CN110927371A - 一种稳定高效的hrp酶促化学发光底物液、其制备方法及应用 - Google Patents

一种稳定高效的hrp酶促化学发光底物液、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及医学检测领域，具体涉及一种稳定高效的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用。本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，以4‑(1，2，4‑三氮唑‑1‑基)苯酚和4‑碘代苯基硼酸作为HRP催化鲁米诺化学发光体系的增强剂，两者可相互增强，与传统增强剂相比，发光强度更高，本底更低，灵敏度好；本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，检测平台期长，发光强度高和本底低，且稳定性好，可在4‑8℃稳定保存2年，可广泛应用于各种以HRP为标记物的试剂盒中。

Description

一种稳定高效的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种稳定高效的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用。
背景技术
化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。CLIA具有灵敏度高，特异性强、无放射性危害等优点，正逐渐取代放射免疫分析应用于生物学、医学研究和临床实验诊断中。其中以吖啶酯(AE)，碱性磷酸酶(ALP)和辣根过氧化物酶(HRP)为标记物的化学发光免疫分析为主要发展趋势。
HRP是从辣根中提取出来的一种过氧化物酶，HRP常用的发光底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺(5-氨基-邻苯二甲酰肼)属于酰肼类有机化合物，是应用最广泛的化学发光剂之一，可以被氧化剂氧化生成3-氨基酞酸盐发出蓝色光。在酶促化学发光免疫分析中，使用HRP标记抗体，进行免疫反应后，使用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH和H2O2)作用下，鲁米诺发光。但鲁米诺作为发光底物，稳定性差、信号持续时间短、发光强度偏低、本底偏高。
近二十多年来，人们陆续发现某些可以增强HRP催化鲁米诺化学发光体系发光强度和信号持续时间的化学试剂，这类化学试剂称为增强剂。目前常用的增强剂为对碘苯酚，但以对碘苯酚作为增强剂时，其本底高，发光强度仍不够，灵敏度不高。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种稳定高效的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用。本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，以4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸作为HRP催化鲁米诺化学发光体系的增强剂，两者可相互增强，与单一成分的增强剂相比，发光强度更高，灵敏度好。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液；
其中，A液包括4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸作为HRP催化鲁米诺化学发光体系的增强剂。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液还包括鲁米诺或鲁米诺钠盐、二甲基甲酰胺和缓冲液1。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液还包括鲁米诺、二甲基甲酰胺和缓冲液1。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，缓冲液1包括硼酸-硼砂缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚终浓度为0.1-1mmol/L；可选地为0.15-0.3mmol/L；进一步可选地为0.2mmol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，4-碘代苯基硼酸终浓度为0.02-0.5mmol/L；可选地为0.1-0.3mmol/L；进一步可选地为0.15mmol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，鲁米诺或鲁米诺钠盐终浓度为1-10mmol/L；可选地为6-9mmol/L；进一步可选地为7.5mmol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，二甲基甲酰胺终浓度为1-10mmol/L；可选地为5-7mmol/L；进一步可选地为6.45mmol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，缓冲液1的pH值为8.0-9.0；可选地为8.6。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液中，硼酸-硼砂缓冲液的终浓度为0.1-0.3mol/L；可选地为0.2mol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液包括终浓度分别为1-10mmol/L的鲁米诺或鲁米诺钠盐，0.1-1mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.02-0.5mmol/L的4-碘代苯基硼酸，1-10mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.1-0.3mol/L的pH值为8.0-9.0的硼酸-硼砂缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液包括终浓度分别为6-9mmol/L的鲁米诺或鲁米诺钠盐，0.15-0.3mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.1-0.3mmol/L的4-碘代苯基硼酸，5-7mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.1-0.3mol/L的pH值为8.0-9.0的硼酸-硼砂缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液包括终浓度分别为7.5mmol/L的鲁米诺或鲁米诺衍生物，0.2mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.15mmol/L的4-碘代苯基硼酸，6.45mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.2mol/L的pH值为8.6的硼酸-硼砂缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，A液包括终浓度分别为7.5mmol/L的鲁米诺，0.2mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.15mmol/L的4-碘代苯基硼酸，6.45mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.2mol/L的pH值为8.6的硼酸-硼砂缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，所述HRP酶促化学发光底物液还包括B液，其中，B液包括过氧化脲或过氧化氢。