Cell 5:855-863 (1993)), y se fusionó con el gen argE (SEQ ID N0:3) en el marco de lectura de traducción correcto. El promotor ?S13 es un promotor preferencial femenino. El gen argE se obtuvo a partir del ADN genómico de E. coli mediante reacciones en cadena de la polimerasa con el cebador 5 ' -TATCTAGACCAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3 ' (SEQ ID NO: 5), y el cebador 5 ' CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3 ' (SEQ ID NO: 6). El fragmento resultante se clonó en pGEM-TA (Stratagene) , y se confirmó la secuencia correcta. Utilizando una serie de reacciones en cadena de la polimerasa y pasos de subclonación, se colocó una secuencia en consenso de traducción de plantas y un sitio BamHI corriente arriba del sitio de inicio de traducción argE utilizando cebadores de reacción en cadena de la polimerasa, ' -CGCGGATCCTAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3 ' (SEQ ID NO: 7), y GCGCCTAGGCGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3 ' (SEQ ID NO: 8). Luego este producto se fusionó corriente abajo del promotor ?S13 en el plásmido pSH15 (el promotor ?S13 en Bluescript sk) , y se agregó el terminador de transcripción nos 3 ' para el gen de ß-glucuronidasa (GUS) . Luego este cásete ?S13 -argE-nos se ligó como un fragmento EcoRI en pCIB200 conteniendo límites de ADN-T y un marcador funcional seleccionable en plantas, de resistencia a la kanamicina. Este plásmido se designó como pSH58. El plásmido pFAlOO se construye de una manera similar al pSH58 anterior, con la excepción de que el gen argE (SEQ ID NO: 3) reemplaza al gen GUS en Stigl-GUS (Goldman y colaboradores, EMBO J. 13:2976-2984 (1994)) en el marco de lectura de traducción correcto, utilizando enzimas de restricción apropiadas. Luego se liga la fusión STIGl-argE en un vector tal como pCIB200 conteniendo límites de ADN-T, secuencias de terminación 3 ' , y un marcador funcional seleccionable en plantas, tal como de resistencia a la kanamicina. El promotor Stigl es un promotor preferencial femenino . Se transforman discos de hoja de tabaco como se describe en Horsch y colaboradores, Science 227:1229-1231 (1985) con pSH58. La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se utiliza análisis Northern del ARN hecho a partir de tejido femenino para confirmar la expresión específica del tejido del gen argE en las plantas transgénicas. Estas plantas son auto-fértiles, y tienen el fenotipo de esterilidad femenina condicional. Se recolectan las semillas TI después de la auto-polinización. También se introduce el transgén condicional femenino de pFAlOO en tabaco o empleando procedimientos similares.

Ejemplo 2 : Plantas d Tabaco que aon Condicionales gara Esterilidad Masculina Se construyó el plásmido pSH60 con el promotor TA29 (Kriete y colaboradores, Plant J. 9:809-818 (1996)) fusionado con el gen argE. Se clonó el promotor TA29 a partir de tabaco mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los cebadores 5 ' -AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3 ' (SEQ ID NO: 9) y 5'-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3 ' (SEQ ID NO: 10). Mediante una serie de pasos de subclonación, el fragmento TA29 se fusionó corriente arriba de argE que contenía la secuencia de traducción en consenso de la planta, como se describe en el Ejemplo 1, y un terminador de transcripción nos agregado 3' para el gen argE. Se clonó el cásete TA29-argE-nos entre los límites de ADN-T en el plásmido pSGCGFl, que también contiene al marcador seleccionable en plantas de higromicina. El plásmido resultante se designó como pSH60. Se transformaron discos de hoja de tabaco como se describe en Horsch y colaboradores, Science 227:1229-1231 (1985) con pSH60. La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se utiliza análisis Northern del ARN hecho a partir del tejido femenino para confirmar la expresión específica de te ido del gen argE en las plantas transgénicas. Estas plantas son auto-fértiles, y tienen el fenotipo de esterilidad masculina condicional. Se recolectan semillas TI después de la auto-polinización. También se transforman discos de hoja de tabaco con pGK73 , que contiene un cásete de expresión del gen argE bajo el control del promotor TA29 (Kriete y colaboradores, Plant J. 9:809-818 (1996)) como se describe en Horsch y colaboradores, Science 227:1229-1231 (1985). La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se utiliza análisis Northern del ARN hecho a partir de las anteras para confirmar la expresión específica de tejido del gen argE en las plantas transgénicas. Estas plantas son auto-fértiles, y tienen el fenotipo de esterilidad macho condicional. Se recolectan semillas de la generación Tx después de la auto-polinización.

Ejemplo 3 : El Tratamiento Químico de Plantas de Tabaco Transformadas Confiere Esterilidad Específica del Te ido Se plantan semillas de la generación T17 tanto de plantas femeninas estériles condicionales (transformadas con pFAlOO) como de plantas masculinas estériles condicionales (transformadas con pGK73) en el suelo. Una vez que han crecido las plántulas hasta un tamaño suficiente, se analiza el tejido de la hoja mediante reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia del transgén argE . Las plantas positivas 5 en la reacción en cadena de la polimerasa se transfieren al invernadero. Estas plantas son completamente fértiles en ausencia de la protoxina exógenamente aplicada. Un subconjunto de las plantas femeninas estériles condicionales, y un subconjunto de las plantas masculinas estériles condicionales, se tratan con la protoxina acetil-PPT durante las etapas de crecimiento. Como resultado de la conversión preferencial de la protoxina a la toxina, las plantas masculinas estériles condicionales tratadas llegan a ser masculinas estériles, y las plantas femeninas estériles condicionales llegan a ser femeninas estériles. Las plantas no tratadas permanecen completamente fértiles. Se recolecta el polen de las plantas femeninas estériles tratadas, y se utiliza para polinizar los pistilos de las plantas masculinas estériles tratadas, que son las plantas progenitoras femeninas. Se presenta la fertilización, y se producen semillas -¿ 20 híbridas en la planta masculina estéril.

Ejemplo 4. Obtención de Clones de ADN de Genes Novedosos Preferencialmßntß Expresados en la Estructura Reproductora Femenina de Maíz 25 Primero se identificó un fragmento de ADNc específico de algodoncillo, utilizando el Estuche de Sustracción de ADNc de selección en Reacción de Cadena de la Polimerasa de Clontech (Clontech cat .#K1804-1) . Se aisló ARNm de poliA a partir de algodoncillo de maíz en desarrollo, tejidos de borla entera, hoja, y raíz de la línea endógama de maíz CG00526, siguiendo los procedimientos ilustrados en el Estuche de Aislamiento de ARNm Quick de Poli (A) (Stratagene cat . #200348) . Los ADNcs se sintetizaron a partir de ARNm de poliA de cada tejido, y se dividieron en el "ADNc de prueba", en este caso representado por los ADNcs de algodoncillo, y el "ADNc impulsor" compuesto de cantidades iguales de ADNcs de borla, hoja, y raíz. La sustracción del ADNc y la amplificación en reacción de cadena de la polimerasa se realizaron como se describe en el manual del usuario. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se subclonaron en un vector de clonación de TA, pCRII (Invitrogen cat . #2000-01) . Cada subclon se seleccionó para determinar la especificidad del tejido en manchas Northern con 5 microgramos de ARNm total a partir de algodoncillo de maíz, borla, hoja, y tejido de raíz. El clon B200Í, de 145 pares de bases de longitud, mostró una expresión específica del algodoncillo. Se utilizó el fragmento de ADNc específico del algodoncillo B200i para seleccionar una biblioteca de ADNc de algodoncillo en desarrollo. La biblioteca de ADNc de algodoncillo se construyó utilizando ARNm de poliA aislado a partir de algodoncillos tomados de las mazorcas de 18 centímetros de largo, siguiendo los procedimientos detallados en el Estuche de Clonación Zap cDNA GigaPack II Gold de Stratagene (Stratagene cat. #200402) . Se seleccionaron los clones que se hibridaron con la sonda B200i para el análisis de secuencia. Un clon, de un tamaño de 772 pares de bases, contenía la secuencia de la sonda B200i. Este clon, B200Í4-2, se utilizó como una sonda en manchas Northern que contenían 1 microgramo de ARNm de poliA a partir de algodoncillo de maíz, borla, hoja, y tejido de raíz. La expresión se detectó solamente en el algodoncillo. La secuencia de ADNc del clon B200Í4-2 se estipula en la SEQ ID N0:1. Con el objeto de aislar la región genómica correspondiente, se utilizó ADNc de B200Í4-2 como una sonda para seleccionar una biblioteca genómica de maíz Mol7 (Stratagene) . Se aislaron clones lambda que se hibridaron fuertemente con la sonda B200Í4-2. Se utilizó análisis Southern y mapeo de restricción para identificar los fragmentos genómicos que contenían la secuencia de ADNc respectiva con las regiones 5 ' y 3 ' . Se aisló un fragmento BamHI de aproximadamente 6.5 kb a partir de uno de los clones lambda positivos, y se subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene) , y se designó como pSH64. El clon B200Í4-2 genómico, pSH64 , que contenía las regiones reguladoras 5' y 3', se analizó mediante análisis de secuencia. También se utilizó exploración computarizada para identificar los elementos promotores supuestos. La secuencia de la región reguladora 5 ' y 3 ' del gen preferencial femenino contenido en el clon genómico pSH64 se estipula en la SEQ ID NO: 11. El clon pSH64 se depositó de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 27 de febrero de 1998 con el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, E.U.A. y con el número de acceso asignado NRRL B-21920. Un gen quimérico que se expresa de una manera preferencial en estructuras reproductoras femenina se construye como sigue. La región reguladora 5' de 431 pares de bases de B200i se amplificó a partir de pSH64 mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores 5'-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3 ' (SEQ ID NO: 12) y 51-GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3 ' (SEQ ID NO: 13), y se clonó como un fragmento PstI-BamHI en pSOGlO que contiene GUS fusionado con las secuencias de terminación nos. Luego se subclonó el cásete B200i-GUS-nos como un fragmento EcoRI en el pSH64 digerido con EcoRI , colocando efectivamente a GUS-nos corriente abajo de la región reguladora B200i de longitud completa (nucleótidos 1-3790 de la SEQ ID NO: 11) . Este plásmido se designó como pSH70. La región reguladora B200i a partir de pSH70, como se describe anteriormente, se clonó como un fragmento BglII-BamHI en BS-KS (Stratagene) , y se agregó la región reguladora 3 ' de B200i a partir de pSH64 corriente abajo como un fragmento EcoRV (nucleótidos 4427-6397 de la SEQ ID NO: 11). Este plásmido se designó como pSH73. El plásmido pSH74 se construyó mediante una digestión parcial con BamHI de pSH73, y ligando en un fragmento de ADN que contenía argE (del Ejemplo 1) en el sitio BamHI , colocando efectivamente el argE entre las regiones reguladoras 5 ' y 3 ' de B200i.

