WO2004108921A1

WO2004108921A1 - 核酸導入法

Info

Publication number: WO2004108921A1
Application number: PCT/JP2004/008020
Authority: WO
Inventors: Mikio Aoki
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.; Sumitomo Chemical Company, Limited
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2004-12-16
Also published as: JPWO2004108921A1; US20060166914A1; EP1637597A1; EP1637597A4

Abstract

　（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させる工程、および（ｂ）前記（ａ）工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、を含む核酸導入法、およびオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を成分として含有する核酸導入用試薬を提供する。

Description

明細書

核酸導入法技術分野

本発明は、新規な核酸導入法に関する。より詳細には、本発明は、浸透圧の差を利用した新規な核酸導入法に関する。 . 背景技術

ァンチセンス核酸、短い干渉 RNA (siR A)などのォリゴヌクレオチドの細胞への効率的な導入は、これらの分子を用いた遺伝子機能解析において極めて重要である。従来の遺伝子導入法は、機能性分子の負電荷と細胞膜の負電荷およびそれらとィオン結合するカチオンリボソーム（Feigner, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 , 7413 (1987)、 Invitrogen社， FOCUS, Vol. 21， No. 3 (1999) ) やポリエチレンィミン (Boussif, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92， 7297 (1995) )などの正電荷をもつた運搬担体の複合体を細胞へ導入する方法や、細胞透過性べプチドとオリゴヌクレオチドを共有結合させた融合分子を導入する方法 (Thoren et al, FEBS Letters, 482, 265 (2000)、 Nagahara, et al, Nature medicine, 4, 1449 (1998) )、細胞に一過性に電気的に穴をあけて細胞へ導入する方法 (Neumann, et al, EMBO J， 1， 84 1 (1982) )などであった。

正電荷をもつた運搬担体との複合体を用レ、る導入法は接着培養細胞株への導入効率は概ね良好であるが、オリゴヌクレオチド一運搬担体複合体の細胞外から細胞内への取り込みにおいては細胞内在性の取り込み機構を用いるため、取り込み活性の低い細胞への導入は困難であった。また、運搬担体自身に細胞毒性や免疫アジュバント活性があるため、リンパ球などの浮遊細胞や初代培養細胞への導入は困難でつた。細胞透過性べプチドとオリゴヌクレオチドを共有結合させた融合分子を導入する方法では、共有結合形成反応効率の問題や反応の煩雑さに加え、オリゴヌタレォチドだけの作用ではなく、細胞透過性べプチドと機能性分子の共有結合体としての作用し力観察することができないなどの問題があった。また細胞に一過性に電気的に穴をあけて機能性分子を導入する方法は、電気パルスのため細胞が極度のダメージを受け、多くの細胞が破裂してしまう問題などがあった。このように従来の核酸導入法は各々問題点があるため、細胞種を問わず効率良く核酸を導入することの可能な新たな核酸導入法が望まれている状況にあった。努明の開示

本発明は、新規な核酸導入法を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は浸透圧の差を利用した新規な核酸導入法を提供することを目的とする。

発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、運搬担体、細胞透過性ぺプチド、電気パルスに依らない核酸の細胞への効率的な導入法を開発することに成功した。すなわち本発明は、細胞外液と細胞内液の浸透圧差を利用し、細胞が外界の溶液を摂取する現象の一つとして知られる pinocytosis (飲作用）を促進し、オリゴヌクレオチド等核酸の細胞への効率的な導入を可能にしたものである。

これまで pinocytosisを利用して細胞内へ低分子化合物や蛋白質を導入した報告はなされていた (Craig Y Okada et al. , Cell, 29， 33-41, 1982)。しかしながら現在では既に陳腐化した技術となっており、核酸の導入に用いられた報告もない。本宪明者らは浸透圧差を利用した核酸を導入する方法につき検討した。すなわち ( 1 ) 核酸を含有する高張液と細胞とを接触させて pinocytosisにより核酸を細胞内に取り込ませ、（2 ) その後前記高張液の浸透圧を低下させて細胞内で pinocyti c vesicleを破裂，核酸を細胞内に放出させることにより、核酸を導入する方法につき鋭意検討を行った。その結果驚くべきことに、本方法を用いることにより、従来にない高い効率で核酸を導入できることを見出した。しかも、従来技術では導入が極めて困難であった細胞種へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能であることを見出した。また本方法は従来使用していたアジュバント（リボソーム、ポリエチレンイミン等）を使用しない方法であるため、従来法の問題点であった細胞毒性や免疫アジュバント活性も認められない。そのため接着性細胞株だけでなく、細胞毒性への感受性が高い初代培養細胞ゃリンパ球へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能となった。

本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、下記に掲げるものである： (1) 以下の工程 (a) 及び（b) を含む核酸導入法：

(a) 核酸、高張液および細胞を接触させる工程、

(b) 前記（a) の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、

(2) 前記工程 (b) において、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させる、前記（1) 記載の核酸導入法、

(3) 核酸がオリゴヌクレチドである、前記（1)または（2) 記載の核酸導入法、

(4) オリゴヌクレオチドが、一本鎖ォリゴヌクレオチド、二本鎖ォリゴヌクレォチドまたはそれらの類縁体である、前記（3) 記載の核酸導入法、

(5) オリゴヌクレオチドが、デォキシリボヌクレオチド（DNA) 、リポヌクレオチド（RNA) 、ホスホロチォエートオリゴデォキシヌクレオチド、 2' — O 一（2—メトキシ）ェチル一修飾核酸（2，一 M〇E—修飾核酸）、短い干渉 RN A (s i RNA) 、架橋型核酸（LNA) 、ペプチド核酸（PNA) またはモルフォリノ ·アンチセンス核酸である、前記 (3) 又は（4) 記載の核酸導入法、

(6) 高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種の物質を含有する、前記（1) 〜（5) いずれか記載の核酸導入法、

(7) オリゴ糖が二糖類である、前記（6) 記載の核酸導入法、

(8) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（7) 記載の核酸導入法

(9) 多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、前記（6) 記載の核酸導入法、

(10) ジオールがグリコール誘導体である、前記（ 9 ) 記載の核酸導入法、

(1 1) トリオールがグリセリン誘導体である、前記（ 9 ) 記載の核酸導入法、

(12) ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（ 9 ) 記載の核酸導入法、

(13) 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（9) 記載の核酸導入法、

(14) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（13) 記載の核酸導入法、 (15) ダリコール誘導体がエチレンダリコールである、前記（10) 記載の核酸導入法、 ·'

(16) グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（1 1) 記載の核酸導入法

(17) ポリグリコール誘導体がポリェチレングリコールである、前記（12) 記載の核酸導入法、

(18) ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、前記（1 7) 記載の核酸導入法、

(19) ポリエチレングリコールが PEG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG600、 PEG1000、 PEG 1500、 P E G 1540または P E G 2000である、前記（18) 記載の核酸導入法、

(20) 単糖アルコーノレ類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（13) 記載の核酸導入法、

(21) 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、前記（14) 記載の核酸導入法、

(22) 高張液が、（a) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（b) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを含有する、前記（6) 記載の核酸導入法、

(23) オリゴ糖が二糖類である、前記（22) 記載の核酸導入法、

(24) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（23) 記載の核酸導入法、

(25) 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（22) 記載の核酸導入法、

(26) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（25).記載の核酸導入法、

(27) 単糖アルコーノレ類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（25) 記載の核酸導入法、

(28) 二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（26) 記載の核酸導入法、 (29) ジオールがグリコール誘導体である、前記（22) 記載の核酸導入法、

(30) トリオールがグリセリン誘導体である、前記（22) 記載の核酸導入法

(31) ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（22) 記載の核酸導入法、

(32) グリコール誘導体がェチレングリコールである、前記（29) 記載の核酸導入法、

(33) グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（30) 記載の核酸導入法 (34) ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（31) 記載の核酸導入法、

(35) ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、前記（3 4) 記載の核酸導入法、

(36) ポリエチレングリコールが P EG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG 600, PEG1000、 PEG 1500、 P E G 1540または P E G 2000である、前記（35) 記載の核酸導入法、

(37) 高張液が、（a) ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、（b) PEG 200, PEG 300 PE G400、 PEG600、 PEG 1000、 PEG 1 500, PEG1540、 P EG 2000およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを含有する、前記 (22) 記載の核酸導入法、

(38) 高張液が、（a) ショ糖、マン-トール、ソルビトールまたはキシリト一ノレと、（b) PEG200、 PEG300、 PEG400、 P EG 600_S PE G1000、 PEG1500、 P EG 1540, P E G 2000またはグリセリンとを含有する、前記（37) 記載の核酸導入法、

(39) 高張液がオリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質を含有する、前記（6) 記載の核酸導入法、

(40) オリゴ糖が二糖類である、前記（39) 記載の核酸導入法、

(41) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（40) 記載の核酸導入法、 ..

(42) 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（39) 記載の核酸導入法、

(43) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（42) 記載の核酸導入法、

(44) 単糖アルコーノレ類がマン-トール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（42) 記載の核酸導入法、 '

(45) 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、前記（43) 記載の核酸導入法、

(46) 高張液がショ糖、マン-トール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する、前記（39) 記載の核酸導入法、

(47) 高張液中に存在するオリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0. 29M〜3Mの範囲内である、前記（1) 〜（46) いずれか記載の核酸導入法、

(48) 高張液中に存在するオリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0. 5M〜2. 1Mの範囲内である、前記（47) 記載の核酸導入法、

(49) 低張液の浸透圧が等張以下である、前記（2) 〜（48) いずれか記載の核酸導入法、

(50) オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種の物質を成分として含有する、核酸導入用試薬、

(51) 前記（1) 〜（49) いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、前記（50) 記載の核酸導入用試薬、

(52) オリゴ糖が二糖類である、前記（50) または（51) 記載の核酸導入用試薬、

(53) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（52) 記載の核酸導入用試薬、

(54) 多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、前記（50) または（51) 記載の核酸導入用試薬、

(55) ジオールがグリコール誘導体である、前記（54) 記載の核酸導入用試薬、

(56) トリオールがグリセリン誘導体である、前記（54) 記載の核酸導入用薬、

(57) ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（54) 記載の核酸導入用試薬、

(58) 糠アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（54) 記載の核酸導入用試薬、

(59) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（58) 記載の核酸導入用試薬、

(60) グリコール誘導体がェチレングリコールである、前記（55) 記載の核酸導入用試薬、

(61) グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（56) 記載の核酸導入用、

(62) ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（57) 記載の核酸導入用試薬、

(63) ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、前記（6 2) 記載の核酸導入用試薬、

(64) ポリエチレングリコールが P EG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG600、 PEG 1000 PEG 1500, P E G 1540または P E G 2000である、前記（63) 記載の核酸導入用試薬、

(65) 単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（58) 記載の核酸導入用試薬、

(66) 二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（59) 記載の核酸導入用試薬、

(67) (a) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（ b ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを成分として含有する、前記（50) または（51) 記載の核酸導入用試薬、

(68) オリゴ糖が二糖類である、前記（67) 記載の核酸導入用試薬、

(69) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（68) 記載の核酸導入用試薬、

(70) 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（67) 記載の核酸導入用試薬、

(71) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（70) 記載の核酸導入用試薬、

(72) 単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（70) 記載の核酸導入用試薬、

(73) 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、前記（71) 記載の核酸導入用試薬、

(74) ジオールがグリコール誘導体である、前記（67) 記載の核酸導入用試薬、

(75) トリオールがグリセリン誘導体である、前記（67) 記載の核酸導入用薬、

(76) ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（67) 記載の核酸導入用試薬、

(77) グリコール誘導体がェチレングリコールである、前記（74) 記載の核酸導入用試薬、

(78) グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（75) 記載の核酸導入用 if¾薬、

(79) ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（76) 記載の核酸導入用試薬、

(80) ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、前記（7 9) 記載の核酸導入用試薬、

(81) ポリエチレングリコールが PEG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG600、 PEG1000、 PEG 1 500、 P E G 1540または P E G 2000である、前記（80) 記載の核酸導入用試薬、

(82) (a) ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、（b) PEG 200_N PEG 300_N PEG400、 PEG 600_S PEG 1000、 P EG 1500_S P EG 1540, P EG 200 0およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを成分として含有する、前記 (67) 記載の核酸導入用試薬、

(83) (a) ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（ b) PEG200、 PEG300、 PEG400、 PEG 600, PEG 1000 、 P EG 1 500, P EG 1540, P E G 2000またはグリセリンとを成分として含有する、前記（82) 記載の核酸導入用試薬、

(84) オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質を成分として含有する、前記（50) または（51) 記載の核酸導入用試薬、