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液包括过氧化脲或过氧化氢、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液2。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液包括过氧化脲、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液2。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液中，过氧化脲或过氧化氢的终浓度为0.5-5mmol/L；可选地为2-4mmol/L；进一步可选地为3.5mmol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液中，聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为0.1-5g/L；可选地为0.5-3g/L；进一步可选地为1g/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液中，缓冲液2的pH值为6.5-7.8；可选地为7.2。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液中，缓冲液2包括磷酸盐缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液中，磷酸盐缓冲液的终浓度为0.1-0.3mol/L；可选地为0.2mol/L。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液包括终浓度分别为0.5-5mmol/L的过氧化脲或过氧化氢，0.1-5g/L的聚乙烯吡咯烷酮，和0.1-0.3mol/L的pH值为6.5-7.8的磷酸盐缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液包括终浓度分别为2-4mmol/L的过氧化脲或过氧化氢，0.5-3g/L的PVP，和0.1-0.3mol/L的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
上述HRP酶促化学发光底物液在一种可能的实现方式中，B液包括终浓度分别为3.5mmol/L的过氧化脲，1g/L的PVP，和0.2mol/L的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
本发明实施例还提供了利用上述配方制备HRP酶促化学发光底物液的制备方法。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述制备方法包括下述步骤：
配制A液：配制缓冲液1，将鲁米诺或鲁米诺钠盐溶于缓冲液1中；将4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸分别溶于二甲基甲酰胺后，倒入缓冲液1中；调节pH，定容，得A液。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述制备方法包括下述步骤：
配制B液：配制缓冲液2，将过氧化脲或过氧化氢和PVP分别溶于双蒸水后，倒入缓冲液2中；调节pH，定容，得B液。
本发明实施例还提供了上述HRP酶促化学发光底物液、上述制备方法在化学发光免疫分析中的应用。
有益效果
(1)本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，以4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸为HRP催化鲁米诺化学发光体系的增强剂，两者可相互增强，与单一成分的增强剂相比，发光强度更高，灵敏度好。
(2)本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，对发光剂鲁米诺或鲁米诺衍生物的用量进行了特定选择，特定比例的发光剂，发光强度更好。
(3)本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，以过氧化氢或过氧化脲作为氧化剂，其中，以过氧化脲的效果更优。
(4)本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，针对HRP酶促化学发光底物液体系，选择了合适的缓冲溶液，缓冲能力好，对整个体系pH值的稳定效果好。
(5)本发明实施例中提供的HRP酶促化学发光底物液，通过使用特定比例及组成的A液和特定比例及组成的B液配制的HRP酶促化学发光底物液，检测平台期长，发光强度高和本底低，且稳定性好，可在4-8℃稳定保存2年，可广泛应用于各种以HRP为标记物的试剂盒中。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是ThermoFisher Pierce生产的化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值校准曲线图。
图2是本发明试验例4中实验组的HRP酶促化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值校准曲线图。
图3是本发明试验例5中实验组和对照组反应试剂-发光计数值图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
以下实施例中所用各原料均为市售原料。
其中，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚的CAS号为：68337-15-5；
4-碘代苯基硼酸的CAS号为：5122-99-6；
鲁米诺的CAS号为：521-31-3。
实施例1
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例2
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺2.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺0.4425g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例3
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺10mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.77g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例4
