CN116249784A

CN116249784A - 人血细胞的选择性裂解

Info

Publication number: CN116249784A
Application number: CN202180053535.3A
Authority: CN
Inventors: R·杜阿; S·杜根尼; X·张
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-06-09
Also published as: US20240084404A1; WO2022136621A1; EP4267755A1; JP2024500211A

Abstract

本发明涉及用于通过在含有非离子型洗涤剂的pH为约9的缓冲剂中孵育含有微生物诸如细菌和真菌的样品来特异性裂解所述样品中的真核细胞的方法。

Description

人血细胞的选择性裂解

背景技术

由血流感染(BSI)引起的败血症是一种危及生命的疾病，伴随着住院率增加。由于诊断延迟会导致多器官衰竭和死亡率增加，因此适当和及时地检测败血症至关重要。聚合酶链反应(PCR)提供了一种快速检测由BSI诱导的败血症中细菌病原体的方法。在基于PCR的败血症诊断中最重要的因素之一是可靠地扩增和检测血液中由病原体产生的低水平核酸拷贝。这就要求PCR达到高的检测灵敏度。

分子诊断旨在快速检测样品(诸如血液)中的微量病原体(通常是细菌)。然而，血液是一种复杂的基质，并且包括用于适应性免疫系统的白细胞(白血球)、用于氧气运输的红细胞(红血球)和用于伤口愈合的血小板(凝血细胞)。这使得在含有大量细胞物质的样品(诸如全血)中直接检测病原体变得复杂。

对于基于PCR的方法，新鲜血液样品中的细菌数量理论上足够高，无需进一步培养此类样品内存在的细菌即可检测到。然而，为了及早检测到微量细菌，需要大量血液。尤其是白细胞中的大量DNA显著增加了基于DNA的检测方法的背景。血红蛋白中血红素的存在也会强烈降低DNA聚合酶的活性。一微升人血液含有约4,000至11,000个白细胞和约150,000至400,000个血小板。血液中DNA的浓度在30μg/ml和60μg/ml之间。在体积为10ml的全血中检测大约10到100,000个细菌的存在是极具挑战性的。

然而，由白细胞和漂浮在血液中的其他DNA片段的存在而产生的大量人类DNA阻碍了基于PCR的对于败血症诊断的检测灵敏度。除了干扰PCR反应本身外，哺乳动物DNA的量增加了样品的粘度。此外，来自裂解的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成复合物，其阻止样品的过滤。对于小型化装置来说，这尤其是一个问题。进一步稀释已经很大的样品体积会导致不可接受的长操作步骤。

Molysis^TM(来自德国不来梅的Molzym GmbH&Co.KG公司)使用离液剂和洗涤剂选择性裂解哺乳动物细胞。此裂解步骤随后是使用DNA酶的消化，它不受该离液的药剂/洗涤剂的影响。替代方法(诸如由罗氏诊断产品(上海)有限公司(Roche Diagnostics)(

Septifast^TM)商业化的替代方法)依赖于PCR引物对，这些引物对是专门设计的，以防止与人类DNA非特异性结合和人类DNA的扩增。然而，本领域需要一种去除人类DNA而不会影响细菌病原体的核酸检测的预分析缓冲液。

发明内容

如本发明所述的方法允许样品中的白细胞和红细胞选择性裂解，同时细菌和真菌(死亡或存活)保持完整和未裂解。

本发明的特定和优选方面在所附的独立权利要求和从属权利要求中阐述。来自从属权利要求的特征可适当地与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征相结合。

本发明的一个方面涉及一种用于选择性裂解含有或疑似含有微生物的样品内的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法包括以下步骤：提供含有或疑似含有微生物的具有真核细胞，特别是动物细胞的样品，向样品中加入非离子洗涤剂和缓冲液以获得pH约为9.0或略低的溶液，其中添加的洗涤剂和添加的缓冲液的体积与样品的体积之间的比率在2∶1和1∶10之间，并且将溶液孵育足够长的时间段以裂解真核细胞，特别是动物细胞。

在一些实施例中，非离子洗涤剂以在0.1％和5％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在。在某些实施例中，非离子洗涤剂以在0.1％和2％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在，特别是以在0.1％和1％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在。在特定实施例中，非离子洗涤剂以约1％(w/v％或v/v％)的浓度存在。

在一些实施例中，非离子洗涤剂是聚多卡醇。在一些实施例中，非离子洗涤剂是浓度在0.1％和2％(v/v％)之间的，特别是浓度在0.1％和1％(v/v％)之间的聚多卡醇。在一些实施例中，非离子洗涤剂是浓度约为1％(v/v％)的聚多卡醇。

