CN104619335A - 包含抗-pdgf适体和vegf拮抗剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防眼科疾病。

Description

包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年6月1日提交的美国临时申请号61/654,672和2013年3月12日提交的美国临时申请号61/778,208的权益，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
序列表
与本申请有关的序列表以替代纸件副本的文本形式提供，并且特此通过引用并入本说明书中。含有该序列表的文本文件的名称是OPHT_010_02WO_ST25.txt。该文本文件是约35KB，创建于2013年5月29日，并且经由EFS-Web电子地呈送。
技术领域
本发明涉及包含抗-血小板衍生的生长因子(抗-PDGF)适体和血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂的组合物。本发明也涉及用于抑制细胞的增殖过度或异常血管生成的方法，以及用于治疗或预防眼科疾病的方法，所述方法包括：施用包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物。此外，本发明涉及提供抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的延长递送的组合物和药物递送装置。
背景技术
多种眼障碍以下述病症为特征、由下述病症造成或导致下述病症：脉络膜、视网膜或虹膜新生血管形成或视网膜水肿。这些障碍包括黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、囊样黄斑水肿、寇茨病和眼或附件肿瘤，诸如脉络膜视网膜病变、视网膜色素上皮癌和眼内淋巴瘤。年龄相关的黄斑变性(AMD)是一种影响大约1/10的65岁以上美国人的疾病。一类AMD (“湿性AMD”，也被称作“新生血管性AMD”和“渗出性AMD”)仅占AMD病例的10％，但是导致90％的法定盲病例来自老年人黄斑变性。糖尿病性视网膜病变可以影响所有患有糖尿病的患者中的多达80％达10年或更久，并且是成年人失明的第三大主要原因，占美国失明的几乎7％USA。
在理解伴随或导致眼新生血管形成的分子事件(包括生长因子诸如血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的作用)方面，已经取得进展。已经证实，抑制这些生长因子的活性的治疗剂会给遭受眼血管障碍(诸如AMD和糖尿病性视网膜病变)的患者提供治疗益处，包括由合成寡核苷酸组成的适体。近年来，正在开发靶向PDGF或VEGF的治疗剂的联合应用。
在治疗多种以下述病症为特征、由下述病症造成或导致下述病症的眼障碍中，PDGF和VEGF的组合抑制可能导致更大的益处：脉络膜、视网膜或虹膜新生血管形成或视网膜水肿。通过两种药剂的同时共同施用，可以实现对每种生长因子特异性的各种药剂对PDGF和VEGF的组合抑制。
不幸的是，多肽治疗剂可能易于物理和化学降解。多肽治疗剂的稳定性可以被多种因素影响，包括多肽本身，例如，它的氨基酸序列。因而，包含多肽治疗剂的稳定药物组合物的开发提出了一个重大挑战。对于包含多肽治疗剂和另一种治疗剂(诸如多核苷酸治疗剂)的组合物的开发而言，该挑战甚至更大，因为它需要鉴别使2种具有可接受的相容性的不同治疗剂稳定的赋形剂和条件。
显然，本领域需要包含多种治疗剂的稳定组合物，包括包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的那些。
发明内容
本发明提供了组合物，其包含有效量的：(a)抗-PDGF适体或其药学上可接受的盐；和(b)VEGF拮抗剂或其药学上可接受的盐。包含有效量的(a)抗-PDGF适体或其药学上可接受的盐和(b)VEGF拮抗剂或其药学上可接受的盐的组合物是“本发明的组合物”。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含有效量的：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；(b)约0.5mg/mL至约20mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和(d)张度调节剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂是约1mM至约20mM L-组氨酸或约1mM至约20mM磷酸钠，且所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。在特定实施方案中，本发明的组合物进一步包含：(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含有效量的：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；和(b)约0.5mg/mL至约25mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和(d)张度调节剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂是约5mM至约200mM磷酸钠或约5mM至约200mM Tris.HCl，且所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。在特定实施方案中，本发明的组合物进一步包含：(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含有效量的：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；和以下的一种或多种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；(d)张度调节剂；和(e)0至约10％(w/v)蔗糖。在某些实施方案中，所述缓 冲剂是约5mM至约50mM磷酸盐，且所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl。在特定实施方案中，本发明的组合物进一步包含：(f)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含有效量的：(a)约3mg/mL至约90mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；(b)约1.0mg/mL至约30mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和(d)张度调节剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含约1mM至约100mM磷酸钠或约1.0mM至约10mM组氨酸.HCl，且所述张度调节剂是约0.5％(w/v)至约10％(w/v)海藻糖。
本发明进一步提供了用于治疗或预防眼科疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用本发明的组合物。
附图说明
图1显示了在37℃储存8周的本发明的选定组合物的AEX-HPLC色谱图。
图2显示了在37℃储存8周的本发明的选定组合物的WCX-HPLC色谱图。
图3显示了在37℃储存8周的本发明的选定组合物的SE-HPLC色谱图。
图4显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图5显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图6显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图7显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图8显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图9显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图10显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图11显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图12显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图13显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图14显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图15显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图16A和16B显示了在37℃储存的具有不同pH的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。图16A显示了在不同pH随时间变化的、包含5％山梨醇的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比，图16B显示了在不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比。
图17A和17B显示了在37℃储存的具有不同pH的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。图17A显示了在不同pH随时间变化的、包含5％山梨醇的组合物中的雷珠单抗的纯度百分比，图17B显示了在不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl的组合物中的雷珠单抗的纯度百分比。
图18显示了在37℃储存的具有不同pH的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图19A和19B显示了在37℃储存的本发明的具有不同pH的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。图19A显示了包含 5％山梨醇的组合物中的雷珠单抗的纯度百分比，图19B显示了包含130mM NaCl的组合物中的雷珠单抗的纯度百分比。
图20显示了在37℃储存的、在不同pH的、包含不同张度调节剂的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图21显示了在37℃储存的、在pH 8.0的、包含不同张度调节剂的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图22显示了在37℃储存的、在不同pH的、包含不同张度调节剂的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图23显示了在37℃储存的、在不同pH的、包含不同张度调节剂的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图24显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图25A和25B显示了在25℃(图25A)和37℃(图25B)储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图26A和26B显示了在25℃(图26A)和37℃(图26B)储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图27A、27B和27C显示了在37℃(图27A)、25℃(图27B)和4℃(图27C)储存8周的本发明的选定组合物的SE-HPLC色谱图。
图28显示了在4℃、25℃和37℃储存的组合物F6中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图29显示了在4℃、25℃和37℃储存的组合物F6中的雷珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图30显示了在4℃、25℃和37℃储存的组合物F6中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图31显示了在4℃、25℃和37℃储存的本发明的选定组合物中的雷珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图32显示了在37℃储存2周的本发明的选定组合物的AEX-HPLC色谱图。
