CN105806830A - 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用。典型地，本发明由化学发光底物液A液和B液两组分构成，其中所述A液包括鲁米诺(Luminol)，对咪唑苯酚，四苯基硼酸钠，二甲基甲酰胺(DMF)，磺丁基-β-环糊精，光稳定剂以及一定浓度的Tris缓冲液；所述B液包括：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，过氧化脲以及Tris缓冲液。本发明提供的化学发光底物液能够解决已有化学发光底物平台期短、稳定性较差，发光强度低，灵敏度低，本底偏高的问题。

Description

一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及用于化学发光免疫分析领域的组合物；具体而言，本发明涉及一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，所述底物液的制备方法及应用。

背景技术

化学发光是指物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，可以分为直接发光和间接发光。两种物质发生化学反应生成新物质，反应释放的能量被新生成物质的分子吸收并跃迁至激发态，由激发态回到基态的过程中产生光辐射。多余的能量以光子的形式释放出来，这种现象称为化学发光。

利用化学发光原理的化学发光免疫分析:(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光免疫分析技术已被广大研究人员所认可，正逐渐替代传统的生物检测技术。

化学发光免疫分析按化学发光时间分类可分为闪光型(flashtype)和辉光型(glowtype)。闪光型发光时间很短，只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。闪光型的样品必须立即测量，必须配以全自动化的加样及测量仪器。辉光型样品的测量可以使用通用型仪器，也可以配有全自动化仪器。

目前，化学发光免疫分析涉及了医学临床诊断领域及生物科学各个领域。甚至，与生物学科有关的交叉领域，只要涉及到微量有机物质的含量测定，应用最为广泛的定量免疫检测方法主要是化学发光免疫分析(CLIA)。尤其是化学发光免疫分析的简便、快捷、灵敏、成本低廉，兼具放射免疫(RIA)灵敏度高和酶免疫(ELISA)便于操作、检测结果准确等优点，同时又克服了二者缺点。

在生物和医学领域，应用化学发光免疫分析时，通过免疫结合酶标记物，使得含酶标记物的量直接反应了免疫结合效率，在标记抗体(抗原)、包被抗体(抗原)与底物均过量的条件下，使得待测物质的发光效率完全取决于发生结合反应之后的待测抗原(抗体)的浓度。其中化学发光的标记物主要以例如吖啶酯(AE)、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)为发展趋势。

利用HRP标记的CLIA中，常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼,Luminol),或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼),其是一类重要的发光试剂。其结构如下所示：

鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中与氧化剂(过氧化氢脲)使其进行化学反应，当其产物回到基态时发光,其波长为425nm。

在已有的实践中，早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体),但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近年来，采用标记抗体进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物,鲁米诺的发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。鲁米诺发光较为迅速，但易于衰减，光信号持续时间短，造成检测结果的稳定性，重现性不佳。

已有的研究已涉及了应用于鲁米诺发光的酶促化学发光及其底物组合物的研究。例如，文献1(CN1661370A)公开了一种酶促化学发光底物及配置方法，其涉及了A，B两组份的液体，包括了增强剂对碘苯酚等促进发光的组分；然而文献1使用对碘苯酚的增强发光组分，造成本底发光高；并且文献1也没有涉及发光灵敏度及发光强度的研究。

此外，例如文献2(CN1687751A)也公开了一种高稳定性的增强化学发光底物，其中公开使用了对碘苯酚和四苯硼钠作为鲁米诺的增强剂组分，然而文献2中的化学发光底物，发光底物灵敏度不高，且发光强度响应速率较慢(从发光开始至发光强度最大值的时间间隔超过30分钟)。

可见，现有技术存在已有的化学发光底物重复性、稳定性差，发光强度低，本底偏高，存在光氧化效应等问题，而这些问题一定程度上限制了化学发光免疫分析的实际应用。

发明内容

本发明基于以上问题及需求，提供一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、配置方法及其应用，本发明提供的化学发光底物液能够解决已有化学发光底物平台期短、稳定性较差，发光强度低，灵敏度低，本底偏高的问题。

根据本发明的第一方面，提供一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于，所述A液包括如下含量或浓度的组分：

0.5-1.5g/L鲁米诺(Luminol)，

0.5-2g/L对咪唑苯酚，

0.15-0.5g/L四苯基硼酸钠，

5-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

0.2-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.2-4g/L光稳定剂，

pH约7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

1-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.2-1g/L过氧化脲，

pH约7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

根据本发明所提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液，进一步优选地，所述A液包括组分的含量或浓度为：