(85) オリゴ糖が二糖類である、前記（84) 記載の核酸導入法、

(86) 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（85) 記載の核酸導入用試薬、

(87) 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（84) 記載の核酸導入用試薬、

(88) オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（87) 記載の核酸導入用試薬、

(89) 単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（87) 記載の核酸導入用試薬、

(90) 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、前記（88) 記載の核酸導入用試薬、

(91) ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを成分として含有する、前記（84) 記載の核酸導入用試薬、

(92) 成分が固体または液体の形状にある、前記（50) 〜（91) いずれか記載の核酸導入用試薬、

(93) オリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種以上の成分を含有する場合に、各成分が各々独立した固体または液体の形状にある、前記（92) 記載の核酸導入用試薬、

(94) 高張液中でのオリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0 . 29M〜3Mの範囲内になるようにあらかじめ調製された、前記（50) 〜（9 3) いずれか記載の核酸導入用試薬、 0

(95) 高張液中でのォリゴ糖および/または多価アルコールの総モル濃度が 0 . 5M〜2. 1Mの範囲内になるようにあらかじめ調製された、前記（94) 記載の核酸導入用試薬、

(96) 前記（ 50 ) (95) いずれか記載の試薬を含有する核酸導入用キッ K

(97) 前記（50) - (96) いずれか記載の試薬またはキットの、核酸導入における使用、

(98) 前記（ 50 ) - (96) いずれか記載の試薬またはキットを成分とする核酸導入剤、

(99) 前記（1) (49) いずれか記載の導入法により核酸が導入された細胞、

(100) 前記（ 1 ) (49) いずれか記載の導入法により核酸が導入された、マクロファージ様細胞株 RAW264.7細胞、ハイプリドーマ D011.10細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞、

(101) 前記 (99) または（100) 記載の細胞から調製された細胞由来の RN Aまたはタンパク質、ならびに

(102) 前記（99) または（100) 記載の細胞、若しくは前記（101) 記載の RNAまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法。図面の簡単な説明

図 1は、本発明核酸導入法（上段）、 Oligofectamine法（中段）およびポリェチレンイミン法（下段）によるマウスマクロファージ細胞株 RAW264.7細胞へのォリゴヌクレオチドの導入結果を示す。図中、左側は導入細胞の明視野像を、また右側は蛍光視野像を示す。

図 2は、本発明核酸導入法により RAW264.7細胞に TLR4 siRNAを導入し、定量的 PC Rにより siRNA効果を測定した結果を示す。図中、 TLR4 siRNAは TLR4 siRNAを導入した結果を示し、 Negative Control siRNAはネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 GAPDH mRNA量でノーマライズ後の TLR4 mR A相対量を示す。

図 3は、本発明核酸導入法により RAW264. 7細胞に TLR4 siRNAを導入し、 LPSまたは GLA- 60刺激による TNF a産生の抑制効果を測定した結果を示す。図中、 TLR4 siRN Aは TLR4 siRNAを導入した結果を示し、 Negative Control siRNAはネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 TNF a産生量を示す。図 4は、本発明核酸導入法により MW264. 7細胞に FITC標識ォリゴヌクレオチドを導入し、導入効率（上図）および細胞毒性（下図）を測定した結果を示す。横軸は導入効率のマーカー FITCの蛍光量（上図）および細胞毒性のマーカー 7 MDの蛍光量（下図）を示し、縦軸は Event数を示す。

図 5は、 RAW264. 7細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖ゃ多価アルコールの種類が細胞への siRNA導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、 GAPDH siRNA は GAPDH siRNAを導入した結果を示し、 Negative Control siRNAはネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 Cyclophilin mRNA量でノ一マラィズ後の GAPDH mRNA相対量を示す。

図 6は、、 RAW264. 7細胞を用いて、高張液が含有するショ糖と多価アルコール（PE G) の組み合わせが細胞への siRNA導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、 GAPDH siRNAは GAPDH siRNAを導入した結果を.示し、 Negative Control siRNAはネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 Cyclophilin mRNA量でノ一マラィズ後の GAPDH mRNA相対量を示す。

図 7は、 MW264. 7細胞を用いて、高張液が含有するソルビトールと多価アルコール（PEG) の組み合わせが細胞への siRNA導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、 GAPDH siRNAは GAPDH siRNAを導入した結果を示し、 Negative Control siRNA はネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 Cyclo philin raRNA量でノーマライズ後の GAPDH mRNA相対量を示す。

図 8は、 D011. 10細胞を用いて、本発明核酸導入法が電荷を持たない核酸にも適用できるかどうかを検討した結果を示す。上図は電荷を持たない核酸アナログであるモルフォリノ 'アンチセンス核酸を導入した結果を示し、下図は電荷を持つ核酸アナログであるホスホロチォエートオリゴデォキシヌクレオチドを導入した結果を示す。上図中、横軸は導入マーカー Fluoresceinの蛍光量を示し、縦軸は Event数を示す。下図中、横軸は導入マーカー FITCの蛍光量を示し、縦軸は Event数を示す。図 9は、 D011. 10細胞を用いて、本発明核酸導入法による siRNAの反復導入の効果を調べた結果を示す。図中、 GAPDH siRNAは GAPDH siRNAを導入した結果を示し、 Ne gative Control siRNAはネガティブコントロールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 Cyclophilin mRNA量でノーマライズ後の GAPDH mRNA相対量を示す図 1 0は、本発明核酸導入法によりラット初代培養分化脂肪細胞に siRNAを導入し、導入効率（ノックダウン活性）を測定した結果を示す。図中、 GAPDH siRNAは G APDH siRNAを導入した結果を示し、 Negative Control siRNAはネガティブコント口ールである siRNAを導入した結果を示す。また縦軸は、 Cyclophilin mR A量でノーマライズ後の GAPDH mRNA相対量を示す。

図 1 1は、本発明核酸導入法により RAW264. 7細胞に siRNAを反復導入し、導入効率（ノックダウン活性）をタンパクレベルで測定した結果を示す。図中、 Ctrlはネガティブコントロール siRNAを示し、 TLR2は TLR2に対する siRNAを示す。また Anti_T

LR2は抗 TLR2抗体によつて検出された TLR2蛋白質を示し、 Anti- GAPDHは抗 GAPDH抗体によつて検出された GAPDH蛋白質を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、少なくとも以下の工程（a ) 及び（b ) ：

( a ) 核酸、高張液および細胞を接触させる工程、

( b ) 前記（a ) の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、

を含む核酸導入法を提供する。

工程（a ) において用いられる核酸は、方法の原理上、その種類に制限は無くどのような核酸であっても導入対象として用いることができる。すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれであっても良く、また一本鎖 ·二本鎖およびこれらの類縁体のいずれの形態であっても良い。本発明の核酸が一本鎖である場合、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれも用いることができる。さらに本発明の核酸がポリヌクレオチドの場合、プラスミドの形態であっても良い。本発明の核酸として好ましくはオリゴヌクレオチドを挙げることができる。方法の原理上、導入するォリゴヌクレオチドの種類に制限はなく、一本鎖ォリゴヌタレォチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはこれらの類縁体のいずれも用いることができる。具体的には、デォキシリボヌクレオチド（DNA) 、リボヌクレオチド（RNA ) 、ホスホロチォエートオリゴデォキシヌクレオチド (実施例 1等参照) 、 2，-0- ( ² -メトキシ）ェチル-修飾核酸（²，_M0E -修飾核酸）、短い干渉 RNA (small interferi ng RNA： siRNA、実施例 2及び 3参照）、架橋型核酸（Locked Nucleic Acid: LNA ； Singh, et al, Chera. Coramun. , 455, 1998)、ぺプチド核酸（Peptide Nucleic Acid ： PNA; Nielsen, et al. , Science, 254, 1497, 1991)、またはモノレフオリノ 'ァンチセンス核酸 (Morpholino antisense ; Suramerton and Weller, Antisense & Nu cleic Acid Drug Development, 7, 187, 1997)などを例示することができる。

本発明の核酸の高張液中での濃度は、細胞への導入が可能な濃度であれば如何なる濃度であっても良いが、通常は 0 . 0 1 // M〜l mMの範囲を、好ましくは 1 μ M〜l 0 0 ί Μの範囲を挙げることができる。

工程（a ) において用いられる高張液は、等張以上の浸透圧を保ち、かつ核酸を含有する当該高張液と細胞とを接触させることにより細胞内への核酸の取り込みを可能とするような溶液であれば、如何なる溶液であっても、本発明の高張液として使用することができる。好ましくは、オリゴ糖類又は多価アルコール類に属する少なくとも 1種（1つ）の物質を含有する高張液が挙げられる。

ここでオリゴ糖とは具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、孚し糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビォース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖または乳糖が挙げられる。

また前記で多価アルコールとは具体的にはジオール、トリオール、ポリオール、糖アルコールが挙げられる。より好ましくはトリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。

ここでジォルとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としてはエチレンダリコールが例示される。またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。

またポリオールとしては、ポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレンダリコールが挙げられる。

当該ポリエチレングリコールは、分子量 2000以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、 PEG 200、 PE G300、 PEG400、 PEG600、 PEG1000、 PEG 1500, PE G 1540および PEG 2000が例示される。

前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。

単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。

前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。

本発明の核酸導入法において用いられる高張液は、前記に挙げた種々のオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を少なくとも 1種含有していれば良い。具体的には、前記において列挙した物質、例えばショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビオース、メリビオ ^ ス、ェピセロビオース、ッラノース、ノレチノース、口.ビノビオース、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量 2000以下の P EG—例えば PEG 200、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 P EG 1000 、 PEG1500、 P EG 1540, PEG2000等）、マンニトーノレ、ソノレビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、ラクチトールおよび還元パラチノース等の物質の中から、任意に選択した少なくとも 1種の物質を含有していれば良い。より具体的には、前記列挙した物質の中から任意に選択した 1種の物質、 2種の物質、 3種の物質、または 4種以上の物質を含有する高張液が例示される。その際、当該高張液、核酸及び細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及び/または多価アルコールの総モ/レ濃度が 0 . 2 9 M〜3 Mの範囲内となるように調製する必要がある。この範囲内であれば如何なるモル濃度であっても良いが、好ましくは 0 . 3 5 M〜2 . 5 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0 . 3 5 M〜2 . 1 M、さらに好ましくは 0 . 5 M〜2 . 1 Mの範囲が挙げられる。

なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して 1 M、 1 . 5 Mおよび 2 Mの 3種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。

本発明の核酸導入法において用いられる高張液は、前記のようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種（1つ）の物質を含有していれば良い。当該物質は 1種のみを含有していても良く、 2種以上を含有していても良い。 2種以上を含有する場合は、（1 ) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを含有することが好ましい。

ここで用いられるオリゴ糖は、具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビオース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、ノレチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。

単糖アルコーノレ類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリス'リトールが挙げられる。

前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。

二糖アルコール類としては、マルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。

前記でジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としては、エチレングリコールが挙げられる。

またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。またポリオールとしては、ポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールが挙げられる。

当該ポリエチレングリコールは、分子量 2000以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、 PEG200、 PE G 300、 PEG400、 PEG 600, PEG 1000、 P EG 1 500, PE G 1 540および PEG 2000が例示される。

以上のような（1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（2) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを含有する本発明の高張液の好ましい組み合わせとしては、（1) ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、（2) PEG200、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 PEG 1000、 P EG1500、 P EG 1540, P E G 2000およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを含有する高張液が例示される。

より好ましくは、（1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質と、（2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する 1種の物質とを含有する高張液が挙げられ、具体的には、（1) ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトーノレと、（2) PEG200、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 P EG1000、 P EG 1500, PEG1540、 P E G 2000またはグリセリンとを含有する高張液が例示される。

このようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種以上の物質を含有する本発明の高張液は、当該高張液中に存在するオリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0. 29M〜3Mの範囲内となるように調製されていれば、成分の各々はどのようなモル濃度であっても良い。好ましくは総モル濃度 0.35M〜2. 5 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0. 35M〜2. 1Mの範囲が挙げられる。さらに好ましくは 0. 5M〜2. 1Mの範囲が挙げられる。

なお、如^ Γなるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して 1M、 1. 5 Mおよび 2 Mの 3種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモノレ濃度を容易に決定することができる。

本発明の高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種の物質を含有する場合、前記のように総モル濃度が前記の範囲内であれば各々の成分のモル濃度は如何なる値であっても良いが、例えば（1 ) オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質のモル濃度が 0 . 5 M〜2 Mの範囲であり、かつ（2 ) ジオール、トリオ一ノレ又はポリオールに属する 1種の物質のモル濃度が 0 . 1 Mである場合などを例示することができる。

本発明の核酸導入法において用いられる高張液が、オリゴ糖又は多価アルコールに属する物質を 1種類のみ含有する場合は、オリゴ糖又は糖アルコールの中から選択することが好ましい。

以上のような、オリゴ糖又は糖アルコールに属する物質を 1種類のみ含有する本発明の高張液としては、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する高張液が好ましい。

このようにオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を 1種類のみ含有する本発明の高張液は、当該高張液中に存在するオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度が 0 . 2 9 M：〜 3 Mの範囲内となるように調製されていれば良い。好ましくはモル濃度 0 . 3 5 M〜 2 . 5 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0 . 3 5 M〜 2 . 1 Mの範囲が挙げられる。さらに好ましくは 0 . 5 M〜2 . 1 Mの範囲が挙げられる。なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して 1 M、 1 . 5 Mおよび 2 Mの 3種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモゾレ濃度を容易に決定することができる。

本発明の高張液は、オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種の物質を含有しており、かつ当該高張液と核酸及び細胞を接触させることにより細胞内への核酸の取り込みを可能とするような溶液であれば、如何なる溶液であっても、本発明の高張液として使用することができる。具体的には本発明の高張液は、培養液、緩衝液および/または血清を含有することが好ましく、培養液、緩衝液および血清のいずれも含有することがより好ましい。

ここで用いられる培養液は、各々の細胞に合った培養液であればどのような培養液であっても良い。例えば RPMI1640 (Invitrogen社）、 DULBECCO' S MODIFIED EAGL E MEDIA (Invitrogen|±) 、 F- 10 Nutrient Mixture (Invitrogen¾：) 、 F-12 Nutri ent Mixture (Invitrogen i) 、 Iscove' s Modified Dulbecco' s Media (Invitroge n社）または MINIMUM ESSENTIAL MEDIA (Invitrogen社）などが例示される。

また緩衝液としては、 HEPES緩衝液（シグマ社）、 TRIS緩衝液（シグマ社）、 PBS 緩衝液（Invitrogen社）などが例示される。高張液中の緩衝液の濃度はどのようなモル濃度であっても良い。好ましくはモル濃度 0 M〜 1 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 1 mM〜 1 0 0 πιΜ、最も好ましくは 1 mM〜 1 0 mMの範囲が挙げられる。

また血清としては、ゥシ胎児血清、ゥシ血清、仔ゥシ血清、ゥマ血清などが例示される。高張液中の血清の濃度はどのような濃度であっても良い。好ましくは 0〜 2 0 % (v/v) の範囲が挙げられ、より好ましくは 5〜10% (v/v) の範囲が挙げられる。

本発明の高張液全体の総モル濃度は、等張〜 3 Mの範囲内であれば良い。

本発明の核酸導入法において用いられる細胞は、方法の原理上、適応細胞種に制限はない。すなわち実施例で示したように、本発明の核酸導入法は、これまで核酸導入が極めて困難であった種々の細胞種への核酸導入を可能とした。従って細胞種を制限することなく、本発明の核酸導入法を適用することができる。

具体的には、通常の核酸導入が容易な細胞は勿論のこと、ハイプリドーマ、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆褐色脂肪細胞、初代培養褐色脂肪細胞、初代培養前駆白色脂肪細胞、初代培養白色脂肪細胞または初代培養神経細胞等に対して本発明の核酸導入法を適用することができる。

さらに本発明の方法は、原理上細胞の由来する種にとらわれることなく、動物細胞だけでなく、プロトプラスト状態を含む植物細胞、昆虫細胞、線虫細胞などに対しても適応可能である。

本発明の核酸導入法は、（a ) 核酸、高張液および細胞を接触させた後に、（b ) 前記高張液の浸透圧を低下させることを特徴とする。

ここで前記（b ) において高張液の浸透圧を低下させるためには、具体的には、等張液またはそれ以下の浸透圧の溶液（低張液）と細胞とを接触させれば良く、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させることがより好ましい。具体的な組成としては、例えば培地：水（好ましくは DEPC処理水）が 6 ： 4の比率で混合された低張液、または水（蒸留水、 DEPC処理水等）を挙げることができる。次に本発明の核酸導入法の具体例を示す。

まず導入対象となる細胞を培養する。培養は、各々の細胞に合った培養液を用いて通常の条件（37°C、 5%C0₂ ) 下で培養すれば良い。また細胞数（密度）は、各々の細胞が良好に生育できる程度の細胞数であれば良い。

高張液および低張液は、前述した本発明の高張液および低張液の組成となるように適宜調製すれば良い。

細胞への核酸の導入は以下のようにして行う。まず細胞から培養上清を除き、核酸及び高張液を接触させる。接触のさせ方としては、最終的に高張液中で核酸と細胞とが接触するような方法であればどのようなものであっても良い。具体的には、核酸を含有する高張液を予め調製し、これを前記細胞に添加する方法や、細胞に対してまず核酸（核酸含有溶液）を添加し、その後高張液を添加する方法などが例示される。

その後細胞を適当な時間保温する。保温時間は 2分〜 2 0分程度が好ましく、 10 分〜 15分程度がより好ましい。その後核酸を含有する高張液を除去し、低張液を添加する。または高張液を除去することなく水を添カ卩して低張にしても良い。その後適当な時間保温しても良いし、また添カ卩した低張液を除去した後ふたたぴ低張液を添カロして適当な時間保温しても良い。保温時間は 2分〜 1 0分程度が好ましい。前記高張液、低張液を添加した後の保温温度は、液体状態を保つ温度であれば特に制限はないが、好ましくは 0°C〜42°Cの範囲が、より好ましくは室温〜 37°Cの範囲が挙げられる。

その後低張液を除去し、通常の増殖培地を添加する。以上の操作により、核酸の導入が達成される。なお、この導入操作は反復して行うことが出来る。

本発明の核酸導入法は、従来にない高い効率（50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上）でォリゴヌクレオチドを導入することができる。しかも、従来技術では極めて困難であった細胞種へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能である。また本方法は従来使用していたアジュバント（リボソーム、ポリエチレンイミン等）を使用しない方法であるため、従来法の問題点であった細胞毒性や免疫アジュバント活性も認められない。そのため接着性細胞株だけでなく、細胞毒性への感受性が高い初代培養細胞ゃリンパ球へもォリゴヌクレオチドを効率的に導入することができる。

本発明は、前記本発明の核酸導入法のために用いられる核酸導入用試薬を提供する。

本発明の核酸導入用試薬は、オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1 種の物質を成分として含有することを特徴とする。

オリゴ糖及び多価アルコールは、従来公知の通常の手法にて調製することができる。

ここでオリゴ糖とは具体的には二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビオース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、チノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。また前記で多価アルコールとはジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。より好ましくはトリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。

ここでジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としてはエチレンダリコールが例示される。またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。

またポリオールとしてはポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレンダリコールが挙げられる。

当該ポリエチレングリコールは、分子量 2000以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、 PEG200、 PE G300、 PEG400、 PEG600、 PEG 1000、 PEG 1500、 PE G 1540および P EG 2000が例示される。

前記で糖アルコールとしては単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。単糖アルコーノレ類としてはマン-トール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。

本発明の核酸導入用試薬は、前記に挙げた種々のオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を少なくとも 1種含有していれば良い。具体的には、前記において列挙した物質、例えばショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビオース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、ノレチノース、ロビノビオース、エチレングリコーノレ、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量 2000以下の PEG—例えば PEG 200、 P EG300、 PEG400、 PEG 600_N PEG 1000、 PEG 1500, P EG 1540, P EG 2000等）、マンエト一ノレ、ソノレビトーノレ、キシリトーノレ、エリスリトール、マルチトール、ラタチトールおよび還元パラチノース等の物質の中から、任意に選択した少なくとも 1種の物質を含有していれば良い。より具体的には、前記列挙した物質の中から任意に選択した 1種の物質、 2種の物質、 3種の物質または 4種以上の物質を含有していても良い。その際、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及ひ： /または多価アルコールの総モル濃度が 0. 29M〜3Mの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の各成分の濃度はどのようなものであっても良い。なお高張液中のオリゴ糖及び/または多価アルコールの総モル濃度は前記範囲内であれば如何なるモル濃度であっても良いが、好ましくは 0 . 3 5 M〜2 . 5 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0 . 3 5 M〜2 . 1 M、さらに好ましくは 0 . 5 M〜2 . 1 Mの範囲が挙げられる。

なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して 1 M、 1 . 5 Mおよび 2 Mの 3種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモノレ濃度を容易に決定することができる。

本発明の核酸導入用試薬は、前記のようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種（1つ）の物質を含有していれば良い。当該物質は 1種のみを含有していても良く、 2種以上を含有していても良い。 2種以上を含有する場合は、（ 1 ) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種とを含有することが好ましいここで用いられるオリゴ糖は、二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンブビオース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、ノレチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。

二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。

またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。またポリオールとしては、ポリダリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコール（PEG) が挙げられる。

当該ポリエチレンダリコールは、分子量 2000以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、 PEG200、 PE G300、 PEG400、 PEG600、 PEG 1000, PEG 1500、 PE G 1540および P EG 2000が例示される。

以上のような（1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、 (2) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを含有する本発明の核酸導入用試薬の好ましい組み合わせとしては、（ 1 ) ショ糖、マン-トール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、 (2) PEG 200, PEG 300, PEG400、 PEG 600, PEG 10 00、 PEG1500、 PEG1540、 P E G 2000およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを成分として含有する核酸導入用試薬が例示される。より好ましくは、（1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質と、（2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する 1種の物質とを含有する核酸導入用試薬が挙げられ、具体的には（1) ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（2) PEG200、 PEG 300_N PEG400、 P EG 60 0、 PEG 1000 PEG 1500、 P EG 1540, PEG2000またはグリセリンとを成分として含有する核酸導入用試薬が例示される。

このようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種以上の物質を含有する本発明の核酸導入用試薬は、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液（すなわち核酸導入時に用いられる本発明の高張液）と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及び Z または多価アルコールの総モル濃度が 0. 29 M〜 3 Mの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の各成分の濃度は、どのようなモル濃度であっても良い。好ましくは、高張液中のオリゴ糖及び/または多価アルコールの総モル濃度 0.35M〜2. 5Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0. 35M〜2. 1 M、さらに好ましくは 0. 5M〜2. 1Mの範囲が挙げられる。

本発明の核酸導入試薬がオリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種の物質を含有する場合、前記のように高張液中でのこれら 2種の成分の総モル濃度が前記の範囲内であれば、各々の成分のモル濃度は如何なる値であっても良いが、例えば、高張液中における（1 ) オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質のモル濃度が 0 . 5 M〜 2 Mの範囲であり、かつ（ 2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する 1種の物質のモル濃度が 0 . 1 Mである場合などを例示することができる。本発明の核酸導入用試薬が、オリゴ糖又は多価アルコールに属する物質を 1種類のみ含有する場合は、オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質を含有することが好ましい。

ここで用いられるオリゴ糖は、具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシァノース、サンプビオース、メリビオース、ェピセロビオース、ッラノース、ノレチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。

単糖アルコーノレ類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。

前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコーノレ類が挙げられる。

以上のような、オリゴ糖又は糖アルコールに属する物質を 1種類のみ含有する本発明の核酸導入用試薬としては、ショ糖、マン-トール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有することが好ましい。

このようにオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を 1種のみ含有する本発明の核酸導入用試薬は、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液（すなわち核酸導入時に用いられる本発明の高張液）と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度が 0 . 2 9 M〜 3 Mの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の当該物質（成分）の濃度は、どのようなモル濃度であつても良い。好ましくは、高張液中のオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度 0 . 3 5 M〜2 . 5 Mの範囲が挙げられ、より好ましくは 0 . 3 5 M〜2 . 1 M：、さらに好ましくは 0 . 5 M〜2 . 1 Mの範囲が挙げられる。

本発明の核酸導入用試薬中の各成分は、固体の形状であっても、また液体の形状であっても良い。ここで固体の形状とは、ロウ状（ワックス等）の形態、ワセリン状の形態、フレーク状の形態、結晶化された形態、粉状の形態などを指す。また液体の形状とは、高粘性の形態、低粘性の形態、非粘性の形態などを指す。

オリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種以上の成分（物質）を含有する場合は、各々の成分は、独立した固体または液体の形状であっても、また混合した固体または液体の形状であっても良い。

ここで独立した固体とは、各成分が別個に固体化していることを指す。各々の成分は 1つの容器中に封入されていても良く、また別々の容器中に封入されていても良い。また前記で独立した液体とは、各々の成分が液体の状態で別々の容器中に封入されていることを指す。

前記で混合した固体とは、各成分が固体の形状で混合されている形態、または各成分が混合した状態で固形化され、 1つの容器中に封入された形態を指す。また前記で混合した液体とは、各成分が液体の状態で混合され 1つの容器中に封入されている形態、または 1つの成分が液体の状態で他方の成分が固体の状態で混合され 1 つの容器中に封入されている形態を指す。

具体的には、例えば（1 ) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質が結晶化されており、かつ（2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質がロウ（ワックス）状の形態にある場合が例示される。この場合、両者は 1つの容器中に封入することが可能である。より具体的には、（1 ) 結晶化されたショ糖、および（2 ) ロウ（ワックス）状のポリエチレングリコールが 1つの容器中に封入された形態が例示される。