图33显示了在25℃储存8周的本发明的选定组合物的WCX-HPLC色谱图。
图34显示了在37℃储存8周的本发明的选定组合物的SE-HPLC色谱图。
图35显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图36显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图37显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图38显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图39显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图40显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图41显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图42显示了在37℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图43显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图44显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图45显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图46显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图47显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图48显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图49显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图50显示了在25℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图51显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图52显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图53显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图54显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图55显示了在4℃储存的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图56显示了在37℃储存的、具有不同pH的、本发明的选定的含有山梨醇的组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图57显示了在37℃储存的、具有不同pH的、本发明的选定的含有山梨醇的组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图58显示了在37℃储存的、具有不同pH的、本发明的选定的含有山梨醇的组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图59显示了在37℃储存的、具有不同pH的、本发明的选定的含有山梨醇的组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图60A和60B显示了在37℃储存的具有不同pH的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。图60A显示了在不同pH随时间变化的、包含5％山梨醇的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比，图60B显示了在不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl或150mM NaCl的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比。
图61A和61B显示了在37℃储存的具有不同pH的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。图61A显示了包含5％山梨醇的组合物中的贝伐珠单抗的纯度百分比，图61B显示了在 不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl或150mM NaCl的组合物中的贝伐珠单抗的纯度百分比。
图62A和62B显示了在37℃储存的具有不同pH的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。图62A显示了包含5％山梨醇的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比，图62B显示了在不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl或150mM NaCl的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比。
图63A和63B显示了在37℃储存的具有不同pH的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。图63A显示了包含5％山梨醇的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比，图63B显示了在不同pH随时间变化的、包含130mM NaCl或150mM NaCl的组合物中的拮抗剂A的纯度百分比。
图64显示了在37℃储存8周的、包含不同浓度的拮抗剂A的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图65显示了在37℃储存8周的、包含不同浓度的拮抗剂A的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图66显示了在37℃储存的包含不同浓度的拮抗剂A的本发明的选定组合物中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图67显示了在37℃储存8周的、包含不同浓度的拮抗剂A的本发明的选定组合物中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图68显示了在不同储存温度的组合物F19中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图69显示了在不同储存温度的组合物F19中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图70显示了在不同储存温度的组合物F19中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图71显示了在不同储存温度的组合物F19中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图72显示了在不同储存温度，与组合物F25相比，组合物F19中的拮抗剂A稳定性的AEX-HPLC趋势图。
图73显示了在不同储存条件，与组合物F25相比，组合物F19中的拮抗剂A稳定性的SE-HPLC趋势图。
图74显示了在不同储存温度，与组合物F18相比，组合物F19中的贝伐珠单抗稳定性的WCX-HPLC趋势图。
图75显示了在不同储存条件，与组合物F18相比，组合物F19中的贝伐珠单抗稳定性的SE-HPLC趋势图。
图76显示的图描绘了本发明的不同组合物抑制VEGF诱导的TF表达。
图77显示的图描绘了本发明的不同组合物抑制PDGF诱导的BTG2表达。
图78显示了拮抗剂A的结构(图A-F)，其中命名指示前一图的继续。
图79A和79B显示的图描绘了在不同储存条件下组合物F27的减法微流成像(MFI)结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图79A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图79B提供了在跨10μm至100μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图80A和80B显示的图描绘了在不同储存条件下组合物F28的减法MFI结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图80A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图80B提供了在跨10μm至100μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图81A和81B显示的图描绘了在不同储存条件下组合物F29的减法MFI结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图81A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图81B提供了在跨10μm至100μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图82A和82B显示的图描绘了在不同储存条件下组合物F30的减法MFI结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图82A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图82B提供了在跨10μm至100μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图83A和83B显示的图描绘了在不同储存条件下组合物F31的减法MFI结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图83A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图83B提供了在跨10μm至100μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图84A和84B显示的图对比了组合物F27与F31在不同储存条件下的减法MFI结果。所述图提供了当在瓶或注射器中在5℃或30℃储存时，为列出的等同圆直径范围中的每一个确定的颗粒计数(颗粒数目/mL)。图84A提供了在跨1μm至100μm等同圆直径的不同范围内的颗粒计数，图84B提供了在跨10μm至75μm等同圆直径的选定范围内的颗粒计数。在图84A中，关于在瓶中在30℃储存的组合物F31得到的在<1μm至<2μm等同圆直径范围内的颗粒计数是217,404，其超过了在该图的y-轴中描绘的值，所以该值在对应条上方指示。在图84B中，关于在瓶中在30℃储存的组合物F31得到的在<10μm至<25μm等同圆直径范围内的颗粒计数是3,044，其超过了在该图的y-轴中描绘的值，所以该值在对应条上方指示。从上至下的图例对应于每个粒径范围从左至右的条。
图85显示的图描绘了用1.65nM PDGF-BB和指定浓度的拮抗剂A(F32)处理过的NIH 3T3细胞的相对BTG2基因表达。
图86显示的图描绘了用与阿柏西普组合的1.65nM PDGF-BB和指定浓度的拮抗剂A(F33)或单独拮抗剂A(F34)处理过的NIH 3T3细胞的相对BTG2基因表达。
具体实施方式
定义和缩写 
本文中使用的下述术语和短语应当具有本文中阐述的含义。
当与引用的数值指示结合使用时，术语“约”是指所述数值指示加或减该引用的数值指示的至多10％。例如，“约100”是指90-110。
术语“拮抗剂”表示部分地或完全地抑制靶分子的活性或产生的试剂。具体地，在本文中选择性地使用的术语“拮抗剂”是指能够降低靶分子的基因表达水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的试剂。拮抗剂的示例性形式包括，例如，蛋白、多肽、肽(诸如环肽)、抗体或抗体片段、肽模拟物、核酸分子、反义分子、核酶、适体、RNAi分子和小有机分子。拮抗剂抑制的示例性的非限制性机制包括：抑制配体合成和稳定性中的一种或两种(例如，使用靶向配体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断配体与它的同源受体的结合(例如，使用抗-配体适体、抗体、抗-受体抗体或或可溶性的诱饵同源受体或其片段)、抑制受体合成和稳定性中的一种或两种(例如，使用靶向配体受体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断受体与它的同源应答元件的结合(例如，使用抗-受体抗体)和阻断受体的同源配体对所述受体的活化(例如，使用受体酪氨酸激酶抑制剂)。另外，所述拮抗剂可以直接地或间接地抑制靶分子。
