CN106754954A

CN106754954A - 一种玉米ms8基因突变体及其分子鉴定方法和应用

Info

Publication number: CN106754954A
Application number: CN201611064810.9A
Authority: CN
Inventors: 黄培劲; 李新鹏; 李京琳; 张维; 安保光; 龙湍
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-28
Also published as: CN106754954B

Abstract

本发明提供一种玉米Ms8基因突变体及其分子鉴定方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明将糯玉米品种京科糯2000经钴60辐射诱变引起玉米β‑1,3半乳糖基转移酶(Ms8)基因第6个外显子中一个碱基T突变为碱基C，导致一个酪氨酸转变为一个组氨酸。将该Ms8基因突变体命名为ms8‑4505，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实该突变体引起玉米隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的玉米自交系和转基因玉米，在玉米种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。

Description

一种玉米MS8基因突变体及其分子鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种玉米MS8基因突变体ms8-4505及其分子鉴定方法和应用。

背景技术

植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因MS44(Cigan and Albertsen，1998，Reversible nuclear genetic system for malesterility in transgenic plants，US5750868)；2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:5.1-5.28)。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因。

玉米已成为我国第一大粮食作物，播种面积达到5.5亿亩，是饲料、食品加工、生物能源的重要原料，在国外也是消费量最大的蔬菜之一。目前国内种植的玉米几乎全部为杂交玉米。玉米杂交授粉主要通过人工去雄进行杂交，需耗费大量的劳动力，成本高昂；而且由于去雄损伤玉米顶部叶片，会造成制种产量损失。利用雄性不育系制种可解决人工去雄带来的问题。但玉米中曾经应用的胞质雄性不育系存在一些缺陷：首先由于胞质雄性不育系需要特定的恢复基因恢复育性，因此种质资源利用率很低，限制了优良品种的选育效率；其次部分不育系育性不稳定，在特定条件下可恢复育性，影响杂交种的纯度；最后，由于胞质基因型单一，造成玉米斑病大爆发，直接导致胞质雄性不育技术退出市场。普通核不育则可避免这些问题，如在玉米中得以应用，不但可以节省人工去雄所需的劳动力成本，而且可以提高制种产量。

通过自然突变体鉴定和人工诱变如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在玉米中获得了多种不育突变体。MS8突变体是其中之一。玉米MS8基因有9个外显子，编码一个β-1,3半乳糖基转移酶类蛋白，可能与脂类物质合成有关，但其确切底物还未发现；MS8功能缺失影响了玉米花药表皮和绒粘层分化，进而导致雄性不育；除花药外，MS8在其它组织也有少量表达，但在ms8突变体中这些组织没有突变表型(Wang等,2013,Maize Malesterile 8(Ms8),a putativeβ-1,3-galactosyltransferase,modulates cell division,expansion,and differentiation during early maize anther development.PlantReprod,26:329–338)。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米MS8基因突变体ms8-4505及其分子鉴定方法和应用。

本发明首先对玉米品种京科糯2000种子(M₀代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M₁代植株；M₁代植株自交产生种子(为M₂代)，种植M₂代植株，对M₂代植株进行形态学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研究。

本发明提供的玉米MS8基因突变体ms8-4505，其为玉米MS8基因编码区第814个碱基，即基因组序列中起始密码子起第1302位碱基，由T突变为C，导致一个酪氨酸转变为一个组氨酸；该突变位点位于第6个外显子。

进一步地，玉米MS8基因突变体ms8-4505，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了含有本发明所述玉米MS8基因突变体ms8-4505的表达载体。

本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明提供了玉米MS8基因突变体ms8-4505在制备转基因植物中的应用。

本发明提供了玉米MS8基因突变体ms8-4505在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。

本发明提供了玉米MS8基因突变体ms8-4505在玉米改良育种、制种中的应用。

本发明还提供了检测玉米MS8基因突变体ms8-4505的分子标记，该分子标记是由以下一组引物扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT(如SEQ ID NO.4所示)；

上游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG(如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC(如SEQ ID NO.6所示)。