Ejemplo 5: Obtención de Clones de ADNc de Genes Novedosos Preferencialmente Expresados en la, Estructura Reproductora Femenina de Trigo Se aisló un fragmento de ADNc específico del pistilo a partir de trigo UC703, utilizando el método de Despliegue Visual Diferencial de ARNm de Genhunter (Genhunter cat.#M502), como se describe en el protocolo del estuche. Los cebadores utilizados para identificar el fragmento de ADNc específico del pistilo fueron AP-18 y T12 CA. El fragmento se subclonó en un vector de clonación pGEM-TA (Promega cat.#A362A), y se nombró como P26. El clon P26 se utilizó como una sonda en manchas Northern que contenían 5 microgramos de ARNm total a partir de pistilo de trigo, antera, hoja, y tejido de raíz, y se confirmó la especificidad del tejido. Se construyó una biblioteca de ADNc de pistilo de trigo utilizando pistilos aislados a partir de trigo UC703, siguiendo los procedimientos descritos en el Estuche de Clonación Zap cDNA GigaPack II Gold de Stratagene (Stratagene cat. #200402) . Se seleccionaron los clones que se hibridaron en la sonda P26 para el análisis de secuencia. Un clon, P26-A4, fue de 881 pares de bases de longitud, y contenía la secuencia P26 de 203 pares de bases. Las manchas Northern que contenían 5 microgramos de ARNm total a partir de cuatro etapas de desarrollo de pistilos, A) retoñados, B) surgidos, C) maduros, y D) fertilizados, así como la antera, la hoja, y la raíz, se hibridaron con la sonda P26-A4 de 881 pares de bases. Se detectó la expresión del pistilo predominante con una expresión muy menor detectada en la raíz. También se aisló un segundo fragmento de ADNc específico del pistilo a partir de trigo UC703, utilizando procedimientos similares a los anteriores. Este fragmento se subclonó en un vector de clonación pGEM-TA (Promega cat.#362A), y se denominó P19. El clon P19 se utilizó como una sonda en manchas Northern conteniendo 5 microgramos de ARNm total a partir de pistilo de trigo, antera, hoja, y tejido de raíz, y se confirmó la especificidad del tejido. Se construyó una biblioteca de ADNc de pistilo de trigo como se describe anteriormente. Los clones que se hibridaron con la sonda P19 se seleccionaron para el análisis de secuencia. Un clon, P19-QA, fue de 649 pares de bases de longitud, y contenía la secuencia P19. Las manchas Northern que contenían 5 microgramos de ARNm total a partir de cuatro etapas de desarrollo de pistilos, A) retoño, B) , surgido, C) maduro, y D) fertilizado, así como la antera, la hoja, y la raíz, se hibridaron con la sonda P19-QA de 649 pares de bases. La expresión demostró ser preferencial para el pistilo.

Ej empl o 6 : Obtención de Clones Genómicos de Genes Novedosos Preferencialmente Expresados en Estructuras Reproductoras Femeninas de Trigo, e Identificación de la Región Promotora Con el objeto de aislar la región genómica correspondiente, se utilizó el ADNc de P26-A4 como una sonda para selección una biblioteca genómica de trigo UC703 a la medida preparada a partir de plántulas de dos semanas de edad. La biblioteca se construyó mediante digestión parcial con Mbol del ADN genómico total, y el ligamiento subsecuente de la fracción de un tamaño de 8-22 kb con ADN de EMBL3 lambda digerido con BamHI (Clontech Cat. #CS1013j) . Se aislaron los clones lambda, los cuales se hibridaron fuertemente con la sonda P26-A4. Se utilizó análisis Southern y mapeo de restricción para identificar los fragmentos genómicos que contenían la secuencia de ADNc respectiva con las regiones 5 ' y 3 ' . Se aisló un fragmento Xbal de 5.5 kb a partir de uno de los clones lambda positivos, y se subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene) . Este se designó como pCIB10302. El clon P26-A4 se depositó de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 21 de enero de 1997, con el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, E.U.A., y se le asignó el número de acceso NRRL B-21655. El clon P26-A4 genómico, pCIB10302, que contenía las regiones reguladoras 5', se analizó mediante análisis de secuencia. También se utilizó exploración computarizada para identificar los elementos promotores supuestos. Además, las regiones 5 ' se mapean mediante enzimas de restricción de endonucleasa, y se determina el sitio de inicio de transcripción mediante reacción en cadena de la polimerasa RACE, y métodos de protección de ARNsa. La secuencia de la región reguladora 5' del gen preferencial femenino contenido en el clon genómico P26-A4 se estipula en la SEQ ID NO : 2. Con el objeto de aislar la región genómica correspondiente, se utilizó ADNc de P19 como una sonda para seleccionar una biblioteca genómica de trigo UC703 a la medida, preparada a partir de plántulas de dos semanas de edad, como se describe en el Ejemplo 6. Se aislaron los clones lambda, los cuales se hibridaron fuertemente en la sonda P19. Se utilizó análisis Southern y mapeo de restricción para identificar los fragmentos genómicos que contenían la secuencia de ADNc respectiva con las regiones 5' y 3' . Se aisló un fragmento Xhol de aproximadamente 8 kb a partir de uno de los clones lambda positivos, y se subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene) , designado como X2-1. El clon P19 genómico que contenía las regiones reguladoras 5' y 3' se analizó mediante análisis de secuencia.

También se utilizó exploración computarizada para identificar los elementos promotores supuestos. Además, se mapearon las regiones 51 y 3' mediante enzimas de restricción de endonucleasa. La secuencia de la región reguladora 5 ' del gen preferencial femenino contenida en el clon genómico X2-1, se estipula en la SEQ ID NO: 14. El clon X2-1 se depositó de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 27 de febrero de 1998, con el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, E.U.A., y se le asignó el numero de acceso NRRL B-21919.

Ej empl o 7 : Construcción de Genes Quiméricos que se Expresan de una Manera Preferencial en Estructuras Reproductoras Femeninas Se construyó el plásmido pFA200 mediante enlace operativo, utilizando los métodos convencionales conocidos en la técnica, con los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras P26, como se describieron anteriormente (nts 1-3987) , 2) un fragmento de ADN que contenía al gen argE diseñado con sitios de restricción apropiados para fusionar el ATG del marco de lectura abierta de argE adentro del marco con el sitio de inicio de traducción (ATG en el nucleótido 3987) del fragmento P26, fusionando de esta manera la región reguladora corriente arriba de P26 con argE, y 3) un vector que contenía las secuencias de terminación 3' que son funcionales en plantas. La expresión de argE bajo el control del promotor P26 expresará el producto genético argE preferencialmente en la estructura reproductora femenina de la planta. Las regiones reguladoras 5' de P19 (nucleótidos 1-1093 de la SEQ ID NO: 14) , se cortaron con Pst I, y se encontró un sitio de enzima de restricción justo corriente arriba de las secuencias P19 en el plásmido X2-1, y se ligó Ncol (nucleótido 1088 de la SEQ ID «NO: 14) en el ATG de P19, al pSOG15 cortado con PstI y Ncol (pS0G15 contiene al gen GUS y al terminador nos con un sitio PstI 5' para el gen GUS, y Ncol en el ATG del gen GUS) . Este plásmido se designó como pXBl . El plásmido pl9arg se construye mediante el enlace operativo, utilizando los métodos convencionales conocidos en la técnica, con los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras P19, como se describieron anteriormente, 2) un fragmento de ADN que contenía al gen argE diseñado con sitios de restricción apropiados para fusionar el ATG del marco de lectura abierta de argE adentro del marco con el sitio de inicio de traducción (ATG en 1090 de la SEQ ID NO: 14) del fragmento P19, fusionando de esta manera la región reguladora corriente arriba de P19 con argE, y 3) un vector que contenía las secuencias de terminación 31 que son funcionales en planta. La expresión de argE bajo el control del promotor P19 expresará el producto del gen argE preferencialmente en la estructura reproductora femenina de la planta. Se determinó la expresión transitoria de genes en estructuras reproductoras femeninas mediante suministro a tejidos intactos. Se recubrió tejido floral de trigo (pistilos y anteras) sobre un medio de Murashige y Skoog conteniendo maltosa al 15 por ciento. Se precipitó el ADN de pXBl ó pSH70 sobre partículas de oro en tamaño de mieras empleando procedimientos convencionales . Dos placas objetivo con 20 pistilos y anteras por objetivo, se dispararon dos o tres veces con el dispositivo de helio DuPont BiolisticsR utilizando una presión de ráfaga de 77 kg/cm2. Las placas se dispararon con una malla 80 en su lugar entre la etapa del portador y el objetivo. Los objetivos se colocaron en la oscuridad a 26°C durante 16 horas después del bombardeo, antes de que se transfirieran los tejidos a la mezcla de desarrollo GUS (100 miligramos de X-gluc en 200 mililitros de fosfato de sodio 0.05M, pH de 7) durante 2 a 24 horas a 37°C. Los genes GUS en pXBl y pSH70 produjeron actividad de GUS en los pistilos. Los ensayos de transformación transitoria de pSH70 en tejido de algodoncillo de maíz demostraron la expresión de GUS en los tejidos femeninas.