0.6-1.5g/L鲁米诺，

1-2g/L对咪唑苯酚，

0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，

15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

1-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.2-4g/L光稳定剂，

pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括组分的含量或浓度为：

3-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3-1g/L过氧化脲，

pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

根据本发明进一步优选的实施方案中，所述A液包括组分的含量或浓度还可以为：

0.6-0.8g/L鲁米诺，

1-1.2g/L对咪唑苯酚，

0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，

15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

4-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.8-1.3g/L光稳定剂，

pH8.5-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液还可以包括如下含量或浓度的组分：

3-4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3-0.6g/L过氧化脲，

pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

在本发明所提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液中，所述的光稳定剂可优选受阻胺光稳定剂；当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值优选为8.5。

在本发明提供的化学发光底物液中，HRP催化作用的较佳pH是中性或弱酸性,而发明人发现，鲁米诺化学发光反应的量子产率在pH为10左右时较高,若在酶的最佳条件下测定,检测的灵敏度会降低；反之，在碱性条件下HRP活性降低,使得催化能力减弱甚至丧失。本发明的化学发光底物液的双组份混合后pH为8.5，是灵敏度和发光量子产率综合较高的酸碱环境。

本发明的化学发光底物液中的各个组分，可以在一个技术方案中组合使用，也可以在各个技术方案中分别选择或使用。

本发明另一方面还提供了以上所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述A液的配制：

(1)配置1L的pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；

(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.15-0.5g四苯基硼酸钠和0.2-8g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；

(3)分别称取0.5-1.5g鲁米诺，0.5-2g对咪唑苯酚，0.2-4g光稳定剂用5-30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；

(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分混匀；

(5)用步骤(1)的缓冲溶液将上述步骤(4)得到的液体定容至1L,混匀得发光底物的所述A液，在4℃避光保存；

所述B液的配制：

(6)配置1L，pH7.0-9.0的0.2mol/L或0.25mol/L的Tris缓冲液备用；

(7)量取900ml步骤(6)的Tris缓冲液，加入1-6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.2-1g过氧化脲，使其溶解；

(8)用步骤(6)的缓冲溶液将上述步骤(7)液体定容至1L，混匀，得发光底物的所述B液，在4℃度保存。

在上述方法中，所加入的所述光稳定剂为受阻胺光稳定剂；并且，当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值为8.5。

在发光底物液配制过程中，鲁米诺化学发光反应的量子产率在pH为10左右时最高,若在酶的最佳条件下测定,检测的灵敏度会降低；反之，在碱性条件下HRP活性降低,使得催化能力减弱甚至丧失。本发明的化学发光底物液的双组份混合后pH为8.5，是灵敏度和发光量子产率综合较高的酸碱环境。

此外，本发明还提供了所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液在化学发光免疫分析(CLIA)中的应用。

在本发明所提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液中，可以包含上述组分涉及的物质；此外，在本发明优选的技术方案中，所述HRP酶促化学发光底物液的A液组分仅由鲁米诺(Luminol)、对咪唑苯酚、四苯基硼酸钠、二甲基甲酰胺(DMF)、磺丁基-β-环糊精、光稳定剂以及Tris缓冲液组成；而所述HRP酶促化学发光底物液的B液组分仅由聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、过氧化脲以及Tris缓冲液组成。

如上所述，本发明针对化学发光免疫分析中的Luminol-过氧化脲-HRP反应体系，提供了双组份底物的化学发光底物液；针对用HRP催化Luminol-H₂O₂反应体系进行免疫分析测定时,由于大分子的空间位阻作用,发光强度及检测方法的灵敏度不高的问题，选用对咪唑苯酚(4-(咪唑-1-基)苯酚)和四苯基硼酸钠协同增强，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)助溶，以及磺丁基-β-环糊精、光稳定剂、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30三种物质协同作用提高发光底物的稳定性。

以下，将结合说明书附图及具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。本领域技术人员能够在说明书公开内容的基础上，针对各种合理的变换得到变化后的技术方案，只要不脱离本发明的精神，各种变化后的技术方案均包括在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1为本发明具体实施方案1-3制备得到的发光底物液与市售的进口双组份发光底物液在测定甲胎蛋白(AFP)实验中的发光强度的平台期(发光强度与发光时间)的对照图。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施方案对本发明进行详细的说明，应当理解，以下所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明的技术方案，并不用于对本发明的限定。