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺钠盐7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺钠盐1.492g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例5
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.1mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.016g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例6
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.4mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.064g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例7
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.05mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.012g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例8
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.45mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.111g，溶于0.25mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例9
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.2mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚0.032g，溶于0.5mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例10
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，A液包括下述终浓度的组分：
鲁米诺7.5mmol/L，4-碘代苯基硼酸0.15mmol/L，二甲基甲酰胺6.45mmol/L，硼酸-硼砂缓冲液(pH值为8.6)0.2mol/L。
上述A液的配制方法包括下述步骤：
取硼酸11.4g，硼砂4.9g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至8.6；
取鲁米诺1.3275g，溶于上述硼酸-硼砂缓冲液中；
取4-碘代苯基硼酸0.037g，溶于0.5mL二甲基甲酰胺，待完全溶解后后倒入硼酸-硼砂缓冲液中；调节pH至8.6，再加入双蒸水定容至1000mL，得A液。
实施例11
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，B液包括下述终浓度的组分：
30％过氧化氢水溶液3.5mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1g/L，磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)0.2mol/L。
上述B液的配制方法包括下述步骤：
取十二水合磷酸氢二钠51.58g、二水合磷酸二氢钠8.74g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至7.2；
取30％氧化氢水溶液0.353mL，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；
取PVP 1g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；调整pH至7.2，再加入双蒸水定容1000mL，得B液。
实施例12
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，B液包括下述终浓度的组分：
过氧化脲3.5mmol/L，PVP 1g/L，磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)0.2mol/L。
上述B液的配制方法包括下述步骤：
取十二水合磷酸氢二钠51.58g、二水合磷酸二氢钠8.74g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至7.2；
取过氧化脲0.329g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；
取PVP 1g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；调整pH至7.2，再加入双蒸水定容1000mL，得B液。
实施例13
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，B液包括下述终浓度的组分：
过氧化脲5mmol/L，PVP 1g/L，磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)0.2mol/L。
上述B液的配制方法包括下述步骤：
取十二水合磷酸氢二钠51.58g、二水合磷酸二氢钠8.74g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至7.2；
取过氧化脲0.47g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；
取PVP 1g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；调整pH至7.2，再加入双蒸水定容1000mL，得B液。
实施例14
一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液和B液；其中，B液包括下述终浓度的组分：
过氧化脲1.5mmol/L，PVP 1g/L，磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)0.2mol/L。
上述B液的配制方法包括下述步骤：
取十二水合磷酸氢二钠51.58g、二水合磷酸二氢钠8.74g，用800mL双蒸水溶解，调节pH至7.2；
取过氧化脲0.141g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；
取PVP 1g，溶于双蒸水，倒入磷酸盐缓冲液中；调整pH至7.2，再加入双蒸水定容1000mL，得B液。
试验例1不同增强剂(浓度及组成)发光强度测试
1、对照组：实施例1的A液；
实验组：实施例5-10的A液；