Ejemplo 8; Transformación de Trigo con un Gen Quimérico que Codifica una Proteína que Cataliza la Conversión de una Protoxina a una Toxina de una manera Preferencial de Femeninas Se recubren embriones inmaduros (de 0.75 a 1.0 milímetros de longitud) del genotipo UC703, sobre un medio de Murashige y Skoog conteniendo 3 miligramos/litro de 2,4-D y 3% de sacarosa. Después de aproximadamente 4 horas, se recubren los embriones con el lado del eje del embrión hacia abajo, sobre placas que contienen medio de Murashige y Skoog con 15 por ciento de maltosa, sacarosa al 3 por ciento de sacarosa, y 3 miligramos/litro de 2,4-D sobrepuesto con una losa soportada en papel filtro de agarosa conteniendo los mismos componentes. Se permite que los embriones se plasmolicen durante 2 a 3 horas antes del bombardeo . Se precipita ADN de pFA200 y pSOG35 sobre partículas de oro en tamaño de mieras empleando procedimientos convencionales. Cuatro placas blanco con 20 embriones por objetivo se disparan dos veces con el dispositivo de helio DuPont BiolisticsR utilizando una presión de ráfaga de 77 kg/cm2. Las placas se disparan con una malla 80 en su lugar entre la etapa del portador y el objetivo. Los objetivos se colocan en la oscuridad a 26°C durante 24 horas después del bombardeo, antes de que se extiendan las losas con los embriones sobre placas conteniendo medio de Murashige y Skoog con 3 miligramos/litro de 2,4-D y 3 por ciento de sacarosa. Se remueven los embriones individuales de las losas, y se colocan directamente sobre un medio fresco de la misma composición después de otras 48 horas. Aproximadamente seis semanas después del suministro del gen, se coloca el tejido que responde sobre un medio de Murashige y Skoog con 3 miligramos/litro de 2,4-D y 3 por ciento de sacarosa, con 0.2 miligramos/litro de metotrexato durante un período de 3 semanas . Luego el tej ido se coloca sobre un medio de regeneración comprendido de medio de Murashige y Skoog con 1 miligramo/litro de ribosida de zeatina y 1 miligramo/litro de metotrexato. Después de 2 semanas, se colocan las plántulas en regeneración en recipientes estériles denominados "GA7s" con sales de Murashige y Skoog a media concentración, 10 por ciento de sacarosa, 1 miligramo/litro de NAA, y ya sea 4 u 8 miligramos/litro de metotrexato. En otro ejemplo, se procesan embriones inmaduros (de 0.75 a 1.0 milímetros de longitud) del genotipo UC703 como se describió anteriormente, excepto que se utiliza un medio de Murashige y Skoog conteniendo 2 miligramos/litro de 2,4-D. Después de aproximadamente 4 horas, se recubren los embriones con el lado del eje del embrión hacia abajo sobre placas conteniendo medio de Murashige y Skoog con 15 por ciento de maltosa, al 3 por ciento de sacarosa, y 2 miligramos/litro de 2,4-D, sobrepuesto con una losa soportada en papel filtro de agarosa conteniendo los mismos componentes. Se permite que los embriones se plasmolice durante 2 a 3 horas antes del bombardeo. El ADN de pFA200, pSH74 , ó pl9arg, junto con pUbi-Hyg conteniendo al promotor de ubiquitina de maíz operativamente enlazado con el gen de higromicina fosfotransferasa, se precipita sobre partículas de oro en tamaño de mieras empleando procedimientos convencionales. Cuatro placas objetivo con 20 embriones por objetivo se disparan dos veces con el dispositivo de helio DuPont BiolisticsR utilizando una presión de ráfaga de 77 kg/cm2. Las placas se disparan con una malla 80 en su lugar entre la etapa del portador y el objetivo. Los objetivos se colocan en la oscuridad a 26°C durante 24 horas después del bombardeo, antes de que se extiendan las losas con los embriones sobre placas conteniendo medio de Murashige y Skoog con 2 miligramos/litro de 2,4-D y 3 por ciento de sacarosa. Aproximadamente 3 semanas después del suministro del gen, se coloca el tejido que responde sobre un medio de Murashige y Skoog con 3 miligramos/litro de 2,4-D y 3 por ciento de sacarosa. Luego se coloca el tejido sobre un medio de regeneración comprendido de medio de Murashige y Skoog, 3 por ciento de sacarosa, 5 miligramos/litro de GA3 , 1 miligramo/litro de NAA, y 20 miligramos/litro de higromicina. Después de 2 semanas, el tejido en regeneración se transfiere a un medio comprendido de medio de Murashige y Skoog con al 3 por ciento de sacarosa y 20 miligramos/litro de higromicina. Después de 2 semanas, las plántulas en generación se colocan en recipientes estériles denominados "GA7s", con sales de Murashige y Skoog a media concentración, 2 por ciento de sacarosa, 1 miligramo/litro de NAA, y 20 miligramos/litro de higromicina. Se extrae el ADN del tejido de la hoja de las plantas derivadas a partir de la transformación, y se ejecuta la reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia de los genes marcadores seleccionables dhfr ó hyg y el gen argE . Las plantas positivas en la reacción en cadena de la polimerasa se envían al invernadero para su propagación. Durante las etapas de florecimiento, se recolectan los pistilos de cada planta transgénica, y se hace el ARN de este tejido. La expresión de argE se confirma mediante análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan, y se recolectan las semillas.

Ejemplo 9 : Construcción de Genes Quiméricos que se Expresan de una Manera Preferencial en Estructuras Reproductoras Masculinas Se utiliza el plásmido pGK73 como un punto de partida. Se remueven las secuencias de terminación TA29-argE-3' como un cásete del vector de transformación de Agrobacterium, y se ligan en pBluescript KS+ utilizando enzimas de restricción apropiadas. El plásmido resultante es referido como pMA200. Se construyó el promotor específico de la antera, B6, a partir del plásmido, pSGBNEl, que contiene un clon genómico de 3 kb subclonado como un fragmento EcoRI-Nhel a partir de pSGB6gl (ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,470,359) . Un fragmento Apall/Xbal de 1558 pares de bases se clonó romo en Bluescript (KS) en el sitio Smal. Se construyó una fusión de traducción al gen argE como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. El plásmido resultante es referido como pSH68. El promotor específico del polen Zmg, un fragmento HindIII-PpuMI de 1 kb de Zmgl3 (Hamilton y colaboradores, Sexual Plant Reproduction 2, 208-212 (1989)) se clonó a partir de pCIB391 en bluescript como un fragmento HindIII-Smal . Se agregó la región de terminación de transcripción nos como un fragmento BamHI-Xbal. Luego se ligó la secuencia de codificación para argE como un fragmento BamHI (del Ejemplo 1) en el sitio BamHI, colocando efectivamente argE entre el promotor Zmg y las secuencias de terminación nos. Este plásmido es referido como Zmgarg .

Ejemplo 10 : Transformación de Trigo con un Gen Quimérico que se Expresa de una manera Preferencial de Masculina Los plásmidos pUbi-Hyg, que contienen al promotor de ubiquitina de maíz operativamente enlazado con el gen para higromicina fosfotransferasa, y pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg, se utilizan como las secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de trigo, como se describe en el Ejemplo 8. Las plantas se regeneran, y se utiliza reacción en cadena de la polimerasa para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las etapas de florecimiento, se recolectan las anteras, y se hace el ARN de este tejido, y se confirma la expresión de argE mediante análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan, y se recolectan las semillas.

Ejemplo 11 Transformación de Maíz con un Gen Quimérico que Codifica una Proteína que Cataliza la Conversión de una Protoxina a una. Toxina d una manera Preferencial de Femenina Se obtiene callo Tipo I a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo CG00526, utilizando técnicas de cultivo convencionales. Para el suministro del gen, se preparan aproximadamente 300 miligramos de callo Tipo I picando con un escalpelo, enjuagando tres veces con un medio de cultivo estándar conteniendo 18 por ciento de sacarosa, y se colocan inmediatamente sobre un medio de cultivo semisólido que contiene nuevamente 18 por ciento de sacarosa. Después de aproximadamente 4 horas, se bombardea el tejido utilizando el dispositivo PDS-1000/He Biolistic de BioRad. Uno de los siguientes plásmidos: pFA200, pSH74 ó pl9arg, junto con pSOG35, se precipita sobre partículas de oro de 1 miera utilizando el protocolo estándar de BioRad. Aproximadamente 16 horas después del suministro del gen, se transfiere el callo a un medio de cultivo estándar conteniendo 2 por ciento de sacarosa y 2 miligramos/litro de metotrexato. El callo se subcultiva sobre selección durante 8 semanas, después de lo cual se transfiere el callo sobreviviente y en crecimiento a un medio de regeneración estándar para la producción de plantas . Se obtienen plantas, y se les dan números de evento. Las plantas de cada evento se ensayan mediante reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia del gen argE, y las plantas positivas en la reacción de cadena de la polimerasa se transfieren al invernadero. Durante el florecimiento, se recolectan las mazorcas, se hace el ARN a partir de este tejido, y se confirma la expresión de argE mediante análisis Northern. De una manera alternativa, se obtienen plantas de maíz transgénicas mediante bombardeo con microproyectiles de embriones inmaduros. Las mazorcas del genotipo CG00526 se auto-polinizan, y se obtienen embriones cigóticos inmaduros aproximadamente 10 días después. Aproximadamente 840 embriones cigóticos inmaduros se dividen entre 14 placas blanco diferentes que contienen un medio capaz de inducir y soportar la formación de callo embriogénico. Los embriones cigóticos inmaduros se transfieren inmediatamente al mismo medio, pero conteniendo 12 por ciento de sacarosa. Después de 5 horas, los embriones cigóticos inmaduros se bombardean con pFA200 ó pSH74 ó pl9arg, junto con pSOG35, utilizando el dispositivo PDS-1000/He de BioRad. Los plásmidos se precipitan sobre partículas de oro de 1 miera esencialmente de acuerdo con el procedimiento publicado de BioRad, como se describió anteriormente. Las partículas se suministran utilizando una presión de ráfaga de 108.5 kg/cm2. Cada placa blanco se dispara dos veces con la preparación de plásmido y partícula de oro. El agente de selección, metotrexato, se aplica en 2 miligramos/litro en - el día del suministro del gen, y se incrementa hasta después de aproximadamente 1 mes. El callo embriogénico así obtenido se regenera en la presencia del agente de selección metotrexato. Se obtienen plantas, y se les dan números de evento. Las plantas de cada evento se ensayaron mediante reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia del gen argE, y las plantas positivas en la reacción en cadena de la polimerasa se transfieren al invernadero. Durante el florecimiento, se recolectan las mazorcas, se hace el ARN a partir de este tejido, y se confirma la expresión de argE mediante análisis Northern.