本文中使用的“抗体”包括完整抗体及其任意抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括含有特定分子的任意蛋白或肽，所述特定分子包含具有结合抗原的生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。其例子可以包含重链或轻链的互补性决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或其任意部分、或结合蛋白的至少一个部分。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
术语“抗体片段”包括作为抗原结合片段或其单链的抗体的一部 分。抗体片段可以是合成地或遗传地工程改造的多肽。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，(ii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区处的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341544-546，其由VH结构域组成，和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由单独的基因编码，它们可以使用重组方法通过合成接头连接到一起，所述合成接头使它们能够制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(被称作单链Fv(scFv),参见例如，Bird等人(1988)Science 242423-426,和Huston等人(1988)Proc Natl Acad Sci USA 855879-5883)。这样的单链抗体也意图被包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且可以筛选所述片段用于以与完整抗体相同的方式使用。
术语“适体”表示对靶标具有抑制作用的肽或核酸。适体对靶标的抑制可以如下发生：通过靶标的结合，通过催化地改变靶标，通过以修改靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应，通过离子地或共价地连接至靶标(象在自杀抑制剂中那样)，或通过促进靶标与其它分子之间的反应。适体可以是肽、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其它核酸或不同类型的核酸的混合物。适体可以包含一个或多个如本文中更详细地描述的经修饰的氨基酸、碱基、糖、聚乙二醇间隔物或磷酸酯主链单元。适体可以是聚乙二醇化的或未聚乙二醇化的。例如，一个或多个聚乙二醇链可以经由接头连接至核酸适体的5’末端。
“组合物”可以包含活性剂以及惰性的或有活性的载体。所述组合物可用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。在特定实施方案中，所述组合物是无菌的，基本上不含有内毒素，或在使用剂量或浓度对受体是无毒的。
术语“标记”包括、但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(例如，生物素或半抗原)等。荧光团标记的例子包括荧光素、罗丹明、丹磺酰基、伞形酮、德克萨斯红和鲁米诺。标记的其它例子包括NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。
术语“核酸”表示多核苷酸诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。该术语也包括从核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物，以及在适用于描述的实施方案时，单链(有义或反义)和双链多核苷酸、已表达序列标志(EST)、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。核酸包括修饰形式的核酸，其在结构上不同于基于标准结构单元(腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷)的天然存在的核酸结构。修饰可以是针对主链、糖或核苷碱基，并且可以是天然存在的或人工引入的。例如，可以在它们的主链内修饰核酸。本文中公开了示例性的修饰。核酸可以包括核酸适体和spiegelmer。
在某些实施方案中，拮抗剂A以修饰形式存在。拮抗剂A的修饰形式是包含呈如本文中所述的修饰形式的核苷酸的修饰形式，其中所述核苷酸以未修饰形式存在于拮抗剂A中。
术语“RNA干扰”、“RNAi”、“miRNA”和“siRNA”表示通过在靶细胞中引入一个或多个双链RNA而降低基因或基因产物的表达的任何方法，所述双链RNA与目标基因(特别是与目标基因例如，PDGF或VEGF的信使RNA)同源。
术语“新生血管形成”表示在异常组织中或在异常位置中的新血管形成。
术语“血管生成”表示在正常的或在异常的组织或位置中的新血管形成。
术语“眼科疾病”包括眼的疾病和眼附件的疾病。
术语“眼新生血管病症”表示以新生血管形成为特征的眼障碍。某些癌症是眼新生血管障碍。在一个实施方案中，所述眼新生血管病症是除了癌症以外的障碍。除了癌症以外的眼新生血管障碍的例子包括糖尿病性视网膜病变和年龄相关的黄斑变性。
术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物，例如，人、小鼠、大鼠、兔、猴、牛、猪、绵羊、马、狗和猫。
术语“蛋白”和“多肽”互换使用，并且以它们的最宽含义表示2个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽拟似物的化合物。所述亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚基可以通过其它键(例如，酯、醚等)连接。对于可以构成蛋白序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。
本文中使用的术语“氨基酸”表示天然的或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽拟似物。
术语“PDGF”表示调节细胞生长或分裂的血小板衍生的生长因子。本文中使用的术语“PDGF”包括PDGF的各种亚型，包括PDGF-B(例如，GenBank登记号X02811和CAA26579)、PDGF-A(GenBank登记号X06374和CAA29677)、PDGF-C(GenBank登记号NM 016205和NP057289)、PDGF-D、变体1和2(GenBank登记号NM 025208、NP 079484、NM 033135、NP 149126)，及其二聚化形式，包括PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD。血小板衍生的生长因子包括A-链(PDGF-A)和B-链(PDGF-B)的同源或异源二聚体，其通过结合2种有关的受体酪氨酸激酶血小板衍生的生长因子细胞表面受体(即，PDGFR)PDGFR-α(参见GenBank登记号NM 006206和NP 006197)和 PDGFR-β(参见GenBank登记号NM 002609和NP 002600)以及所述受体的二聚化而发挥它们的作用。关于PDGF序列，也参见，PCT申请公开号WO2010/127029，其整体并入本文中。另外，已经鉴别了PDGF-C和PDGF-D，即PDGFR复合物的2种额外蛋白酶活化的配体(Li等人,(2000)Nat.Cell.Biol.2:302-9；Bergsten等人,(2001)Nat.Cell.Biol.3:512-6；和Uutele等人,(2001)Circulation 103:2242-47)。由于PDGFR的不同配体结合特异性，已知的是，PDGFR-α/α结合PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-CC；PDGFR-β/β结合PDGF-BB和PDGF-DD；而PDGFR-α/β结合PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD(Betsholtz等人,(2001)BioEssavs 23:494-507)。本文中使用的术语“PDGF”也表示通过响应性细胞类型上的PDGFR的结合和活化而诱导DNA合成和有丝分裂发生的生长因子类别的那些成员。PDGF可以影响，例如：定向细胞迁移(趋化性)和细胞活化；磷脂酶活化；增加的磷脂酰肌醇周转和前列腺素代谢；响应性细胞对胶原和胶原酶合成的刺激；细胞代谢活性(包括基质合成、细胞因子生产和脂蛋白摄取)的改变；缺乏PDGF受体的细胞中的增生性应答的间接诱导；和有效的血管收缩活性。术语“PDGF”可以用于表示“PDGF”多肽、编码“PDGF”的基因或核酸、或其二聚化形式。术语“PDGF-A”表示PDGF的A链多肽或它的对应编码基因或核酸。术语“PDGF-B”表示PDGF的B链多肽或它的对应编码基因或核酸。术语“PDGF-C”表示PDGF的C链多肽或它的对应编码基因或核酸。术语“PDGF-D”表示PDGF的D链多肽或它的对应编码基因或核酸，包括PDGF的D链多肽的变体1和2。术语“PDGF-AA”表示具有2个PDGF-A链多肽的二聚体。术语“PDGF-AB”表示具有一个PDGF-A链多肽和一个PDGF-B链多肽的二聚体。术语“PDGF-BB”表示具有2个PDGF-B链多肽的二聚体。术语“PDGF-CC”表示具有2个PDGF-C链多肽的二聚体。术语“PDGF-DD”表示具有2个PDGF-D链多肽的二聚体。
术语“VEGF”表示诱导血管生成或血管生成过程的血管内皮生长因子。本文中使用的术语“VEGF”包括VEGF(也被称作血管渗透因子 (VPF)和VEGF-A)的不同亚型(参见GenBank登记号NM 003376和NP003367)，所述亚型例如通过VEGF-A/VPF基因的选择性剪接而产生，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。关于VEGF序列，也参见，PCT申请公开号WO2010/127029,其整体并入本文中。此外，本文中使用的术语“VEGF”包括VEGF相关的血管生成因子诸如PIGF(胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，其通过同源VEFG受体(即，VEGFR)起作用而诱导血管生成或血管生成过程。术语“VEGF”包括结合VEGF受体诸如VEGFR-I(FIt-I)(参见GenBank登记号AF063657和PCT申请公开号WO 2010/127029的SID NO:8)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)(参见GenBank登记号AF035121和AAB88005)或VEGFR-3(FLT-4)的生长因子类别中的任意成员。术语“VEGF”可以用于表示编码“VEGF”多肽或“VEGF”的基因或核酸。
术语“PDGF拮抗剂”通常表示部分地或完全地减少或抑制PDGF的活性或产生的试剂。PDGF拮抗剂可以直接地或间接地减少或抑制特定PDGF(诸如PDGF-B)的活性或产生。此外，“PDGF拮抗剂”与上面“拮抗剂”的定义相一致，包括这样的试剂：其作用于PDGF配体或它的同源受体，从而减少或抑制PDGF-相关的受体信号。“PDGF拮抗剂”的例子包括：靶向PDGF核酸的反义分子、核酶或RNAi；抗-PDGF适体、针对PDGF本身或它的受体的抗-PDGF抗体、或阻止PDGF与它的同源受体的结合的可溶性PDGF受体诱饵；靶向同源PDGF受体(PDGFR)核酸的反义分子、核酶或RNAi；结合同源PDGFR受体的抗-PDGFR适体或抗-PDGFR抗体；和PDGFR酪氨酸激酶抑制剂。