在一些实施例中，有足够长的时间段以裂解真核细胞，特别是动物细胞在30秒和10分钟之间，更具体地在1分钟和8分钟之间，更具体地在2分钟和6分钟之间。

在一些实施例中，裂解可以在15℃和30℃之间、更具体地在18℃和27℃之间、更具体地在20℃和25℃之间的温度下进行。在一些实施例中，裂解可在室温附近或在室温下进行。

在一些实施例中，动物细胞为哺乳动物细胞。

在一些实施例中，样品为哺乳动物血液样品。在某些实施例中，哺乳动物血液样品是全血样品。在特定实施例中，哺乳动物血液样品是血浆样品或血小板制剂。

在一些实施例中，微生物是细菌或真菌。

在某些实施例中，添加的洗涤剂和缓冲液的体积与样品的体积之间的比率在2∶1与1∶5之间。在其他实施例中，添加的洗涤剂和缓冲液的体积与样品的体积之间的比率在1∶1与1∶10之间。在又其他实施例中，添加的洗涤剂和缓冲液的体积与样品的体积之间的比率在1∶1与1∶5之间。

在一些实施例中，最终溶液将具有约8.5至9.0的pH。在某些实施例中，最终溶液将具有约8.7至9.0的pH。在特定实施例中，最终溶液将具有约8.8至9.0的pH。在具体实施例中，最终溶液将具有约8.9至9.0的pH。

在一些实施例中，缓冲液是碱性缓冲液。在此，碱性缓冲液可具有约9.0的pKa值。在某些实施例中，缓冲液是碳酸钠。在某些实施例中，缓冲液具有足够的缓冲能力，当缓冲液以根据本发明的比率与样品混合时，最终溶液的pH约为9.0或略低。在特定实施例中，碱性缓冲液具有约9.0的pKa，因此最终溶液将具有约9.0或略低的pH，特别是最终溶液将具有约8.5至9.0的pH；更具体地，约8.7至9.0；更具体地，约8.8至9.0；更具体地，约8.9至9.0。

在某些实施例中，该方法可进一步包括“中和步骤”。在一些实施例中，该步骤包括在根据本公开的选择性裂解之后添加酸或酸性缓冲液以获得约在7和9之间的pH。在一些实施例中，中和缓冲液的步骤包括添加酸或酸性缓冲液以获得约7.0的pH。

在某些实施例中，如上所述的方法之后是裂解微生物的步骤。在某些实施例中，如上所述的方法之后是通过执行聚合酶链反应(PCR)测定来检测微生物。

具体实施方式

本发明上下文中的“血细胞”涉及存在于血液中的哺乳动物细胞并且包括红细胞(红血球)、白细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。

本发明上下文中的“全血”涉及未处理的血液，其包含可能用抗凝剂处理过的血浆和细胞。

“样品”涉及水性悬浮液，该水性悬浮液不仅包括细胞材料和包括体液，诸如淋巴液、脑脊髓液、血液(全血和血浆)、唾液，而且包括例如均质化悬浮液的水性部分，诸如肌肉、大脑、肝脏或其他组织。

本发明中的“真核”是指除真菌以外的任何种类的真核生物，诸如动物，特别是含有血液的动物，并且包括无脊椎动物(诸如甲壳类)和脊椎动物。脊椎动物包括冷血动物(鱼类、爬行动物、两栖动物)和恒温动物(鸟类和哺乳动物)。哺乳动物特别包括灵长类动物，更特别地是人类。

如本发明所用的“选择性裂解”是当在样品(诸如血液)中，样品中保持完整的微生物细胞(如细菌细胞)的百分比与收集样品的生物体中保持完整的真核细胞的百分比相比显著提高(例如2、5、10、20、50、100、250、500、或1000倍)时获得的。

如本发明所用的“微生物”涉及细菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以及细菌孢子)和单细胞真菌诸如酵母和霉菌，它们存在于从中收集样品的生物体中，通常作为病原体。

本发明的第一方面涉及一种用于选择性裂解含有或疑似含有微生物(诸如细菌)的样品内的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法的目的是提高样品(即每毫升样品的微生物少于10000、1000、100或更少)中的微量细菌检测的测试灵敏度。如背景技术中所述，在样品中来自真核细胞的DNA，特别是来自动物细胞的，干扰基于PCR的检测方法，并且该DNA与蛋白质和膜一起形成聚集体，其在裂解后增加粘度并且具有对裂解样品的过滤具有巨大影响。为了解决这个问题，真核细胞，特别是动物细胞，被选择性裂解，其中大部分(即超过20％、40％、60％、80％、90％或甚至超过95％)的微生物仍然活着，或如果被处理杀死，仍然包含细胞壁内的细菌DNA。在如本发明所述的方法中，上述问题得到解决。

如本发明所述的方法特别地适用于任何类型的样品，其中来自微生物，特别是来自细菌的DNA的检测受到包含DNA的其他细胞的存在，特别是来自其中微生物作为病原体存在的宿主的细胞的损害。