Ejemplo 12 : Transformación de Maíz con un Gen Quimérico que Codifica una Proteína que Cataliza la Conversión de una Protoxina a una Toxina de una manera Específica Preferencial de Masculina Se utilizan los plásmidos pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg y pSOG35 como las secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de maíz como se describe en el Ejemplo 11. Las plantas se regeneran, y se utiliza reacción en cadena de la polimerasa para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las etapas de florecimiento, se recolectan las borlas, se hace el ARN a partir de este tejido, y se confirma la expresión de argE mediante análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan, y se recolectan las semillas.

Ejemplo 13 : Transformación de Cebada que Codifica una Proteína que Cataliza la Conversión de una Protoxina a una Toxina de una manera Preferencial de Femenina Se cosechan espigas de cebada (variedad Golden Promise) con embriones inmaduros de un tamaño de aproximadamente 1.5 a 2.5 milímetros, se esterilizan superficialmente en blanqueador al 15 por ciento (volumen/volumen) (hipoclorito de sodio al 5.25 por ciento) durante 10 minutos, y se enjuagan cinco veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se disectan a partir de cariopsas jóvenes y se bisectan longitudinalmente. Se recubren sobre un medio de inducción de callo (Wan y Lemaux, Plant Physiology 104:37-48 (1994)) conteniendo sales básicas de Murashige y Skoog complementadas con 30 gramos/litro de maltosa, 1 miligramo/litro de tiamina-HCl, 0.25 gramos/litro de mio-inositol, 1 gramo/litro de hidrolizado de caseína, 0.69 gramos/litro de prolina, 2.5 miligramos/litro de dicamba, y se solidifica con 3.5 gramos/litro de PhytagelR (Sigma) . Para el bombardeo de los embriones, se incuban los embriones con el lado del escutelo hacia arriba en la oscuridad a 24-28°C durante 1 a 3 días. En el día de la transformación, los embriones se colocan en el centro de una caja de Petri (100 x 15 milímetros) para formar un anillo. El ADN de los plásmidos pFA200 ó pSH74 ó pl9arg, junto con pUbi-hyg, se precipita sobre partículas de oro de 0.6 ó de 1.0 mieras (Bio-Rad) siguiendo el manual DuPont Biolistic Particle Delivery Systems. Cada placa de embrión se dispara una vez con una pistola de helio DuPont PDS-1000 utilizando una ráfaga de una presión de 77 kg/cm2. Después del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio de inducción de callo fresco con el lado del escutelo hacia abajo. De 3 a 7 días después del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio de selección (medio de inducción de callo más 10 miligramos/litro de higromicina) durante aproximadamente 14 días. El callo derivado se rompe en pedazos más pequeños, y se mantienen por separado. En los subcultivos subsecuentes, el callo se transfiere a un medio de selección fresco con 20 miligramos/litro de higromicina, aproximadamente cada 21 a 28 días. Después de 2 a 3 subcultivos, el callo sobreviviente se transfiere a un medio FHG (Hunter, Ph.D. thesis, Wye College, Universidad de Londres, Ashford, Kent, 1988) complementado con 1 a 3 miligramos/litro de 6-bencil-aminopurína, y de 10 a 20 miligramos/litro de higromicina para la regeneración de las plantas. Las plantas se regeneran a 23-25°C bajo luces fluorescentes . Los retoños verdes/plántulas que emergen se transfieren a un medio exento de hormonas basado en sales básicas de Murashige y Skoog en una caja de Petri de 25 x 100 milímetros. Las plantas se transfieren a un contenedor Magenta GA7 para un desarrollo adicional, cuando alcanzan un tamaño de 2 a 3 centímetros . Para el bombardeo del callo, los embriones se incuban con el lado del escutelo hacia abajo en la oscuridad a 24-28°C durante cuando menos 10 días. En el día de la transformación, se corta el callo embriogénico de los embriones cultivados en pequeños pedazos, y se colocan en el centro de una caja de Petri. El suministro de ADN y los siguientes pasos de regeneración de la planta son idénticos a los descritos en el bombardeo del embrión. Las plantas se ensayan mediante reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia del transgén, y las que son positivas se transfieren al invernadero. Durante las etapas de florecimiento, se recolectan los pistilos, y se hace el ARN a partir de este tejido. La expresión de argE se confirma mediante análisis Northern. Las plantas son auto-fértiles, y se cosechan las semillas.

Ejemplo 14 : Transformación de Cebada con un Gen Quimérico que Codifica una Proteína que Cataliza la Conversión de una Protoxina a una Toxina de una Manera Preferencial de Masculina Se utilizan los plásmidos pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg y pUbi-Hyg como las secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de cebada y callo, como se describe en el Ejemplo 13. Las plantas se regeneran, y se utiliza reacción en cadena de la polimerasa para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las etapas de florecimiento, se recolectan las anteras, y se hace el ARN de este tejido, y se confirma la expresión de argE mediante análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan, y se recolectan las semillas.

Ejemplo 15: El Tratamiento Químico de Plantas Transformadas Confiere Esterilidad Condicional Las semillas de la generación Tx de plantas transformadas con pFA200 ó pSH74 ó pl9arg (que confiere esterilidad femenina condicional) , y las plantas transformadas con pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg (que confieren esterilidad masculina condicional) se plantan en el suelo. Una vez que han crecido las plantitas hasta un tamaño suficiente, se analiza el tejido de la hoja mediante reacción en cadena de la polimerasa, para determinar la presencia del transgén argE. Las plantas positivas en la reacción en cadena de la polimerasa se transfieren al invernadero. Estas plantas son completamente fértiles. Un subconjunto de las plantas que contienen pFA200 ó pSH74 ó pl9arg, y un subconjunto que contiene pMA200 ó pSH68 ó pZmarg, se tratan con la protoxina acetil-PPT durante las etapas de crecimiento. Las plantas transformadas con pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg (se necesitan homocigotos para la construcción del promotor de polen Zmgarg) son masculinos-estériles como un resultado de la conversión de acetil-PPT a PPT en las estructuras reproductoras masculinas. Las plantas transformadas con pFA200 ó pSH74 ó pl9arg son femeninas-estériles como un resultado de la conversión de acetil-PPT a PPT en las estructuras reproductoras femeninas. Las plantas no tratadas transformadas con pFA200 ó PSH74 ó pl9arg y pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg son completamente fértiles.