术语“VEGF拮抗剂”通常表示部分地或完全地减少或抑制VEGF的活性或产生的试剂。VEGF拮抗剂可以直接地或间接地减少或抑制特定VEGF(诸如VEGF165)的活性或产生。此外，“VEGF拮抗剂”与上面“拮抗剂”的定义相一致，包括这样的试剂：其作用于VEGF配体或它的同源受体，从而减少或抑制VEGF-相关的受体信号。“VEGF拮抗剂”的例子包括：靶向VEGF核酸的反义分子、核酶或RNAi；抗-VEGF 适体、针对VEGF本身或它的受体的抗-VEGF抗体、或阻止VEGF与它的同源受体的结合的可溶性VEGF受体诱饵；靶向同源VEGF受体(VEGFR)核酸的反义分子、核酶或RNAi；结合同源VEGFR受体的抗-VEGFR适体或抗-VEGFR抗体；和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。本文中使用的术语“VEGF拮抗剂”用于共同地表示雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普。
“药学上可接受的盐”包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐(lsomcotinate)、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、扑酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-l,4-二甲酸盐、己炔-l,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐(mcotinate)、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐(teraphthalate)、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-l,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐和酒石酸盐。术语“药学上可接受的盐”也表示具有酸性官能团(诸如羧酸官能团)的本发明的拮抗剂和碱的盐。合适的碱包括、但不限于碱金属(诸如钠、钾和锂)的氢氧化物，碱土金属(诸如钙和镁)的氢氧化物，其它金属(诸如铝和锌)的氢氧化物，氨，和有机胺，诸如未被取代的或羟基取代的单-、二-、或三-烷基胺，二环己胺，三丁基胺，吡啶，N-甲胺，N-乙胺，二乙胺，三乙胺，单-、二-、或三-(2-OH-低级烷基胺)，诸如单-、二-、或三-(2-羟基乙基)胺,2-羟基-叔丁 基胺，或三-(羟基甲基)甲基胺，N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，诸如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺，N-甲基-D-还原葡糖胺，和氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸等。术语“药学上可接受的盐”也包括本发明的化合物的水合物。
当与本发明的组合物或眼科疾病的治疗或预防结合使用时，术语“有效量”表示可用于治疗或预防眼科疾病的PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合量。“有效量”可以随施用模式、眼科疾病的特定部位、哺乳动物的年龄、体重和一般健康而变化。本发明的组合物的每种拮抗剂的有效量是可用于与所述组合物一起治疗或预防眼科疾病的每种拮抗剂的量，即使在没有VEGF拮抗剂存在下PDGF拮抗剂的量，或在没有PDGF拮抗剂存在下VEGF拮抗剂的量不可有效地治疗或预防眼科疾病。
多肽X的“变体”表示具有改变了一个或多个氨基酸残基的多肽X的氨基酸序列的多肽。所述变体可以具有“保守”变化，其中经置换的氨基酸具有类似的结构或化学性能(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。更罕见地，变体可以具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变异还可以包括氨基酸缺失或插入或二者。使用本领域众所周知的计算机程序，例如，LASERGENE软件(DNASTAR)，可以确定在不消除生物学或免疫学活性的情况下确定哪些氨基酸残基可以被置换、插入或删除的指导。
当在多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可以包括与基因、其编码序列、适体或其它多核苷酸序列的序列有关的多核苷酸序列。与参比基因、编码序列、适体或其它多核苷酸序列相比，所述变体可以包括一个或多个核苷酸或核苷置换、添加或插入。该定义也包括，例如，“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多晶型”变体。剪接变体可以与参比分子具有显著的同一性，但是通常由于mRNA加工过程中外显子的选择性剪接而具有更大或更少数目的多核苷酸。物种变体是在 一个物种与另一个物种之间变化的多核苷酸序列。多态变体是给定物种的个体之间的特定基因的多核苷酸序列的变化。
本文中使用的术语“赋形剂”通常表示常用作活性剂的稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，并且包括、但不限于蛋白(例如，血清白蛋白等)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如，磺酸烷酯、辛酸酯等)、表面活性剂(例如，SDS、聚山梨酯、非离子型表面活性剂等)、糖(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如，甘露醇、山梨醇等)。也参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Joseph P.Remington,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)和Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C.Rowe,第5版,APhA Publications,Washington,D.C.)，其特此整体并入。在某些实施方案中，所述赋形剂给所述组合物赋予有益的物理性质，诸如增加的蛋白、多核苷酸、适体或小分子稳定性，增加的蛋白、多核苷酸、适体或小分子可溶性，或降低的粘度。在某些实施方案中，所述组合物包含多个活性剂，并且所述赋形剂帮助稳定所述活性剂。
本文中使用的术语“缓冲剂”表示稳定药物制剂的pH的药学上可接受的赋形剂。合适的缓冲剂是本领域众所周知的。合适的药学上可接受的缓冲剂包括、但不限于乙酸盐-缓冲剂、组氨酸-缓冲剂、柠檬酸盐-缓冲剂、琥珀酸盐-缓冲剂、tris-缓冲剂和磷酸盐-缓冲剂。用于制备这样的缓冲剂的方法是本领域已知的。独立于使用的缓冲剂，可以用本领域已知的酸或碱(例如，琥珀酸、盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾)在约4.5至约7.0或可替换地约5.5至约6.5或可替换地约6.0的值调节pH。合适的缓冲剂包括、但不限于，组氨酸缓冲剂、2-吗啉代乙磺酸(MES)、二甲基胂酸盐、磷酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。磷酸盐缓冲剂的其它例子也包括、但不限于，磷酸钠缓冲剂和磷酸钾缓冲剂。可以如下制备磷酸钠缓冲剂：例如，通过将NaH2PO4(单碱基)的溶液与Na2HPO4(二碱基)的溶液组 合，然后用磷酸或氢氧化钠调节组合的溶液的pH以达到期望的pH。可以如下制备2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)缓冲剂：例如，通过用HCl调节Tris溶液的pH以达到期望的pH，例如，在约pH 7.0至约pH 9.0范围内的pH。L-组氨酸也可以用作根据本发明的缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂能够实现或维持本发明的组合物的pH在期望的范围内或在期望的pH处或附近，例如，在储存过程中，例如，在室温或4℃储存至少1周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少1年或至少2年的过程中。在某些实施方案中，所述缓冲剂的浓度是约0.01mM至约1000mM、约0.1mM至约1000mM、约0.1mM至约500mM、约0.1至约200mM、约0.1至约100mM、约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约1mM至约200mM、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约2mM至约60mM、约4mM至约60mM、或约4mM至约40mM、约5mM至约20mM、或约5mM至约25mM。
药学上可接受的“冷冻保护剂”是本领域已知的，并且包括、但不限于，例如，蔗糖、海藻糖和甘油。药学上可接受的冷冻保护剂会提供组合物或其中的一种或多种活性成分的稳定性保护，免于冷冻或低压冻干的作用。
本文中使用的术语“张度剂”或“张度调节剂”表示用于调节组合物的张度的药学上可接受的试剂。合适的张度剂包括、但不限于氯化钠、山梨醇、海藻糖、氯化钾、甘油和来自如本文中定义的氨基酸、糖的集合的任意组分、以及它们的组合。在某些实施方案中，可以以约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约5mM至约500mM、约10mM至约450mM、约20mM至约400mM、约50mM至约300mM、约100mM至约200mM、或约125mM至约175mM的量使用张度剂。在某些实施方案中，张度剂包含以约5mM至约500mM存在于组合物中的氨基酸。
术语“稳定剂”指示药学上可接受的赋形剂，其保护活性药物成分或试剂或组合物在制备、储存和施用过程中免于化学或物理降解。稳定剂包括、但不限于糖、氨基酸、多元醇、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、环糊精(例如羟丙基-β-环糊精、磺丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精)、聚乙二醇(例如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000)、白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA))、盐(例如氯化钠、氯化镁、氯化钙)和螯合剂(例如EDTA)。稳定剂可以以约0.1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约10至约300mM、或约100mM至约300mM的量存在于所述组合物中。
本文中使用的术语“表面活性剂”表示具有两亲结构的药学上可接受的有机物质；即，它由相反可溶性趋势的基团(通常是油溶性的烃链和水溶性的离子基团)组成。根据表面活性部分的电荷，可以将表面活性剂分类成阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂。表面活性剂可以用作药物组合物和生物材料制品的润湿剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。在本文描述的组合物的某些实施方案中，将表面活性剂的量描述为以重量/体积百分比(w/v％)表示的百分比。合适的药学上可接受的表面活性剂包括、但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)的集合、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆,Pluronic)或十二烷基硫酸钠(SDS)。聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯包括聚山梨酯20,(在商标吐温20TM下销售)和聚山梨酯80(在商标吐温80TM下销售)。聚乙烯-聚丙烯共聚物包括在名称或泊洛沙姆188TM下销售的那些。聚氧乙烯烷基醚包括在商标BrijTM下销售的那些。烷基苯酚聚氧乙烯醚包括在商业名称Triton-X下销售的那些。聚山梨酯20(吐温20TM)和聚山梨酯80(吐温80TM)通常以组合物的总体积的约0.001％w/v至约1％w/v、或约0.002％w/v至约0.1％w/v(或可替换地约0.003％w/v至约0.007％w/v)的浓度范围使用。在某些实施方案中，以约0.003％w/v、约0.004％w/v、约0.0045％w/v、约0.005％w/v、约0.0055％w/v、约0.006％w/v或约0.007％w/v使用吐温80TM。在某些实施方案中，以约0.005％w/v使用 吐温80TM。在该方面，“w/v”是指表面活性剂的重量/组合物的总体积。
“冷冻保护剂”表示在低压冻干过程中稳定蛋白、核酸或其它活性药物成分或试剂的药学上可接受的物质。冷冻保护剂的例子包括、但不限于蔗糖、海藻糖或甘露醇。
“多元醇”表示含有多个羟基的醇或糖醇。糖醇是碳水化合物的氢化形式，其羰基(醛或酮，还原糖)已经被还原为伯或仲羟基(因此是醇)。糖醇具有通式H(HCHO)n+1H，而糖具有H(HCHO)nHCO。