将对照组和实验组分别与实施例12的B液配制成HRP酶促化学发光底物液；检测其发光强度。
2、测试对象：单纯疱疹病毒II型IgG抗体。
3、实验方法：使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，用10、80、320AU/mL的校准品和0AU/mL的阴性血清作为样品，每孔分别加入10μL样品和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；混匀后1-5分钟检测发光强度；平行进行三次检测，结果取均值；结果见表1。
表1 不同增强剂对校准品和0AU/mL阴性血清浓度RLU的影响
Figure BDA0002186311270000101
由表1可知，实施例1的A液，测定校准品10、80和320AU/mL发光值分别为81259、1002389和1002389，均高于实验组实施例5、7、9和10提供的A液。其中，实施例9的增强剂单独使用4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，实施例10的增强剂单独使用4-碘代苯基硼酸，其检测质控品的发光值均远低于其他实施例(增强剂为4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸)。实施例6和实施例8提供的A液，调高了增强剂4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸的用量，结果其检测0AU/mL阴性血清和低值质控品10AU/mL的发光值升高，而高值质控品320AU/mL的发光值受抑制。综上，实施例1提供的A液用于HRP酶促化学发光底物液效果最优。
试验例2不同鲁米诺浓度及其衍生物发光强度测试
1、对照组：实施例1的A液；
实验组：实施例2的A液；实施例3的A液；和实施例4的A液；
将对照组和实验组分别与实施例12的B液配制成HRP酶促化学发光底物液；检测其发光强度。
2、测试对象：单纯疱疹病毒II型IgG抗体。
3、实验方法：使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，用10、80、320AU/mL的校准品和0AU/mL的阴性血清作为样品，每孔分别加入10μL样品和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；混匀后1-5分钟检测发光强度；平行进行三次检测，结果取均值；检测结果见表2。
表2 不同鲁米诺浓度及其衍生物对校准品和0AU/mL阴性血清浓度发光值(RLU)的影响
Figure BDA0002186311270000111
由表2可知，对照组(实施例1配制的A液)测定校准品10、80和320AU/mL，发光值分别为79826、968856和3996859，均高于实验组。由此可见，实施例1配制的A液测定高质控品发光值高，灵敏度更高。
试验例3不同浓度过氧化脲及过氧化氢发光强度测试
1、对照组：实施例12的B液；
实验组：实施例11-14的B液；
将对照组和实验组分别与实施例1的A液配制成HRP酶促化学发光底物液；检测其发光强度。
2、测试对象：单纯疱疹病毒II型IgG抗体。
3、实验方法：使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，用10、80、320AU/mL的校准品和0AU/mL的阴性血清作为样品，每孔分别加入10μL样品和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；混匀后1-5分钟检测发光强度；平行进行三次检测，结果取均值；结果见表3。
表3 不同氧化剂及其浓度对校准品和0AU/mL阴性血清浓度RLU的影响
Figure BDA0002186311270000121
由表3可知，实施例12的B液用于测定10、80和320AU/mL质控品时，发光值分别为6949、90523、1012413和4048711，均高于实施例11和14的B液。实施例13的B液，测定的0AU/mL质控品的发光值高于对照组，但此时测得的为本底发光值，应越低越好；测定的0AU/mL质控品的发光值高于对照组，但在测定80和320AU/mL质控品时，发光值逐渐出现了抑制。综上，对照组(实施例12配制的B液)用于HRP酶促化学发光底物液效果最优。
试验例4本发明与进口发光底物液比较发光强度测试
1、实验组：实施例1的A液和实施例12的B液配制的HRP酶促化学发光底物液；
对照组：ThermoFisher Pierce生产的发光底物液(成分未知)；
2、测试对象：单纯疱疹病毒II型IgG抗体。
3、实验方法：使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，用10、20、40、80、160、320AU/mL的校准品和0AU/mL的阴性血清作为样品，每孔分别加入10μL样品和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；混匀后1-5分钟检测发光强度；平行进行三次检测，结果取均值；
分别使用实验组的HRP酶促化学发光底物液和ThermoFisher Pierce生产的发光底物液按上述实验方法进行检测，结果见表4：
表4 本发明和市售产品检测校准品和阴性血清发光值
Figure BDA0002186311270000131
以上述ThermoFisher Pierce生产的化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值数据进行线性拟合，得：
Y＝10577X-67723，
R2＝0.9997，
ThermoFisher Pierce生产的化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值校准曲线图见图1。
以上述实验组的HRP酶促化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值数据进行线性拟合，得：
Y＝13063lX-80151，
R2＝0.9997，
实验组的HRP酶促化学发光底物液测定单纯疱疹病毒II抗体IgG试剂中6个校准品浓度-发光值校准曲线图见图2。
由表4、图1和图2可知，与对照组相比，实验组的HRP酶促化学发光底物液的本底更低(0AU/mL阴性血清发光值更低)，发光强度更高，灵敏度更高。
试验例5发光平台期测试
1、实验组：实施例1的A液和实施例12的B液配制的HRP酶促化学发光底物液；
对照组：ThermoFisher Pierce生产发光底物液；
2、测试对象：单纯疱疹病毒II型IgG抗体。
3、实验方法：使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，每孔分别加入10μL 320AU/mL的校准品，和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；加完发光底物液后，每隔5分钟用发光仪测量一次，连续测量60分钟；统计相同样本的发光值在60分钟内的变化情况；平行进行三次检测，结果取均值；
分别使用实验组的HRP酶促化学发光底物液和对照组的发光底物液按上述实验方法进行检测，结果见表5：
表5 本发明和市售产品发光值
Figure BDA0002186311270000141