Ejemplo 16: Producción de Semillas Híbridas de Trigo Utilizando Plantas Transgénicas que Convierten una Protoxina a una Toxina en Estructuras Reproductoras Femeninas Las plantas de trigo transgénicas de los Ejemplos 8 y 10, que se transformaron con pFA200 ó pSH74 ó pl9arg (que confieren esterilidad femenina condicional) , y pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg (que confieren esterilidad masculina condicional) se reproducen como líneas de plantas homocigotas para cada uno de los transgenes, y las semillas se multiplican mediante prácticas convencionales. Las semillas homocigotas de las plantas que contienen pFA200 ó pSH74 ó pl9arg, y las plantas que contienen pMA200 ó pSH68 ó pZmgarg, se interplantan en una proporción de progenitoras masculinas a femeninas suficiente para garantizar una transferencia eficiente del polen. En un tiempo apropiado durante el desarrollo de la planta, se aplican la protoxina acetil-PPT al campo. En seguida de que madura la semilla, se cosecha todo el campo de producción, produciendo solamente semillas híbridas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de capacidad de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia hasta el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente o individualmente indicada como incorporada como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Crossland, Lyle D Harper, Stacy M (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Método de producción de semillas híbridas utilizando esterilidad femenina condicional . (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIA: Novartis Corporation - Departamento de Patentes y Marcas . (B) CALLE: P.O. Box 12257 (C) CIUDAD: Research Triangle Park (D) ESTADO: NCNY (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 22057 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US TBA (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-FEBRERO-1998 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US (prov) (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Pace, Gary M. (B) NUMERO DE REGISTRO: 40,403 (C) REFERENCIA/NUMERO DE CASO: CGC 1915/Reg (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO 919-541-8582 (B) TELEFAX: 919-541-8689 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 772 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA.: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "secuencia de ADNc para transcripción preferencial de femenina designada como B200Í4-2" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : GTCCTACGTG GTCGAGGACT ACAGCAAGAA ATGGGGGTCT ACAAGTCTGC AGTTCTGCTT 60 GGTGTGGTTT TGGCCTCAGT CCTTCTCGGC TTCCTGGACG TTGTGTACGC AAGGGAGCTC 120 ?CTGAAGCCA ATGGCTCTGG AGTGAAGAAT AATGTGAAGC CTGCAGGAGA GCCTGGGCTC 180 AAG ATG GA AGTGGTTTGG TGGTGGATAC AAGCATGGTG GAGGGTATGG AAACAACCAG 240 CCAGGATACG GTGGCGGAGG AAACAGCCAA CCTGGATACG GCGGCGGAGG AAACAGTCAG 300 CCCGGATACG GTGGAGGATA CAAGCGCCA CACCCTGGTG GCGGCTACGG GTCTGGACAA 360 GGAGGG *- .. GATGTGGATG GGAGGAGGG TATGGAGGTG GCAATGGTAG TCCTGGGTAC 420 uo x i ?? ?-A i u? rtL 1 GGTGGCGGAA ATGGCAATGC TGGTGGGTAC 480 TTA GGAGGC GGCTACGGCA GTGGTAGTGG TACAGCACCA 540 ATCATGGCGG TGGTGGTGCA CAACGCTACG CTGGGCAAAA CTAGCAAGAA 600 TGCTAGTTTA TGTTAAATAA ACGATCCATT GTTCATGTGA CTGAGCAATT 660 AGGATCTTGA CTCGTGTTAT T GTGTTACC ATATGTATTG GTTGTTTTAT 720 AATG CACC GCTATTTGTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 772 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4126 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : TATA_señal (B) LOCALIZACION: 3864 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: características_varias (B) LOCALIZACION: 3912 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "sitio de inicio de transcripción" . (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : características_varias (B) LOCALIZACION: 3983 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "sitio ATG utilizado para las fusiones de traducción" . (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : TCTAGATTAT TGAATCTAGT GCA G GGGA GACTGAAGGA AATATGCCCT AGAGGCAATA 60 ATAAAGTTGT TA TTACATT TCCTTATATC ATGATAAATG TCTATTATTC ATGCTAGAAT 120 TGTATTAACC AGAAACTTGA TACATGTGTG GATACA AGA CAAAACACAG TGTCCCTAGT 180 AAGCCTCTAC TAGATTAGCT CGTTAATCAA AGATGGTTAA GTTTCCTAAC CATATACATG 240 TG TG CA T TGATGAACGG GATCACATTA TTAGGAGAAT GATGTGATGG ACAAGACCCA 300 A?AGGGAATG AGGTTTTACT CATGGACTAC TTGCCCAAGT GCTTAGAGAT ATTGCTCCAA 2340 AACCCTCAGC CACACCCTCA CATTCATCTA TTTCCAAAAC CCTAAAGCCT ATCTCGGTCC 2400 CACCAAAACA CATCCAACCG GACCCACCAA GATACACTTG ACATAGTCGC TGCCTAAACC 2460 CAAGCAACTT GGTCCCACCG GGATGACCCT CCGGTCTCAC CGAAGAGCAC TTGCCAACCT 2520 TCTGTAACCT ATCATTTCAT CTCGGAAATT CCGAGAGGT TCGATAGGTC TTAGCGAAGT 2580 GTGAAAAGTG ATTAGGTCAT CACCATTCGG TCTCACCGCA CTGTTCTATC CGGTCTCACC 2640 GAAAATTCTG AAGTTCAAAC CTTTTGTGCT AGTCGGCCTC ACCAAGTGAT TTCATCCGGT 2700 CCCACTGAGT AGTGCATAAA GGTGTGTGCT TAGTGCCTAT ATATACGTCC ACCCATTCCA 2760 CCAACTCTCA GAGAGCAATC AGGACGAAAC TACCACTTCC CA ATTCATT TTCTGAGAGA 2820 G.AACCACCTG CACTTGTGTT GAAATCAAGG GGATTCCAC CCAACCTTTG ATCTTTGATT 2880 TCTATCCCCC TCAAGTGGC TTCCACTCTA CTCATTC CC TGCCACATAG CCAAATCTGT 2940 GAGAGAATGA TTGGGTGTTG AGGTGACTAT CTTTTGAAAC ACAAAAATAA GGAGTTCATC 3000 AGCAACAACA ACATC AT A CCTTTGTGAG AGTGGTGTCT TCCAGATTGG TTAGGTGTCA 3060 CTTGGGAGCC TCCAAGATGT GGAGTTGAAC CAAGGAGTTT GTAAAGGTAA AGAGATCGCC 3120 TACTTCATGA AGAT TACCT GAGTGAGGCT AGTCCTTCAT GGGCGTAAGC CATGGTGACA 3180 TAGATAAGGT TGCATTTGAT CTTCCAAACC CCCTCCTTTA TGTTCATATG CAAAGTCTTT 3240 ACT TCTGCT GCC ACTAAC TTAGACTTGC ATGTATAGAG TGTGACAAGA CTTGTTAGAA 3300 TTGCCAAAAC TTGCCTAGAA TT.AAAATTGG GAAAAGGTCA AGTTTTTACT TGCCAAGTAG 3360 TCTAATCCCC TCCCCCCTAC TAGACCTACT TGCGATCCTA CAAAGTGACG CCGCGCTCTA 3420 CTCCGGCCGC ATCACTCTGA AGCGGTGGTC ACCTGCATGA ATGCACGGTA ACCGCTTCTC 3480 GTGGAGAGGG TTTTCGGGCA CA^GGG TTT TGGGTGGGAC CGTGGTGTCG GGCGAGGGCG 3540 TGTATGTATC TGCAATCCGG TCGTTGTGTC CGGTTTGTGG AAAAACGGAC AACCAGATCG 3 600 G~ CACAGAT C.AATAGGATA CTGCATTGGA TGGTAAATTT CATCTAAAGA CCGATGAGAT 3660 ACCGCGTTGA ATGATAAATT ACATCCTAAC TACCCGATCC AGATG." TTGC AGACAGTTTA 3720 AGGGTCAGAG ATGCACTT.AA GGTCACCAT GAACAAACAT CTGCACCCCA CGCCATTCTC 3780 GCAC GGCCT CAT TACAGC CTCCCCATCT GCCCCGCTCG ACTCTCCATC GCACCATACG 3840 TACTCCCYTC CTCCTCCTCG GCCTATTTAA ACCGCAAGC TCACCACACC AAATGCACTA 3900 GTAGGAACGA TC7CACGCGC AACACAAGAG AGAGCGAATA GAACCGACAT CCGTAGCTGG 3960 TTTGCTAG ^C T ^G ^G GGCG CCATGGCCAA GAAGGGCTCA GGCACTGCCG CCTCTCTCCT 4020 GCTCTGCC C GCGCTGGCGG CGCACACCGT CG GGCTGCC AGGACCATGC CCGCTGCAGC 4080 4126 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2070 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACION: 211.1362 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto = "N-acetilorni- tinasa" . (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 GGTCACTAGC TCTGCGCCAG CGTAGCCGCT GGCACCCACA ATCAGCGTAT TCAACATCGG 60 GGCTATTCAC CTTCTTATGT CTGGTTGCCA GGTTAAACGT AAAACATTCA CCTTACGGCT 120 GGTGGGTTTT ATTACGCTCA ACGTTAGTGT ATTTTTATTC ATAAATACTG CATGAATATT 180 GATACTATCA TGACCAGAGG TGTGTCAACA ATG AAA AAC AAA TTA CCG CCA TTT 234 Met Lys Asn Lys Leu Pro Pro Phe 1 5 ATC GAG ATT TAC CGC GCT CTG ATT GCC ACÁ CCT TCA ATA AGC GCC ACG 282-lie Glu lie Tyr Arg Ala Leu lie Ala Thr Pro Ser lie Ser Ala Thr 10 ' 15 20 GAA GAG GCA CTC GAT CAÁ AGC AAT GCA GAT TTA ATC ACT CTG CTG GCG 330 Glu Glu Ala Leu Asp Gln Ser Asn Ala Asp Leu lie Thr Leu Leu Ala 25 30 35 40 GAC TGG TTT AAA GAT TTG GGC TTC AAT GTG GAA GTG CAG CCT GTT CCA -378 Asp Trp Phe Lys A=p Leu Gly Phe Asn Val Glu Val Gln Pro Val Pro 45 50 55 GGA ACT CGC AAC AAA TTC AAT ATG CTG GCA AGT ATC GGA CAG GGG GCT 426 Gly Thr Arg Asn Lys Phe Asn Met Leu Ala Ser He Gly Gln Gly Ala 60 65 ' 70 GGC GGC TTG TTG CTG GCG GGG CAT ACC GAT ACG GTG CCA TTT GAT GAC 474 Gly Gly Leu Leu Leu Ala Gly Kis Thr Asp Thr Val Pro Phe Asp Asp 75 80 85 GGT CGC TGG ACG CGC GAT CCG TTT ACÁ CTG ACG GAG CAT GAC GGC AAG 522 Gly Arg Trp Thr Arg Asp Pro Phe Thr Leu Thr Glu His Asp Gly Lys 90 95 100 CTT TAC GGC TTA GGC ACC GCC GAC ATG AAA GGC TTT TTT GCG TTT ATC 570 Leu Tyr Gly Leu Gly Thr Ala Asp Mee Lys Gly Phe Phe Ala Phe He 105 110 115 120 •T G; 3CG C "S í~, GC GAT G GAC GTC ACG AAA CTG AAA AAA CCG CTC 618 Leu Asp Ala Leu Arg Asp Val Asp Val Thr Lys Leu Lys Lys Pro