JP6075723B2 - N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸を用いる発光増強方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明の構成は、以下の[1 ]から[8 ]の通りである。
[ 1 ]ホタルルシフェラーゼの発光反応において、発光増強作用を有する化合物としてN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を用い、該N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸は発光反応開始時の直前或いは直後にはじめてルシフェリンと混和されることを特徴とする発光増強方法であり、該発光増強方法は、リン酸イオン存在下を除いて実施される発光増強方法。
[ 2 ] 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子およびATPを含む試薬を添加する工程、
( b ) ルシフェリンおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬は用時調製されるものであり、これを添加する工程、
( c ) ルシフェリンの発光を検出する工程。
[ 3 ] 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a' ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子およびATPを含む試薬を添加する工程、
( b' ) ルシフェリンを含む試薬を添加する工程、
( c’) N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬を添加する工程、
( d' ) ルシフェリンの発光を検出する工程。
[ 4 ] 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a'' ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子、ATPおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬を添加する工程、
( b'' ) ルシフェリンを含む試薬を添加する工程、
( c'' ) ルシフェリンの発光を検出する工程。
[ 5 ]N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸の反応液中の終濃度が0.18mmol/L以上である[ 2 ]乃至[ 4 ]のいずれか1に記載の発光反応を増強する方法。
[ 6 ]ホタルルシフェラーゼの発光反応において、発光増強作用を有する化合物としてN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含み、該N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸は発光反応開始時の直前或いは直後にはじめてルシフェリンと混和されることを特徴とする発光増強剤であり、該発光増強剤は、リン酸イオン存在下を除いて用いられる発光増強剤。
[ 7 ][ 6 ] の発光増強剤を含むことを特徴とする生物発光反応試薬キット。
[ 8 ][ 1 ]乃至[ 5 ]のいずれか1に記載の発光増強方法に使用される発光反応試薬であって、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む発光反応試薬。
(a)ルシフェラーゼ標識された抗体あるいは抗原を含む試料にルシフェラーゼの補因子、ATPを含む試薬を添加する工程、
(b)ルシフェリンおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬を添加する工程、
(c)ルシフェラーゼの発光を検出する工程。
・ルシフェラーゼ標識された抗体あるいは抗原を含む試薬
・ルシフェラーゼの補因子およびATPを含む試薬
・ルシフェリンおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬
(1)実験材料
試薬1として、100mM Tris-HCl(pH8.5)、30mM MgSO4・7H2O、4mM ATP-2Na、0.1mM ピロリン酸カリウムからなる試薬を調製した。試薬2として、20mM 各種化合物、0.5mM D-ルシフェリンからなる試薬をpH6.5あるいはpH6.0となるように調製した。また、ホタルルシフェラーゼ溶液として5×10-12(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダー(ベルトールド社、Centro LB 960)を用いて 50μLの試薬1、 50μLの試薬2を相次いで添加し、発光強度を測定した。反応時のpH(試薬1と試薬2を等容量混和したときのpHの測定値)は、pHは8.2±0.1であった。
表1に示すように、発光増強作用を有しない化合物MOPSO-NaOHを用いた系における発光強度を100%とし、各種化合物を用いた場合の発光強度を比較したところ、ADA-NaOH、BES-NaOH、Bis-Tris-HCl、MES-NaOH、KH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-四ホウ酸ナトリウム、3,3-Dimethylglutaric acid-NaOH、酢酸-酢酸ナトリウムを用いた系では発光強度が大きくなった。特にADA-NaOHを用いた系ではADA-NaOHのpHによらず顕著な発光強度の増大が認められた。
(1)実験材料
試薬1として実施例1と同じ組成条件の試薬を調製した。試薬2として、10mM MOPSO(pH6.5)、0.5mM D-ルシフェリンからなる試薬を調製した。試薬3として、ADA、MOPSO、PIPES 3種類の化合物について、それぞれ30mM水溶液を調製した。3種類の水溶液はいずれもpH6.5に調整した。発光増強効果を比較するための対照には試薬3の代わりに精製水を用いた。また、ホタルルシフェラーゼ溶液として5×10-12(M)、1×10-10(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダーを用いて予め試薬1と試薬2を等容量混和した試薬100μLを添加し、次いで試薬3を50μL添加し、発光強度を測定した。発光マイクロプレートリーダーは2種類の試薬までしか添加できないため、試薬1と試薬2を予め混和して用いた。
表2に示すように、ルシフェラーゼ反応中に精製水を添加した系を100%として発光強度を比較したところ、試薬3にADAを用いた場合にのみ、発光強度が増加した。発光反応が開始した後、すなわち発光反応中にADAを添加しても、発光強度が増強することを確認した。
(1)実験材料
試薬1として、実施例1の試薬1と同じ組成で、pH7.5-9.5の範囲でpH7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、すなわちpHの異なる5種類の試薬を調製した。試薬2として、ADA、MOPSO、PIPESそれぞれの20mM水溶液(pH6.5)、0.5mM D-ルシフェリンからなる、すなわち3種類の試薬を調製した。また、実施例1と同様にホタルルシフェラーゼ溶液5×10-12(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダーを用いて 50μLの試薬1、次いで 50μLの試薬2を添加して、発光強度を測定した。また、反応時のpHは、試薬1と試薬2を等容量混和したときのpHの測定値とした。