本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。

本发明提供了上述分子标记在玉米种质资源改良中的应用。

一种玉米MS8基因突变体ms8-4505的分子标记的方法，通过下述一组引物扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT(如SEQ ID NO.4所示)；

上游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG(如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC(如SEQ ID NO.6所示)。

PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL dNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：94-98℃变性1-3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，30-40个循环。

扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中，5V/cm电场下电泳30min，在凝胶成像系统中记录电泳图像。

如果用上述引物对扩增出的产物为501bp和191bp，则标志着该待检植物MS8基因型为野生型；如果扩增产物为501bp和247bp，则标志着该待检植物MS8基因型为ms8-4505突变体；如果扩增产物为501bp、247bp和191bp三条带型，则标志着该待检植物MS8基因型为野生型和ms8-4505突变体的杂合基因型。

本发明还提供了用于检测玉米MS8基因突变体ms8-4505的引物组合，含有4条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-6所示。

含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述引物组合或含有其的试剂盒在玉米育种、制种中的应用。

本发明提供了上述引物组合或含有其的试剂盒在制备转基因玉中的应用。

本发明提供了上述引物组合或含有其的试剂盒在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。

本发明提供的突变体ms8-4505优点如下：

(1)该突变体只影响雄性育性，造成雄性完全不育，但对雌雄育性和其它农艺性状没有影响。

(2)该突变体为基因内点突变，不会影响MS8两侧相邻基因的功能。

(3)该突变体为点突变，可设计为CAPS、多引物标记，用最广泛使用的琼脂糖凝胶电泳即可完成检测；同时也适用于中、高通量的单核苷酸多态(SNP)检测技术。

(4)该突变体为点突变，利于研究特定氨基酸残基与蛋白质结构、功能的关系。

附图说明

图1是实施例2中4505突变体的花药和果穗。

图2是实施例3中野生型和4505突变体的花粉I₂-KI染色结果。

图3是实施例6中4505突变体MS8基因的突变位点示意图。

图4是实施例7中野生型京科糯2000、4505分离株系中的突变体、和分离株系中野生型MS8基因分子标记鉴定的电泳结果。

图5是实施例8中所描述的杂交转育的技术路线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1钴60辐射诱变突变体库

2015年9月，于长沙用钴60(⁶⁰Co)辐射京科糯2000种子(M₀代)3公斤，辐射剂量250Gy。辐射的种子于2015年10月种植于海南三亚市崖城区田间，分单株严格自交，收获M₁代种子。

选取M₁代种子5400个株系，每个株系种植50棵单株，于2016年2月种植于海南临高田间。在苗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存。

实施例2M₂代种植与性状观察

在M₂代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为4505的家系中发现6株育性异常的植株。该突变体花药比野生型瘪小，颜色浅黄，无可见花粉，但在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，被选作候选突变体材料进行下一步研究。

实施例3花粉镜检，自交，异交

通过碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察4505突变体雄花形态，花药比野生型小，颜色较浅(见图1)。田间采集开花期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)中轻轻挤压花药，滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照。野生型花粉多而染成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒(图2)。

突变体开放授粉下可正常结实(图1)，表明该突变体为雄性不育突变体，雌性不受影响。对同家系野生型进行套袋自交，均正常结实，获得10个M3株系的种子，将M3种子播种，抽穗后鉴定育性，其中2个株系的雄性育性发生分离。将分离株系的花药碘染后在显微镜下观察，其中88株花粉正常碘染，27株无花粉，符合3:1分离，表明该不育性状由单个隐性基因控制。

实施例4叶片采样与DNA提取

采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1g叶片，放入离心管，加入600μL CTAB提取缓冲液，5μL RNase A，震荡分散，65℃水浴0.5hr，其间轻摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚(1:1，v/v)，混匀，轻摇10min；4℃10000rpm离心20min；转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH值5.2)、0.6-1倍体积的冷异丙醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4℃10000rpm离心10min；弃去上清，用体积百分含量70％乙醇洗沉淀2次；风干，加入50μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。

实施例5PCR反应与产物回收

根据玉米自交系B73的MS8基因序列设计引物，扩增野生型京科糯2000和4505突变体的基因组DNA，扩增产物测序后拼接出完整序列。用于扩增玉米MS8的引物对序列见下表1：