现在针对研究其中哺乳动物血液样品中微量细菌的出现的实施例进一步示出如本发明所述的方法。

血液样品可作为全血或经过处理的部分(诸如血浆或血小板制剂)储存。通常，如本发明所述的方法是在新鲜分离的全血上进行的。这些样品通常用例如肝素、EDTA或柠檬酸盐处理以避免凝固。

可替代地，该方法是在有洗涤剂和缓冲液的管中在新鲜血液上通过收集直接来自静脉的血液进行的。

因此，新鲜血液样品或保存的样品补充有缓冲液和非离子洗涤剂。缓冲液及其浓度的选择是为了补偿所提供的血液样品的缓冲能力并为了获得约9.0或稍低的pH，特别是约8.5至9.0的pH。具体而言，选择缓冲液及其浓度以获得约8.7至9.0的pH；更具体地，约8.8至9.0；更具体地说，约为8.9至9.0。同样，缓冲液充分浓缩，使得至多将样品体积的200％、150％、100％、50％、20％或10％的缓冲液体积添加至样品中以获得所需的pH变化。特别地，缓冲液包含洗涤剂并且以添加的洗涤剂和缓冲液的体积与样品的体积在2∶1和1∶10之间的比率添加。进一步地，加入的洗涤剂和缓冲液的体积与样品体的积的比率可以在2∶1和1∶5之间、1∶1和1∶10之间或1∶1和1∶5之间。

本发明的上下文中的合适的缓冲液通常具有约9.0的pKa，并且包括在上述pH范围内具有最佳缓冲能力的碳酸盐缓冲液。

合适的洗涤剂是非离子洗涤剂，其一方面仅对真核细胞，特别是动物细胞具有裂解作用，而另一方面对DNA和蛋白质具有增溶作用。在一个特定实施例中，非离子洗涤剂是聚多卡醇(polidocanol)，也称为聚多卡醇(polidocanol)。聚多卡醇涉及由聚乙二醇单十二烷基醚的混合物组成的化合物或成分，平均每分子约9个环氧乙烷基团。它可以用分子式描述(C₂H₄O)_nC₁₂H₂₆O或HO(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₁₁CH₃其中n为约为或恰好为9，即乙二醇部分的中位数约为或恰好为9，这是其中月桂醇与环氧乙烷(乙氧基化)反应的生产方法的结果。在美国8，192，958中公开了聚多卡醇用于纯化核酸的用途，其整体通过引用并入本文。

洗涤剂的最有效浓度取决于洗涤剂与洗涤剂的不同，但通常在0.1％和5％之间的范围内，特别是在0.1％和2％之间，更特别是在0.1％和1％之间。根据洗涤剂(固体或液体)的不同，％分别指w/v％或v/v％。在一个特定实施例中，用于选择性裂解人血细胞的缓冲液是1000mM碳酸钠(Na₂CO₃)/1％聚多卡醇，pH 9.0。

在缓冲液和洗涤剂的存在下的血液样品的孵育在10分钟内，优选地在30秒和10分钟之间，和更优选地约1-3分钟、1-5分钟、1-8分钟、2-6分钟或1-10分钟，以在10和30℃之间的温度，更优选地在室温附近进行。

根据本发明的方法具有在低于10分钟的时间内在低于30℃的温度下获得选择性裂解的优点。因此，这些方法通常可以在而不需要加热样品的环境温度下进行。

任选地，在裂解后，通过在中和步骤中添加酸或酸性缓冲液，裂解样品的pH值达到中性值(即，pH值约为7.0)。结果发现，中性pH值下的裂解样品可以长时间储存(长达1、2、6、12或甚至24小时)，而不会进一步裂解细菌细胞，并且裂解样品的流体特性不会发生显著变化。

通常，根据本发明的方法包括其中将完整细菌细胞与样品分离的步骤，通常通过离心或过滤执行。

应当理解，尽管在此针对根据本发明的装置对优选实施例、具体构造和配置以及材料进行了讨论，但在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以在形式和细节上作各种改变或修改。

实例

本发明描述了一种新的缓冲液，其可以去除人类细胞和DNA而不会影响细菌病原体的核酸检测。缓冲液的配方是1000mM Na₂CO₃/1％聚多卡醇，pH 9.0。在现有文献中，pH9.5及以上的碳酸盐/非离子洗涤剂缓冲液显示出人类细胞的选择性裂解以去除人类DNA。令人惊讶的是，本发明在pH9.0时去除了人类DNA。与在pH 9.5及以上起作用的碳酸盐/非离子洗涤剂相比，本发明对于专门使用基于RNA的PCR检测败血症的方案具有优势。RNA在碱性pH条件下极易降解。因此，与pH 9.5及以上的碳酸盐/非离子洗涤剂相比，本缓冲体系中较低的pH 9.0有助于将RNA降解的风险降至最低。当比较1000mM Na₂CO₃/1％聚多卡醇、有1000mM Na₂CO₃/1％聚多卡醇的pH 9.0缓冲液、pH 9.6缓冲液的性能时观察到这种趋势(表2和3)。此外，可以观察到碳酸盐在pH 9.0缓冲液中的稳定性更高。