实施方案1

本发明实施方案1的HRP酶促化学发光底物液的组成为：

所述A液的组分为：

0.8g/L鲁米诺，

1.2g/L对咪唑苯酚，

0.2g/L四苯基硼酸钠，

15ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

1g/L磺丁基-β-环糊精，

1g/L光稳定剂，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B的组分为：

3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.4g/L过氧化脲，

pH7.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

实施方案1所述的发光底物液的配制可按下述工艺过程进行，包括如下步骤：所述A液的配制：(1)配置1L的pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.2g四苯基硼酸钠和1g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；(3)分别称取0.8g鲁米诺，1.2g对咪唑苯酚，1g光稳定剂用15ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分混匀；(5)用步骤(1)的缓冲溶液将上述步骤(4)得到的液体定容至1L,混匀得发光底物的所述A液，在4℃避光保存；

所述B液的配制：(6)配置1LpH7.0的0.2mol/L的Tris缓冲液备用；(7)量取900ml步骤(6)的Tris缓冲液，加入3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.4g过氧化脲，使其溶解；(8)用步骤(6)的缓冲溶液将上述步骤(7)液体定容至1L，混匀，得发光底物的所述B液，在4℃度保存。

保存上述得到的底物液，底物A液与底物B液分开储存于塑料瓶中，其中A液最佳要用避光条件保存。

实施方案1中的HRP酶促化学发光底物液，是本发明一种典型综合性能的发光底物组合物，其综合考虑了发光信号稳定(可达3小时)，储藏时间较长(储藏1-2年)，发光强度较高的特性。关于本实施方案的特性，还将在本说明书后文实施方案性能测试中予以更加详尽的阐述。

实施方案2

本发明实施方案2的HRP酶促化学发光底物液的组成为：

所述A液的组分为：

0.6g/L鲁米诺(Luminol)，

1g/L对咪唑苯酚，

0.4g/L四苯基硼酸钠，

30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

8g/L磺丁基-β-环糊精，

1.3g/L光稳定剂，

pH8.5的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B的组分为：

4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3g/L过氧化脲，

pH7.0的0.25mol/L的Tris缓冲液。

实施方案2所述的发光底物液的配制可按下述工艺过程进行，包括如下步骤：所述A液的配制：(1)配置1L的pH8.5的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.4g四苯基硼酸钠和8g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；(3)分别称取0.6g鲁米诺，1g对咪唑苯酚，1.3g光稳定剂用30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分混匀；(5)用步骤(1)的缓冲溶液将上述步骤(4)得到的液体定容至1L,混匀得发光底物的所述A液，在4℃避光保存；

所述B液的配制：(6)配置1LpH7.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(7)量取900ml步骤(6)的Tris缓冲液，加入4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.3g过氧化脲，使其溶解；(8)用步骤(6)的缓冲溶液将上述步骤(7)液体定容至1L，混匀，得发光底物的所述B液，在4℃度保存。

保存上述得到的底物液，底物A液与底物B液分开储存于塑料瓶中，其中A液最佳要用避光条件保存。

实施方案2中的HRP酶促化学发光底物液，是本发明提出的一种具有持久发光性能的发光底物组合物，其具有发光信号稳定时间(可达6小时)，储藏时间长(可达2年)的特性。关于本实施方案的特性，还将在本说明书后文实施方案性能测试中予以更加详尽的阐述。

实施方案3

本发明实施方案3的HRP酶促化学发光底物液的组成为：

所述A液的组分为：

0.8g/L鲁米诺(Luminol)，

1g/L对咪唑苯酚，

0.2g/L四苯基硼酸钠，

30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

4g/L磺丁基-β-环糊精，

0.8g/L光稳定剂，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液的组分为：：

3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.6g/L过氧化脲，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液。

实施方案3所述的发光底物液的配制可按下述工艺过程进行，包括如下步骤：所述A液的配制：(1)配置1L的pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.2g四苯基硼酸钠和4g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；(3)分别称取0.8g鲁米诺，1g对咪唑苯酚，0.8g光稳定剂用30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分混匀；(5)用步骤(1)的缓冲溶液将上述步骤(4)得到的液体定容至1L,混匀得发光底物的所述A液，在4℃避光保存；

