JP6932082B2 - ルシフェリンの安定化方法及び生物発光の測定方法 - Google Patents
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Description
(1A)ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法。
(2A)前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、(1A)に記載のルシフェリン溶液の安定化方法。
(3A)前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、(1A)または(2A)に記載のルシフェリン溶液の安定化方法。
(4A)標識酵素としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ボロン酸誘導体又はその塩を共存させてルシフェリン溶液を安定化させる免疫学的測定方法。
(5A)前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、(4A)に記載の免疫学的測定方法。
(6A)前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、(4A)または(5A)に記載の免疫学的測定方法。
(7A)(4A)〜(6A)のいずれかに記載の免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定試薬。
(1B)ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
(2B)前記ボロン酸誘導体又はその塩が下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、(1B)に記載の生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
(3B)前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、(1B)または(2B)に記載の生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
(4B)標識物としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させて生物発光強度の減衰・低下を抑制させる免疫学的測定方法。
(5B)前記ボロン酸誘導体又はその塩が下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、(4B)に記載の免疫学的測定方法。
(6B)前記ルシフェリンがホタルシフェリンである(4B)または(5B)に記載の免疫学的測定方法。
(7B)前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、(4B)から(6B)に記載の免疫学的測定方法。
(8B)(4B)〜(7B)のいずれかに記載の免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定試薬。
本発明において、C1〜C10のアルキル基とは、二重結合又は三重結合を(好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個)有してもよく、炭素数が1〜10であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基を示す。かかる二重結合又は三重結合を有してもよく、炭素数が1〜10であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、t−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n−ヘプチル基、n−オクチル基、n−ノニル基、n−デシル基、ビニル基、1−プロペニル基、2−プロペニル基、2−メチル−2−プロペニル基、イソプロペニル基、1−ブテニル基、2−ブテニル基、3−ブテニル基、2−ペンテニル基、3−ペンテニル基、4−ペンテニル基、5−ヘキセニル基、エチニル基、プロパ−2−イン−1−イル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
第一の実施形態において、本発明は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法を提供する。
本発明において、ボロン酸誘導体又はその塩として
本発明において、ボロン酸誘導体又はその塩として
本発明はまた、標識酵素としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ボロン酸誘導体又はその塩を共存させてルシフェリン溶液を安定化させる免疫学的測定方法を提供する。本実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリンとして、ルシフェリン及びボロン酸誘導体又はその塩を含む溶液を用いることを特徴とする。当該実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることに起因して、当該測定前のルシフェリン溶液の保存安定性が改善されており、そのため長期間にわたって安定な高感度の測定をすることが出来る。当該実施形態における、ルシフェリンの種類、ルシフェリン溶液、緩衝液、安定剤の組成等は上記「ルシフェリン溶液の安定化方法」と同様である。
また、一実施形態において、本発明は、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩の共存下でルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行う工程を含む、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法を提供する。言い換えると、本発明は、ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法を提供する。
典型的には、生物発光反応を用いた免疫学的測定方法は、以下の手順により行うことができる:
まず、担体固定化抗体(第一抗体)溶液に被験試料を添加する。次に、バッファを分離(洗浄)する。そしてルシフェラーゼ標識抗体(第二抗体)溶液を添加する。次に、バッファを分離(洗浄)する。そして基質を混合(ルシフェリン等)し、発光を測定する。
