JP2016082980A - 核酸の単離 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記洗浄溶液は、前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲(buffering range)を有する緩衝剤を含み、及び前記洗浄溶液のpHは、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い。
【選択図】図1
Description
(i) 結合緩衝剤の存在下、第一のpHで、核酸を固相に結合させる工程;
(ii) 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程;及び
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpHで、核酸を固相から溶出させる工程;を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲(buffering range)を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のpHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤(即ち洗浄緩衝剤)の緩衝範囲よりも低い、前記方法が提供される。
(i) 第一のpHで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤;
(ii) 前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、pHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液;及び任意で
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpH値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液;
を備える。
(i) 第一のpHで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤;
(ii) 前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、pHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物;及び任意で
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpH値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物;
を備える。
pH4及びpH5での酸性及びアルカリ性の洗浄緩衝剤を使用して達成される核酸の収量の比較を示す。
HIVウイルスRNAを、水ベースの溶解緩衝剤(pH4.0のTris酢酸含有)を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、pH4若しくは5の10mM Tris−HCl(緩衝範囲pH7.1〜9)、pH4若しくは5の10mM クエン酸ナトリウム(緩衝範囲pH3.0〜6.2)、又はpH4若しくは5の10mM Tris酢酸(緩衝範囲pH3.6〜5.6)のいずれかの洗浄緩衝剤で洗浄する。pH4及び5の10mM Tris−HClは、本発明の溶液の態様である。
洗浄緩衝剤のpHに対する残留した溶解緩衝剤の影響、及び溶出緩衝剤のpHに対する残留した洗浄緩衝剤の影響
残留した溶解緩衝剤と洗浄緩衝剤との間の、及び残留した洗浄緩衝剤と溶出緩衝剤との間の相互作用は、これらの緩衝剤を混合することにより調査された。20μlの溶解緩衝剤(pH4のTris酢酸を含有する)を500μlの洗浄緩衝剤(pH4の10mM Tris−HCl、pH6の10mM Tris−HCl、又はpH4の10mM クエン酸ナトリウム)と混合し、及び、20μlの洗浄緩衝剤(pH4の10mM Tris−HCl、pH6の10mM Tris−HCl、又はpH4の10mM クエン酸ナトリウム)を120μlの溶出緩衝剤(pH8.5のTris−HClを含有する)と混合することにより、様々な緩衝剤の相互作用を記載した。混合物のpHを、pH紙を用いて測定した。結果を、図2に示す。
異なるpHの洗浄緩衝剤(MESを含有する洗浄緩衝剤を使用する)で達成される核酸の収量の比較
HIVウイルスRNAを、水ベースの溶解緩衝剤(pH4.0のTris酢酸含有)を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、pH4.5若しくは6の10mM MES(緩衝範囲pH5.5〜6.7)で洗浄する。核酸を溶出緩衝剤(pH8.5の10mM Tris−HCl)で溶出した。単離された核酸を、増幅及び検出した。図3は、平均の検出シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
本発明の方法を使用して達成されるRNA回収率の、Qiagenの核酸単離方法との比較
HIV陽性血漿試料から、本発明の方法及びQiagenの方法を使用して、ウイルスRNAを単離した。そして、単離された核酸を増幅及び検出した。
Claims (40)
- 核酸を単離する方法であって、以下:
(i) 結合緩衝剤の存在下、第一のpHで、核酸を固相に結合させる工程;
(ii) 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程;及び
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpHで、核酸を固相から溶出させる工程;を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲(buffering range)を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のpHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記方法。 - 前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲が、第一のpHよりも高い、請求項1に記載の方法。