表1用于扩增玉米MS8的引物对序列

PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL dNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：94-98℃变性1-3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，30-40个循环。循环结束后72℃补充延伸3-10min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

实施例6DNA序列分析与突变位点的确定

将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6.0对双向测序结果进行拼接；4505突变体MS8基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由2031个碱基组成，将玉米MS8基因的该突变体基因命名为ms8-4505。对野生型和突变体序列进行比对发现，在野生型京科糯2000的MS8基因编码区第814位碱基，即基因组序列中起始密码子起第1302位碱基由T突变为C，导致其翻译的蛋白质第272位氨基酸由酪氨酸转变为组氨酸。ms8-4505突变基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。该突变位点位于第6个外显子。MS8基因结构及ms8-4505突变位点见图3。

实施例7突变位点分子标记设计与基因型鉴定

根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计4条基因特异引物：正向引物4505_F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物4505_R1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；反向引物4505_R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；正向引物4505_F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。其中4505_F1和4505_R2的5’末端碱基分别与突变位点的野生型与突变体的碱基相同，4505_F2和4505_R1位于突变位点较远的两侧，5’末端向内。

用上述引物对扩增出的产物如果为501bp和191bp，则标志着该待检植物MS8基因型为野生型；如果扩增产物为501bp和247bp，则标志着该待检植物MS8基因型为ms8-4505突变体；如果扩增产物为501bp、247bp和191bp三条带型，则标志着该待检植物MS8基因型为野生型和ms8-4505突变体的杂合基因型。

在实施例3中获得的有表型分离的M3群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株，提取叶片DNA，与京科糯2000基因组DNA一起，分别用上述引物对进行扩增。PCR反应体系为：10×反应缓冲液1μL，dNTP 0.25μL，引物4505_F1、4505_F2、4505_R1和4505_R2各0.25μL，Taq酶0.5U，10ng/μL模板DNA 1μL，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：95℃变性3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53-58℃复性20s，72℃延伸30s，35个循环。

结果见图4，野生型对照的扩增产物为501bp+191bp；4505家系中突变体的扩增产物均为501bp+247bp；所有的分离家系中的野生型扩增为501bp+191bp或501bp+191bp+247bp，而没有501bp+247bp带型。这一结果表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断4505突变体的雄性不育表型是由实施例6中所述的点突变造成的。

实施例8突变基因的杂交转育

可按图5的步骤将4505的不育基因ms8-4505通过杂交转育到其它玉米遗传背景中：

①杂交：

以4505为母本，与受体玉米材料为父本杂交获得F₁种子；

②第一轮回交：

F₁播种后获得F₁植株，将F₁植株与轮回亲本进行杂交，获得BC₁种子；

③BC₁不育基因选择(前景选择)：

播种BC₁种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物组(4505_F1、4505_R1、4505_F2和4505_R2)进行扩增、酶切和电泳，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；

④BC₁背景选择：

采用一组(例如100个，或200个等)在突变体4505和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；

⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC₂种子；

⑥BC₂的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC₂代植株；

⑦自交获得BC₂F₂种子：对步骤⑥中选出的BC₂植株进行自交，获得BC₂F₂种子；

⑧BC₂F₂的前景选择：将步骤⑦中获得的BC₂F₂种子播种，获得500株以上幼苗，在幼苗期采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物组(4505_F1、4505_R1、4505_F2和4505_R2)进行扩增、酶切和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；

⑨BC₂F₂的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的基因型为纯合突变体，则该单株为最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它玉米材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株用于杂交育种或制种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种玉米MS8基因突变体及其分子鉴定方法和应用