反応時のpHが8.3における発光強度を100%として、図1に示すように、pHの異なる5種類の試薬1に対し、3種類の試薬2 ADA、MOPSO、PIPESをそれぞれ添加した場合の発光強度を比較したところ、全てのpHにおいて、ADAを添加した場合にMOPSO、PIPESした場合より高い発光強度を示した。
反応時のpHの影響によらず、ADAがルシフェラーゼの発光強度を増強することが明らかになった。
(1)実験方法
試薬1として、実施例1と同じ組成条件の試薬を調製した。試薬2として、0.5mM D-ルシフェリンに加えて、ADAとMOPSOを合わせて20mM(pH6.5)となるように表3に示す5種類の濃度の試薬を調製した。ホタルルシフェラーゼ溶液として5×10-12(M)、1×10-10(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダーで 50μLの試薬1、次いで 50μLの試薬2を添加して、発光強度を測定した。反応時のpH(試薬1と試薬2を等容量混和したときのpHの測定値)は、pHは8.3であった。
表3に示すように、試薬2のADAを含まない反応系(ADA 0mM、MOPSO 20mMの組合せ)における発光強度を100%としてそれぞれの発光強度を比較したところ、ADA濃度0.4mMから20mMまで、ADAの終濃度で0.18mMから9.09mMまでは濃度依存的に発光強度の増加がみられた。
(1)実験方法
試薬1として、実施例1と同じ組成条件の試薬を調製した。試薬2として、0.5mM D-ルシフェリンに加えて、ADAを5-50mMの範囲で5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mM含むように、すなわち10種類の試薬をいずれもpH6.5となるように調製した。ホタルルシフェラーゼ溶液として5×10-12(M)、1×10-10(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダーで 50μLの試薬1、次いで 50μLの試薬2を添加して、発光強度を測定した。反応時のpH(試薬1と試薬2を等容量混和したときのpHの測定値)は、pHは8.1±0.2であった。
表4に示すように、試薬2のADA濃度5mMの反応系における発光強度を100%として、それぞれの発光強度を比較したところ、ADA濃度が10mMから20mMまで、ADAの終濃度で4.55mMから9.09mMまでは濃度依存的に発光強度の増加がみられ、ADA濃度20mMすなわちADAの終濃度で9.09mM以上ではプラトーとなった。
(1)実験材料
試薬1は、実施例1の組成およびpH8.5の条件に加え、ADAを0-100mMの範囲で0、2.5、5、10、15、20、25、50、75、100mM含むように、すなわち10種類の試薬を調製した。試薬2は、10mM MOPSO、0.5mM D-ルシフェリン(pH6.5)となるように調製した。また、ホタルルシフェラーゼ溶液として5×10-12(M)、1×10-10(M)を調製した。
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液10μLを分注し、発光マイクロプレートリーダーを用いて 50μLの試薬1、次いで 50μLの試薬2を添加して、発光強度を測定した。反応時のpH(試薬1と試薬2を等容量混和したときのpHの測定値)は、pHは8.3であった。
表5に示すように、試薬1のADA濃度が0mMの反応系の発光強度を100%として発光強度を比較したところ、ADA濃度が2.5mMから10mMまで、ADAの終濃度で1.14mMから4.55mMまでは濃度依存的に発光強度の増加がみられ、ADA濃度10mM以上すなわちADAの終濃度4.55mM以上ではプラトーとなった。
また、ホタルルシフェラーゼを標識物質として用いる微量の生体内物質の検出、例えば、生物発光酵素免疫測定法に利用できる。
Claims (8)
- ホタルルシフェラーゼの発光反応において、発光増強作用を有する化合物としてN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を用い、該N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸は発光反応開始時の直前或いは直後にはじめてルシフェリンと混和されることを特徴とする発光増強方法であり、該発光増強方法は、リン酸イオン存在下を除いて実施される発光増強方法。
- 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子およびATPを含む試薬を添加する工程、
( b ) ルシフェリンおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬は用時調製されるものであり、これを添加する工程、
( c ) ルシフェリンの発光を検出する工程。 - 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a' ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子およびATPを含む試薬を添加する工程、
( b' ) ルシフェリンを含む試薬を添加する工程、
( c’) N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬を添加する工程、
( d' ) ルシフェリンの発光を検出する工程。 - 請求項1に記載の方法であって、以下の工程を含む発光増強方法。
( a'' ) ルシフェラーゼを含む試料にルシフェラーゼの補因子、ATPおよびN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む試薬を添加する工程、
( b'' ) ルシフェリンを含む試薬を添加する工程、
( c'' ) ルシフェリンの発光を検出する工程。 - N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸の反応液中の終濃度が0.18mmol/L以上である請求項2乃至4のいずれか1に記載の発光反応を増強する方法。
- ホタルルシフェラーゼの発光反応において、発光増強作用を有する化合物としてN-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含み、該N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸は発光反応開始時の直前或いは直後にはじめてルシフェリンと混和されることを特徴とする発光増強剤であり、該発光増強剤は、リン酸イオン存在下を除いて用いられる発光増強剤。
- 請求項6の発光増強剤を含むことを特徴とする生物発光反応試薬キット。
- 請求項1乃至5のいずれか1に記載の発光増強方法に使用される発光反応試薬であって、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸を含む発光反応試薬。
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