Leu ' 125 130 135 TAC ATT CTG GCG ACT GCT GAT GAA GAA ACC AGT ATG GCC GGA GCG CGT 666 Tyr He Leu Ala Thr Ala Asp Glu Glu Thr Ser Mee Ala Gly Ala Arg 140 145 150 TAT TTT GCC GAA ACT ACC GCC CTG CGC CCG GAT TGC GCC ATC ATT GGC 714 Tyr Phe Ala Glu Thr Thr Ala Leu Arg Pro Asp Cys Ala He He Gly 155 160 165 G.A CCG ACG TCA CTA CAÁ CCG GTA CGC GCA CAT AAA GGT CAT ATC TCT 762 Glu Pro Ser Leu Gln Pro Val Arg Ala His Lys Gly His He Ser 170 175 180 AAC GCC ATC CGT ATT CAG GGC CAG TCG GGG CAC TCC AGC GAT CCA GCA 810 Asn Ala He Arg He Gln Gly Gln Ser Gly His Ser Ser Asp Pro Ala 185 190 195 200 CGC GGA GTT AAC GCT ATC GAA CTA ATG CAC GAC GCC ATC GGG CAT ATT 858 Arg Gly Val Asn Ala He Glu Leu Mee His Asp Ala He Gly His He 205 210 215 TTG CAÁ TTG CGC GAT AAC CTG AAA GAA CGT TAT CAC TAC GAA GCG TTT 906 Leu Gln Leu Ara Asp Asn Leu Lys Glu Arg Tyr His Tyr Glu Ala Phe ==0 225 230 ACC G * J CCA TAC CCT ACG CTC AAC CTC GGG CAT ATT CAC GGT GGC GAC 954 Val Pro Tyr Pro Thr Leu Asn Leu Gly His He His Gly Gly Asp 235 240 245 GC TCT .AAC GCT TGC TGT GAG TTG CAT ATG GAT ATT CGT 1002 Al Ser Asr. Arg lie Cys Ala Cys Cys Glu Leu His Met Asp 'He Arg 250 255 260 CCG ACÁ :tc AT GAA CTT AAT GGT TTG CTC AAC GAT 1050 Pro Leu Pro Gly jeu ?sp Glu Leu Asn Gly Leu Leu Asn Asp 265 275 -280 GCA CGC TGG CCG GGT CGT CTG ACG GTC GAC 1098 Ala ,a- Ala Pro Val Ser Glu Arg Trp Pro Gly Arg Leu Thr Val Asp 235 290 295 GAG TAT GAA TGC CCA CCG AAT CAT CAÁ 1146 Glu Pro Pro Tyr Glu Cys Pro Pro Asn His Gln 305 310 CTG GTT GAA GTG GTT GAG AAA TTG CTC GGA GCA AAA ACC GAA GTG GTG 1194 Leu Val Glu Val Val Glu Lys Leu Leu Gly Ala Lys Thr Glu Val Val 320 325 AAC TGT ACC GAA GCG CCG ATT CAÁ ACG TTA TGC CCG ACG CTG 1242 Asn l'yr Cys Thr Glu Ala Pro Phe He Gln Thr Leu Cys Pro Thr Leu 340 - *-? ? - - AAT CAG GCT CAT CAÁ CCT GAT GAA TAT 1290 Va -eu Glv ro Glv Ser He Asn Gl.n Ala His Gln Pro Asp Glu Tyr 345 350 355 360 CTC _AA :A CGG CCC ACC CGC GAA CTG ATA ACC CAG GTA 1338 Lev Arg Phe He Lvs Pro Thr Arg Glu Leu He Thr Gln Val 365 370 375 ATT CAC CAT . >_-\ .-^ GGTAGGCC GGATAAGGCG CTCGCGCCGC 1392 He fi:s His ?ne Cys Trp His 380 ATC : . o .. .. ^ *_ ñ_". •— . - i-.-\u GCCG CAATAATGTC GGATGCGATG CTTGCGCATC 1452 TA * *- "^ ¿ f- » "^^ * ' ATGC CC.AACCGTAG GCCGGATAAG GCGCTCGCGC 1512 -T CGCAATAAT G CGGATGCG ATACTTGCGC 1572 CGCCGCATCC GGCACTGTTG CCAAACTCCA GTGCCGCAAT AATGTCGGAT GCGATACTTG 1692 CGCATCTTAT CCGACCTACA CCTTTGGTGT TACTTGGGGC GATTTTTTAA CATTTCCATA 1752 AGTTACGCTT ATTTAAAGCG TCGTGAATTT AATGACGTAA ATTCCTGCTA TTTATTCGTT 1812 TGCTGAAGCG ATTTCGCAGC ATTTGACGTC ACCGCTTTTA CGTGGCTTTA TAAAAGACGA 1872 CGAAAAGCAA AGCCCGAGCA TATTCGCGCC AATGCGACGT GAAGGATACA GGGCTATCAA 1932 ACGATAAGAT GGGGTGTCTG GGGTAATATG AACGAACAAT ATTCCGCATT GCGTAGTAAT 1992 GTCAGTATGC TCGGCAAAGT GCTGGGAGAA ACCATCAAGG ATGCGTTGGG AGAACACATT 2052 CTTGAACGCG TAGAAACT 2070 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 384 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 Met Lys Asn Lys Leu Pro Pro Phe He Glu He Tyr Arg Ala Leu He 1 " 5 10 15 Ala Thr Pro Ser He Ser Ala Thr Glu Glu Ala Leu Asp Gln Ser Asn 20 25 ' 30 Ala Asp Leu He Thr Leu Leu Ala Asp Trp Phe Lys Asp Leu Gly Phe 35 40 45 Asn Val Glu Val Gln Pro Val Pro Gly Thr Arg Asn Lys Phe Asn Met 50 55 60 Leu Ala Ser He Gly G n Gly Ala Giy Gly Leu Leu Leu Ala Gly His 65 70 75 80 Thr Asp Thr '.'al Pro Pne Asp Asp Gly Arg Trp Thr Arg Asp Pro Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Glu H s Asp Gly Lys Leu Tyr Gly Leu Gly Thr Ala Asp 100 105 110 Met Lys Gly Phe Phe Ala Phe He Leu Asp Ala Leu Arg Asp Val Asp 115 120 125 Val Thr Lys Leu Lys Lys Pro Leu Tyr He Leu Ala Thr Ala Asp Glu 130 135 140 Glu Thr Ser Mee Ala Giy Ala Arg Tyr Phe Ala Glu Thr Thr Ala Leu 145 150 155 160 Arg Pro Asp Cys Ala He He Gly Glu Pro Thr- Ser Leu Gln Pro Val 165 170 175 Arg Ala His Lys Gly His He Ser Asn Ala He Arg He Gln Gly Gln 180 185 190 ' Ser Gly H..S Ser Ser Asp Pro Ala Arg Gly Val Asn Ala He Glu Leu 195 200 205 Met His Asp Ala He Gly His He Leu Gln Leu Arg Asp Asn Leu Lys 210 215 220 Glu Arg Tyr His Tyr Glu Ala Phe Thr Val Pro Tyr Pro Thr Leu Asn 225 230 225 240 Leu Gly His His Gly Gly Asp Ala Ser Asn Arg He Cys Ala Cys 245 250 255 Cys Glu Leu ,-.?s Mee Asp He Arg Pro Leu Pro C-ly Mee Thr Leu Asn 260 265 270 Asn Gly Leu Leu Asn Asp Ala Leu .a Pro Val Ser Glu Arg 275 280 285 Trp Pro Gly Arg Leu Thr Val Asp Glu Leu His Pro Pro He Pro Gly- 290 295 300 Tyr Glu Cys Pro Pro Asn His Gin Leu Val Glu Val Val Glu Lys Leu 305 310 315 320 Leu Gly Ala Thr Glu Val Val Asn Tyr Cys Thr Glu Ala Pro Phe 325 330 335 Leu Cys Pro Thr Leu Val Leu Gly Pro Gly Ser He Asn 340 345 350 His Pro Asp Glu Tyr Leu Glu Thr Arg Phe He Lys Pro 355 360 365 ?hr Arg Glu Thr G n Val He His His Phe Cys Trp His 370 375 230 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para argE" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 TATCTAGACC AGAGGTGTGT CAACAAATGA A 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para argE" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : CGTCTAGATT GCGGCACTGG AGTTTC 26 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para argE" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 CGCGGATCCT AAACAATGAA AAACAAATTA CCGCC 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para argE" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 GCGCCTAGGC GCTTAATGCC AGCAAAAATC C 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para TA29" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 AACTGCAGCT TTTTGGTTAG CGAATGC 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para TA29" (üi) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CAGACTAGTT TTAGCTAATT TCTTTAAGTA AAAAC 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6596 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: promotor (B) LOCALIZACION: 1..3790 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "Región reguladora 5 ' de B200Í4-2" . /evidencia: EXPERIMENTAL (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : señal_varias (B) LOCALIZACION: 4427..6397 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "región reguladora 3' para B200Í4-2" /evidencia = EXPERIMENTAL (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : características_varias (B) LOCALIZACION: 3789..3791 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función —=- "inicio de traducción de ATG" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: características_varias (B) LOCALIZACION: 4402..4404 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "paro de traducción" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: GGATCCTTAG ATCTTTAGGT GCACGTTAGT TACTGGAAAT GTAAACACAA CAGGAATAGG CAATTTTCGA TCCAAGAACT AGATGCAAAG AGCT?CT?AC AA?GCG?CTC TTGT?GA?TG 180 AACTAGGTAC AATAGAAGTA AAAAACATGG CCAAAATTTG CGGCATCCTT TTGCAATGCA 240 ACCAAACGCT TTGTAGTTTG CAACATTGTT GAAGTCATTG AAGATCATTC AGGAGTACGC 300 ATAGCTCTGG CCCACCTAGC TGTCAAGCCT AGGGTAGCGA AAAACAGGTG TTAGGTAAGA 360 GTATTCGTTA CTAAGGTGTT GTTTGGTTCA ACCACAAAAG AGGCAACACT AATTAGGAAT 420 AGCTGCTCCT GGTATCTGTT ATGATGCAAT GATCATCGGT TTTTGTTTGG TTGCAACCAA 480 TGTGAGCAGT GAAATAGCGT GGCATTGAAT CATAGCTAGA TGGGAGCATT AATGATTTTT 540 CACAAGCCTG TATCAGATGT CACTGTGATC GATTGCAGCC TATTGCAACC AAATTTAAAG 600 TTATGATAAC AGATACCGAT GTAAACTAAT CACTTCCCTA AATCGTCAAA CCAAACATTA 660 CATAAAGTTG ATAGGATCAA TGTAATTAAA AAGTACATGT CACGGAATAT TTATAGAGGG 720 CTCACCTTAT TCCATATACA AAGTCAAAAA TACCACTTAA CTTTTTTTAC AATTATTCAT 780 TTATATAAGG ATAATCCGGT AATTTTATCT TACATATATA TTCCATACTT CTTTTGGGCA 840 CACAATCTTC ATCAGAGGCT TTGCTTCCTG TGAAGTGAAC CAATCTATCT TCTTTCGCTT 900 CTAACTTTGT TTCACGCCTC GCAAAGTGAA CCGATTTGCC TCCGTTCATT TCTGACTTCA 960 CTTCACATTC TACAAAGTGA ACGAGTCTGT CTCCATTTAC TTCTAACTTA GCTTTACTTT 1020 CTGCAAAGTG AACCGATCTT TCGTCGTTCA CTTTTGGTTT TACTTCATGT TCTATAAAGT 1080 G2ACTAATGC GTCTTTGTTC ACTTCTTGCT TGCTTCTAAT GAAGATGATC CTAAAAATAA 1140 ATATCAAATA AATACAAAAA TAGTTGTTAA TCAACTTTCG AAACGTAAGG GATTGCATTT 1200 GTCCGAGGCC AAATCCCTAA CAACAACCCC TAGTGGGCAA AAGCCTCCTC TGAAGGTACG 1260 AATCCTTTGA AATTATGATT TGGACCAGAG GTAAAATGTT ATCCTCAAGC TTCAGAGTTG 1320 TCTATTGGAG GTTAGGAGGT GAGTAGTTTC GATTTCAAAT TTGTAATGAC CAAGTTTCAA 1380 CAAAGTCAGG TATATAAGGA AGTTGAAGGG TCACTTTTGA CCAAAGCCAT GTA ACATAC 1440 CGTGCTTTCT GGGTCATAGT TTGCTACTGC