根据以上数据绘制反应试剂-发光计数值图，见图3。从图3可看出，实验组的HRP酶促化学发光底物液与ThermoFisher Pierce生产的发光底物液，两者趋势一致：ThermoFisher Pierce发光液从5min到30min后发光值下降13.51％，到60min后下降34.25％；实验组的HRP酶促化学发光底物液从5min到30min后发光值下降13.41％，到60min后下降34.11％。两者发光平台期差别不大。
试验例6热稳定性测试
将实施例1配制的A液和实施例12配制的B液等量分装10份，各取5份分别对应放置于4℃、37℃下保存，放置1周、2周、3周、4周和5周时取出检测；
检测步骤包括：
使用北京贝尔生物工程股份有限公司生产的单纯疱疹病毒II型IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，每孔分别加入10μL 320AU/mL的校准品，和20μL磁微粒混悬液；
混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；每孔分别加入酶结合物100μL，混匀后37±0.5℃温育15分钟；磁分离去上清，加300μL清洗液洗三遍；
每孔加入发光底物A液和发光底物B液各100μL；混匀后1-5分钟检测发光强度；平行进行三次检测，结果取均值，结果见表6；
表6 本发明的HRP酶促化学发光底物液热稳定性数据
放置时间 1周 2周 3周 4周 5周
4℃(RLU) 4018956 4015982 4010895 4010062 4002259
37℃(RLU) 4023865 4019478 4018558 4015268 4012568
从表6可以看出：实施例1的A液和实施例12的B液配制的HRP酶促化学发光底物液具有较好的稳定性。根据等效实验可以推测，此发光液在2-8℃环境中至少可以保存3年，稳定性好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种HRP酶促化学发光底物液，包括A液；其中，A液包括4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸。
2.根据权利要求1所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：A液还包括：鲁米诺或鲁米诺钠盐、二甲基甲酰胺和缓冲液1；
和/或，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚和4-碘代苯基硼酸作为HRP催化鲁米诺化学发光体系的增强剂。
3.根据权利要求2所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：A液中，4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚终浓度为0.1-1mmol/L；
和/或，A液中，4-碘代苯基硼酸终浓度为0.02-0.5mmol/L；
和/或，鲁米诺或鲁米诺钠盐终浓度为1-10mmol/L；
和/或，A液中，缓冲液1的pH值为8.0-9.0；
和/或，A液中，缓冲液1包括硼酸-硼砂缓冲液。
4.根据权利要求2所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：A液包括终浓度分别为1-10mmol/L的鲁米诺或鲁米诺钠盐，0.1-1mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.02-0.5mmol/L的4-碘代苯基硼酸，1-10mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.1-0.3mol/L的pH值为8.0-9.0的硼酸-硼砂缓冲液；
或，A液包括终浓度分别为6-9mmol/L的鲁米诺或鲁米诺钠盐，0.15-0.3mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.1-0.3mmol/L的4-碘代苯基硼酸，5-7mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.1-0.3mol/L的pH值为8.0-9.0的硼酸-硼砂缓冲液；
或，A液包括终浓度分别为7.5mmol/L的鲁米诺或鲁米诺衍生物，0.2mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.15mmol/L的4-碘代苯基硼酸，6.45mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.2mol/L的pH值为8.6的硼酸-硼砂缓冲液；
或，A液包括终浓度分别为7.5mmol/L的鲁米诺，0.2mmol/L的4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚，0.15mmol/L的4-碘代苯基硼酸，6.45mmol/L的二甲基甲酰胺，和0.2mol/L的pH值为8.6的硼酸-硼砂缓冲液。
5.根据权利要求1所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：所述HRP酶促化学发光底物液还包括B液，其中，B液包括过氧化脲或过氧化氢。
6.根据权利要求5所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：B液包括过氧化脲或过氧化氢、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液2。
7.根据权利要求6所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：B液中，过氧化脲或过氧化氢的终浓度为0.5-5mmol/L；
和/或，B液中，聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为0.1-5g/L；
和/或，B液中，缓冲液2的pH值为6.5-7.8；
和/或，B液中，缓冲液2包括磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6所述的HRP酶促化学发光底物液，其特征在于：B液包括终浓度分别为0.5-5mmol/L的过氧化脲或过氧化氢，0.1-5g/L的聚乙烯吡咯烷酮，和0.1-0.3mol/L的pH值为6.5-7.8的磷酸盐缓冲液；
或，B液包括终浓度分别为2-4mmol/L的过氧化脲或过氧化氢，0.5-3g/L的PVP，和0.1-0.3mol/L的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液；
或，B液包括终浓度分别为3.5mmol/L的过氧化脲，1g/L的PVP，和0.2mol/L的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
9.利用权利要求1-8任一项所述的HRP酶促化学发光底物液制备HRP酶促化学发光底物液的制备方法。
10.权利要求1-8任一项所述的HRP酶促化学发光底物液或权利要求9所述的制备方法在化学发光免疫分析中的应用。
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