“抗氧化剂”表示能够减慢或阻止其它分子的氧化的分子。抗氧化剂经常是还原剂、螯合剂和氧清除剂诸如硫醇、抗坏血酸或多酚。抗氧化剂的非限制性例子包括抗坏血酸(AA、E300)、硫代硫酸盐、甲硫氨酸、生育酚(E306)、没食子酸丙酯(PG、E310)、叔丁基氢醌(TBHQ)、丁羟茴香醚(BHA、E320)和丁羟甲苯(BHT、E321)。
“防腐剂”是加入产品(诸如食品、药物组合物、油漆、生物样品、木材等)中以防止通过微生物生长或通过不希望的化学变化而引起的分解的天然或合成化学试剂。防腐剂添加剂可以单独使用，或与其它防腐方法结合使用。防腐剂可以是抗微生物防腐剂(其抑制细菌和真菌的生长)或抗氧化剂(诸如氧吸收剂，其抑制组分的氧化)。抗微生物防腐剂的例子包括苯扎氯铵、苯甲酸、氯己啶(cholorohexidine)、甘油、苯酚、山梨酸钾、硫柳汞、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和EDTA二钠。其它防腐剂包括在胃肠内蛋白组合物中常用的那些，诸如苯甲醇、苯酚、间甲酚、三氯叔丁醇或对羟基苯甲酸甲酯。
本发明提供了包含至少一种抗-PDGF适体和至少一种VEGF拮抗剂的组合物、以及其制备和使用的有关方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含有效量的：(a)抗-PDGF适体或其药学上可接受的盐；和(b)VEGF拮抗剂或其药学上可接受的盐。在特定实施方案中，当将所述组合物在约2.0℃至约8.0℃的温度储存至少约12周时，抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂中的一种或两种的至少约90％是化学上稳定的。
在本发明的不同组合物和方法的特定实施方案中，抗-PDGF适体是拮抗剂A或其修饰形式。在本发明的不同组合物和方法的特定实施方案中，所述VEGF拮抗剂是雷珠单抗、贝伐珠单抗或阿柏西普或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防眼科疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用本发明的组合物。以有效地治疗或预防眼科疾病的量施用所述组合物。在不同的实施方案中，所述眼科疾病是年龄相关的黄斑变性、多息肉状脉络膜血管病、与脉络膜新生血管形成有关的病症、高血压性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、镰刀状细胞视网膜病变、与周围视网膜新生血管形成有关的病症、早产儿视网膜病变、静脉闭塞性疾病、动脉闭塞性疾病、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、囊样黄斑水肿、视网膜毛细管扩张、动脉大动脉瘤、视网膜血管瘤病、辐射诱导的视网膜病变、虹膜发红或肿瘤。在特定实施方案中，所述眼科疾病是年龄相关的黄斑变性，并且所述年龄相关的黄斑变性是湿性年龄相关的黄斑变性或干性年龄相关的黄斑变性。在某些实施方案中，所述组合物存在于药物递送装置中。在某些实施方案中，眼内地施用所述组合物。在具体实施方案中，所述眼内施用是玻璃体内施用或前房施用。在其它实施方案中，所述哺乳动物上人。
PDGF适体和VEGF拮抗剂
本发明提供了包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物，包括药物组合物。在特定实施方案中，所述抗-PDGF适体是拮抗剂A或其 修饰形式(或其药学上可接受的盐)，所述VEGF拮抗剂是雷珠单抗、贝伐珠单抗或阿柏西普(或其药学上可接受的盐)。本发明进一步提供了包含有效量的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物。
抗-PDGF适体
在某些实施方案中，抗-PDGF适体包括、但不限于在美国专利号8,039,443(其通过引用整体并入本文)中描述的那些，其包括PDGF-特异性的和PDGF-VEGF-特异性的适体。
抗-PDGF适体的例子包括这样的适体：其寡核苷酸序列包含下述序列之一、基本上由其组成或由其组成：
ARC126:5'-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3'[SEQ ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3'[SEQ ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3'[SEQ ID NO:3])-3'，其中“HEG”＝六乙二醇间隔物，“m”指示2'-甲氧基取代的核苷酸，“f”指示2'氟取代的核苷酸，“d”指示脱氧核苷酸，且“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸；
ARC127:5'-[40K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3'[SEQ ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3'[SEQ ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3'[SEQ ID NO:3])-3'，其中“HEG”＝六乙二醇间隔物，“m”指示2'-甲氧基取代的核苷酸，“f”指示2'氟取代的核苷酸，“d”指示脱氧核苷酸，且“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸；
ARC240:5'-[20K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3'[SEQ ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3'[SEQ ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3'[SEQ ID NO:3])-3'，其中“HEG”＝六乙二醇间隔物，“m”指示2'-甲氧基取代的核苷酸，“f”指示2'氟取代的核苷酸，“d”指示脱氧核苷酸，且“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷 酸；
ARC308:5'-[30K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3'[SEQ ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3[SEQ ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3'[SEQ ID NO:3])-3'，其中“HEG”＝六乙二醇间隔物，“m”指示2'-甲氧基取代的核苷酸，“f”指示2'氟取代的核苷酸，“d”指示脱氧核苷酸，且“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸；
脱氧ARC126:5'-dCdAdGdGdCdTdAdCdGdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T]-3'(SEQ ID NO:75)，其中“d”指示未修饰的脱氧核苷酸，且“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸；因而，所述寡核苷酸具有2个5'末端，并且因而耐受作用于3'羟基末端上的核酸酶；和
ARC124:5'-CACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTG[3T]-3’(SEQ ID NO:6)，其中“[3T]”表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸。
结合PDGF-VEGF的多价适体的例子包括PDGF-B-VEGF适体嵌合体TK.131.12.A和TK.131.12.B，其允许同时靶向PDGF-B和VEGF。这些适体嵌合体描述在PCT专利申请公开号WO2006/050498和WO2004/094614中。
TK.131.012.A的序列是：5'dCdAdGdGdCdTdAdCdGmAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmUdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG[3T]-3'(SEQ ID NO:4)，其中“m”指示2'-OMe核苷酸，且“d”和“[3T]”如上面所定义；
并且TK.131.012.B的序列是： 5'dCdAdGdGdCdTdAdCdGmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T](SEQ ID NO:5)其中“m”、“d”和“[3T]”如上面所定义。
在特定实施方案中，抗-PDGF适体结合PDGF。在特定实施方案中，抗-PDGF适体结合PDGF-A或PDGF-B。抗-PDGF适体的例子包括长度为31-35个核苷酸的一系列核酸适体(美国专利号8,039,443的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:74)，其在体外特异性地结合PDGF-B蛋白，并且其在体内和基于细胞的测定中在功能上阻断PDGF-BB的活性。在特定实施方案中，所述抗-PDGF-B适体源自母体分子ARC126、5'-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3'[SEQ ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3'[SEQ ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3'[SEQ ID NO:3])-3'，其含有7个单独的含有2'F的残基，且其中HEG＝六乙二醇间隔物，且[3T]表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸。含有2'F的残基可以通过阻断血清内切核酸酶或外切核酸酶对它的降解而增加适体的体外血清和体内稳定性。在特定实施方案中，所述抗-PDGF适体是完全不含2’F的适体，其保留有效的体外结合和抗增生活性并且含有天然存在的2'脱氧或2'OMe取代的核苷酸。另外，在特定实施方案中，这些适体保留实质的血清稳定性，如在体外稳定性测定中通过对核酸酶降解的抗性所确定的。
在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体是拮抗剂A或其药学上可接受的盐。拮抗剂A的化学名称是[(单甲氧基20K聚乙二醇氨甲酰基-N2-)(单甲氧基20K聚乙二醇氨甲酰基-N6-)]-赖氨酸-酰氨基-6-己烷二基-(1-5')-2'-脱氧胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-氟 尿苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-氟胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-甲氧基鸟苷酰基-(3'-l)-PO3-六(乙氧基)-(18-5')-2'-脱氧胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'-5')-胸苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-甲氧基鸟苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-甲氧基鸟苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-2’-脱氧-2'-氟尿苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-氟胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-甲氧基腺苷酰基-(3'-l)-PO3-六(乙氧基)-(18-5')-胸苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧腺苷酰基-(3'-5')-胸苷酰基-(3'-5')-2’-脱氧-2'-氟胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-氟胞苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2'-氟尿苷酰基-(3'-5')-2'-脱氧-2’-甲氧基鸟苷酰基-(3'-3')-胸苷。