本発明はまた、標識物としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させて生物発光強度の減衰・低下を抑制させる免疫学的測定方法を提供する。当該実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリン溶液にピロリン酸塩及びボロン酸誘導体又はその塩を共存させることに起因して、免疫学的測定の際の、経時的な生物発光強度の減衰・低下を抑制することができる。当該実施形態における、ボロン酸誘導体の種類、濃度、ルシフェリンの種類、ルシフェリン溶液、緩衝液、安定剤の組成等は上記「生物発光強度の減衰・低下の抑制方法」と同様である。
各種ボロン酸誘導体によるホタルルシフェリンの安定化
ホタルルシフェリン溶液に種々のボロン酸誘導体を溶解し、25℃または37℃で一定期間保存後にホタルルシフェラーゼの活性を測定し、ホタルルシフェリンの安定性を評価した。
本実施例で用いたホタルルシフェラーゼ活性の至適pHは、pH8.2〜8.3である。一方、基質であるホタルルシフェリンは弱酸性において安定である(特許文献2)。
7日間保存後、凍結させたものは水浴で融解し、全ての試薬を30℃で予備加温した。
ホタルルシエラーゼ溶液は、1×10−11mol/Lとなるように調製した。
ボロン酸誘導体の異性体によるホタルルシフェリンの安定化
ボロン酸誘導体の異性体によるホタルルシフェリンの安定化に対する効果を検討した。
ボロン酸誘導体としてクロロフェニルボロン酸を用い、その異性体として、2−クロロフェニルボロン酸、3−クロロフェニルボロン酸、および4−クロロフェニルボロン酸を用いた。
実施例1と同様に測定した結果を表5および6に示す。
−30℃での発光強度を比較すると、クロロフェニルボロン酸は4位、3位、および2位の順で発光強度の低下が大きく、ホタルルシフェラーゼの活性を阻害した。一方、ホタルルシフェリンの安定化効果は、4位がよい傾向が認められた。しかし、その差は著しいものではないので、より高感度な測定を行うためには、ホタルルシフェラーゼ活性の阻害が小さい2−クロロフェニルボロン酸を用いることが適当である。
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響(その1)
ボロン酸誘導体として、ブチルボロン酸およびフェニルボロン酸を用い、ボロン酸誘導体の濃度を0.2mmol/L、2mmol/L、および20mmol/Lとしてボロン酸誘導体の濃度の違いによる影響を検討した。
各々の試薬の組成は、R1が30mmol/L MgSO4/7H2O、4mmol/L ATP・2Na、および0.1mmol/L ピロリン酸カリウム含有100mmol/L Tris緩衝液(pH8.5)、R2が0.5mmol/L ホタルルシフェリンおよびボロン酸誘導体含有10mmol/L ADA緩衝液(pH6.5)とした。
実施例1と同様に測定した結果を表7に示す。
ブチルボロン酸、フェニルボロン酸とも濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響(その2)
ボロン酸誘導体として、ほう酸を用い、ほう酸の濃度を1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、および25mmol/Lとし、Trisの濃度を200mmol/Lとした他は、実施例3と同様に調製した。
実施例1と同様に測定した結果を表8に示す。
ほう酸濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響(その3)
ボロン酸誘導体として、プロピルボロン酸を用い、プロピルボロン酸の濃度を0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、および100mmol/Lとし、Trisの濃度を200mmol/Lとした他は、実施例3と同様に調製した。
実施例1と同様に測定した結果を表9に示す。
ほう酸同様、プロピルボロン酸濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。
ボロン酸誘導体とシクロデキストリン誘導体を組み合わせたときのホタルルシフェリンの安定化
ボロン酸誘導体とホタルルシフェリンの安定化に効果が認められたシクロデキストリン誘導体(特許文献3)を組み合わせたときの効果の増大の有無を検討した。
ボロン酸誘導体として2mmol/L フェニルボロン酸、およびシクロデキストリン誘導体として2.5mmol/L ジメチル−β−シクロデキストリンを用いた他は、実施例1と同様に調製した。
実施例1と同様に測定した結果を表10に示す。
ボロン酸誘導体またはシクロデキストリン誘導体単独で使用したときに比較して、ボロン酸誘導体とシクロデキストリン誘導体を組み合わせて共存させたときの方が25℃、37℃ともにホタルルシフェラーゼの活性が高く、両者を組み合わせることによりホタルルシフェリンの安定化が高まることが認められた。
HPLCによるホタルルシフェリンの分解産生物の分析
フェニルボロン酸を含まないホタルルシフェリン溶液(対照)および20mmol/L フェニルボロン酸を含むホタルルシフェリン溶液を調製した。なお、フェニルボロン酸の他は、実施例1と同様に調製した。
HPLCとしてWaters社のUPLC、検出器はPDAを用いて、330nmで測定した。カラムは、CHIRALCEL OD−RH(4.6×15cm)(ダイセル化学工業社)を用いた。移動相はアセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸を用いて、アセトニトリルを0〜30分間で25%から85%のグラジエント分析(UPLCパラメータ曲線増加8)を用いた。
ルシフェリン溶液にピロリン酸塩および/またはブチルボロン酸を共存させたときの発光の減衰・低下の抑制
ホタルルシフェリン溶液にピロリン酸塩および/またはブチルボロン酸を添加して、ルシフェラーゼによる発光反応を経時的に測定し、発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。
本実施例のルシフェラーゼは遺伝子変異で得られたホタルルシフェラーゼを用いた。この酵素の至適pHは、pH8.2〜8.3である。一方、基質であるホタルルシフェリンは弱酸性において安定である。
ホタルルシフェラーゼ溶液は、1×10−11mol/Lとなるように調製した。
96穴マイクロプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)の各ウエルに10μLのホタルルシフェラーゼ溶液をマニュアルで分注した。また、全ての試薬を30℃で予備加温した。発光強度測定装置CentroLB960(ベルトールド社)を用いてR1を50μLおよびR2を50μL各々吐出し、0秒後から30秒後までの発光強度を連続的に測定した。
プロピルボロン酸をR1またはR2に添加したときの発光の減衰・低下の抑制
ボロン酸誘導体としてプロピルボロン酸を用い、より高い効果を得るためには、いずれの試薬にボロン酸誘導体を添加した方が良いか、検討した。
