JP2008525043A - 核酸配列の機能およびそれにより核酸配列にコードされる発現産物の決定方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
・ 転換率は非常に高く、多くの細胞型に対して90%より大であり、したがって、選択する必要がない。
・ 発現レベルは、形質転換に用いるRNA量によって、非常に良好に滴定することができる。このようにして、細胞内の発現レベルの差異の効果をシミュレートすることが可能となる。
・ 形質転換後、同期翻訳が直ちに起こるため、年代順に生物学的余効を感度よく検出できる。
・ RNA形質転換は、トランスクリプトームに関して、形質転換細胞の方法依存変動を殆ど示さない。
本発明によれば、組み換え核酸の産物、細胞の培養、および核酸、特にRNAの細胞への導入、特にエレクトロポレーションおよびリポフェクションについて標準的な方法を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造者の指示または公知の手法により行う。
2.負のチャージを帯びた残基およびそれらのアミド:Asn、Asp、Glu、Gln
3.正のチャージを帯びた残基:His、Arg、Lys
4.大きな脂肪族の、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys)
5.大きな芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
実施例2:IVT RNAの生産
実施例3:細胞へのエレクトロポレーション
Vmは膜電位であり、fは細胞外の電界分布に対する細胞の影響を表す形状因子である。fEexは適用された電界を表し、rは細胞半径を表し、φは外部から適用された電界に対する角度を表す。fは、通常1.5として与えられるが、それは他の多くの因子に依存している。適用された電界が、細胞膜の容量を越えるとき、すなわち、ΔVmが1Vとして与えられる閾値ΔVsより大きいとき、細胞へのエレクトロポレーションは成功する(Kinosita,K.,Jr.and Tsong,T.Y.(1977)Nature,268,438−441)。二分子膜としての細胞膜の構造は、真核細胞に共通の特徴であるため、この値は異なった細胞株に対して、ほとんど変動を示さない。
実施例4:実験条件の確立と実験系の特徴付け
形質転換条件:200Vかつ250μFのエレクトロポレーション。
実施例5:モデル遺伝子のIVT RNA形質転換
実施例6:例としてSYT−SSX1およびSYT−SSX2を用いた推定発癌転写物の従来未知の機能の同定。
Claims (19)
- 生命体における核酸および/または核酸発現産物の機能を調査する方法であって、
(a)発現産物の一部または全配列の核酸および/またはコードに由来するRNAの宿主細胞への導入、
(b)前記RNAの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査、および
(c)(b)のステップで決定された宿主細胞における効果に基づいた核酸および/または発現産物の一つ以上の機能の同定、
の各ステップを含む方法。 - 前記RNAがそれをエンコードする核酸をクローニングし、インビトロでの転写によって得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記インビトロでの転写は、T7、T3またはSP6プロモーターによって調節されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記核酸はポリアデニルカセットと組み合わせて存在することを特徴とする請求項2または3に記載の方法。
- 前記RNAが定義された長さのポリアデニル化部分を有すること特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記RNAがCap構造を有することを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記RNAの宿主細胞への導入は、前記RNAによりエンコードされた発現産物の発現を引き起こすことを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記発現産物が、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の表現型および/または生化学的特徴の調査を含むことを特徴とする請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞のタンパク質発現プロファイルの調査(プロテオーム解析)を含むことを特徴とする請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の前記RNA発現プロファイルの調査(トランスクリプトーム解析)を含むことを特徴とする、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の代謝の調査を含むことを特徴とする請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 前記代謝の調査が、酵素反応の基質または産物の集積の調査を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、遺伝子調節の調査を含むことを特徴とする請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果が、RNAが導入されていない細胞と比較して調査されることを特徴とする請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、相補性解析を含むことを特徴とする、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、原生または真核細胞であることを特徴とする、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞へのRNA導入が、エレクトロポレーション法またはリポソームを用いて、行なわれることを特徴とする、請求項1から17のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞に対する効果の調査が、高密度マイクロアレイ処理を用いて行なわれることを特徴とする請求項1から18のいずれかに記載の方法。
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