拮抗剂A的结构显示在图78A-F中，并且它也描述在PCT申请公开号WO 2010/127029(其整体并入本文中)的图7中。
拮抗剂A的序列是： 
5'-[mPEG240kD]-[HN-(CH2)6O]CAGGCUfACfGm(SEQ ID NO:1)[PO3(CH2CH2O)6]CGTAGmAGmCAUfCfAm(SEQ ID NO:2)[PO3(CH2CH2O)6]TGATCfCfUfGm[3T](SEQ ID NO:3)-3'，其中[3T]表示在核糖糖的3’位置处连接至寡核苷酸的3’末端的反转胸苷核苷酸，且[mPEG240kD]代表2个20kD聚乙二醇(PEG)聚合物链，在一个实施方案中，2个约20kD PEG聚合物链，所述链经由氨基甲酸酯键共价地连接至赖氨酸残基的2个氨基。该部分又经由下述的氨基接头与寡核苷酸连接。
[HN-(CH2)6O]代表双功能的α-羟基-ω-氨基接头，其经由酰胺键共价地连接至PEG聚合物。所述接头通过磷酸二酯键在拮抗剂A的5'-末端处连接至寡核苷酸。
[PO3(CH2CH2O)6]代表经由磷酸二酯键连接寡核苷酸区段的六乙二醇(HEX)部分。拮抗剂A具有2个HEX键，它们经由接头和各个核 苷酸之间的磷酸二酯键将第9个和第10个核苷酸以及第21个和第22个核苷酸连接在一起。
C、A、G和T分别代表胞嘧啶、腺苷、鸟苷和胸苷核酸的2'-脱氧衍生物的单字母代码。拮抗剂A具有4个2’-脱氧核糖胞嘧啶、6个2’-脱氧核糖腺苷、4个2'-脱氧核糖鸟苷和4个2’-脱氧核糖胸苷。
Gm和Am分别代表鸟苷和腺苷的2’-甲氧基取代的形式。拮抗剂A具有4个2'-甲氧基鸟苷和一个2'-甲氧基腺苷。Cf和Uf分别代表胞嘧啶和尿苷的2'-氟取代的形式。拮抗剂A具有4个2'-氟胞嘧啶和3个2'-氟尿苷。
除了3'-端以外，寡核苷酸的磷酸二酯键用标准的核苷或核苷酸磷酸二酯键连接核糖环的5'-氧和3'-氧。3'-端胸苷和倒数第二个Gm之间的磷酸二酯键连接它们各自的3'-氧，其被称作3',3'-帽。
就整个分子(包括核酸、氨基接头和聚乙二醇部分)而言，拮抗剂A具有约40,000至约60,000道尔顿的分子量，在一个实施方案中，具有40,000-60,000道尔顿的分子量，并且在溶液中可以是无色至浅黄色。在某些实施方案中，拮抗剂A可以存在于磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠七水合物(作为缓冲剂)和氯化钠(作为张度调节剂)的溶液中。拮抗剂A是亲水聚合物。如通过目检所评估的，拮抗剂A钠盐可溶于水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，达到至少约50mg(基于寡核苷酸重量)/mL溶液。
在一个实施方案中，如下制备拮抗剂A：使用反复化学合成规程来生产寡核苷酸部分和氨基接头，然后将其与聚乙二醇化试剂共价地键合，如在实施例5中所述和如在PCT申请公开号WO 2010/127029(其特此通过引用整体并入)的实施例4中所述。
拮抗剂A可以具有足够碱性的官能团，其可以与许多无机酸和有机酸中的任一种反应以形成药学上可接受的盐。如本领域众所周知的，药学上可接受的酸加成盐由药学上可接受的酸形成。这样的盐包括本文描述的那些和在以下文献中列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts,Properties,Selection,and Use,P H Stahl和C G Wermuth(编),Verlag,Zurich(瑞士)2002，其特此通过引用整体并入。
在其它实施方案中，所述抗-PDGF适体是适体(诸如拮抗剂A)的修饰形式，或本文描述的另一种适体，其可以包括本文描述的一种或多种修饰。尽管具体地关于拮抗剂A进行了讨论，应当理解，本文描述的任意修饰可以以本文描述的任意其它抗-PDGF适体的修饰形式存在，它们中的每一种可以用在本发明中。在特定实施方案中，适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)包含与适体相同的核苷酸序列和核酸或者由与适体相同的核苷酸序列和核酸组成，但是包含一个或多个与适体不同的聚乙二醇聚合物链，或包含一个或多个不同的接头，所述接头将一个或多个聚乙二醇聚合物链连接至适体的核酸部分。
在某些实施方案中，与适体相比，适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)可以具有化学修饰的核苷酸，包括嘧啶碱基中的5-X或2'-Y置换以及嘌呤碱基中的8-X或2'-Y置换。2'-修饰，诸如2'-氟和2'-O-Me，可以用于稳定核酸酶，而不损害适体与靶标的结合相互作用。参见，例如，Lin等人,Nucleic Acids Res.,22,5229-5234(1994)；Jellinek等人,Biochemistry,34,11363-1137(1995)；Lin等人,Nucleic Acids Res.,22,5229-5234(1994)；Kubik等人,J.Immunol.,159(1),259-267(1997)；Pagratis等人,Nat.Biotechnol.,1,68-73(1997)；和Wilson等人,Curr Opin Chem Biol,10(6),607-614(2006)。在某些实施方案中，所述化学置换可以是糖位置处的化学置换、碱基位置处的化学置换、或磷酸酯位置处的化学置换。
可以存在于修饰形式的适体(例如，拮抗剂A)中的修饰包括、但不限于，提供其它化学基团的那些修饰，所述其它化学基团将额外电荷、可极化性、疏水性、氢键合、静电相互作用或流动性(fluxionality)并入并入适体基质或适体整体。这样的修饰包括、但不限于2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、硫代磷酸酯或磷酸烷酯修饰、甲基化、罕见碱基配对组合诸如异碱基、异胞苷和异胍等。修饰还可以包括3'和5'修饰，诸如如用糖部分加帽或修饰。在本发明的某些实施方案中，适体的修饰形式，例如，拮抗剂A的修饰形式，是在嘧啶残基的糖部分上2′-氟(2′-F)修饰的RNA分子。可以存在于适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)以及根据本发明可以使用的稳定化的适体中的修饰的例子，描述在美国专利号8,039,443中，其特此通过引用整体并入。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体是抗-PDGF-B适体，包括、但不限于在美国专利号8,039,443中描述的那些。
在某些实施方案中，通过这样的修饰的引入，以及通过沿着RNA的磷酸酯主链的修饰和置换，可以增加所述适体的稳定性，所述修饰和置换也可以存在于适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)中。另外，可以对核苷碱基本身做出多种修饰，所述修饰抑制降解并且可以增加期望的核苷酸相互作用或减小不希望的核苷酸相互作用。因此，一旦已知适体的序列，通过下述的合成规程或通过本领域技术人员已知的规程，可以进行修饰或置换。任何这样的修饰可以存在于拮抗剂A的修饰形式中。
可以存在于适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)中的其它修饰包括经修饰的碱基(或经修饰的核苷或经修饰的核苷酸)的掺入，所述经修饰的碱基是在核糖核酸(即，A、C、G和U)和脱氧核糖核酸(即，A、C、G和T)中存在的标准碱基、糖或磷酸酯主链化学结构的变体。在该范围内包括，例如：Gm(2'-甲氧基鸟苷酸)、Am(2'-甲氧 基腺苷酸)、Cf(2'-氟胞苷酸)、Uf(2'-氟尿苷酸)、Ar(核糖腺苷酸)。拮抗剂A的修饰形式可以包括胞嘧啶或任意胞嘧啶相关的碱基，包括5-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶(例如，5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶和5-碘胞嘧啶)、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、N4、N4-桥亚乙基胞嘧啶、吩噁嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、咔唑胞苷或吡啶并吲哚胞苷。拮抗剂A的修饰形式可以包括鸟嘌呤或任意鸟嘌呤相关的碱基，包括6-甲基鸟嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、6-丙基鸟嘌呤、8-卤代鸟嘌呤(例如，8-氟鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤和8-碘鸟嘌呤)、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤或3-脱氮鸟嘌呤。适体的修饰形式(例如，拮抗剂A的修饰形式)可以包括腺嘌呤或任意腺嘌呤相关的碱基，包括6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、8-卤代腺嘌呤(例如，8-氟腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-氯腺嘌呤和8-碘腺嘌呤)、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-卤代腺嘌呤(例如，2-氟腺嘌呤、2-溴腺嘌呤、2-氯腺嘌呤和2-碘腺嘌呤)、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或3-脱氮腺嘌呤。也包括尿嘧啶或任意尿嘧啶相关的碱基，包括5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶)、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-偶氮尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。
本领域已知的其它经修饰的碱基变体(其可以存在于适体的修饰 形式中，例如，拮抗剂A的修饰形式中)的例子包括、但不限于，4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2'-甲氧基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、b-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、b-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-b-D-核糖呋喃糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-b-D-核糖呋喃糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿苷、Q核苷、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-b-D-核糖呋喃糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷(wybutosine)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷。
本领域已知的经修饰的核苷和核苷酸糖主链变体的例子包括、但不限于，具有以下取代基的那些：例如，2’-核糖基取代基诸如F、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、OCH2OCH2N(CH3)2、O(Cl-10烷基)、O(C2-10烯基)、O(C2-10炔基)、S(Cl-10烷基)、S(C2-10烯基)、S(C2-10炔基)、NH(C1-10烷基)、NH(C2-10烯基)、NH(C2-10炔基)和O-烷基-O-烷基。合乎需要的2'核糖基取代基包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH2-CH＝CH2)、2'-氨基(2'-NH2)和2'-氟(2'-F)。2'-取代基可以是在阿糖基(上游)位置或核糖基(下游)位置。这些可以存在于拮抗剂A的修饰形式中。
修饰的例子包括：嘌呤对嘧啶的置换；2'-脱氧二氢尿苷对尿苷的置换；2'-脱氧-5-甲基胞苷对胞苷的置换；2-氨基嘌呤对嘌呤的置换； 硫代磷酸酯对磷酸二酯的置换；二硫代磷酸酯对磷酸二酯的置换；脱氧核苷酸对2'-OH核苷酸的置换；2'-OMe核苷酸、2'-氟核苷酸或2'-O-甲氧基乙基核苷酸对2'-OH或脱氧核苷酸的置换；PEG或PAG聚合物的添加；大立体分子的添加；3'帽的添加；或已知会阻断核酸酶降解的任意其它修饰。参见，例如，美国专利公开号20090075342，其通过引用整体并入。