各々の成分が固体の形状にある場合、それぞれの成分にあった方法（加熱、希釈等）により溶解すれば良い。最終的に、培養液、緩衝液及び Zまたは血清等を添加することにより、前記に示したモル濃度を示す本発明の高張液となるように調製すれば良い。

以上のような本発明の核酸導入用試薬は、核酸導入用のキットの一成分とすることができる。当該キットは、前記本発明の核酸導入試薬のみからなるキットであつても、また本発明の核酸導入試薬と他の成分とを含むキットであっても良い。当該キット中の他の成分としては、蛍光標識オリゴヌクレオチド、ポジティブコント口ール siRNAなどが挙げられる。

本発明の核酸導入用試薬およびキットは、核酸の導入を可能とするための核酸導入剤として使用することができる。

本発明は、前記本発明の核酸導入法により核酸が導入された細胞を提供する。前述のように、本発明の核酸導入法により、高い効率で細胞に核酸導入することが可能となった。また、従来核酸の導入が困難であった種々の細胞にも核酸を導入できるようになった。本発明は、このような本発明の核酸導入法により核酸が導入された細胞を提供するものである。

本発明の細胞は、本発明の核酸導入法により核酸導入された如何なる細胞であつても良いが、例えばマクロファージ様細胞株 RAW264. 7細胞、ハイブリドーマ D011. 1 0細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞が挙げられる。

好ましくは、従来核酸導入が困難であった細胞、すなわちマクロファージ様細胞株 RAW264. 7細胞、ハイプリドーマ D011. 10細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞が挙げられる。

これらの細胞は、前記本発明の核酸導入法により作製することができる。

本発明は、前記本発明の細胞から調製された細胞由来の R N Aまたはタンパク質を提供する。これら細胞由来の RNAやタンパク質を調製する方法は既に公知であり、 7こと xJiMo丄 ecular Cloning 3^{r d} Edition (Cold Spring Harbor Press)、 Curren t Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc) などを参考にして容易に行うことができる。

本発明は、前記本発明の細胞、若しくは前記本発明の R NAまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法も提供する。

本発明の核酸導入法は、前記のようにどのような核酸導入をも可能とするものであるが、標的遺伝子の発現■機能を抑制する、すなわちノックダウン細胞を作製する際に、特に好ましく用いることができる。

たとえばノックダウン細胞を用いた機能解析としてはアンチセンス核酸、短い干渉 RNAまたはおとり型核酸を導入し、標的遺伝子またはその遺伝子がコードする蛋白質の生成または機能を抑制し、当該遺伝子の細胞での働きを調べることなどが挙げられる。

本発明の機能解析方法は、従来核酸導入が困難であった細胞、すなわちマクロファージ様細胞株 RAW264. 7細胞、ハイブリドーマ D011. 10細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞や、当該細胞由来の RNA、タンパク質を用いて行うことが好ましい。実施例

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。し力し、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。

実施例 1

本発明核酸導入法および従来法を用いたマウスマク口ファージ細胞株 RAW264. 7細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

マウスマクロファージ細胞株 RAW264. 7細胞を用いて、浸透圧ショックによる本発明の核酸導入法（以下 Osmotic transfection法とも称する）と従来法との比較を行 1-1) 本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株 RAW264. 7細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) を 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invi trogen) に懸濁し、 24ゥエルプレート (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の糸且成： 10 /i M FITC標識オリゴヌクレオチド（20 - mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG _3，；配列番号： 1 ) 、 1Mショ糖、 10% (w/v) ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI1640培地： DEPC処理水（6 : 4) 混合液になるように調製した。

4.生育培地

RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v

) 、 ⁶0mg/L加えて調製した。

5. 24well plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100， 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ ΐ添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、 5分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニタス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。 1-2) Oligofectamineによるマウスマクロファージ細胞株 R 264. 7細胞へのオリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

MW264. 7細胞（ATCC No. TIB-71) を 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invi trogen) に懸濁し、 24ゥェルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチドの導入

オリゴヌクレオチド / Ol igofectamine混合液の調製は Invitrogen社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、 Oligofectamine 9 μ 1を 150 /i 1の 0ΡΤΙ- ΜΕΜΙ (Invitrogen) に懸濁し、室温で 5分間静置後、等量のオリゴヌクレオチド希釈液

(20 μ M FITC標識ォリゴヌクレオチド 9 μ 1と 150 μ 1の 0PTI-MEMIの混合液）と混和し、 20分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド / Ol igofectaraine混合液として用いた。その後、上記 24wellプレートで調製した細胞を 0PTI- MEMIにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド/ Oligofectaraine 2000混合液 318 μ 1を静かに加え、 6時間 37°C、 5%C02下で静置後、上清を除去し、増殖培地 10% (v/v)ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitrogen) を 3ml添加し、 37°C、 5°/。C02下で導入後 24時間培養を行った。

3.導入効率の観察

導入効率の観察は上記実施例 1— 1)と同様に CCDカメラを用いて実施した。

1-3) ポリエチレンィミンによるマウスマクロファージ細胞株 MW264. 7細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB-71) を 10% (v/v)ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ウエノレプレー 1、 (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチドの導入

ポリエチレンィミンとしては jetPEI (PolyPlus社）を用いた。オリゴヌクレオチド /ポリエチレンィミン混合液の調製は PolyPlus社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、 7. 5mM jetPEI 8 μ 1を 192 / 1の 150raM NaCl水溶液（ナカラィテスク）に懸濁し、等暈のォリゴヌクレオチド希釈液（20 μ M FITC標識ォリゴヌクレォチド 40 1と 160 μ 1の 150mM NaCl水溶液）と混和し、 15分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド /ポリエチレンィミン混合液として用いた。その後、上記 24wel 1プレートで調製した細胞にオリゴヌクレオチド /ポリエチレンィミン混合液 400 μ 1を静かに加え、 24時間、 37°C、 5°/。C02下で導入後 24時間培養を行った。

3.導入効率の観察

導入効率の観察は上記実施例 1-1)と同様に CCDカメラを用いて実施した。

1-4) 本発明核酸導入法、 Oligofectamine法およびポリエチレンィミン法によるォリゴヌクレオチド導入結果の比較

前記本発明核酸導入法、 Oligofectamine法およびポリエチレンイミン法による FI

TC標識ォリゴヌクレオチド導入 24時間後の細胞の形態、細胞へのダメージおよび導入効率を比較した。結果を図 1に示す。

その結果、本宪明核酸導入法では細胞の形態変化、ダメージはみとめられず、また視野中の 80%以上の細胞にオリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。一方、 Oli gofectamine法、およびポリエチレンイミン法では視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられたが、導入操作時の細胞の剥離による細胞数の減少が認められると同時に明視野中の全ての細胞に形態変化がみとめられ、ほとんどの細胞がバーストし、細胞死がみとめられた。これらの結果から、本発明核酸導入法は、 Oligofectamine法、およびポリエチレンィミン法とは異なり、細胞に形態変化ゃダメージを与えることなく、オリゴヌクレオチドを導入できることが分かった。

実施例 2

本発明核酸導入法による RAW264. 7細胞への TLR4 siR Aの導入と定量的 PCRによる siR NA効果の測定

1. 本発明核酸導入法による RAW264. 7細胞への TLR4 siRNAの導入

TLR4 siRNA (sense配列 5，-AUCCACMGUCMUCUCUCUU- 3，；配列番号： 2、 antisense 配列 5，-GAGAGAUUGACUUGUGGAUUU- 3'；配列番号： 3の二本鎖 RNA) ) は Proligo社にて合成した。 Negative Control #1 siRNAは Ambion社から購入した。本発明核酸導入法による RAW264. 7細胞への TLR4 siRNAおよび Negative Control #1 siRNAの導入は上記実施例 1 -1)と同様に 10 /z Mの TLR4 siRNAあるいは Negative Control #1 siRNA を含有する高張液を調製し、実施例 1 - 1)と同手法にて実施した。

2.導入細胞からのトータル RNAの回収及び定量的 PCR

導入 24時間後に Qiagen社 R easy kitを用いて細胞からトータル RNAを回収し、 TLR 4 mR Aに特異的なプライマー（Forward Primer： 5'- GGATGATGCCTCCCTGGC- 3，（酉己列番号： 11) 、 Reverse Primer： 5，_ GGGATTCAAGCTTCCTGGTG-3' (配列番号： 12) ) およびノーマライゼーシヨンコントロールである GAPDH mRNAに特異的なプライマー（ Forward Primer： 5，- AACTCGGCCCCCAACACT -3，（配列番号： 13) 、 Reverse Primer ： 5' - TAGGCCCCTCCTGTTATTATGG -3' (配列番号： 14) ) を用いて、以下のように定量的 PCRを実施した。

まず total RNA 1 μ g 铸型に TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems)を用い、キットのプロトコールにしたがって cDNA合成を行った。得られたトータル RNA50ng由来の cDNAを铸型に検出用特異的 Primer Setおよび SYBR Gree n PCR Master Mix and RT - PCR Kit (Applied Biosystems)をキットのプロトコ一ノレにしたがって混合し、 Applied Biosystems社リアルタイム PCRシステム ABI7700にて測定した。 Negative Control #1 siRNA導入群と TLR4 siRNA導入群における GAPDHの発現量を等しいものとみなし、 TLR4 mRNAの低減の割合を計算した。結果を図 2に示す。

その結果、 TLR4 siRNA導入群では Negative Control #1 siRNA導入群と比較して T LR4 mRNA力 3%消失していることが分かった。

以上の結果から、本発明核酸導入法によって蛍光標識オリゴヌクレオチドだけでなく siRNAも導入することができること、導入した siRNAは高い効率で細胞の mRNAを消失させることが分かった。

実施例 3

本発明核酸導入法による RAW264. 7細胞への TLR4 siRNAの導入とノックダウン細胞を用いたバイオアツセィ

TLR4は LPS (Calbiochem)、 GLA-60 (WAK0 CHEMICAL) の受容体であり、 MW264. 7細胞をこれらの化合物で刺激すると T F αの産生が誘導されることが知られている。そこで、実施例 2に記載のように RAW264. 7細胞に TLR4 siRNAを導入し、 24時間後に細胞をスクレーパーで剥がし、増殖培地に懸濁し、 10000細胞を 96wel lプレートの各 wellに播き、 37°C、 5°/。C02にて培養を行った。 siRNAの導入 48時間後に培養上清を除去し、無刺激、 10 / g/ral GLA- 60、 lOng/ml LPSにて 8時間刺激を行い、培養上清を回収した。対照として、 TLR4 siRNAの代わりに Negative Control #1 siRNA (Seq uitur社）を同条件にて導入し、 48時間後に培養上清を除去し、無刺激、 lO g/ml GLA-60、 10ng/ml LPSにて 8時間刺激を行い、培養上清を回収した。

TLR4 siRNA導入細胞および対照細胞の培養上清に含まれる TNF aを Mouse TNF- a AN' ALYZA ELISAキット（コスモバイオ）にて定量した。結果を図 3に示す。その結果、 TLR4 siRNA導入細胞では対照細胞と比較して LPS刺激による T Fひの産生が 45% 、 GLA-60刺激による TNF αの産生が 66%低減することが分かった。

これらの結果から、本亮明核酸導入法によって Negative Control siRNAを導入した細胞では通常の細胞と同様に LPS、あるいは GLA- 60の刺激に応じた T F aの産生誘導がみとめられるが、 TLR4 siRNA導入細胞ではこれらの刺激に応じた TNF aの産生誘導が有意に抑制されることが分かり、本発明核酸導入法による siRNAの導入によつて細胞機能が抑制されたことが示され、具体的には受容体-リガンド対の同定などの遺伝子機能の解析に有効であることが示された。

実施例 4

本発明核酸導入法によるラット初代培養肝細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養肝細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥエルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、 37°C、 5%C02の条件で一晩培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： 10 / M FITC標識オリゴヌクレオチド（20_mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1Mショ糖、 10% (w/v) ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI 1640培地： DEPC処理水（6 : 4) 混合液になるように調製した。 4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導人

肝細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 1添加した。室温で 3分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 5分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニタス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。

実施例 5

本発明核酸導入法によるラット初代培養筋芽細胞へのオリゴヌクレオチドの導入 1.細胞の調製

ラット初代培養筋芽細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥ 'ルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： 10 /i M FITC標識ォリゴヌクレオチド（20- mer； 5， - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1Mショ糖、 10% (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製低張液は、 RPMI 1640培地： DEPC処理水（6 : 4) 混合液になるように調製した。

4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導入

筋芽細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 / l添加した。室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 5分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置 (Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニタス）搭載微分干渉顕微鏡ァキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕 ί敷鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

