JP5426668B2 - Ｒｎａ単離のための細胞溶解試薬 - Google Patents

Description

関連出願のクロスレファレンス
本出願は2008年6月13日に出願された米国仮特許出願第61/061,159号の利益を主張し、その内容は参照により本願明細書に引用されたものとする。

本発明は真核細胞からRNAを抽出する分野に関する。

細胞物質からのRNA抽出は、診断、治療及び研究のための様々な検査法において重要なステップである。抽出は典型的に抽出試薬の使用により達成され、この目的に有効であるために、試薬は、細胞核を破壊することなく好ましくは細胞溶解によってRNAを抽出すべきである。有効な試薬は、抽出中及び抽出後の両方においてRNAが完全な状態に保持されるように、RNAse等のRNAを分解する物質中のいかなる酵素をも阻害すべきである。更に、試薬はRNA結合タンパク質を破壊して、このタンパク質がRNAを放出するように、また、このタンパク質がまだRNAと接触している際にも、タンパク質が更に結合できなくするようにすべきである。更にまた、試薬は、RNAが後に続く処理及び反応に用いることができるように、例えばキレート化により、いかなる二次又は三次RNA構造も破壊すべきである。

Simmsの米国特許第6,875,857号（"Reagent for the Isolation of RNA"、2005年4月5日に発行）において、タージトール（tergitol）（tert-オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール）等の1つ以上の非イオン性洗剤、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（SDS）等の1つ以上のイオン性洗剤、EDTA等の1つ以上のキレート剤、ベータ−メルカプトエタノール等の1つ以上の還元剤及びアジ化ナトリウム等の1つ以上の抗菌剤を含む、特に植物細胞の細胞物質からRNAを抽出するための試薬が記載されている。この特許によればそのような試薬が植物細胞及び「他の難しい物質」からRNAを抽出するのに有効であるように見える一方で、該試薬は強い試薬であり、更に、RNAを精製するためにクロロホルム等の有機溶媒のその後の使用が必要となる。クロロホルムは有毒物質であり、環境を考慮すると塩素化溶媒を使用することな一般に好ましくない。

細胞物質からRNAを単離するための先行技術の他の方法には、抽出のためフェノール、クロロホルム又はイソアミルアルコールを用いるもの、また、核酸を沈殿させるためのGITC（グアニジンイソチオシアネート）等のカオトロピック剤の使用を含む方法が挙げられる。これら全ての方法には複数のステップ、有害な化学物質又はその両方が伴い、実施するのに数時間を要する。このような方法の１つが、Chenらの米国付与前特許出願公開第米国2007/0015165 Al号（公開日2007年1月18日）に開示されている。市販されているRNA抽出の試薬には、Bio-Rad Laboratories, Inc.（Hercules, カリフォルニア, 米国）のAURUM(商標)の製品名を持つ試薬が含まれる。AURUM製品は、GITCタイプの化合物を含有する。RNA抽出のための他の市販の試薬には、CytosAll（商標） (Thermo Fisher Scientific, Inc.の製品, Waltham, Massachusetts, USA)があり、タンパク質系RNアーゼ阻害剤の添加を要する。

ヘパリン、ジスルフィド結合を還元する還元剤、キレート剤、緩衝剤及びアルカリ金属ハロゲン化物を含有する試薬の使用により、高度な効率でRNAを細胞物質から抽出できることが発見された。非イオン性洗剤を更に随意の成分として含めることができる。この試薬の使用による効率性は、有機溶媒の使用を必要とせず、先行技術に比べ比較的短い時間で行うことができるという事実から来るものである。更に、試薬は化学的又は物理的にも細胞物質あるいは使用者又は環境に対して強くない。本発明は試薬それ自体及び細胞物質からRNAを抽出するための試薬の使用に関する。

本発明の試薬のヘパリン含有量は、試薬の約1pg/μL〜約10pg/μL、好ましくは約1pg/μL〜約5pg/μL、最も好ましくは約1pg/μL〜約3pg/μLである。ヘパリン塩を含む様々な形態のヘパリンを用いることができる。試薬を調製するのに用いられるヘパリン原液は、98％超の純度であることが好ましい。

試薬に含まれる還元剤は、細胞タンパク質においてジスルフィド結合を還元することが知られている任意の還元剤とすることができる。このような還元剤の例としてメルカプタンが挙げられ、好ましいメルカプタンはジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール及びトリス（2−カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）である。ジチオスレイトール及びβ−メルカプトエタノールが特に好ましい。本発明の試薬中の還元剤の濃度は約1mM〜約10mMであり、好ましくは約1mM〜約5mMである。