<130> KHP161117253.7Q

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2002

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

atgctccagc tgctgcgcgc aatgatggtg tgtatgatga tatgtcagct acgcaatttg 60

gattcctgct agtgcttcga cgaagtgact gacggtgttt tccgtgttgg tgcaggcact 120

gacggagcgg cagccgcagc tggagaagaa gccggcgcgc gggagggcgc cgctgtccgg 180

gaaggccgtc gcggcgctgt gcgtgacgag cttcgttgtg gggttgctgc ttagcggcaa 240

cgtgtcgctc atgtcggcct cggcgtcgcc gtcgtcctcg agcacggaca gcgagaagag 300

cattcgtgtt tccggttgcg acaatgagcg tgtaagtagt ctgcttagaa cccatttttt 360

tttaccgcgc gtactggttg gcacgcatcc tgatcgaatt ctgcatctca tctgaccaga 420

aactcggaga gaaccacccc aaggatctcc tgaacgaggt gtcgagaact catcaagcaa 480

tccagtaagc atccggcggt ctcgaatcga acgctgcagg ccttgtcagc aggcacactc 540

attcaacggt gtacggcgtg taaggccatg gactcacggg tcgcacgtgg tgcgctgctg 600

aacttgtagg tcgctggaca aggcggtgtc caccctggag atggagatgg ccgtggaacg 660

cgctaggggc gggggcgggg gcggcggcgc cgcgtccatg gcgtccagca ggactcccca 720

gaaggccttc gtcgtggtcg gcatcaacac ggccttcacc agcaagaagc ggcgcgactc 780

gctccgcgac acctgggtcc ccagaggtac gcacacatgg acggaccgac aagccagcat 840

acatacatac atacattgat cacgtacgta acgtacggga cggcgggcgc atcgcgcgtg 900

caggggataa gctgaggaag ctggagcggg agaaggggat cgtggtccgg ttcgtgatcg 960

ggcacagcgg cacgccgggc ggcggcgcgc tggaccgcgc cctggacgcg gaggaggccg 1020

agaccaggga cttcatgcgg ctggaccacg ccgagggcta ccacgagctg tcgtccaaga 1080

ccaggaccta cttcaccacc gccgtcgcca cctgggacgc cgacttctac gtcaaggtcg 1140

acgacgacat ccacctcaac ctcggtacgt gcgtacgtgc atgcggcgtt acagggtggg 1200

cgtagctgct ggtagcagta gcaggccgta agaatctcgt ttccaactgc acagggatgc 1260

tggcgagcag gctggcgaaa cacaggacgc gcccgagggt gcacgtcggc tgcatgaagt 1320

ccgggcctgt cctgtcacag aagtgagcag agatcatttt tcttcttctt cttctcacag 1380

ccgagttagt tctgttctgt cgagtgagat cggcctgtac tgtactgtgt ctctgtatct 1440

gttgttgcag aggagtcaag taccacgagc cagagtactg gaagttcggc gacgagggca 1500

acaagtactt ccgccacgcc accggccaaa tctacgccat ctccaaggac ctcgccgcct 1560

acatctccat caaccagtta tgtttccgga cacaatcaca tacataatgc cacgtgtggc 1620

cgcgttcgtc tgtgcgtctg acgtgcgtgc gtgcatcgtt tccaggccga tccttcacag 1680

gttcgcgaac gaggacgtct cgctgggcgc gtggctgatc gggctcgagg tcgagcacgt 1740

cgacgaccgg agcatgtgct gcgcgacgcc tccaggtggg tcatgaaact gacagccagc 1800

gtcactcctc tcctgaacaa ttcacctaca tacacctctg actgcgtgtg cagactgcga 1860

gtggaagaag cgagccggga acgtttgcgt ggcgtccttc gactggtcgt gcagcggcgt 1920

ctgcaagtcg gtggaccgga tgcgccacat ccacaaggcg tgcggcgaag gcgaaggcgc 1980

cgtctggaac gccgccacat ga 2002

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 玉米

<400> 2

Met Leu Gln Leu Leu Arg Ala Met Met Ala Leu Thr Glu Arg Gln Pro

1 5 10 15

Gln Leu Glu Lys Lys Pro Ala Arg Gly Arg Ala Pro Leu Ser Gly Lys

20 25 30

Ala Val Ala Ala Leu Cys Val Thr Ser Phe Val Val Gly Leu Leu Leu

35 40 45

Ser Gly Asn Val Ser Leu Met Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Thr Asp Ser Glu Lys Ser Ile Arg Val Ser Gly Cys Asp Asn Glu