所述B液的配制：(6)配置1LpH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(7)量取900ml步骤(6)的Tris缓冲液，加入3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.6g过氧化脲，使其溶解；(8)用步骤(6)的缓冲溶液将上述步骤(7)液体定容至1L，混匀，得发光底物的所述B液，在4℃度保存。

保存上述得到的底物液，底物A液与底物B液分开储存于塑料瓶中，其中A液最佳要用避光条件保存。

实施方案3中的HRP酶促化学发光底物液，是本发明提出的一种具有较高发光强度的发光底物组合物，其具有相对发光强度高的特性。关于本实施方案的特性，还将在本说明书后文实施方案性能测试中予以更加详尽的阐述。

以下，将对本发明具体实施方案提供的HRP酶促化学发光底物液的性能进行测试和评价，以能够更好地说明本发明化学发光底物液相比已有的商业市售发光组合物及其他现有化学发光底物液更优的性能。

测试与性能分析说明：本说明书中采用的与本发明上述实施方案对比的是市售的进口双组份发光底物液在测定甲胎蛋白(AFP)实验中的发光强度。发光检测仪采用的是联众泰克生产的UD1000化学发光检测仪。

测定本发明发光底物和/或对照市售商品发光底物的实验步骤为：校准品和酶标记物各50ul加入甲胎蛋白(AFP)抗体包被的微孔板中，37度反应30分钟后，用洗涤液洗5遍，在吸水纸上拍干，每孔加入事先混合好的底物100ul，室温避光30秒后，用化学发光检测仪检测每孔相对发光值。

一.本发明HRP酶促化学发光底物液的发光效果比对试验

首先，本发明对于制备得到的实施方案1-3的HRP酶促化学发光底物液针对不同浓度的校准品的发光强度进行测试，针对不同校准品浓度的测试的校准品浓度与发光强度的结果，将浓度-发光值数据进行线性拟合(Log(X)-Log(Y)，公式中的X表示待测物的浓度，Y表示相对发光值)，以测算出发光样品的拟合线性值R；所测试的不同校准品浓度及实施方案组合物的发光数值见表1。

在校准品的发光强度测试中，所使用的校准品是试剂盒中建立标准曲线的试剂，其本身含有被检分析物，一般由几个含有被检分析物的已知的不同浓度的试剂组成；例如本发明使用的甲胎蛋白校准品为6个含有甲胎蛋白抗原的不同浓度点组成的试剂(参见表1，其浓度由0变化至600ng/ml)。本发明实验中使用的甲胎蛋白校准品来源自天府新区华阳正龙生化制品研究室生产的甲胎蛋白(AFP)冻干粉(货号：B0101)。

表1不同校准品浓度与相对发光强度对照表

针对以上发光测试结果，对实施方案1的发光底物测定甲胎蛋白(AFP)浓度-发光值数据进行线性拟合的拟合方程：

log(Y)＝0.863166193*log(X)+3.802147099；相关系数R：0.9983；

实施方案2光底物测定甲胎蛋白(AFP)浓度-发光值数据进行线性拟合的拟合方程：

log(Y)＝0.885563454*log(X)+3.347053541；相关系数R：0.9942；

以上述本发明发实例3光底物测定甲胎蛋白(AFP)浓度-发光值数据进行线性拟合：

log(Y)＝0.879454981*log(X)+4.004661801；相关系数R：0.9980；

从以上校准品测试结果能够看出，在相同测试条件下，本发明实施方案1和实施方案3化学发光底物液发光强度远高于进口对照发光底物；并且发光底物液的国家标准要求拟合线性R不小于0.99，本发明发光底物液的发光线性拟合结果均符合国家标准的使用要求。

二.本发明实施方案发光底物的发光平台期测试

接下来，对本发明的HRP酶促化学发光底物液的相对发光强度与发光平台期时间进行了测试。所得测试数据参见下表。相应的曲线图参见图1。

表2：化学发光底物液的相对发光强度与发光平台期

参照表2的数据不难看出，本发明的化学发光底物液相比对照进口样品而言，具有更高的发光强度的同时，还具有较长的平台期。从图1中可以看出，本发明实施方案1和2的化学发光底物液的平台期明显好于对比例中的进口市售底物液(图1中最下侧的曲线)；而实施方案3的发光底物液取得了相对最高的发光强度，其发光平台期相比实施方案1和实施方案2的组合物有所缩短。