RNAの二次及び三次構造を破壊する任意の量のキレート剤が含められる。ほとんどの場合、濃度が約0.3mM〜約3mMの範囲、好ましくは約1mMのキレート剤で最良の結果が得られる。好適なキレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、クエン酸、サリチル酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、クエン酸及びサリチル酸の塩、並びにフタル酸、ヒスチジン、ヒスチジノール二塩酸塩及び8‐ヒドロキシキノリンが挙げられる。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が好ましい。

緩衝剤は生理学的状態に比較的近い、即ち約7.5〜約8.0の試薬のpHを維持するものが好ましい。好適な緩衝剤の例として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Tris-HCl）、ビス（2‐ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（ビス-トリス塩基）、ビス（2‐ヒドロキシエチル）イミノトリス-（ヒドロキシメチル）メタン塩酸塩（ビス-トリス-HCl）及びN-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸（HEPES）が挙げられる。緩衝剤の濃度は実際に用いられる緩衝剤によって変化するが、ほとんどの場合、濃度が約1mM〜約100mM、好ましくは10mM〜50mMの緩衝剤で最良の結果が得られる。

アルカリ金属ハロゲン化物は、イオン強度を維持するために含められる。特に塩化ナトリウム、カリウム又はリチウムのアルカリ金属塩化物が好ましく、個々あるいは２つ又は３つ全ての混合物として使用してもよい。最良の結果のために、アルカリ金属ハロゲン化物の濃度は約1mM〜約100mMの範囲、好ましくは約10mM〜約50mMである。

試薬は随意に例えば、NP-40又はタージトール(IGEPAL（登録商標）)等のアルキルフェノキシポリ（オキシエチレン）アルカノール等の１つ以上の非イオン性界面活性剤又は洗剤を含有する。タージトールは一般的にtert-オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノールである。他の好適なポリ（オキシエチレン）アルカノールは、TRITON（登録商標）製品（オクチルフェノールポリエトキシレート）及びTWEEN（登録商標）製品（様々な脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体）である。試薬に存在する場合、非イオン性洗剤は容量で2.5％までの量で含まれるのが好ましく、更に好ましくは約0.5％〜約2.5％、最も好ましくは約0.5％〜約2％である。

本発明の試薬が効果的に用いられてRNAを抽出する細胞物質は、RNAを含有する任意の個々の生体細胞及びこのような細胞を含む任意の組織又は他の細胞塊を含む。このため、本発明によって哺乳動物細胞物質を含む動物細胞物質からRNAを抽出できる。

本発明の試薬は、「第２の」又は「ヘルパー」洗剤として上記参照したSimms特許に言及されているイオン性（陽イオン性又は陰イオン性）洗剤を要せず、本発明の好ましい試薬組成物はこれらの洗剤を含有しない。これら洗剤を回避することによって、これらの洗剤が存在するときのものより穏和な条件下で、試薬は細胞物質からRNAを抽出することができる。本発明の試薬はまた、上清を抽出するために有機溶媒の使用がなくても、効果的である。特にクロロホルム等の有機溶媒のこのような使用は、上記参照したSimms特許に言及されている。更に、本発明の試薬はカオトロープ又はシリカ結合の使用を必要としない。これらの追加の試薬又は方法のステップがないことにより、本発明の試薬を使用する抽出方法は比較的少ないステップで行われ、わずか約10分で完了する。

次の一般的な手順が、本発明の試薬で細胞物質からRNAを抽出するのに用いられる：

選んだ細胞をPBS溶液(50mMリン酸カリウム及び150mM NaCl; pH 7.2)で回転(500 rcf at 4℃)して洗浄し、所望の濃度(溶解のダイナミック・レンジとして1〜1000細胞/μL)までPBSに再懸濁する。そして、細胞をペレット化し、PBS溶液を除去し、ペレット化した細胞に直接試薬を添加することにより、等量の本発明のRNA抽出試薬で置換する。生じた混合物を約30秒間渦動撹拌し、次いで、細胞核をペレット化するために室温にて3分間5000rcfで回転させる。そして、抽出したRNAを含む上清を除去し、更なる抽出又は処理を行うことなく下流使用の準備が整う。

本発明の試薬は、1〜1000細胞/μLの範囲内で細胞を効率的に溶解する能力によって評価された。成功は、定量的RT-PCRを用いて3つの対数に渡る細胞濃度に対する標準曲線の直線性を評価することにより測定した。溶解物中のゲノムDNAの存在も評価した。処方が成功と考慮されるためには、定量的RT-PCRで測定して特定の遺伝子に対するゲノムDNAがmRNAの少なくとも25倍少なくなくてはならない。