TTTGATGAAA ACAAGAGGTA TTGTTGCATG 1500 TTTTTATGAA TAAAAGCTTT TATGTGAAGT CTGTTTGTAG ATGTGTGTAT AAGCCTTGCA 1560 AGGAAGTTAT CCGCTTGTTG ATTGTGAAGC TTATGAAAGT AATTCCCAAC TGATAACTTG 1620 TTGTTGTATT ATGGTTTGGT TGACTCCTTT TTGTGTTGGA TGTTTAGTGT 1680 TGAATGGAAT CCCCATGTGT CTTCTTATGA TTTTGAGGAT GATTTAGAAG ATT GGAAGT 1740 CTCTAGGTTA AAACTTGTTG ATGATGAAAC CAAGTCATTG AGGTTTGGAA AGTACTTGCT 1800 GGATGAAGCA ACTCTTAATT TTGTTTAGAG AAAAAATATT AACCAGGGAA TGAAACAGTC 1860 CTAAAGTCTA AAGTAGATGA ATGTGTTGTC TTTAAATACT TCATTACTAC CAGGCTCCAC 1920 TAGGATTTGT TGGGTTAGAT TGTAAGTTCA TACAACATCG GAGTGTATCA 1980 TTTGATGTCT AATGGTATTT CAAAGATTGC ACT TGTGTT TCAGCCATCA AAACTCAAGA 2040 ATTAACTCTC AATGTAGTTG CATTTTGTTC TTTGAATGAG ATGCACTACC AATTTAGAAG 2 100 CTATAATAAA ATAGACCATA AACCTTAAAC CCCCCAAACC CAAAGCCCTA AACCTTGGCC 2 160 CCTACTCGGG CGCCGGCTAA TCAGTCATAC ACATCGATTT ACCGGCTTTG GGGAGTGGCT 2 220 AATCGGTAAT CCTGGCAGAT ATATCATTTT ATTTCTTTTT TTTGTATTTT TTTAAACTTC 2280 CATATTTTTA GTTTGAAATC CGTTGCGTAT TTTGAAATTT GGTTTCAGCA GAAAGTCTTC 23 4 0 AAATAATCCA TAGTATTTAT ACAAAAATTG GCATCAAAAG TTTTTAGAAT TTAC?AAAT 24 00 CAAATTCAAA ACCGGTGATA CGGTGGAGCC GTCCGCCATC GATAACAGGC TAGCCGGATT 2 46 0 TATCAATCGG CTTCGTGACC ATTGATCGGA GCTCGCTCGC ATGCAGGAAG TAAATACAAT 2 520 CAAACTAAAC TATGTGCCAA GACTCAACAT GTGTAACATC ATTCTTGTTG 25 80 AGCATATGAT AATTTACTTG TCATAACAAA ATAAAGAATA GAGCAAAATC CACTTTGGTC 2 64 0 CTCTTTGGCA TGGCTCTTTA GGCGGCTCCA GCTCAGACTC ATTATGAAGC CCTATCAAAT 2700 AGTAAAAAAA CGGCTCCTTG TCCAGAGCCC TCCAAGAGCT ATAGCCGTTT TATTGTTGGG 27 60 ACCCAAAGCA CAAAAAACGT AGCTTCTACT GGCTCCTACA TTTTTCTCAT ACGTCATTCC 2820 AAAAGAAATA CATAATAAGT TGTTTTGCCA AACAAATTGC AAAATGGCTC CGGCTCCGCT 28 80 A.U? ?? l- * ? AGGAGATAAA AGAAACAGAG CCGAAACTGT TTTCAGAGGA GCCAGAGCCC 2940 ATACCAATCC AGAAGGGGAT TGGAGGAGAT TAAATGACTA 3 000 GGAGGGGATT TAATCCCCTC CAATCTCCTT CTGAATTGGT ATAACCGAAC ATGCCCTAAA 3 060 GTATGCTTCA TCTTAGAGAG GAATCGAATA AAAGTCGTGT GCTACTTGTT 3 120 T CGCCGTTA ATTCCTCGTG GCTAGCTTGT GCCATTGCAT CCATTGATCC ATAGTGGTGG 3 180 TAAATTAAC? TGCTACATCT TTTATTGTGT CATCCTGTGG TCACCAGTGG TCTGAGAGAA 3 240 GTGGAATTTA TTGTGCCAGC ATAGTTAAAA GACCTGTTAT TCGACTACAC TAGCAATATG 3 3 00 TACTACTGTA GGGGTACTAT ATTTCACATA AGTAGGCAGT CTAATTCTAG CTCTTATTCT 3360 AAACGTCATT GAATTCACTG CTGAGGGAGC GATGGGCAAC AATGAATTGT CATGCTCGCT 34 20 TTCAACAACA CATGTAGCTC C TCTGGTAGT AGATTACGAG AGTGTTTGGT TTATAGAGAC 3480 T?ATTTTTAA TTTATCTATT TTATTTTAAT AATTTAGAGA CTAAAATAGA ATAAAATGGA 3 540 AAACACCCTT TAAATGCCCG ATCGGCTCCA ATTTTTTGGA TAGTAGTACT 3 600 CCAGTAATAA CAGTTATGCT GGGTGCCTGG GTTGCCAACC GCTCATCAGT GCACTTATTT 3 660 TTCGTATAGC CATGGAAGCT GCAGCCATGC TTTCCCGGCT TCTCTATAAA 3720 ATGCAGGCAC TGCATTTCCA TATTCTCAAC GGCCCCAAGG GTCCACGTAG TCGAGGACTA 37 8 0 CAGCAAGAAA TGGGGGTCAA CAAGTCTGCA GTTCTGCTTG GTGTGGTTTT GGTCTCAGTC 3 84 0 CTTCTCTTCC TGGACGTTGT GAGCTCACTG AAGCCAATGG TTGCTAATCC 3 900 CTGCTTTGTG TGTTCTGCAC TACTGTTAAC ATTAGTGCAT GAATTAACTA 39 60 GAACCATTTT AAAGAAGGTA TATCTTTTTG TGCTTCATTC TTTCTTCATG CAGGCTCTGG 4020 AGTGAAGAAT AATGTGAAGC CTGC?GGAGA GCCTGGGCTC AAGGATGAGA AGTGGTTTGG 4080 TGCTGGATAC AGCATGGTG GAGOGT?TGG AA?C??CC?G CC?GGATACG GTGGCGGAGG 4140 AAACAGCCAA CCTGGATACG GCGGCGGAGG AAACAGTC?G CCCGGATACG GTGGAGGATA 4200 CAAGCGCCAT CACCCTGGTG GCGGCTACGG GTCTGGACAA GGAGGGCCTG GATGTGGATG 4260 TGGAGGAGGG TATGGAGGTG GCAATGGTAG TCCTGGGTAC GGCGATGACA ATGGTGGTGG 4320 C?TTGGCACT GGTGGCGGA? ATGGC?ATGC TGGTGGGTAC GGAGGAGGAG GCGGCGGTTA 4380 TGGAGGCGGC TACGGCAGTG GTAGTGGTAC AGCACCAGGA GGCGGATATC ATGGCGGTGG 4440 TGGTGCACAA CGCTACGCTG GGCAGAACTA GCAAGAACAA CCCCTTATGC TAGTTTATGT 4500 TAAATAAACG ATCCATTGTT CATGTGACTG AGCAATTTAA GCAGTGAAGG ATCTTGACTC 4560 GTGTTATTTG GTTACCATA TGTATTGATT GTTTTATGTT TAAGATGAAT GTACACCGCT 4620 ATTTGTATGT CGAACTCGTT GCATGGAGAT GAAAAAAAAA GGCACAAAAA CATCAGCAAA 4680 CCATGCTTTC CTTCCGGTCG ACCAGATTTG GGCTGATATT TATTGAGTAA AAAAAATTCT 4740 ATCTCTGGGA GATTGTTTCA AGTAAAAGCT AGAGCGTGAC ATTTTGTAGC GGAAAATTGG 800 AAC3AAAACA TGTCCAACGT CGAAATTATT GTATATATTC TAATGGATAT ATATAACGTA 4860 A CAGAAGGA AAATTGTTTC CAAGTCATTT TTTCACAATG CAACAGTCAA ACATGGATGC 4920 GGCGAGCGAA GGATGCAGGT GGGTTCCCCT GCCGCTCCAA ATCCTATAGA GCCCTCCTAA 4980 AGACTCCCCT AAAATTAGAT CTTATGTTTC TCATTATGTG TTTTAAGATT TTCATTATTC 5040 ATGGATGTTT CGATATAAGA CTATTTTGAA TTATCATATT TGTCTA? GT GAGTCGTTTA 5100 GGCCCCGTTT GGTTCTATTA GTCTTAGGAT GTGTCACACC CGGATT AAG GGACAAATAA 5160 GCAA3GGTGA ACTTTTACAA TGTTAGAGTG TATAGAGATA AATGTCATAA TAATATTAGA 5220 GTACTTTTAC AATGCGGAAG CTTACAAAA TAAAAGATAA ACATAAAATG AACTAAAATC 5280 CATCTTTGGC GCCAATAAGT CAACTGAAAG ACGCCATCTA AATCAGATCG AACTCCTCGT 5340 TGTGTGCCTC CTCTTGAACC ACCGGTCCTT CTCCTG iGGG GGGTGTGAGA CAGCAAGGGT 5400 GAGCTCACAC ATGATCATAG CTCAACAAGT TGTGGAGAAA CCAGTGAGCA TGAATTCAAC 5460 AATGG GGGA GCTCATGTTA TGTGTAAGGC TGATAAACAA TAAGGGTTAA AGCTGAACAT 5520 TGC7TTTAAT AAGTTGGTCA AAATTTTATT AGTAGTTACT AAATGTAAGT GCATACCAAA 5580 CCAT.AATAGA AATAATAGAA CAAAATTAAT AAATGATCTC ATACAATGCA AATGACAAAT 5640 TGAGTT .AAG TTCCAT.AATT TAATCCTGCG AGAGTCCTGA GTTGCTCATG ACCGTGAGCT 5700 CGGCTAGTAT ACCAGTTTTA CACTCTGCAG AGGTTGTACC CTGTACCCAT AAGTCATGTT 5760 ACCCATCTGC CAAGGGATCG CGACTCCCAT ACACCTCTAC CAAGGAAGCG AGGCAGGGCA 5820 ATACTACGAG GCCTTTACAA AGTTCCACTA GCTTCCGAAA ACCCGCTACA GTTTATGGGA 5880 AGAGCACTTA CAAGAATCCC CCGTCTGATC GCAATTGCAG CAAAATCAAC CCGAAAACCT 5940 CCTTGCATGC AACTCCCCTA CTGCCCTTGC CCCTTTCGGG TAAGGTAGTC TTCCACTAGC 6000 TTTCCTAATT AGTTAGCCAA GGGGTCTCAT TCCTCCCTTA TGGTGGCACG TGTTTCTCAA 6060 GTT AGCTCC ATGTTCCAAT TAACATTAAT GATGTTGACA TGAACATAAA TAAAATAACA 6120 AATAATTGGA ACATGGATAT AATGATATAT TAACCCAAAA CCATGTGAAG CAATAGCAAA 6180 ACTACCCAAG TGATTCAGGG GTAACAAGGT AAAGAGTTAA ACAGTCTAGG GTGACCTATT 6240 CGGTCCCATC AGAATTAAAC CTATGCATGA ATAAGTGATA TTAAAGAACA TTATTGGGTA 6300 TAAAAGTGGT CAAGGGCACA ACTTGCCTTC AATGAGCTCC TACTCAACAA CTTCTATCTG 6360 CTGGGCACCA GGATCCCCCG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGA 6420 CCTCGAGGGG GGGCCCGGTA CCCAATTCGC CCTATAGTGA GTCGTATTAC AATTCACTGG 6480 CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 6540 GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCG 6596 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para B200Í" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: AAAACTGCAG GAATTCACTG CTGAGGGAGC GA 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para B200Í" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13 GCGGGATCCT TCTTGCTGTA GTCCTCGACC ACG 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1093 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iü) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : características_varias (B) LOCALIZACION: 1090..1092 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "inicio de traducción de ATG" /evidencia = EXPERIMENTAL (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: promotor (B) LOCALIZACION: 1..1093 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /función = "Región reguladora 5 de P19" /evidencia = EXPERIMENTAL (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 14 : CTCGAGGATC AATTTAAAAT GAAAACGGAA AAAGTGTAAA AGCTGGTCCA GAAAAATAAG 60 GTCCGAAGCT TCCAAAAACC GGGACGAGCG CCTCCCACGA AAGTGCATTA CGTGGGCCGG 120 CAAAACTACC CTAGCAAAGA ATGACCTGAA CCTAAGCGAT GTCTCAAÁTC TCGATGCCAC 180 GAGCAATCAA GGCGATGCCT TCAGAAGGAA AACAACGCCG TGACACACAA GCTTTGCATA 240 TTCATGAGAG AAGACCAAAA TAACAGTACG TGCCTCATTG CTTATTTTGT TTCCTCATAT 300 AACAGTACGT GCAGTTCAAC CCAGGTGTAT ATGTGTATCC CGCCACTTCT ATCGTTAGGA 360 AAGACTATAA ATACATCCAT TCATCTACST ATCTCTCACG CTCTTTACTT TTGGCTTGCA 420 ATAATAATAC GACCAAAGAG ACTAGCGCAC CACAATACTA CATATACCCA TGCTGATAAT 480 CATACACCCG TCAATTCTAG CTGTGTCCAG GTCGAAGTAA CAGACGGGAA CATCACGGTG 540 GTGATGCAAG AGACTAGCGC GTTTGGACGC TTCGCATCAC CTACCTTTGG ATGCCTCGCA 600 TGAATCAAGT CGTGTCGTCC GCTAGCTTCC GCCTACCACC CACGGAGCAG AGCCAGCGAG 660 CAACTAACAC CGGCCAACTA TCCACTGGAG TTGAATGCAG GACGTCCAAG GTGTGCCCGT 720 CAACCATTCT GCTGACCGTA GTCATGGCGA GCTGGTGCAG TTCAGTGCAT GCTCTAGGTC 780 TAGGGTAGAG TGTTCAACGG ATTGTTAGAG CGGCCGTGGG CGATTCATTA GACGGCTCCC 840 CGCAGGTGGG GTGTTCATTA T CCCTG AT CTTTCTTTAA TCGCTCACCT GCTCGGTCGG 900 CGGCGATGGC* CGCGTACGCT C2 GTACG GT CGCCGCATGG CATGCACATG GCCGGCTCGG 960 GCCACGGCGG TGCGTGGCC G2 ATAAATA CCCCAGCCGG GAGCTCCTAG ATCCATCTCC 1020 ACACAACTAC CAGTACACTC CAGTCCCATC ACACACACGG ACACACCTGC AAGAGCGAGA 1080 GCGTGAGCCA TGG 1093