各々の試薬の組成は、R1が30mmol/L MgSO4・7H2O、4mmol/L ATP・2Na、および0.1mmol/L ピロリン酸カリウム含有 100mmol/L Tris緩衝液(pH8.4)、R2が0.5mmol/L ホタルルシフェリン含有 10mmol/L ADA緩衝液(pH6.5)とし(対照)、試験区にはさらにR1またはR2に5mmol/L プロピルボロン酸を添加した。
実施例8と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、測定を60秒後まで行った他は実施例8と同様の測定を実施した。
結果を図5に示すが、R1にプロピルボロン酸を添加したとき、R2にプロピルボロン酸を添加したとき、およびR1とR2の両方にプロピルボロン酸を添加したときのいずれも同等で、プロピルボロン酸を添加しない対照に比べて発光強度の減衰・低下が小さくなった。従って、プロピルボロン酸はR1、R2のどちらか一方の試薬に添加してもよく、またはR1、R2の両方に添加してもよいことが分かった。
プロピルボロン酸を反応中に添加したときの発光の減衰低下の抑制
ボロン酸誘導体としてプロピルボロン酸を用い、発光反応中にボロン酸誘導体を添加したときの発光の減衰・低下の抑制効果を検討した。
各々の試薬の組成は、R1が30mmol/L MgSO4・7H2O、4mmol/L ATP・2Na、および0.1mmol/L ピロリン酸カリウム含有 100mmol/L Tris緩衝液(pH8.4)、R2が0.5mmol/L ホタルルシフェリン含有10mmol/L ADA緩衝液(pH6.5)とし、さらにR3として7.5mmol/L プロピルボロン酸溶液を調製した。
実施例8と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製した。
96穴マイクロプレートの各ウエルに10μLのホタルルシフェラーゼ溶液をマニュアルで分注後、発光強度測定装置CentroLB960を用いてR1を50μLおよびR2を50μL各々吐出し、0秒後から15秒後までの発光強度を連続的に測定し、その後R3を50μL吐出し、さらに60秒後まで連続的に測定した。対照のR3は精製水50μLとした。
ボロン酸誘導体の濃度による影響
添加するボロン酸誘導体の濃度を変えてルシフェラーゼによる発光反応を経時的に測定し、ボロン酸誘導体の濃度の違いによる発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。
各々の試薬の組成は、R1が30mmol/L MgSO4・7H2O、および4mmol/L ATP・2Na含有100mmol/L Tris緩衝液(pH8.4)、R2が0.5mmol/L ホタルルシフェリン、0.1mmol/L ピロリン酸カリウム含有10mmol/L ADA緩衝液(pH6.5)とし、さらに、R2にプロピルボロン酸が0、0.5、1、5、10、25、50、および100mmol/Lとなるように添加した。
実施例8と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、実施例9と同様の測定を実施した。
結果を図7に示すが、プロピルボロン酸を何れの濃度で添加しても、発光強度の減衰・低下の抑制が認められた。またプロピルボロン酸濃度を50mmol/L以上添加すると発光強度は低下するが、長時間にわたり発光強度を維持することができることが分かった。
種々のボロン酸誘導体の効果
ボロン酸誘導体として、エチルボロン酸、シクロペンチルボロン酸、フェニルボロン酸、2−クロロフェニルボロン酸、3−アミノフェニルボロン酸、4−ヒドロキシフェニルボロン酸、4−カルボキシフェニルボロン酸、1,4−フェニレンジボロン酸、3−フリルボロン酸、(トリヒドロキシ)フェニルボロン酸、3−チオフェンボロン酸、および2,5−チオフェンジイルビスボロン酸を用い、発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。
各々の試薬の組成は、R1が30mmol/L MgSO4・7H2O、4mmol/L ATP・2Na、および0.1mmol/L ピロリン酸含有100mmol/L Tris緩衝液(pH8.4)、R2が0.5mmol/L ホタルルシフェリン含有10mmol/L ADA緩衝液(pH6.5)とし(対照)、試験区にはさらに、ボロン酸誘導体をR2に1〜5mmol/Lとなるように添加した。
実施例8と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、実施例9と同様の測定を実施した。
結果を図8〜図19に示すが、何れのボロン酸誘導体を用いても、発光強度の減衰・低下が抑制されることが分かった。
ボロン酸誘導体としてトリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウムを10mmol/Lで使用し、ATP濃度を2mmol/Lとし、発光強度の測定時間を60分とする以外、実施例8と同様にして、蛍光強度減衰・低下に対するピロリン酸カリウム(PPi)及びボロン酸誘導体の影響を評価した。具体的には、マイクロプレートに検体を分注後、R1、R2をルミノメーターCentro LB960で添加し、添加2分後から2分間隔で60分までの発光強度を測定した。結果を図20に示す。図20に示すように、ピロリン酸とボロン酸誘導体を含まない場合(対照)はフラッシュ発光であり、発光強度は急激に減衰低下し2分以内に定常状態になった。ピロリン酸が存在すると、発光の減衰は緩やかではあるが、15〜20分で減衰し、定常状態になる。ピロリン酸とボロン酸誘導体が存在すると60分後も強い発光強度を測定することができた。
Claims (10)
- 請求項3に記載のルシフェリン溶液を含む、生物発光反応試薬キット。
- ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法であって、
前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、方法。
- 請求項4に記載の生物発光反応試薬キットであって、前記ルシフェリン溶液中にピロリン酸を含むか、及び/又は前記ルシフェリン溶液に加え、さらにピロリン酸を含む、生物発光反応試薬キット。
- 前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、請求項1、5及び6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、請求項2〜4、7〜8のいずれか1項に記載の安定化剤、ルシフェリン溶液、試薬キット又は抑制剤。
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