特别地，通过以上测试及数据分析，发明人发现本发明提供的化学发光底物液相比其他现有技术的底物液同样具有更优的发光性能。例如，文献2(CN1687751A)公开了一种高稳定性的增强化学发光底物液，但根据其对与产品的测试结果显示，文献2中的发光底物液需要在相当长的时间内才能达到底物液发光强度的最大值(参考文献2的附表，其底物液样品发光强度达到最大值的时间多在30分钟以上)；而本发明提供的化学发光底物液在相对很短的时间内(例如0.5分钟以内)即可达到最大的相对发光值，显然本发明的底物液对于测试的准确性和灵敏度等有更大提升。

在本发明的技术方案中，所具有的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，优选K-30)，作为大分子具有作为助溶剂或结晶生成阻止剂、缓释剂药物的可控释放可延长药物的作用时间的作用，因此可增加底物的平台期；同时将磺丁基-β-环糊精与聚乙烯吡咯烷酮共同配合使用，进一步提高了底物溶解度和发光稳定性。

三.化学发光底物液的热稳定性实验

热稳定性是化学发光底物液应用的重要性能和指标。本发明针对所制备的HRP酶促化学发光底物液及市售底物液商品的热稳定性进行了测试和评估。

进行稳定性试验时，将本发明的底物发光液分别放置于37℃，于1、3、7、14天时与4℃储存的发光底物液进行比较，比较二者相对发光值；具体实验时，将校准品稀释液和酶标记物各50ul加入AFP抗体包被的微孔板中，37度反应30分钟后，用洗涤液洗5遍，在吸水纸上拍干，平行孔各加入事先混合好4度与37度的底物100ul，室温避光30min，用化学发光检测仪检测每孔相对发光值。

表3：发光底物液37℃与4℃使用时的热稳定性比较

从以上的数据及测试结果能够看出，实施方案1和2在取得了较好的发光平台期及发光强度的同时，相比市售产品取得了优异的热稳定性性能，本发明的发光底物可在37度14天的考评下活性保留85％以上，由此可推算及证明本发明所述的底物可稳定保存长达2年。实施方案3的发光物底液集中于获得较高的发光强度，热稳定性平台期相比实施方案1和2有所降低，但在14天时仍然保持较高的发光强度水平。相比之下，进口试剂在37℃所进行的热稳定性实验，在七天时基本稳定活性保留83.3％，而14天时活性开始下降至66.8％，其发光强度也降低至较低水平。由此可见市售进口试剂基本可保证一年的有效期，达不到本发明发光物底液的两年。

四.化学发光底物液的灵敏度(即最低检测限)实验

本发明发光底物的灵敏度的测试方法，是以AFP甲胎蛋白为例做20个S0浓度(即表1中的校准品浓度为0时的浓度)，按照说明书中提到的反应步骤反应，最后检测出发光值。用20个S0的检测结果的平均值+3倍的标准差，得到的这个发光值分别带入各自的拟合曲线中计算出的浓度即为该化学发光底物液的灵敏度。测试20个底物样品中的S0发光值均值+3倍的标准差即计算得到的灵敏度，数据参见下表。

表4：不同实施方案的化学发光底物液的灵敏度实验数据

在以上的实验、计算与拟合中，实施方案1的平均值+3倍标准差的计算为：533.4+52.85×3＝691.95；实施方案2的平均值+3倍标准差的计算为：212.65+30.62×3＝304.5；实施方案3的平均值+3倍标准差:1275.85+86.92×3＝1537；进口样品对比例的平均值+3倍标准差:471.9+70.06×3＝682；在此基础上，再将平均值+3倍标准差的数值代入各自的线性拟合曲线得到灵敏度。

由以上灵敏度实验及计算可以看出，本发明提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液的测试灵敏度明显高于进口样品的0.3ng/ml左右的灵敏度，因而本发明的HRP酶促化学发光底物液可以对更微小浓度的待测样品产生有效的发光测试结果，灵敏度性能显著优于现有化学发光底物液。

此外，虽然现有技术中可能采用不同测试条件对发光底物液的性能进行检测和表征，然而通过间接的比较方法仍能体现本发明化学发光底物液的较高灵敏度水平。例如，注意到文献2(CN1687751A)中对于发光底物液进行了不同被测物浓度(5.3ng/ml与112ng/ml)在文献2的两组测试中，待测物浓度值差了21倍，而相应被测物的发光值仅提高了5倍左右。相比之下，本发明的发光底物液(参见表1)的3个实施方案在这两个浓度的发光值，相差了更大倍数的发光数值，可见本发明相比现有技术已有的发光物底物使浓度梯度达到更大的程度，因此灵敏度更高。