适体的修饰形式，例如，拮抗剂A的修饰形式，可以由核苷酸或核苷酸类似物(诸如本文描述的那些)或二者的组合构成，或者是寡核苷酸类似物。适体的修饰形式，例如，拮抗剂A的修饰形式，可以在不会影响寡聚体的功能(例如，结合PDGF)的位置处含有核苷酸类似物。
本文描述的抗-PDGF适体可以与一个或多个非生理学活性基团诸如亲脂化合物(例如，胆固醇)连接；与一个或多个非免疫原性的高分子量化合物(例如，聚亚烷基二醇)连接；或连接至或包囊在含有亲脂组分的复合物(例如，脂质体)中。在一个实施方案中，所述连接的适体会增强细胞对适体的细胞摄取，从而将适体递送至细胞内靶标。美国专利号6,011,020(通过引用整体并入本文)描述了一种用于制备适体的方法，所述适体与一种或多种亲脂化合物或非免疫原性的高分子量化合物连接。
如美国专利号6,011,020所述，在诊断或治疗复合物中，本文描述的抗-PDGF适体可以经由接头连接至一个或多个非生理学活性基团，诸如亲脂的或非免疫原性的高分子量化合物。在美国专利号5,859,228中描述了在诊断或治疗复合物中经由接头与亲脂化合物(诸如二酰基甘油或二烷基甘油)连接的适体。在美国专利号6,051,698中进一步描述了经由接头与亲脂化合物(诸如甘油脂质)或与非免疫原性的高分子量化合物(诸如聚亚烷基二醇)连接的适体。在1997年10月17日提交的标题为“Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)Nucleic Acid  Ligand Complexes”的PCT/US97/18944中，也进一步描述了经由接头与非免疫原性的高分子量化合物或与亲脂化合物连接的适体。本文描述的专利和专利申请中的每一篇特别地通过引用整体并入本文。
一种或多种适体，例如，拮抗剂A，可以经由接头连接至非免疫原性的高分子量化合物或亲脂化合物。非免疫原性的高分子量化合物可以是具有约100Da至1,000,000Da、约1000Da至500,000Da、或约1000Da至200,000Da的分子量的直链或支链化合物，其通常不会产生免疫原性应答。在一个实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物可以是聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物包含聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物包含多个聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物包含2个聚亚烷基二醇。在另一个实施方案中，所述聚亚烷基二醇可以是聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，所述PEG具有约10至约80kDa的分子量，或约20至约45kDa的分子量。在某些实施方案中，所述多个PEG具有约10至约80kDa的组合分子量或约20至约45kDa的分子量。在其它实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物包含2个聚亚烷基二醇，它们中的每一个具有约20kDa的分子量。
适体(例如，拮抗剂A)可以经由接头连接至一种或多种亲脂化合物。亲脂化合物是这样的化合物：其具有与脂质或其它具有低介电常数的材料或相结合或分配在其中的倾向，包括主要基于亲脂组分的化合物。亲脂化合物包括含有脂质以及非脂质的化合物，其具有与脂质(或其它具有低介电常数的材料或相)结合的倾向。胆固醇、磷脂和甘油脂质，诸如二烷基甘油、二酰基甘油和甘油酰胺脂质，是亲脂化合物的其它例子。在一个实施方案中，所述亲脂化合物是甘油脂质。
非免疫原性的高分子量化合物或亲脂化合物可以经由接头共价地结合至适体上的多种位置，诸如结合至核苷酸的碱基上的环外氨基、 嘧啶核苷酸的5-位、嘌呤核苷酸的8-位、核苷酸的磷酸酯的羟基、或在适体的5'或3'末端处的羟基或其它基团。在某些其中亲脂化合物为甘油脂质或非免疫原性的高分子量化合物为聚亚烷基二醇或聚乙二醇的实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物可以经由接头键合至其磷酸酯基团的5'或3'羟基。在一个实施方案中，所述亲脂化合物或非免疫原性的高分子量化合物经由接头键合至适体的5'磷酸酯基团。非免疫原性的高分子量化合物或亲脂化合物与适体的连接可以直接地进行，或利用一个或多个接头进行，所述接头插入在适体和亲脂化合物或非免疫原性的高分子量化合物之间。在某些实施方案中，当直接进行连接时，不存在接头。
接头是通过共价键或非共价相互作用连接2个或更多个分子实体的分子实体，并且可以允许以保留一个或多个分子实体的功能性能的方式实现分子实体的空间分离。
在本发明的一个实施方案中，所述非免疫原性的高分子量化合物是聚亚烷基二醇，且具有结构R(O(CH2)x)nO-，其中R独立地是H或CH3，x＝2-5，且n近似为聚亚烷基二醇的分子量/(16+14x)。在本发明的一个实施方案中，所述聚亚烷基二醇的分子量是约10-80kDa。在另一个实施方案中，所述聚亚烷基二醇的分子量是约20-45kDa。在另一个实施方案中，x＝2，且n＝9X102。可以存在一个或多个经由接头与相同适体连接的聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，多个聚亚烷基二醇经由接头与相同适体连接。在另一个实施方案中，2个聚亚烷基二醇经由接头与相同适体连接。在另一个实施方案中，聚亚烷基二醇是具有约40kDa的分子量的聚乙二醇。
在一个实施方案中，抗-PDGF适体经由接头连接至非免疫原性的高分子量化合物诸如聚亚烷基二醇或PEG，或连接至多个非免疫原性的高分子量化合物。在该实施方案中，连接的PDGF适体的药代动力学性能与单独的抗-PDGF适体相比得到改善。聚亚烷基二醇或PEG可 以经由接头与PDGF适体上的多种位置共价地结合。在其中使用聚亚烷基二醇或PEG的实施方案中，抗-PDGF适体可以经由接头通过5'羟基经由磷酸二酯键进行键合。
在某些实施方案中，多个适体可以与单一非免疫原性的高分子量化合物(诸如聚亚烷基二醇或PEG)或亲脂化合物(诸如甘油脂)结合。所述适体可以都是针对一种靶标或针对不同靶标。在其中化合物包含超过一种抗-PDGF适体的实施方案中，由于与靶标PDGF的多重结合相互作用，可以存在亲合力的增加。在其它实施方案中，一种或多种聚亚烷基二醇、PEG和甘油脂质分子中的多个可以彼此连接，与相同接头连接，或与多个接头连接。在这些实施方案中，一个或多个适体可以与每个聚亚烷基二醇、PEG或甘油脂质结合。这可以导致每个适体与它的靶标的亲合力的增加。另外，在其中存在针对PDGF的适体、或针对PDGF以及与聚亚烷基二醇、PEG或甘油脂质结合的不同靶标的适体的实施方案中，药物还可以与聚亚烷基二醇、PEG或甘油脂质结合，例如共价地键合。因而，所述化合物会提供药物的靶向递送，其中用聚亚烷基二醇、PEG或甘油脂质充当接头，任选地，使用一个或多个额外的接头。
在特定实施方案中，可以在5'末端用5'-5'反转核苷酸帽结构和/或在3'末端用3'-3'反转核苷酸帽结构将适体5'-加帽和/或3'-加帽。在某些实施方案中，拮抗剂A(或拮抗剂A的修饰形式)是5'或3'末端加帽的。在其它实施方案中，所述核苷酸帽是反转胸苷。
VEGF拮抗剂
在本发明的组合物中有用的VEGF拮抗剂包括、但不限于雷珠单抗、贝伐珠单抗、阿柏西普和它们的药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是结合人VEGF的抗体或其片段，其可以是人源化抗体或人抗-VEGF抗体。在特定实施方案中，抗 -VEGF抗体重链可变结构域包含氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYG X4SHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:76)，其中X1是T或D；X2是N或H；X3是Y或H；且X4是S或T。在一个特定实施方案中，所述重链可变结构域包含氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL(SEQ ID NO:77)。这些重链可变结构域序列可以与下述轻链可变结构域序列或与其它轻链可变结构域序列组合，前提条件是，如此产生的抗体结合人VEGF。
在某些实施方案中，抗-VEGF抗体轻链可变结构域包含具有下述氨基酸序列的高变区：CDRLl(SASQDISNYLN[SEQ ID NO:78]),CDRL2(FTSSLHS[SEQ ID NO:79])和CDRL3(QQYSTVPWT[SEQ ID NO:80])。在特定实施方案中，将3个轻链高变区提供在人框架区中，例如，作为由下式代表的连续序列：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。在一个实施方案中，抗-VEGF抗体轻链可变结构域包含氨基酸序列：DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:81)，其中X1是M或L。在特定实施方案中，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV(SEQ ID NO:82)。这些轻链可变结构域序列可以与上面鉴别的重链可变结构域序列或与其它重链可变结构域序列组合，前提条件是，如此产生的抗体保留结合人VEGF的能力。
在一个特定实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗体贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐，其分别包括下述重链和轻链可变结构域序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL(SEQ ID NO:77)；和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV(SEQ ID NO:82)。贝伐珠单抗是在商标阿伐他汀(Genentech,S.San Francisco,CA)下商购可得的，并且也描述在美国专利号6,054,297中。
在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是亲本抗-VEGF抗体(所述亲本任选地是人源化的或人抗-VEGF抗体)的变体，其中所述变体结合人VEGF，并且包含在亲本抗-VEGF抗体的重链或轻链可变结构域的高变区中的氨基酸置换。在特定实施方案中，所述变体具有在抗-VEGF抗体的一个或多个高变区中的一个或多个置换。在更具体的实施方案中，所述置换是在亲本抗体的重链可变结构域中。例如，氨基酸置换可以是在重链可变结构域的CDRH1或CDRH3中，或者可以在这2个高变区中存在置换。在某些实施方案中，这样的“亲和力成熟的”变体比产生它们的亲本抗-VEGF抗体更强烈地结合人VEGF，即，它们的Kd值显著小于亲本抗-VEGF抗体的Kd值。在某些实施方案中，所述变体就在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖而言的ED50值比亲本抗-VEGF抗体的ED50值低至少约10倍、低至少约20倍或低至少约50倍。在一个实施方案中，变体具有包含氨基酸序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO:83)的CDRH1和包含氨基酸序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO:84)的CDRH3。这些高变区和CDRH2可以提供在人框架区中，例如，产生包含下述氨基酸序列的重链可变结构域：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL(SEQ ID NO:77)。这样的重 链可变结构域序列任选地与轻链可变结构域组合，所述轻链可变结构域包含含有下述氨基酸序列的氨基酸结构域：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV(SEQ ID NO:82)。
在一个实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗体片段雷珠单抗或其药学上可接受的盐，其分别包括下述重链和轻链可变结构域序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL(SEQ ID NO:77)；和DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV(SEQ ID NO:82)。雷珠单抗是在商标下商购可得的，其中将它配制成用于玻璃体内施用(Genentech,S.San Francisco,CA)，并且也描述在美国专利号7,060,269中。