实例1：去除人类DNA的预分析

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)细菌菌株在LB培养基中生长至对数期，并将相当于1000CFU/mL的适当体积掺入新鲜收集的人类全血中。将含有掺入细菌的血液与选定的缓冲液(表2)以1∶1的比率混合，并在室温下保存10分钟以使人类染色质碎裂。孵育步骤后，加入等体积的中和缓冲液(1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)，pH 4.5)，并且样品以3220g离心15分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1mL含有1％β巯基乙醇的

PCR介质(4.2M盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)，pH 7.5)中。将样品转移至组织匀浆仪(MagNa Lyser instrument)(罗氏诊断产品(上海)有限公司)进行细胞裂解，以最大速度进行70秒。将裂解的样品加载到/>

6800系统上，并使用标准

测定工作流程在50μL的洗脱缓冲液中分离总核酸。

实例2：逆转录PCR测定

测定包含针对铜绿假单胞菌特异性tuf靶标的2个引物和1个探针，以及针对人β-珠蛋白靶标的2个引物和1个探针。引物和探针的序列示出于表1中。反应在

480仪器(罗氏诊断产品(上海)有限公司)中使用温度曲线进行，反应包括：尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的孵育步骤(50℃持续120s、94℃持续5s)；预PCR步骤(1个循环：55℃持续120s、60℃持续360s、65℃持续240s)；5个循环(每个循环结束时进行第一次测量)：95℃持续5s和55℃持续30s；随后是45个循环(每个循环结束时进行第二次测量)：91℃持续5s和58℃持续25s；并以冷却步骤(40℃持续120s)结束。实时PCR测定混合物由15μL/>

PCR通用预混反应液组成，其包含100-300nM引物和50-200nM探针，10μL 3mM的Mn²⁺，和25μL的总核酸模板。使用自定义优化算法测试框架(ATF)软件计算PCR测定的循环(Ct)阈值

表1：引物和探针序列

<FAM_T11r>和<CY5.5>是报告染料；<BHQ2>是Black HoleQuencher-2；<Phos>是磷酸盐。

实例3：实验结果

表2：在不同预分析缓冲液中使用细菌tuf基因和人β珠蛋白基因进行PCR测定的Ct值

表3：与“无预分析缓冲液对照”相比Ct值的变化

/>

序列表

<110> F.霍夫曼-罗氏公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

罗氏诊断有限公司 (Roche Diagnostics GmbH)

罗氏分子系统公司 (Roche Molecular Systems, Inc.)

<120> 人血细胞的选择性裂解

<130> P36609-WO-HS

<150> 63/130,625

<151> 2020-12-25

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌 tuf 正向引物

<400> 1

ccgtgcagaa gctggtaga 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌 tuf 反向引物

<400> 2

gagatcgaga acacgtcttc ga 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌 tuf 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` FAM

<220>

<221> misc_feature

<223> 3` 磷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<400> 3

ttccggagcc ggttcgtgcc atcg 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人 β 珠蛋白正向引物

<400> 4

gccagtgcca gaagagcca 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人 β 珠蛋白反向引物

<400> 5

tccttaaacc tgtcttgtaa ccttg 25

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人 β 珠蛋白探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 5` CY5.5

<220>

<221> misc_feature

<223> 3` 磷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> BHQ-2 猝灭剂

<400> 6

cctccctgct cctgggagta gattggccaa ccctag 36

Claims

1.一种用于选择性裂解含有或疑似含有微生物的样品内的真核细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供含有或疑似含有微生物的具有真核细胞的样品，

b)向所述样品添加非离子型洗涤剂和缓冲剂以获得pH为约9.0或略低的溶液，其中添加的洗涤剂和缓冲剂的体积与样品的体积之间的比率在2∶1与1∶10之间，

c)将所述溶液孵育足够长的时间段以裂解所述真核细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂以在0.1％与5％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂以约1％v/v％的浓度存在。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂为聚多卡醇。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述真核细胞为动物细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品为哺乳动物血液样品。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物为细菌或真菌。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂为碳酸钠。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其进一步包括：d)用酸中和所述缓冲剂以获得约7.0的pH。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其进一步包括：e)裂解所述微生物。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其进一步包括：f)通过执行聚合酶链式反应(PCR)测定来检测所述微生物。