実施例 6

本発明核酸導入法によるラット初代培養筋細胞へのオリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養筋芽細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥェルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、 37°C、 5%C02の条件で一晚培養した。その後、培養上清を除き、添付の筋分化培地に交換し、 5日間培養を行い、分化筋細胞を得た。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： ΙΟ μ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20- mer； 5， - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1Mショ糖、 10% (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5⁰/₀ (v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI1640培地： DEPC処理水（6 : 4) 混合液になるように調製した。 4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導人

分化筋細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ 1添加した。室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3ml を添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 5分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた

。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。

実施例 7

本発明核酸導入法によるラット初代培養脂肪钾胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥエルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の分化培地に交換し培養を行い、分化白色脂肪細胞を得た。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の糸且成： ΙΟ μ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20 - mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖、 10% (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 lOraM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI1640培地： DEPC処理水（6 :4) 混合液になるように調製した。

4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導入

分化脂肪細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ 1添カロした。室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3m 1を添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3tnlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添カ卩した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

視野中のほとんどすベての細胞に蛍光ォリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。

実施例 8

本発明核酸導入法によるラット初代培養神経細胞へのォリゴヌクレオチドの導入 1.細胞の調製

ラット初代培養神経細胞は住友べ一クライト株式会社より購入した。具体的には、添付の 24ゥュルプレート（住友ベークライト）に 100000細胞/ゥュルの密度で細胞を播き、添付の培地に交換し培養を行い、神経細胞を得た。 2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： ΙΟ μ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20- mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG _3，；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖、 10°/。 (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導入

神経細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ 1添加した。室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3tnlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3ralを添加した。

6.導入効率の観察

7.結果

実施例 9

本発明核酸導入法および従来法を用いたラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入

ラット初代培養前駆脂肪細胞を用い、本発明核酸導入法と従来法との比較を行つた。 9-1) 本発明核酸導入法によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ウエノレプレート (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： ΙΟ μ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20_mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖、 10% O/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI1640培地： DEPC処理水（6: 4) 混合液になるように調製した。

4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導入

前駆白色脂肪細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ 1添加した。室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3tnlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニタス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入²⁴時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

9-2) Oligof examineによるラット初代培養前駆脂肪細胞へのォリゴヌクレオチドの導入 1.細胞の調製

ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥェルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。

2.オリゴヌクレオチドの導入

オリゴヌクレオチド / Oligofectaraine混合液の調製は Invitrogen社の推奨マユュアルに従って実施した。具体的には、 Oligofectatnine 9 μ 1を 150 μ 1の 0ΡΤΙ- ΜΕΜΙ (Invitrogen) に懸濁し、室温で 5分間静置後、等量のオリゴヌクレオチド希釈液 (20 μ M FITC標識ォリゴヌクレオチド 9 1と 150 μ 1の 0ΡΤΙ - ΜΕΜΙの混合液）と混和し、 20分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド / Qligofectamine混合液として用いた。その後、上記 24wellプレートで調製した細胞を 0PTI- MEMIにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド/ Oligofectamine 2000混合液 318 μ 1を静かに加え、 6時間 37°C、 5%C02下で静置後、上清を除去し、生育培地を 3ml添加し、 37 。C、 5%C02下で導入後 24時間培養を行つた。

3.導入効率の観察

導入効率の観察は上記実施例 9-1)と同様に CCD力メラを用いて実施した。

9-3) Lipofectamine2000によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのォリゴヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥエルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。

2.オリゴヌクレオチドの導入

オリゴヌクレオチド /Lipofectatnine2000混合液の調製は Invitrogen社の推奨マ二ュアルに従って実施した。具体的には、 Lipofectamine2000 3 μ 1を 150 / 1の 0ΡΤΙ - MEMI (Invitrogen) に懸濁し、室温で 5分間静置後、等量のォリゴヌクレオチド希釈液（²0 μ M FITC標識ォリゴヌクレオチド 3 μ 1と 150 μ 1の OPT I - MEMIの混合液）と混和し、 20分間室温に置いたものをォリゴヌクレオチド /Lipofectamine2000混合液として用いた。その後、上記 24wellプレートで調製した細胞を 0PTI- MEMIにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド/ Lipof ectaraine2000混合液 306 // 1を静かに加え、 6時間 37°C、 5%C02下で静置後、上清を除去し、生育培地を 3ml添加し、 3 7°C、 5%C02下で導入後 24時間培養を行つた。

3.導入効率の観察

9-4) 本発明核酸導入法、 Oligofectamine法および Lipofectamine2000法によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチド導入結果の比較

前記本発明核酸導入法、 Oligofectamine法および Lipofectamine法による FITC標識オリゴヌクレオチド導入 24時間後の細胞の形態、細胞へのダメージおよび導入効率を比較した。

その結果、本発明核酸導入法では細胞の形態変化、ダメージはみとめられず、視野中の 80%程度の細胞にオリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。一方、 Oligofe ctamine法および Lipofectamine法では視野中のほとんどの細胞に FITCォリゴヌタレォチドの導入がみとめられなかった。これらの結果から、本発明核酸導入法は、 01 igofectamine法および Lipofectamine法とは異なり、細胞に形態変化ゃダメージを与えることなく、ラット初代培養前駆脂肪細胞へもオリゴヌクレオチドを導入できることが分かった。

実施例 1 0

高張液のショ糖濃度が導入効率に及ぼす効果に関する検討

高張液中のショ糖以外の組成は実施例 1-1)と同様に保ったまま、ショ糖の濃度を

0. 5M、 0. 75M、 1Mと変化させた時の導入効率の変化について調べた。

1.細胞の調製

MW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) を 10% (v/v)ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ゥェルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件で一 B免培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： 10 /x M FITC標識オリゴヌクレオチド（20- mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG _3，；配列番号： 1 ) 、 0. 5M、 0. 75 Mまたは 1Mショ糖、 10% (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen ) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

4.生育培地

) 、 60mg/L加えて調製した。

5. 24well plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100, 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 添加した。次に、室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

0. 75Mおよび 1Mショ糖含有高張液を用いた場合は視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。 0. 5Mショ糖含有高張液を用いた場合は、 0. 75Mおよび 1Mショ糖含有高張液を用いた場合に比してやや少なかったものの、細胞への蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。またいずれのショ糖濃度含有高張液を用いた場合においても明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。以上の結果から、高張液中のショ糖濃度としては 0. 5M〜1Mがより好ましいことが分かった。

実施例 1 1

高張液の糖の種類が導入効率に及ぼす効果に関する検討高張液中の溶質のモル濃度は実施例 1 -1)と同様に保ったまま、糖の種類をショ糖、マン-トール、ソルビトール、あるいはキシリトールと変化させた時の導入効率の変化について調べた。

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) を 10% (v/v)ゥシ胎仔血清含有 RPMI1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ウエノレプレート (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥヱルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件で一 B免培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： ΙΟ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20-tner； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1 Mの各種糖（ショ糖、マンニトール、ソルビトールあるいはキシリトール）、 10% (w/v)ポリエチレングリコール 1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

4.生育培地

RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10°/。 (v/v ) 、 60mg/L加えて調製した。

5. 24well plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100, 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 I添加した。次に、室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

7.結果

ショ糖、マンニトール、ソルビトールあるいはキシリトールのいずれの糖でも、導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、いずれの糖も用いることができることが分かった。

実施例 1 2

高張液の PEGの種類が導入効率に及ぼす効果に関する検討

高張液中の溶質のモル濃度は実施例 1-1)と同様に保ったまま、 PEGの種類を PEG20 0、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 PEG1000、 PEG1500、 PEG1540または PEG2000と変化させた時の導入効率の変化について調べた。

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB-71) を 10°/。（ν/ν)ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ゥエルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥェルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： ΙΟ μ Μ FITC標識オリゴヌクレオチド（20-mer； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3，；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖、 10% (w/v) (=100mM)ポリエチレングリコール 1000あるいは等モル濃度の PEG (PEG20 0、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 PEG1000、 PEG1500、 PEG1540または PEG2000) 、 RPMI l 640 (Invitrogen) 、 5°/₀ (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

RPMI 1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v ) 、 ⁶0mg/L加えて調製した。

5. 24 el l plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100， 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 添加した。次に、室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、增殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

7·和^ i¾

PEGのポリマー化の程度（平均分子量）を問わず、導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、いずれのポリマー化の程度 ( 平均分子量）の PEGも用いることができることが分かった。

実施例 1 3

高張液の PEGをグリセリンと置換した場合に導入効率に及ぼす効果に関する検討高張液中の溶質のモル濃度は実施例 1-1)と同様に保ったまま、 10% (w/v) (=100raM ) PEG1000を等モル濃度のグリセリンに置換した場合の導入効率の変化について調ベた。 '

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) を 10°/。（v/v)ゥシ胎仔血清含有 RPMI1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ゥエルプレート (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播き、 37°C、 5%C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成： 10 z M FITC標識オリゴヌクレオチド（20- mer； 5， - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3，；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖、 10 (w/v) (= 1 0 O mM) ポリエチレングリコール 1000あるいは 1 0 0 mMグリセリン、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4 ) になるように調製した。

3.低張液の調製

4.生育培地 '

RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10°/。 (v/v

) 、 60mg/L加えて調製した。

5. 24well plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100, 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 μ ΐ添加した。次に、室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3tnlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置（Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニタス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕 ί敷鏡システムによつて 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果

PEGだけでなくグリセリンを用いた場合も導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、 PEGだけでなくグリセリンも用いることができることが分かった。

実施例 1 4 '

実施例 1 - 1 ) の高張液の PEGとショ糖を等モル濃度のショ糖または糖アルコールと置換した場合に導入効率に及ぼす効果に関する検討

高張液中の溶質のモル濃度は実施例 1-1)と同様に保ったまま、 10% (w/v) (=100mM ) PEG1000と 1 Mショ糖を等モル濃度のショ糖、ソルビトール、マンニトールまたはキシリトールに置換した場合の導入効率の変化について調べた。 1.細胞の調製

R 264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) を 10%(ν/ν)ゥシ胎仔血清含有 RPMI1640 (Invitr ogen) に懸濁し、 24ゥエルプレート（Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥェルの密度で細胞を播き、 37°C、 5°/。C02の条件でー晚培養した。

2.オリゴヌクレオチド含有高張液の調製

オリゴヌクレオチド含有髙張液は以下の組成： 10 /i M FITC標識オリゴヌクレオチド（20-mer ； 5' - GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG -3' ；配列番号： 1 ) 、 1 Mショ糖と 10°/₀.(w/v) (= 1 0 O mM) PEG1000、または 1. 1Mの各種糖（ショ糖、ソノレビトーノレ、マン-トールまたはキシリトール）、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/。（v/v)ゥシ胎児血清、 lOraM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.低張液の調製

4.生育培地

5. 24well plateでの導入

RAW264. 7細胞を各 wellに 100， 000細胞ずっ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を 400 x l添加した。次に、室温で 10分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液 3mlを添加し、室温で 2分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3mlを添加した。

6.導入効率の観察

導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシォバード 135用蛍光検鏡装置 (Carl Zeiss)による励起光を FITCバンドパスフィルターを通し、 20x対物レンズ、超高感度 C C Dカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシォバード 13 5 (Carl Zeiss) を用いて実施した。導入 24時間後に FITCの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって 2秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、、フィルターなしの条件下で 0. 03秒間露光して撮影した。

7.結果同じモル濃度（1. 1M) であれば、 PEG.とショ糖の混合物だけでなく各種糖単体（ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）を用いた場合もオリゴヌクレオチドの導入が可能であることが分かった。これらの結果から、高張液の溶質として、 PEGとショ糖の混合物だけでなく各成分単体も用いることができることが分かった。

実施例 1 5

本発明核酸導入法を用いたマウスマクロファージ様細胞株 RAW264. 7細胞へのオリゴヌクレオチドの導入

本発明核酸導入法による導入効率、細胞毒性を調べるため、マウスマクロファージ様細胞株 RAW264. 7細胞を用いて、 FITC標識核酸の導入効果、導入による細胞毒性の有無を Flow Cytometryにより調べた。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株 MW264. 7細胞への FITC 標識ヌクレオチドの導入

1.細胞の調製

R ¾⁶4. ⁷細胞は 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitrogen) 、 T- 75フラスコ（IMKI) にて 37°C、 5%C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 1. 4Mショ糖、 100mM (10%) PEG1000、 RPMI 1640 (Invitrog en) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。 3. FITC標識ォリゴヌクレオチド溶液の調製

実施例 1と同様にして調製した。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。

5.生育培地

RPMI 1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v

) 、 60mg/L加えて調製した。

6.懸濁状態での導入

RAW264. 7細胞を各 2. 0mlチューブに 500, 000細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM FITC標識オリゴヌクレオチド溶液を 10 μ 1、高張液を 190 /z l添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. 1mlを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地² mlに再懸濁し、 6 well plate (IWAKI)に播いた。

1-2) FITC標識ォリゴヌクレオチド導入効果の測定

Flow cytometer EPICS- XL Πシステムを用いて、フルォレセイン蛍光量を指標にオリゴヌクレオチド導入効果を調べた。

導入 24時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2, 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 1mlの生育培地に再懸濁した。得られた細胞のフルォレセイン蛍光強度を EPICS XLIIシステム（ベックマン ' コールター）を用いて測定した。 FITC標識ォリゴヌクレオチドの代わりに等量の DEPC-処理水を用いたコント口ール細胞と本発明導入法により FITC標識ォリゴヌクレオチドを導入した細胞の結果を図 4 (上図）に示す。

その結果、本発明導入法を用いることにより、マウスマクロファージ様細胞株 M W264. 7細胞にオリゴヌクレオチドを効率よく導入できることが分かった。

1 - 3) .細胞毒性の測定

Flow cytometer EPICS- XLIIシステムを用いて、死細胞を染色する試薬 7-ァクチノマイシン D (7AAD) 蛍光量を指標に導入処理時の細胞毒性を調べた。

導入処理 24時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 1mlの生育培地に再懸濁した。 10 /i lの 7MD溶液（ベックマン . コールター）を添加し、 10分間室温にて保温後、得られた細胞の 7MD蛍光強度を EPICS XL Πシステム（ベックマン 'コールター）を用いて測定した。高張液、低張液の代わりに成育培地を用いて同様の処理を行ったコントロール細胞と本発明導入法により導入処理を行った細胞の結果を図 4 (下図）に示す。

その結果、本発明導入処理は細胞毒性を示さないことが分かった。

以上の結果から、本発明導入法は効率良く核酸を導入できるとともに、細胞毒性が認められないことが確認された。

実施例 1 6

本発明核酸導入法を用いたマウスマク口ファージ細胞株 RAW264. 7細胞への siRNAの導入

マウスマクロファージ細胞株 RAW²⁶⁴. 7細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞への siRNA導入に及ぼす効果を検討した。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株 RAW264. 7細胞への siRNA の導入

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) は 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invi trogen) 、 T- 75フラスコ（ΙΜΚΙ) にて 37°C、 5%C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 1. 4Mオリゴ糖または多価アルコール、 RPMI1640 (Invitro gen) 、 5°/。 (v/v)ゥシ胎児血清、 lOraM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。オリゴ糖としてショ糖（二糖類、シグマ）、多価アルコールとしてソルビトール

(単糖アルコール類、シグマ）、マンニトール（単糖アルコール類、シグマ）、キシリトール（単糖アルコーノレ類、シグマ'）、マルチトール（二糖アルコーノレ類、シダマ）、グリセリン (トリオール、ナカライテスク）を用いた。

3. siRNA溶液の調製

siRNAはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これを DEPC -処理水 (ナカライテスク) にて ImMの濃度となるように溶解した。用いた siRNAは以下の配列： ImM Negative Control siRNA (センス鎖 21_mer； 5， - CAAGCUGACCCUGAAGUUCAU -3' ；配列番号： 4、アンチセンス鎖 21- mer； 5，- GAACUU

CAGGGUCAGCUUGUU -3' ；配列番号： 5、プロリゴジャパン）、 IraM GAPDH siRNA (センス鎖 21- mer； 5' - CCACGAGAAAUAUGACAACUC _3' ；配列番号： 6、アンチセンス鎖 2 1 - mer； 5' - GUUGUCAUAUUUCUCGUGGUU -3' ；配列番号： 7 ) 。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。

5.生育培地

RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v ) 、 60mg/L加えて調製した。

6.懸濁状態での導入 ¾¾64. 7細胞を各2. (½1チュープに100, 000細胞ずっ回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2, 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM siRNA溶液を 10 μ 1、各高張液を 190 μ 1添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. 1mlを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2 , 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地 2mlに再懸濁し、 6 well plate (IWAKI)に播いた。

1-2) siRNA導入に及ぼす効果の測定

GAPDH siRNAによる内在性 GAPDH mRNAのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖ゃ多価アルコールの種類が細胞への siRNA導入に及ぼす効果を調べた。

導入 24時間後に Qiagen社 R easy kitを用いて細胞からトータル腿を回収し、 GAP DH mRNAに特異的なプライマー（Forward Primer ： 5'- TCACCACCATGGAGAAGGC - 3，（配列番号： 15) 、 Reverse Primer： 5，- CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG -3' (配列番号： 16) )およびノーマライゼーシヨンコントロールである Cyclophilin raR Aに特異的なプライマー（Forward Primer： 5し GTCAACCCCACCGTGTTCT _3，（配列番号： 17)、 Rever se Primer： 5'- GAGGTACCTGCTGTCTTTGG-3' (配列番号： 18) ) を用いて、実施例 2と同様にして定量的 PCRを実施した。 Negative Control siRNA導入群と GAPDH siRNA導入群における Cyclophilinの発現量を等しいものとみなし、 GAPDH mRNAの低減の割合を計算した。 '結果を図 5に示す。

その結果、 GAPDH siRNA導入群では Negative Control siRNA導入群と比較して GAP

DH mRNAが、ショ糖含有高張液群で 80. 2%、ソルビトール含有高張液群で 68. 5%、マンニトール含有高張液群で 75. 6%、キシリトール含有高張液群で 74. 7%、マ ^；レチトーノレ含有高張液群で 69. 8%、およびグリセリン含有高張液群で 38. 2%消失していることが分かった。

以上の結果から、高張液の溶質としてオリゴ糖、多価アルコールいずれを用いた場合でも、 FITC標識オリゴヌクレオチドと同様に siRNAも効率良く導入できること、および導入された siRNAがノックダウン活性を示すことが分かった。また、オリゴ糖と PEG類の組合せだけでなく、各種ォリゴ糖ゃ多価アルコールをそれぞれ単独に溶質として用いた場合においても siRNAを効率良く導入可能できたことから、導 5 入効果は細胞と高張液の接触に依存することが確認された。

実施例 1 7

本発明核酸導入法を用いたマウスマク口ファージ細胞株 R 264. 7細胞への siRNAの導入

マウスマクロファージ細胞株 R 264. 7細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖と多価アルコールの組合せが細胞への siRNA導入に及ぼす効果を検討した。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスマク口ファージ細胞株 MW264. 7細胞への siRNA の導入

1.細胞の調製

RAW264. 7細胞（ATCC No. TIB- 71) は 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invi trogen) 、 T- 75フラスコ（Ι ΚΙ) にて 37°C、 5%C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 1. 4M オリゴ糖、 lOOmM多価アルコール、 RPMI1640 (Invitr ogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOraM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。オリゴ糖としてショ糖またはソルビトール、多価アルコールとしてポリエチレングリコール 200 (PEG200) 、 PEG300、 PEG400、 PEG6Q0、 PEG1000、 PEG1500、 PEG1540 、 PEG2000を用いた。ショ糖、ソルビトールはシグマ、 PEG類はナカライテスタより購入した。

3. siRNA溶液の調製

siRNAはプロリゴジャパンから二本鎖ァニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これを DEPC-処理水（ナカライテスタ）にて ImMの濃度となるように溶解した。用いた siRNAは以下の配列： ImM Negative Control siRNA (センス鎖 21- mer； 5， - CAAGCUGACCCUGAAGUUCAU -3' ；配列番号： 4、アンチセンス鎖 21- mer； 5， - GAACUU CAGGGUCAGCUUGUU _3，；配列番号： 5、プロリゴジャパン）、 ImM GAPDH siRNA (センス鎖 21- mer； 5' - CCACGAGAAAUAUGACAACUC -3' ；配列番号： 6、アンチセンス鎖 2 1- mer； 5' - GUUGUCAUAUUUCUCGUGGUU -3' ；酉己列番号： 7 ) 。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。 ·

5.生育培地 RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v ) 、 60mg/L加えて調製した。

6.懸濁状態での導入

RA 264. 7細胞を各 2. 0mlチューブに 100， 000細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機 (トミー精ェ） 2, 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM siR A溶液を 10 // 1、各髙張液を 190 添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. 1mlを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2 ，000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地 2mlに再懸濁し、 6 well plate (IWAKI)に播いた。

1-2) siRNA導入に及ぼす効果の測定

GAPDH siRNAによる内在性 GAPDH mR Aのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖と多価アルコールの組合せが細胞への siRNA導入に及ぼす効果を調ベた。

導入 24時間後に Qiagen社 RNeasy kitを用いて細胞からトータル RNAを回収し、 GAP DH mRNAに特異的なプライマー（Forward Primer ： 5，- TCACCACCATGGAGAAGGC - 3，（配列番号： 15) 、 Reverse Primer： 5，- CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG -3' (配列番号： 16) )およびノーマライゼーションコントロールである Cyclophilin mRNAに特異的なプライマー（Forward Primer： 5'- GTCAACCCCACCGTGTTCT _3，（配列番号： 17)、 Rever se Primer： 5，- GAGGTACCTGCTGTCTTTGG-3' (配列番号： 18) ) を用いて、実施例 2と同様にして定量的 PCRを実施した。 Negative Control siRNA導入群と GAPDH siRNA導入群における Cyclophilinの発現量を等しいものとみなし、 GAPDH mRNAの低減の割合を計算した。ショ糖と各種 PEG類の組合せの結果を図 6に、またソルビトールと各種 PEG類の組合せの結果を図 7に示す。

その結果、ショ糖と各種 PEG類の組合せでは GAPDH mRNAが、ショ糖と PEG200含有高張液群で 69. 2°んショ糖と PEG300含有高張液群で 77. 9%、ショ糖と PEG400含有高張液群で 69. 1%, ショ糖と PEG600含有高張液群で 72. 9%、ショ糖と PEG1000含有高張液群で 68. 7%、およびショ糖と PEG1500含有高張液群で 73. 3°/。消失していることが分かつた。また、ソルビトールと各種 PEG類の組合せでは GAPDH mRNAが、ソルビトルと PEG200含有高張液群で 65. 0%、ソルビトールと PEG300含有高張液群で ⁶2. ⁹°んソルビトールと PEG400含有高張液群で 49. 6°/。、ソルビトールと PEG600含有高張液群で 41. 8%、ソルビトールと PEG1000含有高張液群で 70. 5%、ソルビトールと PEG1500含有高張液群で 57. 7%、ソルビトールと PEG1540含有高張液群で 37. 8%、およびソルビトールと PEG2000含有高張液群で 45. 4%消失していることが分かった。

以上の結果から、高張液が含有する溶質としてオリゴ糖と多価アルコールの組合せを用いた場合でも、 FITC標識オリゴヌクレオチドと同様に siRNAも効率良く導入できること、および導入された siRNAがノックダウン活性を示すことが分かった。また、オリゴ糖と PEG類の組合せだけでなく、糖アルコールと PEG類の組合せを溶質として用いた場合においても siRNAを効率良く導入可能でき、導入された siRNAがノックダゥン活性を示したことから、高張液の溶質としてォリゴ糖と多価アルコールの様々な糸且合せを用いる'ことができることが確認された。

実施例 1 8

本発明核酸導入法を用いたマウス T細胞様細胞株 D011. 10細胞へのモルフオリノ -ァンチセンス核酸の導入

本発明核酸導入法に核酸の電荷が必要であるのか否かを調べるため、マウス T細胞様細胞株 D011. 10細胞を用いて、電荷を持たない核酸アナログであるモルフオリノ ·アンチセンス核酸の導入効果を調べた。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスハイプリドーマ D011. 10細胞へのモルフォリノ 'アンチセンス核酸の導入 '

1.細胞の調製

D011. 10細胞は 10°/₀ (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI1640 (Invitrogen) 、 T- 75フラスコ（IMKI) にて 37°C、 5°/。C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 2. 0Mショ糖、 lOOmM PEG1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3.モルフォリノ ■アンチセンス核酸溶液の調製

フルォレセイン標識モルフォリノ ■ アンチセンス核酸はフナコシから凍結乾燥品として購入した。これを DEPC -処理水（ナカライテスタ）にて ImMの濃度となるように溶解した。用いたフルォレセイン標識モルフォリノ 'アンチセンス核酸は以下の配列： ImM モルフオリノ ·アンチセンス（25 - mer； 5，- CCTCTTACCTCAGTTACAATTT ATA -3' ；配列番号： 8 ) 。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。

5.生育培地

6.懸濁状態での導入

D011. 10細胞を各 2. Oralチューブに 500, 000細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM モルフォリノ · アンチセンス核酸溶液を 10 1、高張液を 190 i l添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. lmlを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地 2mlに再懸濁し、 6 well plate (IWAKI)に播いた。

1-2) モルフォリノ 'アンチセンス核酸導入効果の測定

Flow cytometer EPICS-XLIIシステムを用いて、フルォレセイン蛍光量を指標にモルフォリノ ·アンチセンス核酸導入効果を調べた。

導入 24時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2, 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 1mlの生育培地に再懸濁した。得られた細胞のフルォレセイン蛍光強度を EPICS XL Πシステム（ベックマン . コールター）を用いて測定した。モルフォリノ ■アンチセンス核酸の代わりに等量の DEP 処理水を用いたコントロール細胞と本発明導入法によりモルフォリノ ■アンチセンス核酸を導入した細胞の結果を図 8 (上図）に示す。同様の条件でモルフオリノ ■アンチセンス核酸の代わりに、電荷をもつ核酸アナログ FITC標識ホスホロチォエートオリゴデォキシヌクレオチドを導入したときの結果を図 8 (下図）に示す。

その結果、本発明導入法を用いることにより、電荷を持つ核酸だけでなく、電荷を持たない核酸アナログであるモルフォリノ ■アンチセンス核酸も細胞に効率よく導入できることが分かった。

以上の結果から、本宪明導入法の効果は核酸電荷に依存しないことが分かった。実施例 1 9

本発明核酸導入法を用いたマウスハイブリドーマ D011. 10細胞への siRNAの反復導入マウスハイプリドーマ D011. 10細胞を用いて、 GAPDH siRNAの反復導入の効果を調ベた。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスハイプリドーマ D011. 10細胞への siRNAの導入

1.細胞の調製

D011. 10細胞は 10°/₀ (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitrogen) 、 T-75フラスコ（IWAKI) にて 37°C、 5%C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 2. 0Mショ糖、 lOOmM PEG1000、 RPMI 1640 (Invitrogen) 、

5% (v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3. siRNA溶液の調製

siRNAはプロリゴジャパンから二本鎖ァユーリング後の凍結乾燥品として購入した。これを DEPC-処理水（ナカライテスタ）にて ImMの濃度となるように溶解した。用いた siRNAは以下の配列： ImM Negative Control siRNA (センス鎖 21- mer； 5， - CAAGCUGACCCUGMGUUCAU -3，；配列番号： 4、アンチセンス鎖 21_mer； 5，- GAACUU CAGGGUCAGCUUGUU -3' ；配列番号： 5、プロリゴジャパン）、 ImM GAPDH siRNA (センス鎖 21 - mer； 5，- CCACGAGAAAUAUGACAACUC -3，；配列番号： 6、アンチセンス鎖 2 1 - mer； 5' - GUUGUCAUAUUUCUCGUGGUU—3' ；配列番号： 7 ) 。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。

5.生育培地

RPMI 1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v ) 、 60mg/L加えて調製した。

6.懸濁状態での導入 '

D011. 10細胞を各². 0mlチューブに 500, 000細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM モルフォリノ · アンチセンス核酸溶液を 10 // I、高張液を 190 添カ卩した。次に、 37°Cで 15分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. 5ralを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地 2tnlに再懸濁し、 6 well plate (IWAKI)に播いた。反復導入においては導入 24 時間毎に細胞を回収し、同条件にて再導入を実施した。

1-2) siRNA導入に及ぼす効果の測定

単回導入、反復導入したそれぞれの細胞から、導入 24時間、 48時間、および 72時間後に Qiagen社 RNeasy kitを用いて細胞からトータル R Aを回収し、 GAPDH mRNAに特異的なプライマー（Forward Primer ： 5，_ TCACCACCATGGAGAAGGC - 3' (配列番号： 15) 、 Reverse Primer： 5，- CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG -3' (配列番号： 16) )およぴノ一マライゼーシヨンコントロールである Cyclophilin mRNAに特異的なプライマー（ Forward Primer： 5，- GTCAACCCCACCGTGTTCT -3，（酉己列番号： 17)、 Reverse Primer ： 5'- GAGGTACCTGCTGTCTTTGG-3' (酉己列番号： 18) ) を用いて、実施例 2と同様にして定量的 PCRを実施した。 Negative Control siRNA導入群と GAPDH siRNA導入群における Cyclophilinの発現量を等しいものとみなし、 GAPDH mRNAの低減の割合を計算した。結果を図 9に示す。

その結果、 GAPDH siRNA単回導入群では Negative Control siRNA導入群と比較して GAPDH mRNAが 24時間後で 72. 3%、 48時間後で 48. 4°/。、 72時間後で 28. 4%消失していることが分かった。一方、 GAPDH siRNA反復導入群では Negative Control siRNA導入群と比較して GAPDH mRNAが 24時間後で 71. 4%、 48時間後で 70. 4°/。、 72時間後で 68. 0 %消失していることが分かった。

以上の結果から、本発明導入法によって、マウスハイプリドーマ D011. 10細胞においても FITC標識ォリゴヌクレオチドと同様に siRNAも効率良く導入できること、および導入された siRNAがノックダウン活性を示すことが分かった。また、単回導入では時間の経過にしたがいノックダウン効果の減弱がみとめられるが、反復導入を行うことによつて任意の期間 siRNAのノックダウン効果を持続できることが分かつた。

実施例 2 0 本発明核酸導入法によるラット初代培養分化脂肪細胞への siRNAの導入

1.細胞の調製

ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、 24ゥェルプレート (Nalge Nunc) に 100000細胞/ゥエルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の分化培地に交換し培養を行い、分化白色脂肪細胞を得た。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 1. 0Mショ糖、 lOOraM PEG1000、 RPMI1640 (Invitrogen) 、 5°/o (v/v)ゥシ胎児血清、 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。

3. siRNA溶液の調製

siRNAはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これを DEPC-処理水（ナカライテスタ）にて ImMの濃度となるように溶した。用いた siRNAは以下の配列： IraM Negative Control siRNA (センス鎖 21_mer； 5' _ C AAGCUGACCCUGAAGUUCAU -3，；配列番号： 4、アンチセンス鎖 21- mer； 5，- GMC而 CA GGGUCAGCUUGUU -3，；配列番号： 5、プロリゴジャパン）、 ImM GAPDH siRNA (センス鎖 21- mer； 5，- CCACGAGAAAUAUGACAACUC -3' ；配列番号： 6、アチセンス鎖 21 - mer； 5' - GUUGUCAUAUUUCUCGUGGUU -3' ；配列番号： 7 ) 。

3.低張液の調製

低張液は、 RPMI1640培地： DEPC処理水（6: 4) 混合液になるように調製した。 4.生育培地

ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。

5. 24well plateでの導入

分化脂肪細胞の培養上清を除き、 siRNA含有高張液を 200 /i l添加した。室温で 10 分間保温したのち、 siRNA含有高張液を除き、低張液 3mlを添加し、室温で 10分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地 3ralを添加した。

1-2) siRNA導入に及ぼす効果の測定

GAPDH siRNAによる内在性 GAPDH mRNAのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するォリゴ糖ゃ多価アルコールの種類が細胞への siRNA導入に及ぼす効果を調べた単回導入したそれぞれの細胞から、導入 24時間、 48時間、および 72時間後に Qiag en社 RNeasy kitを用いて細胞からトータル RNAを回収し、 GAPDH mRNAに特異的なプライマー（Forward Primer ： 5，- TCACCACCATGGAGAAGGC -3' (配列番号： 15) 、 Reve rse Primer： 5，_ CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG—3，（配列番号： 16) )およびノーマライゼーシヨンコントロールである Cyclophilin mRNAに特異的なプライマー（Forward Pr imer： 5，- GTCAACCCCACCGTGTTCT -3' (配列番号： 17)、 Reverse Primer： 5，_ GAGGT ACCTGCTGTCTTTGG-3' (配列番号： 18) ) を用いて、実施例 2と同様にして定量的 PCR を実施した。 Negative Control siRNA導入群と GAPDH siRNA導入群における Cycloph ilinの発現量を等しいものとみなし、 GAPDH mRNAの低減の割合を計算した。結果を図 10に示す。

その結果、 GAPDH siRNA導入群では Negative Control siRNA導入群と比較して GAP DH tnRNAが 24時間後で 71. 7°/。、 48時間後で 56. 6%、 72時間後で 24. 3%消失していることが分かった。

以上の結果から、本発明導入法によって、初代培養分化脂肪細胞においても FITC 標識オリゴヌクレオチドと同様に siRNAも効率良く導入できること、および導入された si脆がノックダウン活性を示すことが分かった。

実施例 2 1

本発明核酸導入法を用いたマウスマク口ファージ様細胞株 RAW264. 7細胞への siRNA の反復導入

マウスマクロファージ様細胞株 MW264. 7細胞を用いて、 TLR2 siRNAの反復導入の効果を蛋白質レベルで調べた。

1-1) 本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ様細胞株 MW264. 7細胞への siR NAの導入

1.細胞の調製

MW264. 7細胞は 10% (v/v) ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640 (Invitrogen) 、 T-75フラスコ（IWAKI) にて 37°C、 5°/。C02の条件で培養した。

2.高張液の調製

高張液は以下の組成： 1. 4M ショ糖、 lOOraM PEG1000_S RPMI 1640 (Invitrogen) 、 5% (v/v)ゥシ胎児血清、 lOmM HEPES緩衝液 (pH7. 4) になるように調製した。 3. siRNA溶液の調製

siRNAはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これを DEPC-処理水（ナカライテスク）にて ImMの濃度となるように溶解した。用いた siRNAは以下の配列： ImM Negative Control siRNA (センス鎖 21_mer； 5' - CAAGCUGACCCUGAAGUUCAU -3，；配列番号： 4、アンチセンス鎖 21- mer； 5，- GMCUU

CAGGGUCAGCUUGUU -3，；配列番号： 5、プロリゴジャパン）、 ImM TLR2 siRNA (センス鎖 21- mer； 5，- GUCUAAAGUCGAUCCGCGACA 一 3，；配列番号： 9、アンチセンス鎖 2 1— mer； 5，_ UCGCGGAUCGACUUUAGACUU - 3，；配列番号： 10) 。

4.低張液

低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。

5.生育培地

RPMI1640 (Invitrogen) にゥシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ 10% (v/v ) 、 ⁶0mg/L加えて調製した。

6.懸濁状態での導入

RAW264. 7細胞を各 2. 0mlチューブに 500, 000細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2， 000回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、 ImM siRNA溶液を 10 1、高張液を 190 1添加した。次に、 37°Cで 10分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬） 1. 1mlを添加した。 10分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精ェ） 2, 0 00回転/分にて 5分間遠心し、培養上清を除き、生育培地 2mlに再懸濁し、 6 well pi ate (IWAKI)に播いた。初回導入 24時間後に細胞を回収し、同条件にて再導入を実施した。

1-2) 蛋白質レベルの測定

TLR2 siRNAの導入による内在性 TLR2蛋白質のノックダゥン効果を調べた。

Negative Control siRNA, TLR2 siRNAを導入したそれぞれの細胞から、初回導入から 48時間後に l% (w/v) SDS水溶を用いて whole cell lysateを調製した。蛋白質の定量は BCAキット（ピアス）を用いて実施。各サンプノレ 40 μ gを 1/4容量の 5xサンプルバッファーと混合し、 4%/20%グラジェントゲル PAGミニ「第一」 4/20 (第一化学）にて電気泳同を行った。泳同後、 BioRad Western Blotting System (BioRad) を用いて Immobilon PVDF Transfer Menbrane (Millipore)に蛋白質を blottingした後、フィルターを BlockAce (大日本製薬）に浸し、 4°Cにて終夜保温することによりプロッキングを行った。

TLR2の検出においては Anti- TLR2抗体（IMG_526、 IMGENEX) 1/250希釈液（BlockA ceで希釈）にてフィルターを 4°C、 overnight保温後、 TBST (Tris- buffered saline 0. 1% Tween 20) にてフィルターを洗浄した。次に、 goat anti-rabbit IgG-AP co n jugate (BIOSOURCE) 1/1000希釈液にてフィルターを室温で 2時間保温後、 TBST (T ris- buffered saline 0. 1% Tween 20) にてフィルターを洗净し、その後、フィルター "^Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit (BioRad)にて染色しァこ。 GAPDHの検出においては Anti- GAPDH (V- 18、 SantaCruz) 1/100希釈液にてフィルタ一を 4°C、 overnight保温後、 TBST (Tr is-buffered saline 0. 1% Tween 20) にてフィルターを洗浄した。次に、 donky anti-goat IgG-AP conjugate (CHEMICON) 1/10 00希釈液にてフィルターを室温で 2時間保温後、 TBST (Tr is-buffered saline 0. 1% Tween 20) にてフィルターを洗浄し、その後、フィルターを Alkaline Phosphatas e Conjugate Substrate Kit (BioRad)にて染色した。

結果を図 11に示す。

その結果、 TLR2 siR A導入群では Negative Control siRNA導入群と比較して TLR2 蛋白質が減少していることが分かった。

以上の結果から、本発明導入法によって導入された siRNAのノックダウン効果が蛋白質レベルでもみとめられることが分かった。

以上の実施例 1〜 2 1の結果より以下のことが明らかとなった。

1 ) 本発明の核酸導入法は、従来法になく核酸導入効率が高いことが分かった。

2 ) 本宪明の核酸導入法は、従来法と異なり、細胞に形態変化やダメージを与えることなく核酸を導入出来ることが分かった。また導入された核酸は細胞内で有効に機能することが分かった。

3 ) 本発明の核酸導入法は、従来核酸導入が困難であると言われていた細胞（マク口ファージ様細胞株 RAW264. 7細胞、マウスハイブリドーマ D011. 10細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞、初代培養神経細胞等）へも効率的な導入が可能であり、適応細胞種の制限無く使用できることが分かった。 4 ) 本発明の核酸導入法は、核酸の電荷の有無によらず使用できることが分かった

5 ) 本発明の核酸導入法において用いられる高張液の成分としては、オリゴ糖、多価アルコールが挙げられ、具体的にはポリエチレングリコール、グリセリン、ショ糖、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール等）等、種類を問わず使用できることが分かった。

6 ) 本発明の核酸導入法において用いられる高張液中の溶質全体のモル濃度は 0. 5 〜2. 1M程度が好ましいことが分かった。

7 ) 本発明の核酸導入法は、反復導入に使用できることが分かった。産業上の利用可能性

本発明の新規な核酸導入法は、従来になく高い効率で核酸を導入することができる。しかも本発明の核酸導入法は、細胞に形態変化やダメージを与えることなく核酸を導入することができるため、導入された核酸は細胞内で有効に機能することができる。また本発明の導入法は、従来核酸導入が困難であると言われていた細胞へも効率良く核酸を導入することができる。従って本発明の核酸導入法は、従来解析不能であったあらゆる細胞を対象とした遺伝子機能解析（例えば受容体一リガンド対の同定などの遺伝子機能解析）に極めて有効に用いることができる。配列表フリーテキスト

配列番号 1に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである _t

配列番号 2に記載の塩基配列は合成ォリゴヌクレオチドである _t

配列番号 3に記載の塩基配列は合成ォリゴヌクレオチドである _t

配列番号 4に記載の塩基配列は合成ォリゴヌクレオチドである _c

配列番号 5に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである _c

配列番号 6に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである _t

配列番号 7に記載の塩基配列は合成ォリゴヌクレオチドである _c

配列番号 8に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである _c

配列番号 9に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである _c 配列番号 1 0に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである。配列番号 1 1に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 2に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 3に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 4に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 5に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 6に記載の塩基配列は P C Rプライマ、一である。

配列番号 1 7に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

配列番号 1 8に記載の塩基配列は P C Rプライマ一である。

Claims

請求の範囲

1. 以下の工程 (a) 及び（b) を含む核酸導入法：

(a) 核酸、高張液および細胞を接触させる工程、

(b) 前記（a) の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程。

2. 前記工程（b) において、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させる、請求項 1記載の核酸導入法。

3. 核酸がォリゴヌクレチドである、請求項 1または 2記載の核酸導入法。

4. オリゴヌクレオチドが、一本鎖ォリゴヌクレオチド、二本鎖ォリゴヌタレォチドまたはそれらの類縁体である、請求項 3記載の核酸導入法。

5. オリゴヌクレオチドが、デォキシリボヌクレオチド（DNA) 、リボヌクレオチド（RNA) 、ホスホロチォエートオリゴデォキシヌクレオチド、 2' — O 一（2—メトキシ）ェチルー修飾核酸（2，一 MOE—修飾核酸）、短い干渉 RN A ( s i RNA) 、架橋型核酸（LNA) 、ペプチド核酸（PNA) またはモルフォリノ ·アンチセンス核酸である、請求項 3又は 4記載の核酸導入法。

6. 高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種の物質を含有する、請求項 1〜 5いずれか記載の核酸導入法。

7. オリゴ糖が二糖類である、請求項 6記載の核酸導入法。

8. 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 7記載の核酸導入法。

9. 多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、請求項 6言己載の核酸導入法。

10. ジオールがグリコール誘導体である、請求項 9記載の核酸導入法。

1 1. トリオールがグリセリン誘導体である、請求項 9記載の核酸導入法。

12. ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項 9記載の核酸導入法

13. 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 9記載の核酸導入法。

14. オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項 13記載の核酸導入法。

15. グリコール誘導体がエチレングリコールである、請求項 10記載の核酸導入法。

16. グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項 1 1記載の核酸導入法。

17. ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項 12記載の核酸導入法。

18. ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、請求項 1 7記載の核酸導入法。

19. ポリエチレングリコールが P EG 200、 PEG 30 O_x PEG400 、 PEG600、 PEG1000、 PEG1500、 P E G 1540または P E G 2000である、請求項 18記載の核酸導入法。

20. 単糖アルコーノレ類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項 13記載の核酸導入法。

21. 二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項 14記載の核酸導入法。

22. 高張液が、（1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（2) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを含有する、請求項 6記載の核酸導入法。

23. オリゴ糖が二糖類である、請求項 22記載の核酸導入法。

24. 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 23記載の核酸導入法。

25. 糖アルコールが単糖アルコーノレ類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 22記載の核酸導入法。

26. オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項 25記載の核酸導入法。

27. 単糖アルコール類がマンェトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項 25記載の核酸導入法。

28. 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、請求項 26記載の核酸導入法。

29. ジオールがグリコール誘導体である、請求項 22記載の核酸導入法。

30. トリオールがグリセリン誘導体である、請求項 22記載の核酸導入法。

31. ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項 22記載の核酸導入法。

32. グリコール誘導体がェチレングリコールである、請求項 29記載の核酸導入法。

33. グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項 30記載の核酸導入法。

34. ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項 31記載の核酸導入法。

35. ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、請求項 3 4記載の核酸導入法。

36. ポリエチレングリコールが PEG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG600、 PEG 1000、 PEG 1500、 P E G 1540または P E G 2000である、請求項 35記載の核酸導入法。

37. 高張液が、（1) ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、（2) PEG200、 PEG 300_N PE G400、 PEG600、 PEG 1000、 P EG 1500_S P EG 1540, P EG 2000およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを含有する、請求項 22記載の核酸導入法。

38. 高張液が、（1) ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリト一ノレと、（2) PEG200、 PEG 300, PEG400、 P EG 600_S PE G1000、 P EG 1500, P EG 1540, P E G 2000またはグリセリンとを含有する、請求項 37記載の核酸導入法。

39. 高張液がオリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質を含有する、請求項 6記載の核酸導入法。

40. オリゴ糖が二糖類である、請求項 39記載の核酸導入法。

41. 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 40記載の核酸導入法。

42. 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 39記載の核酸導入法。

4 3 . オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項 4 2記載の核酸導入法。

4 4 . 単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトーノレまたはエリスリトールである、請求項 4 2記載の核酸導入法。

4 5 . 二糖アルコ一ノレ類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノ一スである、請求項 4 3記載の核酸導入法。

4 6 . 高張液がショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する、請求項 3 9記載の核酸導入法。

4 7 . 高張液中に存在するオリゴ糖および Zまたは多価アルコ^/レの総モル濃度が 0 . 2 9 M〜 3 Mの範囲内である、請求項 1〜 4 6いずれか記載の核酸導入法

4 8 . 高張液中に存在するオリゴ糖および/または多価アルコ^ "ルの総モル濃度が 0 . 5 M〜 2 . 1 Mの範囲内である、請求項 4 7記載の核酸導入法。

4 9 . 低張液の浸透圧が等張以下である、請求項 2〜 4 8いずれか記載の核酸導入法。

5 0 . オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも 1種の物質を成分として含有する、核酸導入用試薬。

5 1 . 請求項 1〜4 9いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、請求項 5 0記載の核酸導入用試薬。

5 2 . オリゴ糖が二糖類である、請求項 5 0または 5 1記載の核酸導入用試薬

5 3 . 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 5 2記載の核酸導入用試薬。

5 4 . 多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、請求項 5 0または 5 1記載の核酸導入用試薬。

5 5 . ジオールがグリコール誘導体である、請求項 5 4記載の核酸導入用試薬

5 6 . トリオールがグリセリン誘導体である、請求項 5 4記載の核酸導入用試

57. ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項 54記載の核酸導入用試薬。

58. 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 54記載の核酸導入用試薬。

59. オリゴ糖ァルコールがニ糖ァルコール類である、請求項 58記載の核酸導入用試薬。

60. グリコール誘導体がェチレングリコールである、請求項 55記載の核酸導入用試薬。

61. グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項 56記載の核酸導入用試薬。

62. ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項 57記載の核酸導入用試薬。

63. ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、請求項 6 2記載の核酸導入用試薬。

64. ポリエチレングリコールが PEG 200、 PEG300、 PEG400

、 PEG 600 PEG1000、 P EG 1500, P E G 1540または P E G 2000である、請求項 63記載の核酸導入用試薬。

65. 単糖ァ /レコーノレ類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項 58記載の核酸導入用試薬。

66. 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、請求項 59記載の核酸導入用試薬。

67. (1) オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも 1種の物質と、（ 2 ) ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも 1種の物質とを成分として含有する、請求項 50または 51記載の核酸導入用試薬。

68. オリゴ糖が二糖類である、請求項 67記載の核酸導入用試薬。

69. 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 68記載の核酸導入用試薬。

70. 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 67記載の核酸導入用試薬。

71. オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項 70記載の核酸導入用試薬。

72. 単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項 70記載の核酸導入用試薬。

73. 二糖アルコール類がマルチトール、ラタチトールまたは還元パラチノースである、請求項 71記載の核酸導入用試薬。

74. ジオールがグリコール誘導体である、請求項 67記載の核酸導入用試薬

75. トリオールがグリセリン誘導体である、請求項 67記載の核酸導入用試薬。

76. ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項 67記載の核酸導入用試薬。

77. グリコール誘導体がェチレングリコールである、請求項 74記載の核酸導入用試薬。

78. グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項 75記載の核酸導入用試薬。

79. ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項 76記載の核酸導入用試薬。

80. ポリエチレングリコールが分子量 2000以下のものである、請求項 7 9記載の核酸導入用試薬。

81. ポリエチレングリコールが PEG 200、 PEG300、 PEG400 、 PEG600、 PEG1000、 P EG 1 500, P E G 1540または P E G 2000である、請求項 80記載の核酸導入用試薬。

82, (1) ショ糖、マン-トール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも 1種と、（2) PEG200、 PEG 300_S PEG400、 PEG600、 PEG1000、 PEG 1500、 PEG 1540, PEG200 0およびグリセリンから選択される少なくとも 1種とを成分として含有する、請求項 67記載の核酸導入用試薬。

83. (1) ショ糖、マン-トール、ソルビトールまたはキシリトールと、（ 2) PEG200、 PEG300、 PEG400、 PEG600、 P EG 1000

、 PEG 1500, PEG 1540, P E G 2000またはグリセリンとを成分として含有する、請求項 82記載の核酸導入用試薬。

84. オリゴ糖又は糖アルコールに属する 1種の物質を成分として含有する、請求項 50または 51記載の核酸導入用試薬。

85. オリゴ糖が二糖類である、請求項 84記載の核酸導入法。

86. 二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項 85記載の核酸導入用試薬。

87. 糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項 84記載の核酸導入用試薬。

88. オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項 87記載の核酸導入用試薬。

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89. 単糖アルコーノレ類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項 87記載の核酸導入用試薬。

90. 二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項 88記載の核酸導入用試薬。

91. ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを成分として含有する、請求項 84記載の核酸導入用試薬。

92. 成分が固体または液体の形状にある、請求項 50 ~ 91いずれ力、記載の核酸導入用試薬。

93. オリゴ糖又は多価アルコールに属する 2種以上の成分を含有する場合に、各成分が各々独立した固体または液体の形状にある、請求項 92記載の核酸導入用試薬。

94. 高張液中でのォリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0 . 29M〜3Mの範囲内になるようにあらかじめ調製された、請求項 50〜93いずれか記載の核酸導入用試薬。

95. 高張液中でのオリゴ糖および Zまたは多価アルコールの総モル濃度が 0 . 5M〜2. 1Mの範囲内になるようにあらかじめ調製された、請求項 94記載の核酸導入用試薬。

96. 請求項 50〜95いずれか記載の試薬を含有する核酸導入用キット。

97. 請求項 50〜 96いずれか記載の試薬またはキットの、核酸導入における使用。

98. 請求項 50〜96いずれか記載の試薬またはキットを成分とする核酸導入剤。

99. 請求項 1〜 49いずれか記載の導入法により核酸が導入された細胞。

100. 請求項 1〜49いずれか記載の導入法により核酸が導入された、マクロファージ様細胞株 MW264.7細胞、ハイブリドーマ D011.10細胞、初代培養肝細胞

、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞。

101. 請求項 99または 100記載の細胞から調製された細胞由来の RN A またはタンパク質。

102. 請求項 99または 100記載の細胞、若しくは請求項 101記載の R N Aまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法。