以下の表１、２及び３は、HeLa細胞からのRNA抽出で試験された本発明による試薬溶液の組成を示し、上記の基準により成功とみなされる。溶液は、ヘパリン、EDTA及びジチオトレイトール（DTT）を表示した量で、並びに他の成分は特定した通りに含有した。

請求項又は本願明細書に添付された請求項において、用語「a」又は「an」は「１つ以上」を意味することを目的とする。用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等のその変異形は、ステップ又は要素の記述の前にある時、更なるステップ又は要素の付加が随意であり排除されないと意味することを意図する。この明細書に引用される全ての特許、特許出願及び他の公開された参照文献は、全体として本願明細書に参照により引用されたものとする。ここで引用された任意の参照文献とこの明細書の明確な教示とのいかなる相違は、この明細書の教示を優先して解決することを目的とする。これには、言葉又は語句の技術分野で理解されている定義と同じ言葉又は語句のこの明細書で明確に提供される定義とのいかなる相違も含む。

Claims (19)

1. 細胞物質からRNAを抽出するための試薬であって、
   (a)1pg/μL〜10pg/μLのヘパリン；
   (b)細胞タンパク質のジスルフィド結合を還元するのに効果的な1mM〜10mMの還元剤；
   (c)RNA二次及び三次構造を破壊するのに十分な量のキレート剤；
   (d)トリス塩基、トリス-HCl、ビス-トリス塩基、ビス-トリス-HCl及びHEPESからなる群より選ばれる1mM〜100mMの緩衝剤；及び
   (e)1mM〜100mMのアルカリ金属ハロゲン化物
   を含む試薬。
2. 前記ヘパリンが前記試薬の1pg/μL〜3pg/μLを構成する請求項１記載の試薬。
3. 前記還元剤が前記試薬の1mM〜5mMを構成する請求項１記載の試薬。
4. 前記還元剤がジチオスレイトール、β-メルカプトエタノール及びトリス（2-カルボキシ-エチル）ホスフィンからなる群より選ばれるメンバーである請求項1記載の試薬。
5. 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸；エチレングリコール四酢酸；クエン酸；サリチル酸；エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、クエン酸及びサリチル酸の塩；フタル酸；ヒスチジン；ヒスチジノール二塩酸塩；及び8-ヒドロキシキノリンからなる群より選ばれるメンバーである請求項1記載の試薬。
6. 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である請求項１記載の試薬。
7. 前記キレート剤が前記試薬の0.3mM〜3mMを構成する請求項１記載の試薬。
8. 前記緩衝剤が、前記試薬のpHを7.5〜8.0に維持する前記試薬の量を構成する請求項１記載の試薬。
9. 前記アルカリ金属ハロゲン化物が塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化リチウムからなる群より選ばれる請求項１記載の試薬。
10. 前記アルカリ金属ハロゲン化物がアルカリ金属塩化物であり、前記試薬の10mM〜50mMを構成する請求項１記載の試薬。
11. 非イオン性洗剤を2.5％以下の容量で更に含む請求項１記載の試薬。
12. 前記試薬が陽イオン洗剤及び陰イオン洗剤を欠く請求項１記載の試薬。
13. 細胞物質からRNAを抽出する方法であって、前記細胞物質を請求項１の試薬に前記RNAを上清に十分抽出できる程度に接触させ、前記細胞物質の残りから前記上清を回収することを含む方法。
14. 有機溶媒で前記上清を抽出することなく行われる請求項１３記載の方法。
15. 前記細胞物質からゲノムDNAを除去するための前記細胞物質の酵素処理を行なうことなく行われる、請求項１３記載の方法。
16. 前記細胞物質中のタンパク質を変性させるための前記細胞物質の熱処理を行なうことなく行われる、請求項１３記載の方法。
17. 前記ヘパリンが前記試薬の1pg/μL〜3pg/μLを構成し、前記還元剤が前記試薬の1mM〜5mMを構成し、前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸であり、前記試薬の0.3mM〜3mMを構成し、前記緩衝剤が前記の試薬のpHを7.5〜8.0に維持する前記試薬の量を構成し、前記アルカリ金属ハロゲン化物が前記試薬の10mM〜50mMを構成する請求項１３記載の方法。
18. 前記試薬が非イオン性洗剤を2.5％以下の容量で更に含み、イオン性洗剤を欠く請求項１３記載の方法。
19. 前記試薬が有機溶媒を欠く、請求項１記載の試薬。