- 前記第二のpHが、洗浄緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- 前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲がpH5.0よりも高い、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一のpHが、pH3〜6又はpH3〜5の範囲内である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第二のpHが、pH6.5〜10、好ましくはpH7〜9である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記洗浄溶液のpHがpH6.0以下、好ましくはpH3.0〜6.0である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一のpHが結合緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合緩衝剤の緩衝範囲の下端がpH3.0以上である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- カオトロピック剤及び有機溶媒の非存在下で実施される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 固相への核酸の結合が、コスモトロピック剤の存在下で実施される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コスモトロピック剤が硫酸アンモニウムである、請求項11に記載の方法。
- 前記固相が、第一のpHと第二のpHの間のpKaを有する陰イオン化基(negatively ionisable group)を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固相が無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞から核酸を単離する方法であって、細胞を溶解して細胞から核酸を放出させる工程、及び放出された核酸を請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法を使用して単離する工程を含む、前記方法。
- 前記溶解が結合緩衝剤を使用して行われる、請求項15に記載の方法。
- 前記結合緩衝剤がコスモトロピック剤を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 室温よりも高い温度で前記核酸が固相から溶出される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝剤の存在下で前記核酸が固相から溶出され、第二のpHが溶出緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出緩衝剤の緩衝範囲が、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲と重複し、又はこれに包含される、請求項19に記載の方法。
- 第一のpHで核酸が結合し、そして第二のより高いpHで核酸が溶出される固相を洗浄する緩衝剤を含有する溶液であって、pHが、pH6.0以下、好ましくはpH3.0〜pH6.0であり、前記緩衝剤の緩衝範囲がpH6.0を超える、前記溶液。
- カオトロピック剤を含まない、請求項21に記載の溶液。
- 有機溶媒を含まない、請求項21又は22のいずれかに記載の溶液。
- pHがpH5.0以下である、請求項21〜23のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記緩衝剤の緩衝範囲が、pH6.5〜10の範囲と重複し、これに包含され、又はこれを包含する、請求項21〜24のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記緩衝剤がTris緩衝剤、好ましくはTris−HClを含有する、請求項21〜25のいずれか1項に記載の溶液。
- プロテアーゼを含有しない、請求項21〜26のいずれか1項に記載の溶液。
- 更に洗剤(detergent)を含有する、請求項21〜27のいずれか1項に記載の溶液。
- 液体に溶解されることで請求項21〜27のいずれか1項に記載の溶液を形成する、乾燥形態の組成物。
- 核酸を単離するためのキットであって、以下:
(i) 第一のpHで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤;
(ii) 前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、pHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液;及び任意で
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpH値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液;
を備える、前記キット。 - 核酸を単離するためのキットであって、以下:
(i) 第一のpHで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤;
(ii) 前記第一のpHよりも高いpHを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、pHが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物;及び任意で
(iii) 前記第一のpHよりも高い第二のpH値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物;
を備える、前記キット。 - 前記洗浄溶液が、請求項21〜28のいずれか1項に記載の溶液である、請求項30に記載のキット。
- 洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、前記乾燥形態の組成物が、請求項29に記載の組成物である、請求項31に記載のキット。
- カオトロピック剤を含有せず、及び有機溶媒を含有しない、請求項30〜33のいずれか1項に記載のキット。
- 前記結合緩衝剤が、コスモトロピック剤を含有する、請求項30〜34のいずれか1項に記載のキット。
- 更に、結合緩衝剤の存在下、第一のpHで核酸が結合し、そして第二のpHで核酸が溶出する固相を備える、請求項30〜35のいずれか1項に記載のキット。
- 前記固相が、核酸が固相と結合可能な第一のpHと、固相から核酸が溶出可能な第二のpHとの間のpKaを有する陰イオン化基を含む固相を備える、請求項36に記載のキット。
- 前記固相が、無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項36又は37のいずれかに記載のキット。
- 更に、プロテアーゼ、好ましくは凍結乾燥品のプロテアーゼを、結合緩衝剤と別個に備える、請求項30〜38のいずれか1項に記載のキット。
- 核酸を単離するための、請求項21〜28のいずれか1項に記載の溶液、請求項29に記載の組成物、又は請求項30〜39のいずれか1項に記載のキットの使用。
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