由以上本发明提供的HRP酶促化学发光底物液、制备过程及相关的实验及检测表明，在本发明提供的化学发光底物液，同时利用两种增敏剂的协同使用对咪唑苯酚、四苯基硼酸钠协同增强化学发光底物的性能；同时利用两种增敏剂的协同使用对咪唑苯酚、四苯基硼酸钠的不同比例带来的三个不同效果进行具体实施方案；此外，起到助溶和稳定作用的磺丁基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮(优选K-30)的协同使用，使底物的稳定性和溶解度显著得到提高；同时，进一步延长了发光的平台期，使检测的重复性大大提高，也延长了发光液的稳定性，可在分别4℃放置2年，保持其活性本发明还优选使用少量的受阻胺光稳定剂，可以抵御光氧化效应而产生的本底。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (10)

1.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：

所述A液包括如下含量或浓度的组分：

0.5-1.5g/L鲁米诺(Luminol)，

0.5-2g/L对咪唑苯酚，

0.15-0.5g/L四苯基硼酸钠，

5-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

0.2-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.2-4g/L光稳定剂，

pH约7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

1-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.2-1g/L过氧化脲，

pH约7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

2.如权利要求1所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，

所述A液包括组分的含量或浓度为：

0.6-1.5g/L鲁米诺，

1-2g/L对咪唑苯酚，

0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，

15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

1-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.2-4g/L光稳定剂，

pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括组分的含量或浓度为：

3-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3-1g/L过氧化脲，

pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

3.如权利要求1或2所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，所述A液包括组分的含量或浓度为：

0.6-0.8g/L鲁米诺，

1-1.2g/L对咪唑苯酚，

0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，

15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

4-8g/L磺丁基-β-环糊精，

0.8-1.3g/L光稳定剂，

pH8.5-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

3-4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3-0.6g/L过氧化脲，

pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

4.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：

所述A液包括如下含量或浓度的组分：

0.8g/L鲁米诺，

1.2g/L对咪唑苯酚，

0.2g/L四苯基硼酸钠，

15ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

4g/L磺丁基-β-环糊精，

1g/L光稳定剂，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.4g/L过氧化脲，

pH7.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

5.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：

所述A液包括如下含量或浓度的组分：

0.6g/L鲁米诺(Luminol)，

1g/L对咪唑苯酚，

0.4g/L四苯基硼酸钠，

30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

8g/L磺丁基-β-环糊精，

1.3g/L光稳定剂，

pH8.5的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.3g/L过氧化脲，

pH7.0的0.25mol/L的Tris缓冲液。

6.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：

所述A液包括如下含量或浓度的组分：

0.8g/L鲁米诺(Luminol)，

1g/L对咪唑苯酚，

0.2g/L四苯基硼酸钠，

30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，

4g/L磺丁基-β-环糊精，

0.8g/L光稳定剂，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；

所述B液包括如下含量或浓度的组分：

3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

0.6g/L过氧化脲，

pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液。

7.权利要求1-6之一所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，所述的光稳定剂为受阻胺光稳定剂；当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值为8.5。

8.一种制备如权利要求1-7中任一项所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述A液的配制：

(1)配置1L的pH约7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；

(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.15-0.5g四苯基硼酸钠和0.2-8g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；

(3)分别称取0.5-1.5g鲁米诺，0.5-2g对咪唑苯酚，0.2-4g光稳定剂用5-30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；

(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分混匀；

(5)用步骤(1)的缓冲溶液将上述步骤(4)得到的液体定容至1L,混匀得发光底物的所述A液，在4℃避光保存；

所述B液的配制：

(6)配置1L，pH约7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液备用；

(7)量取900ml步骤(6)的Tris缓冲液，加入1-6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.2-1g过氧化脲，使其溶解；

(8)用步骤(6)的缓冲溶液将上述步骤(7)液体定容至1L，混匀，得发光底物的所述B液，在4℃度保存。

9.权利要求8所述的方法，其中加入的所述光稳定剂为受阻胺光稳定剂；并且，当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值为8.5。

10.权利要求1-7中任一项所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液在化学发光免疫分析(CLIA)中的应用。