65 70 75 80

Arg Lys Leu Gly Glu Asn His Pro Lys Asp Leu Leu Asn Glu Val Ser

85 90 95

Arg Thr His Gln Ala Ile Gln Ser Leu Asp Lys Ala Val Ser Thr Leu

100 105 110

Glu Met Glu Met Ala Val Glu Arg Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ala Ala Ser Met Ala Ser Ser Arg Thr Pro Gln Lys Ala Phe Val

130 135 140

Val Val Gly Ile Asn Thr Ala Phe Thr Ser Lys Lys Arg Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Arg Asp Thr Trp Val Pro Arg Gly Asp Lys Leu Arg Lys Leu Glu

165 170 175

Arg Glu Lys Gly Ile Val Val Arg Phe Val Ile Gly His Ser Gly Thr

180 185 190

Pro Gly Gly Gly Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Ala Glu Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Arg Asp Phe Met Arg Leu Asp His Ala Glu Gly Tyr His Glu Leu

210 215 220

Ser Ser Lys Thr Arg Thr Tyr Phe Thr Thr Ala Val Ala Thr Trp Asp

225 230 235 240

Ala Asp Phe Tyr Val Lys Val Asp Asp Asp Ile His Leu Asn Leu Gly

245 250 255

Met Leu Ala Ser Arg Leu Ala Lys His Arg Thr Arg Pro Arg Val His

260 265 270

Val Gly Cys Met Lys Ser Gly Pro Val Leu Ser Gln Lys Gly Val Lys

275 280 285

Tyr His Glu Pro Glu Tyr Trp Lys Phe Gly Asp Glu Gly Asn Lys Tyr

290 295 300

Phe Arg His Ala Thr Gly Gln Ile Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Leu Ala

305 310 315 320

Ala Tyr Ile Ser Ile Asn Gln Pro Ile Leu His Arg Phe Ala Asn Glu

325 330 335

Asp Val Ser Leu Gly Ala Trp Leu Ile Gly Leu Glu Val Glu His Val

340 345 350

Asp Asp Arg Ser Met Cys Cys Ala Thr Pro Pro Asp Cys Glu Trp Lys

355 360 365

Lys Arg Ala Gly Asn Val Cys Val Ala Ser Phe Asp Trp Ser Cys Ser

370 375 380

Gly Val Cys Lys Ser Val Asp Arg Met Arg His Ile His Lys Ala Cys

385 390 395 400

Gly Glu Gly Glu Gly Ala Val Trp Asn Ala Ala Thr

405 410

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgcgcccg agggtgt 17

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actctggctc gtggtacttg actcct 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacttcatgc agccgacgtg 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaagaccag gacctacttc accacc 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctcggcaca taaatcgtct c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtgagtcca tggccttaca c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccttgtcagc aggcacact 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgctccagc ttcctcag 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaggtacg cacacatgga c 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcctggaaa cgatgcac 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tccaaggacc tcgccgccta 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaacaacca cgcttgccat 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcctacatct ccatcaacca gt 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatgtgtca tgccaaacag tg 22

Claims

1.一种玉米MS8基因突变体ms8-4505，其为玉米MS8基因编码区第814位，即基因组序列中起始密码子起第1302位碱基，T突变为C。

2.如权利要求1所述玉米MS8基因突变体ms8-4505，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1或2所述MS8基因突变体ms8-4505的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1或2所述的玉米MS8基因突变体ms8-4505在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1或2所述的玉米MS8基因突变体ms8-4505在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。

7.权利要求1或2所述的玉米MS8基因突变体ms8-4505在玉米改良育种、制种中的应用。

8.检测权利要求1或2所述的玉米MS8基因突变体ms8-4505的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下一组引物同时扩增，扩增产物经过琼脂糖电泳检测扩增产物。所述引物的核苷酸序列为：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT；

下游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG；

上游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC。

9.权利要求8所述的分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。

10.权利要求1或2所述的玉米Ms8基因突变体ms8-4505的分子标记的方法，其特征在于，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT；

下游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG；

上游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC。