JP2000319280A

JP2000319280A - ホタルルシフェリンの安定化方法

Info

Publication number: JP2000319280A
Application number: JP11128433A
Authority: JP
Inventors: Susumu Takayasu; 進高安; Toshihiko Iba; 俊彦井場
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2000-11-21
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: JP4503724B2

Abstract

(57)【要約】【目的】溶液中のホタルルシフェリンの安定性を向上さ
せる。【構成】溶液中のホタルルシフェリンをシクロデキスト
リンに包接させることを特徴とするホタルルシフェリン
の安定化方法。アダマンタン誘導体を添加することによ
る包接したホタルルシフェリンの包接解除方法。ならび
にこの方法を用いた安定なホタルルシフェリン溶液と生
物発光試薬キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はシクロデキストリンに包
接することによるホタルルシフェリンの安定化、および
包接したホタルルシフェリンの包接解除に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェ
ラーゼによる発光反応の基質であり、酸素、ATP、およ
びマグネシウムイオンの存在下に酸化されて発光する。
ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンによる発光
反応は、ATPがごく微量であっても進行することから、A
TPを高感度に検出することができ、特に生物由来のATP
の高感度・簡易検出法に利用されている。

【０００３】細菌検査の分野においては、菌体内のATP
をホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンによる発
光反応で検出することにより、細菌の有無を培養を必要
とせずに迅速かつ高感度に検出可能である。また、食品
加工現場においては、微生物が繁殖するもとになる器具
や設備に付着した食材に由来するATPを検出する清浄度
検査に利用されている。

【０００４】ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリ
ンの発光反応の別の利用法としては、ホタルルシフェラ
ーゼを標識物質とした微量物質の測定が挙げられる。特
に生体内に存在するホルモン等の物質を免疫学的に測定
する生物発光酵素免疫測定法では、高感度であることに
加えて測定範囲も広いことから、従来の酵素免疫測定法
やラジオイムノアッセイに代わるものとして注目されて
いる。

【０００５】しかしながら、ホタルルシフェラーゼとホ
タルルシフェリンはどちらも不安定な物質である。特に
ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼの非共存
下では溶解後２週間（pH8.0、室温）で活性が40%程度ま
で低下することが知られている。生物発光酵素免疫測定
法では、標識物質であるホタルルシフェラーゼを検出す
るという反応系の性質から、ホタルルシフェリンを含む
試薬にはホタルルシフェラーゼを共存させることができ
ないため、溶液状態でのホタルルシフェリンの安定性が
悪いことは大きな問題であった。

【０００６】一般的に酵素とその基質が共存する状態で
は、それぞれが単独で存在するよりも安定性が向上する
ことはよく知られた事実である。ホタルルシフェラーゼ
とホタルルシフェリンが共存する場合の安定化技術とし
ては、安定化剤としてポリオールを添加し、pHを5.5か
ら7.4としたホタルルシフェラーゼ・ホタルルシフェリ
ンの水溶液[1]が知られている。しかしながら、ホタル
ルシフェリン単独の状態でも同様に安定性が向上するか
どうかは全く知られていない。

【０００７】また、ウミホタルルシフェリンをpH6.0以
下の溶液で保存する方法[2]も知られているが、ウミホ
タルルシフェリン（化学式１）とホタルルシフェリン
（化学式２）では全く構造が異なるため、そのままホタ
ルルシフェリンに適用できるとは言い難い。

【０００８】

【化１】

【０００９】

【化２】

【００１０】シクロデキストリンは、多数のα-1,4-結
合したグルコピラノース単位で構成される環状化合物
で、１分子に含まれるグルコース単位の数により、α-
シクロデキストリン（６単位）、β-シクロデキストリ
ン（７単位）、γ-シクロデキストリン（８単位）・・
・と命名されている。

【００１１】シクロデキストリンの特徴は、その環状構
造の中央の空洞にさまざまな低分子化合物を取り込んで
包接化合物を形成する点にある。包接化合物において、
取り込まれる化合物はゲストと呼ばれ、ゲストを取り込
むシクロデキストリンはホストと呼ばれる。ゲストとホ
ストのモル比は通常１：１である。

【００１２】また、ゲスト化合物の溶解度は包接化合物
の形成により増加することが知られていて、この特徴を
利用して水に難溶性の化合物の溶解性を改良する試みが
ある。[3]では、γ-GTP活性測定用の基質（L-γ-グルタ
ミル-p-ニトロアニリド）の溶解性の改善にマルトオリ
ゴ糖結合シクロデキストリンが用いられている。[4]で
は、ベンジジン系発色剤の溶解性の改善にγ-シクロデ
キストリンが用いられている。また、[5]はテトラメチ
ルベンジジンを共存させることによるパーオキシダーゼ
の安定化に関する技術であるが、テトラメチルベンジジ
ンの溶解性を改善するためにβ-シクロデキストリンが
用いられている。しかしながら、シクロデキストリンと
包接化合物を形成することにより、ルシフェリンの安定
性を改善した例は知られていない。

【００１３】ホタルルシフェリンとシクロデキストリン
の両方に関連する技術としては、[6]と[7]が知られてい
る。これらはどちらも細胞から抽出したATPを、ホタル
ルシフェラーゼ・ホタルルシフェリンを加えて発光反応
により検出する際に、抽出に使用した界面活性剤をシク
ロデキストリンで包接することで発光阻害作用を抑制す
るという内容であり、ホタルルシフェリンとシクロデキ
ストリンには何ら関連がない。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、新たなホタルルシフェリンの安定化方法と、その
方法を用いた安定なホタルルシフェリン溶液の提供であ
る

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
の解決のために鋭意検討を行った結果、新たなホタルル
シフェリンの安定化方法を見いだした。本発明は以下の
構成からなる。

【００１６】（１）シクロデキストリンまたはその誘導
体を共存させることを特徴とするホタルルシフェリンの
安定化方法。

【００１７】（２）シクロデキストリンを構成するグル
コース単位の数が７以上であることを特徴とする（１）
に記載のホタルルシフェリンの安定化方法。

【００１８】（３）シクロデキストリンまたはその誘導
体が、β-シクロデキストリンまたはその誘導体である
（１）から（２）に記載のホタルルシフェリンの安定化
方法。

【００１９】（４）ホタルルシフェリンに対してシクロ
デキストリンまたはその誘導体をモル比で１から１００
倍量加えることを特徴とする（１）から（３）に記載の
安定化方法。

【００２０】（５）pHを5.5から6.8に調製することを特
徴とする（１）から（４）に記載の安定化方法。

【００２１】（６）ホタルルシフェリンとシクロデキス
トリンまたはその誘導体を含むことを特徴とするホタル
ルシフェリン溶液。

【００２２】（７）シクロデキストリンを構成するグル
コース単位の数が７以上であることを特徴とする（６）
に記載のホタルルシフェリン溶液。

【００２３】（８）シクロデキストリンまたはその誘導
体が、β-シクロデキストリンまたはその誘導体である
（６）から（７）に記載のホタルルシフェリン溶液。

【００２４】（９）ホタルルシフェリンに対してシクロ
デキストリンまたはその誘導体をモル比で１から１００
倍量含むことを特徴とする（６）から（８）に記載のホ
タルルシフェリン溶液。

【００２５】（１０）pHが5.5から6.8である（６）から
（９）に記載のホタルルシフェリン溶液。

【００２６】（１１）ホタルルシフェリンよりもシクロ
デキストリンまたはその誘導体に対する結合定数が大き
い化合物を添加することを特徴とする、シクロデキスト
リンまたはその誘導体に包接したホタルルシフェリンの
包接解除方法。

【００２７】（１２）化合物がアダマンタン誘導体であ
る（１１）に記載の包接解除方法。

【００２８】（１３）シクロデキストリンまたはその誘
導体に対してアダマンタン誘導体をモル比で０．２５か
ら１．５倍量添加することを特徴とする（１１）から
（１２）に記載の包接解除方法。

【００２９】（１４）少なくとも以下の試薬で構成され
る試薬キット。 1)シクロデキストリンまたはその誘導体とホタルルシフ
ェリンを含む試薬 2)ホタルルシフェリンよりもシクロデキストリンまたは
その誘導体に対する結合定数が大きい化合物を含む試薬

【００３０】（１５）シクロデキストリンまたはその誘
導体が、β-シクロデキストリンまたはその誘導体であ
る（１４）に記載の試薬キット。

【００３１】（１６）ホタルルシフェリンに対してシク
ロデキストリンまたはその誘導体をモル比で１から１０
０倍量含むことを特徴とする（１４）から（１５）に記
載の試薬キット。

【００３２】（１７）ホタルルシフェリンよりもシクロ
デキストリンまたはその誘導体に対する結合定数が大き
い化合物が、アダマンタン誘導体である（１４）から
（１６）に記載の試薬キット。

【００３３】（１８）シクロデキストリンまたはその誘
導体とホタルルシフェリンを含む試薬のpHが5.5から6.8
である（１４）から（１７）に記載の試薬キット。

【００３４】

【発明の実施の形態】本発明では、包接化合物を形成し
てホタルルシフェリンを安定化する化合物として、シク
ロデキストリンおよびその誘導体（以下、シクロデキス
トリンとする）を使用する。使用するシクロデキストリ
ンに関して特に制限はないが、空孔径サイズから考えて
シクロデキストリンを構成するグルコース単位の数が７
以上のものが好ましい。

【００３５】このようなシクロデキストリンの具体例と
しては、例えば2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリ
ン、2,3,6-トリ-O-メチル-β-シクロデキストリン、2,6
-ジ-O-エチル-β-シクロデキストリン、2,3,6-トリ-O-
エチル-β-シクロデキストリン、2,6-ジ-O-メチル-γ-
シクロデキストリン、2,3,6-トリ-O-メチル-γ-シクロ
デキストリン、2,6-ジ-O-エチル-γ-シクロデキストリ
ン、2,3,6-トリ-O-エチル-γ-シクロデキストリン等の
アルキル化シクロデキストリン、例えば2-ヒドロキシエ
チル-β-シクロデキストリン、2-ヒドロキシプロピル-
β-シクロデキストリン、3-ヒドロキシプロピル-β-シ
クロデキストリン、2,3-ジヒドロキシプロピル-β-シク
ロデキストリン、2-ヒドロキシエチル-γ-シクロデキス
トリン、2-ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリ
ン、3-ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン、2,
3-ジヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン等のヒ
ドロキシアルキル化シクロデキストリン、例えば2,3,6-
トリ-O-アセチル-β-シクロデキストリン、2,3,6-トリ-
O-アセチル-γ-シクロデキストリン等のアシル化シクロ
デキストリン、例えば6-O-α-D-グルコシル-β-シクロ
デキストリン、6-O-α-マルトシル-β-シクロデキスト
リン、6-O-α-D-グルコシル-γ-シクロデキストリン、6
-O-α-マルトシル-γ-シクロデキストリン等の糖修飾シ
クロデキストリン、例えばO-カルボキシメチル-β-シク
ロデキストリン、O-カルボキシメチル-γ-シクロデキス
トリン等のカルボキシアルキル化シクロデキストリン、
例えばポリ-β-シクロデキストリン、ポリ-γ-シクロデ
キストリン等のポリマー体等が挙げられる。

【００３６】上にあげたシクロデキストリンの中でもβ
-シクロデキストリン、またはその誘導体が空孔径サイ
ズやシクロデキストリンの水に対する溶解性の点で特に
好ましい。なお、これらのシクロデキストリンは市販の
ものを用いてもよいし、公知の方法に準じて合成したも
のを用いてもよい[8]-[13]。

【００３７】シクロデキストリンの濃度は、ホタルルシ
フェリンの濃度によって決定される。シクロデキストリ
ンはホタルルシフェリンと１：１のモル比で包接化合物
を形成するので、シクロデキストリンは、ホタルルシフ
ェリンと等モル濃度以上でないと安定化の効果が十分で
ない。シクロデキストリンがホタルルシフェリンに対し
て過剰に存在しても問題はないが、安定性向上効果が頭
打ちになることと、後で述べるホタルルシフェリンの包
接解除に際して、包接解除剤を多量に添加しなければな
らなくなる。したがって、ホタルルシフェリンに対する
シクロデキストリンの量はモル比で１００倍を上限とす
るのが好ましい。

【００３８】本発明は、シクロデキストリンに包接した
ホタルルシフェリンの包接を解除する方法も提供する。
シクロデキストリンに包接して安定化したホタルルシフ
ェリンは、そのままでは発光反応の基質として作用しな
い。したがって、ホタルルシフェリンとシクロデキスト
リンの包接を解除する必要がある。そのためにホタルル
シフェリンよりもシクロデキストリンに対する結合定数
が大きい化合物を添加することで包接を解除する。

【００３９】ホタルルシフェリンの包接を解除する化合
物は、ホタルルシフェリンよりもシクロデキストリンに
対する結合定数が大きい化合物であればどのようなもの
でもかまわないが、アダマンタン誘導体がシクロデキス
トリンに対する結合定数が特に大きく好ましい。アダマ
ンタン誘導体の具体例としては1-アダマンタナミン、1-
アダマンタン酢酸、1-アダマンタンカルボン酸、1-アダ
マンタンスルホン酸、1-アダマンタンカルボニルクロリ
ド、1-アダマンタンエタノール、1-アダマンタンメタノ
ール、1-アダマンタンメチルアミン、1-アダマンタノー
ル、1-アダマンタノン、臭化1-アダマンチル、3,5-ジメ
チル-1-アダマンタナミン、α-メチル-1-アダマンタン
メチルアミンがあげられる。

【００４０】ホタルルシフェリンの包接を解除するため
に添加するアダマンタン誘導体の濃度は、シクロデキス
トリンの濃度によって規定される。そのモル濃度比は厳
密に１：１である必要はなく、シクロデキストリンの濃
度に対してアダマンタン誘導体の濃度が25%以上あれ
ば、ホタルルシフェリンの包接を解除することができ
る。ただし、アダマンタン誘導体は発光反応を阻害する
ので、そのモル濃度がシクロデキストリンのモル濃度の
１．５倍を越えるのは好ましくない。

【００４１】本発明の安定化方法は、ホタルルシフェリ
ンとシクロデキストリンが包接化合物を形成することで
ホタルルシフェリンが安定化するものである。したがっ
てホタルルシフェリンの溶液中にホタルルシフェラーゼ
が共存しない場合に特に効果が大きい。また、酸化防止
剤等の公知の安定化剤との組み合わせによりさらに安定
性が向上することも期待できる。

【００４２】シクロデキストリンと併用できる安定化方
法の中でも効果が大きいのは、pHを5.5から6.8に調製す
るという方法である。ホタルルシフェラーゼ−ホタルル
シフェリンによる発光反応の至適pHは8.0付近である
が、ホタルルシフェリンを単独で保存する場合には、pH
7.0以下の方が安定性が良い。特に溶液のpHを5.5から6.
8に調製した場合に安定性が向上する。ただし、pH7.0以
下の領域ではホタルルシフェリンの溶解度が小さくなる
ことに注意しなければならない。

【００４３】本発明の好ましい実施様態を以下に記載す
る。本発明はホタルルシフェラーゼが共存しない系にお
けるホタルルシフェリンの安定化方法なので、生物発光
を利用したATPの高感度検出系よりもホタルルシフェラ
ーゼを標識酵素とした生物発光酵素免疫測定法に適用す
るのが好ましい。

【００４４】生物発光酵素免疫測定法におけるホタルル
シフェリン溶液では、ホタルルシフェリンをシクロデキ
ストリンと共に適当な緩衝液に溶解する。シクロデキス
トリンの濃度は先に述べたようにホタルルシフェリンに
対してモル比で１から１００倍量になるようにする。ま
た、発光に必要な成分であるATPとマグネシウムイオン
の供給源（MgSO₄等）も添加しておく。

【００４５】ホタルルシフェリンを溶解する緩衝液は、
生化学用に一般的に用いられるものであれば特に限定は
ない。また、pH5.5から8.0の範囲の緩衝液が使用可能で
ある。使用可能な緩衝液は具体的には、りん酸緩衝液、
りん酸クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリシン緩衝液、
トリス緩衝液、およびGood's緩衝液があげられる。

【００４６】溶液のpHを5.5から6.8に調製する場合に
は、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝液、ビ
ス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチ
ル)メタン(Bis-Tris)緩衝液、および酢酸緩衝液等を用
いることができる。pH 5.5から6.8の溶液にホタルルシ
フェリンを溶解する場合には、発光反応時にpHを8.0付
近まで上げなければならないことを考慮して、緩衝液の
濃度は必要なpHを保てる最低限の濃度とするのが好まし
い。

【００４７】その他必要に応じて、公知の安定化剤や、
発光増強剤等も添加することが可能である。安定化剤と
してはアデノシンモノフォスフェート(AMP)、アデノシ
ンジフォスフェート(ADP)、およびフェニルフォスフェ
ートといったりん酸供与体を用いることができる。また
発光増強剤としてはコエンザイムA、ピロリン酸とジチ
オスレイトールの組み合わせ、およびAMP等があげられ
る。

【００４８】包接解除試薬はアダマンタン誘導体を適当
な緩衝液に溶解して調製する。包接解除試薬に使用する
緩衝液は、生化学用緩衝液として一般的に用いられるも
のであれば特に制限はない。具体的にはりん酸緩衝液、
トリス緩衝液、およびGood's緩衝液があげられる。ホタ
ルルシフェリン溶液のpHを7.0以下にした場合には、包
接解除試薬のpHを8.0付近に調製しておいて、ホタルル
シフェリン溶液と混合した際に包接解除と同時に、発光
反応の至適pHになるようにpH調節作用を持たせてもよ
い。

【００４９】以上に述べたようにして調製したホタルル
シフェリン溶液と包接解除試薬を、ホタルルシフェラー
ゼを含む系に添加して発光反応を行う。使用するホタル
ルシフェラーゼは天然のものの他に、遺伝子組み換えに
よって安定性の改良されたホタルルシフェラーゼや、発
光波長の改変されたホタルルシフェラーゼも用いること
ができる。系の中においてホタルルシフェラーゼは単独
で存在してもかまわないし、他の物質と結合したホタル
ルシフェラーゼ標識物であってもかまわない。また、ホ
タルルシフェラーゼが直接あるいは間接的に固相に結合
された形態であっても差し支えない。

【００５０】ホタルルシフェリン溶液と包接解除試薬
は、予め混合してホタルルシフェリンの包接を解除して
からホタルルシフェラーゼを含む系に添加してもよい
し、別々にホタルルシフェラーゼを含む系に添加するこ
ともできる。どちらの場合にもホタルルシフェリン溶液
中のシクロデキストリンと包接解除試薬中のアダマンタ
ン誘導体のモル濃度比が１：０．２５から１：１．５の
範囲であることが好ましい。

【００５１】

【実施例】実施例１（シクロデキストリンによる安定化
の検討１）各種シクロデキストリンを添加したホタルルシフェリン
溶液を調製し、発光値と安定化効果を確認した。ホタルルシフェリン溶液の組成 Luciferin 0.47mM ATP 1mM Tricine(pH 7.8) 20mM ピロリン酸カリウム(PPiK) 0.1mM MgSO₄7H₂0 8mM EDTA2Na 0.13mM サッカロース 0.083% 上記組成を基にして、シクロデキストリン無添加のホタ
ルルシフェリン溶液と、α-シクロデキストリン、ジメ
チル-α-シクロデキストリン、およびジメチル-β-シク
ロデキストリンをそれぞれ0.5%（モル濃度比でホタルル
シフェリンのおよそ１０倍に相当する）添加したホタル
ルシフェリン溶液を調製した。

【００５２】調製したホタルルシフェリン溶液は２群に
分け、１群は-20℃で凍結保存し、他の１群は25℃で保
存した。１週間後に保存しておいたホタルルシフェリン
溶液にホタルルシフェラーゼ溶液を添加し、ルミネッセ
ンスリーダーで発光値を測定した。

【００５３】図１に各ホタルルシフェリン溶液の発光量
を示す。数値は-20℃保存の同じ組成の溶液の発光量を1
00とした場合の発光量の割合を示す。ジメチル-α-シク
ロデキストリンとジメチル-β-シクロデキストリンを添
加すると、無添加の場合に比べて発光量は低下するが、
25℃で１週間経過後も相対的な発光量の低下が少なく、
ホタルルシフェリンの安定性が向上していることを示し
ている。

【００５４】実施例２（ホタルルシフェリンの包接の確
認）実施例１で示したシクロデキストリンを添加したホタル
ルシフェリン溶液の発光値の低下と安定性の向上は、ホ
タルルシフェリンがシクロデキストリンに包接すること
で安定化する一方で、包接したままではホタルルシフェ
ラーゼとの発光反応に関与できず、発光値が低下するた
めと考えられる。このことを実証するために、ホタルル
シフェリン溶液にシクロデキストリンを添加した際の吸
収スペクトルの変化を検討した。

【００５５】実施例１で調製したホタルルシフェリン溶
液に、ジメチル-β-シクロデキストリンをモル濃度比で
ホタルルシフェリンの1,5,10,20,40,および80倍になる
ように添加し、DU640 Spectrophotometer（Beckman社
製）で紫外部の吸収スペクトルを測定した。結果を図２
に示す。

【００５６】図２に示すようにシクロデキストリンの濃
度の増加とともに、330nmでは吸光度が増加し、380nmで
は吸光度が減少している。このようなスペクトル変化は
包接化合物形成時の典型的なパターンと合致しており[1
4]、ホタルルシフェリンがシクロデキストリンに包接し
ていると考えられる。

【００５７】実施例３（包接の解除）ホタルルシフェリンよりもシクロデキストリンに対する
結合定数の大きい化合物により、ホタルルシフェリンの
包接が解除でき、発光値が回復するかどうかを検討し
た。シクロデキストリンに対する結合定数の大きな化合
物としては、1-アダマンタンカルボン酸を使用した[1
5]。・試薬組成ホタルルシフェリン溶液実施例１で用いた組成にジメチル-β-シクロデキストリ
ンを1.3%（モル濃度比でホタルルシフェリンの２０倍に
相当する）添加したものを使用した。アダマンタンカルボン酸溶液 Tris HCl(pH8.0) 200mM 1-アダマンタンカルボン酸 0〜37.6mM ホタルルシフェリン溶液と0〜37.6mMアダマンタンカル
ボン酸溶液を等量混合した際の、1-アダマンタンカルボ
ン酸の濃度とジメチル-β-シクロデキストリン(9.4mM)
に対する濃度比率は表１のようになる。

【００５８】

【表１】

【００５９】ホタルルシフェリン溶液とアダマンタンカ
ルボン酸溶液を等量混合し、これにホタルルシフェラー
ゼ溶液を添加してルミネッセンスリーダーで発光値を測
定した。

【００６０】図３に各ホタルルシフェリン溶液の発光値
を示す。1-アダマンタンカルボン酸の濃度が高くにるに
つれて発光値も増加していることから、ホタルルシフェ
リンの包接が解除されて基質としての効力を回復したと
考えられる。また、ジメチル-β-シクロデキストリンの
濃度に対する1-アダマンタンカルボン酸の濃度の比率が
１を越えて、1-アダマンタンカルボン酸が過剰になると
発光値は急激に低下する。これは1-アダマンタンカルボ
ン酸単体では、ホタルルシフェラーゼ−ホタルルシフェ
リンの発光反応を阻害するためである。

【００６１】実施例４（各種シクロデキストリンの検
討） β-シクロデキストリンの各種誘導体について、包接に
よる安定化効果を検討した。・試薬組成ホタルルシフェリン溶液実施例１で用いた組成にジメチル-β-シクロデキストリ
ン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、およ
びヒドロキシブチル-β-シクロデキストリンを1.3%（モ
ル濃度比でホタルルシフェリンの２０倍に相当する）添
加したものを使用した。アダマンタンカルボン酸溶液 Tris HCl(pH8.0) 200mM 1-アダマンタンカルボン酸 18.8mM

【００６２】各々のホタルルシフェリン溶液を25℃で２
週間保存後、アダマンタンカルボン酸溶液を等量加えて
包接を解除した。さらにホタルルシフェラーゼ溶液を添
加してからルミネッセンスリーダーで発光値を測定し
た。対照品は、シクロデキストリンを加えていないホタ
ルルシフェリン溶液を25℃で２週間保存したものに、20
0mM Tris HCl(pH8.0)とホタルルシフェラーゼ溶液を加
えて発光させたものである。-20℃で凍結保存しておい
た同じ組成の溶液での発光値を100%として残存活性を算
出した。

【００６３】結果を図４に示す。β-シクロデキストリ
ンの誘導体はどれも安定性向上効果が認められるが、ジ
メチル-β-シクロデキストリンが特に安定性向上効果が
高い。

【００６４】実施例５（酸性溶液での保存との組み合わ
せ）シクロデキストリンによる安定化と酸性緩衝液中での保
存による安定化の組み合わせを検討した。・試薬組成ホタルルシフェリン溶液実施例１で用いた組成にヒドロキシプロピル-β-シクロ
デキストリンを1.3%（モル濃度比でホタルルシフェリン
の２０倍に相当する）添加したものを使用した。ただ
し、緩衝液は20mM ADA(pH6.5)を使用した。アダマンタンカルボン酸溶液実施例４で用いたものと同一組成。

【００６５】ホタルルシフェリン溶液を25℃で２週間保
存後、アダマンタンカルボン酸溶液を等量加えて包接を
解除すると同時にpHを発光反応の至適であるpH8.0付近
に調節した。さらにホタルルシフェラーゼ溶液を添加し
てからルミネッセンスリーダーで発光値を測定した。対
照品は、シクロデキストリンを加えていないホタルルシ
フェリン溶液を25℃で２週間保存したものに、200mM Tr
is HCl(pH8.0)とホタルルシフェラーゼ溶液を加えて発
光させたものである。-20℃で凍結保存しておいた同じ
組成の溶液での発光値を100%として残存活性を算出し
た。

【００６６】結果を図５に示す。ホタルルシフェリン溶
液のpHを8.0にした場合のデータも併せて示してある。
酸性条件での保存による安定化と、シクロデキストリン
の包接による安定化の相乗効果が認められる。

【００６７】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明が提供す
る安定化方法は溶液中のホタルルシフェリンの安定性を
向上させ、長期間にわたって活性を維持することが可能
である。また、本発明はシクロデキストリンによる包接
作用によるものなので、公知のホタルルシフェリンの安
定化方法と組み合わせて、その効果を相乗的に高めるこ
とができる。

【００６８】参考文献 [1]WO 9411528 [2]特開平 8-154699 [3]特公平7-108240 [4]特公平7-121235 [5]特許第2501571号 [6]特表平6-504200 [7]特開平7-203995 [8]US3453258 [9]US3453259 [10]Polymer Journal Vol.13, No.8, 777-781(1981) [11]特開昭61-266401 [12]特開昭63-122701 [13]特開昭62-243602 [14]Journal of American chemical Society Vol.114.
6012-6016(1992) [15]Nature Vol.356, N0.12, 136-137(1992)

【図面の簡単な説明】

【図１】ホタルルシフェリン溶液にシクロデキストリン
を添加した場合の発光値

【図２】シクロデキストリンにホタルルシフェリンが包
接したことを示すスペクトルチャート

【図３】アダマンタンカルボン酸による包接の解除

【図４】各種シクロデキストリンの検討

【図５】酸性溶液での保存との組み合わせ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ63 QR02 QR58 QS08 QS22 QX02 4C050 AA01 BB05 CC08 EE03 FF02 GG03 HH04 4C090 AA02 AA05 AA08 BA11 BD18 CA46 DA12 DA25 DA27

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シクロデキストリンまたはその誘導体を共
存させることを特徴とするホタルルシフェリンの安定化
方法。
【請求項２】シクロデキストリンを構成するグルコース
単位の数が７以上であることを特徴とする請求項１に記
載のホタルルシフェリンの安定化方法。
【請求項３】シクロデキストリンまたはその誘導体が、
β-シクロデキストリンまたはその誘導体である請求項
１から２に記載のホタルルシフェリンの安定化方法。
【請求項４】ホタルルシフェリンに対してシクロデキス
トリンまたはその誘導体をモル比で１から１００倍量加
えることを特徴とする請求項１から３に記載の安定化方
法。
【請求項５】pHを5.5から6.8に調製することを特徴とす
る請求項１から４に記載の安定化方法。
【請求項６】ホタルルシフェリンとシクロデキストリン
またはその誘導体を含むことを特徴とするホタルルシフ
ェリン溶液。
【請求項７】シクロデキストリンを構成するグルコース
単位の数が７以上であることを特徴とする請求項６に記
載のホタルルシフェリン溶液。
【請求項８】シクロデキストリンまたはその誘導体が、
β-シクロデキストリンまたはその誘導体である請求項
６から７に記載のホタルルシフェリン溶液。
【請求項９】ホタルルシフェリンに対してシクロデキス
トリンまたはその誘導体をモル比で１から１００倍量含
むことを特徴とする請求項６から８に記載のホタルルシ
フェリン溶液。
【請求項１０】pHが5.5から6.8である請求項６から９に
記載のホタルルシフェリン溶液。
【請求項１１】ホタルルシフェリンよりもシクロデキス
トリンまたはその誘導体に対する結合定数が大きい化合
物を添加することを特徴とする、シクロデキストリンま
たはその誘導体に包接したホタルルシフェリンの包接解
除方法。
【請求項１２】化合物がアダマンタン誘導体である請求
項１１に記載の包接解除方法。
【請求項１３】シクロデキストリンまたはその誘導体に
対してアダマンタン誘導体をモル比で０．２５から１．
５倍量添加することを特徴とする請求項１１から１２に
記載の包接解除方法。
【請求項１４】少なくとも以下の試薬で構成される試薬
キット。 1)シクロデキストリンまたはその誘導体とホタルルシフ
ェリンを含む試薬 2)ホタルルシフェリンよりもシクロデキストリンまたは
その誘導体に対する結合定数が大きい化合物を含む試薬
【請求項１５】シクロデキストリンまたはその誘導体
が、β-シクロデキストリンまたはその誘導体である請
求項１４に記載の試薬キット。
【請求項１６】ホタルルシフェリンに対してシクロデキ
ストリンまたはその誘導体をモル比で１から１００倍量
含むことを特徴とする請求項１４から１５に記載の試薬
キット。
【請求項１７】ホタルルシフェリンよりもシクロデキス
トリンまたはその誘導体に対する結合定数が大きい化合
物が、アダマンタン誘導体である請求項１４から１６に
記載の試薬キット。
【請求項１８】シクロデキストリンまたはその誘導体と
ホタルルシフェリンを含む試薬のpHが5.5から6.8である
請求項１４から１７に記載の試薬キット。