Claims (42)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de semillas híbridas, el cual comprende : (a) producir una planta femenina estéril condicional que comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina; (b) interplantar la planta femenina estéril condicional con una planta masculina estéril; (c) inducir esterilidad femenina mediante la aplicación de la protoxina a la planta femenina estéril condicional; y (d) producir semillas híbridas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la planta es una planta normalmente auto-polinizada.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la planta es una planta de polinización normalmente cruzada.

4. El método de la reivindicación 2, en donde la planta normalmente auto-polinizada es trigo.

5. El método de la reivindicación 2, en donde la planta normalmente auto-polinizada es cebada.

6. El método de la reivindicación 3, en donde la planta de polinización normalmente cruzada es maíz.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el promotor preferencial femenino se selecciona a partir del grupo que consiste en un promotor S13 modificado, un promotor Stigl, un promotor AGL5 , un promotor TTS1, un promotor ZAG2 , un promotor Fbp7, un promotor Fbpll, un promotor que se puede aislar a partir del clon B200Í4-2, un promotor que se puede aislar a partir del clon P26, y un promotor que se puede aislar a partir del clon P19.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el promotor preferencial femenino es un promotor que se puede aislar a partir del clon B200Í4-2.

9. El método de la reivindicación 7, en donde el promotor preferencial femenino es un promotor que se puede aislar a partir del clon P26.

10. El método de la reivindicación 7, en donde el promotor preferencial femenino es un promotor que se puede aislar a partir del clon P19.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina, se obtiene a partir de un gen seleccionado a partir del grupo que consiste en el gen argE, el gen de mono-oxigenasa P450sul, y el gen pehA .

12. El método de la reivindicación 11, en donde la secuencia de codificación se obtiene a partir del gen argE.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la protoxina es acetil-fosfinotricina.

14. Las semillas híbridas producidas mediante el método de la reivindicación 1.

15. Un cásete de expresión que comprende un promotor preferencial femenino operativamente enlazado con una secuencia de codificación de interés.

16. El cásete de expresión de la reivindicación 15, en donde la secuencia de codificación de interés codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina a una toxina.

17. El cásete de expresión de la reivindicación 16, en donde la secuencia de codificación se obtiene a partir de un gen seleccionado a partir del grupo que consiste en el gen argE , el gen de mono-oxigenasa P450sul, y el gen pehA.

18. El cásete de expresión de la reivindicación 17, en donde la secuencia de codificación se obtiene a partir del gen argE.

19. El cásete de expresión de la reivindicación 17, en donde la secuencia de codificación se obtiene a partir del gen de mono-oxigenasa P450sul.

20. El cásete de expresión de la reivindicación 17, en donde la secuencia de codificación se obtiene a partir del gen pehA.

21. El cásete de expresión de la reivindicación 15, en donde el promotor preferencial femenino se selecciona a partir del grupo que consiste en un promotor S13 modificado, un promotor Stigl, un promotor AGL5, un promotor TTS1, un promotor ZAG2 , un promotor Fbp7, un promotor Fbpll, un promotor que se puede aislar a partir del clon B200Í4-2, un promotor que se puede aislar a partir del clon P26, y un promotor que se puede aislar a partir del clon P19.

22. El cásete de expresión de la reivindicación 16, en donde el promotor preferencial femenino se puede aislar a partir del clon B200Í4-2, y la secuencia de codificación de interés se obtiene a partir del gen argE.

23. El cásete de expresión de la reivindicación 16, en donde el promotor preferencial femenino se puede aislar a partir del clon P26, y la secuencia de codificación de interés se obtiene a partir del gen argE.

24. El cásete de expresión de la reivindicación 16, en donde el promotor preferencial femenino se puede aislar a partir del clon P19, y la secuencia de codificación de interés se obtiene a partir del gen argE.

25. Un promotor preferencial femenino que se puede aislar a partir del clon genómico B200Í4-2 que tiene el número de acceso NRRL B-21920.

26. El promotor preferencial femenino de la reivindicación 25, en donde el promotor está comprendido de los nucleótidos 1 a 1390 de la SEQ ID NO: 11.

27. Un promotor preferencial femenino que se puede aislar a partir del clon genómico P26 que tiene el número de acceso NRRL B-21655.

28. El promotor preferencial femenino de la reivindicación 27, en donde el promotor esta comprendido de la secuencia estipulada en la SEQ ID NO : 2.

29. Un promotor preferencial femenino que se puede aislar a partir del clon genómico P19, que tiene el número de acceso NRRL B-21919.

30. El promotor preferencial femenino de la reivindicación 29, en donde este promotor está comprendido de los nucleótidos 1 a 1093 de la SEQ ID NO: 14.

31. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 15.

32. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 18.

33. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 21.

34. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 22.

35. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 23.

36. Una planta que comprende el cásete de expresión de la reivindicación 24.

37. Semillas de la planta de la reivindicación 31.

38. Semillas de la planta de la reivindicación 32.

39. Semillas de la planta de la reivindicación 33.

40. Semillas de la planta de la reivindicación 34.

41. Semillas de la planta de la reivindicación 35.

42. Semillas de la planta de la reivindicación 36.