在另一个实施方案中，所述VEGF拮抗剂是VEGF-TrapTM，诸如阿柏西普或其药学上可接受的盐(参见Do等人(2009)Br J Ophthalmol.93:144-9，其特此通过引用整体并入)。阿柏西普也通过名称VEGF-Trap-EyeTM已知，并且是在商标EyleaTM(Regeneron Pharmaceuticals,Tarrytown,NY)下商购可得的。在特定实施方案中，VEGF-TrapTM包含含有2个融合多肽的二聚体融合多肽，每个融合多肽包含由第一VEGF受体人Flt1的免疫球蛋白-样(Ig)结构域2和人Flt4的第二VEGF受体人Flk1的Ig结构域3组成的VEGF受体组分。阿柏西普是包含与VEGF受体1结构域2和VEGF受体2结构域3融合的IgG的Fc片段的融合蛋白，其结合VEGF-A和胎盘生长因子(PlGF)。阿柏西普是具有97千道尔顿(kDa)的蛋白分子量的二聚体糖蛋白，且含有构成总分子质量的另外15％的糖基化，从而产生115kDa的总分子量。示例性的VEGF-Traps(包括阿柏西普)和生产它们的方法描述在 美国专利号7,306,799、7,531,173、7,608,261、7,070,959、7,374,757和7,374,758中。在特定实施方案中，VEGF-TrapTM是包含下述氨基酸序列或由其组成的多肽：MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:85)。
组合物
本发明提供了包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物，包括药物组合物。在某些实施方案中，所述组合物给抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂、或给抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂二者提供稳定性，包括可用于治疗或预防眼科疾病的那些。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体不会不利地影响VEGF拮抗剂的活性。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂不会不利地影响抗-PDGF适体的活性。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体增强VEGF拮抗剂的活性。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂增强抗-PDGF适体的活性。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体不会在统计显著性内不利地影响VEGF拮抗剂的活性。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂不会在统计显著性内不利地影响抗-PDGF适体的活性。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体在统计显著性内增强VEGF拮抗剂的活性。在其它实施方案中，所述VEGF拮抗剂在统计显著性内增强抗-PDGF适体的活性。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的一种或多种抗-PDGF适体是适体拮抗剂A或其 修饰形式。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的一种或多种VEGF拮抗剂是雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普中的一种或多种。在特定实施方案中，本发明的组合物包含：(i)拮抗剂A(或其修饰形式)和雷珠单抗；(ii)拮抗剂A(或其修饰形式)和贝伐珠单抗；或(iii)拮抗剂A(或其修饰形式)和阿柏西普。在某些实施方案中，所述组合物包含抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂中的任一种的药学上可接受的盐。在特定实施方案中，当将所述组合物在约2.0℃至约8.0℃的温度储存至少约12周时，至少约90％的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂是化学上稳定的。
基于这些拮抗剂的强度和特异性以及它们的结合靶标的类型和浓度，可以确定存在于本发明的组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的相对浓度。在一个实施方案中，所述抗-PDGF适体和所述VEGF拮抗剂以基本上相等浓度存在于所述组合物中。在另一个实施方案中，所述抗-PDGF适体或所述VEGF拮抗剂以比另一种高得多的浓度存在，例如，组合物中抗-PDGF适体:VEGF拮抗剂浓度的比率是约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约4:1或约5:1，或组合物中VEGF拮抗剂:抗-PDGF适体浓度的比率是约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约4:1或约5:1。在某些实施方案中，组合物中抗-PDGF适体:VEGF拮抗剂浓度的比率是在约1:1至约5:1、约1.5:1至约5:1、或约2.0:1至约5:1的范围内；在其它实施方案中，组合物中VEGF拮抗剂:抗-PDGF适体浓度的比率是在约1:1至约5:1、约1.5:1至约5:1、或约2.0:1至约5:1的范围内。除非另有说明，适体的浓度仅仅基于适体的核酸部分的分子量，所述核酸部分可以任选地包含短链聚乙二醇。在所述核酸部分包含短链聚乙二醇的情况下，核酸部分的分子量包括所有短链聚乙二醇残基的分子量。
在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体和所述VEGF拮抗剂各自以以下浓度存在于本发明的组合物中：约0.1mg/mL至约200mg/mL、约1至约150mg/mL、约2mg/mL至约100mg/mL、约3mg/mL至约80mg/mL、约4mg/mL至约50mg/mL、约4mg/mL至约 30mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、或约5mg/mL至约20mg/mL。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体以以下浓度存在于所述组合物中：约0.1mg/mL至约200mg/mL、约1至约150mg/mL、约2mg/mL至约100mg/mL、约3mg/mL至约80mg/mL、约4mg/mL至约50mg/mL、约4mg/mL至约30mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、或约5mg/mL至约20mg/mL。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂以以下浓度存在于所述组合物中：约0.1mg/mL至约200mg/mL、约1至约150mg/mL、约2mg/mL至约100mg/mL、约3mg/mL至约80mg/mL、约4mg/mL至约50mg/mL、约4mg/mL至约30mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约10mg/mL至约25mg/mL、或约5mg/mL至约20mg/mL。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体和所述VEGF拮抗剂各自以以下浓度存在：至少约0.1mg/mL、至少约1mg/mL、至少约2mg/mL、至少约3mg/mL、至少约4mg/mL、至少约5mg/mL、至少约6mg/mL、至少约7mg/mL、至少约8mg/mL、至少约9mg/mL、至少约10mg/mL、至少约15mg/mL、至少约20mg/mL、至少约30mg/mL、至少约40mg/mL、至少约50mg/mL、至少约60mg/mL、至少约70mg/mL、至少约80mg/mL、至少约90mg/mL、至少约100mg/mL、至少约120mg/mL、至少约150mg/mL或至少约200mg/mL。在某些实施方案中，所述抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂中的至少一种以以下浓度存在：至少约0.1mg/mL、至少约1mg/mL、至少约2mg/mL、至少约3mg/mL、至少约4mg/mL、至少约5mg/mL、至少约6mg/mL、至少约7mg/mL、至少约8mg/mL、至少约9mg/mL、至少约10mg/mL、至少约15mg/mL、至少约20mg/mL、至少约30mg/mL、至少约40mg/mL、至少约50mg/mL、至少约60mg/mL、至少约70mg/mL、至少约80mg/mL、至少约90mg/mL、至少约100mg/mL、至少约120mg/mL、至少约150mg/mL或至少约200mg/mL。
本发明的组合物也可以包含一种或多种赋形剂、缓冲剂(即，缓冲剂)、冷冻保护剂、张度剂(即，张度调节剂)、液体、稳定剂、表面活 性剂(例如，非离子型表面活性剂)、冷冻保护剂、抗氧化剂、氨基酸、pH-调节剂或防腐剂，诸如本文描述的那些中的任一种。合适的缓冲剂包括、但不限于磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)和醋酸钠。在某些实施方案中，缓冲剂能够将组合物的pH调至期望的pH或在期望的pH范围内，和/或能够实现或维持组合物的pH在期望的pH或在期望的pH范围内。合适的非离子型表面活性剂包括、但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如聚山梨酯20和聚山梨酯80。合适的防腐剂包括、但不限于苯甲醇。合适的张度剂包括、但不限于氯化钠、甘露醇和山梨醇。合适的冷冻保护剂包括、但不限于蔗糖、海藻糖和甘露醇。合适的氨基酸包括、但不限于甘氨酸和组氨酸。合适的pH-调节剂(或能够实现或维持期望的pH或pH范围的试剂)包括、但不限于盐酸、乙酸和氢氧化钠。在一个实施方案中，所述一种或多种pH-调节剂(或能够实现或维持期望的pH或pH范围的试剂)以有效地提供具有约3至约8、约4.0至约8.0、约4至约7、约5至约6、约6至约7、约6至约8、或约7至约7.5的pH的组合物的量存在。组合物的合适的赋形剂也包括在美国专利号7,365,166中描述的那些，它们的内容通过引用整体并入本文。
在特定实施方案中，本发明的组合物包含下述的：(1)抗-PDGF适体；(2)VEGF拮抗剂；(3)缓冲剂；任选的(4)张度调节剂；和，任选的(5)表面活性剂。在特定实施方案中，本发明的组合物包含下述的：(1)抗-PDGF适体；(2)VEGF拮抗剂；(3)张度调节剂；任选的(4)缓冲剂；和，任选的(5)表面活性剂。在特定实施方案中，本发明的组合物包含下述的：(1)抗-PDGF适体；(2)VEGF拮抗剂；(3)缓冲剂；(4)张度调节剂；和任选的(5)表面活性剂。在这样的组合物的具体实施方案中，所述缓冲剂是乙酸盐、磷酸盐、Tris或组氨酸缓冲剂、或其混合物；所述张度调节剂是氯化钠、甘露醇、山梨醇、或海藻糖、或其混合物；和所述表面活性剂是聚山梨酯20。在不同的实施方案中，所述抗-PDGF适体以约0.1mg/mL至约200mg/mL的浓度存在于本发明的组合物中；所述VEGF拮抗剂以约0.1mg/mL至约200mg/mL的浓度存在；所述 缓冲剂以约1mM至约200mM的浓度存在；所述张度调节剂以约10mM至约200mM(氯化钠)、约1％至约10％(w/v)(山梨醇)或约1％至约20％(w/v)(海藻糖)的浓度存在；且所述表面活性剂当存在时以约0.005％至约0.05％的浓度或约0.001％至约0.05％的浓度存在。
在一个有用的方面，胃肠外地(例如，通过肌肉内、腹膜内、静脉内、眼内、玻璃体内、眼球后、结膜下、眼球筋膜下或皮下注射或植入物)或全身性地施用本发明的组合物。用于胃肠外或全身施用的组合物可以包括无菌的水性或非水性溶液、混悬液或乳剂。可以使用多种水性载体，例如，水、缓冲的水、盐水等。其它合适的媒介物的例子包括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、水凝胶、氢化萘(hydrogenated naphalene)和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。这样的组合物还可以含有辅助物质，诸如防腐剂、润湿剂、缓冲剂、乳化剂或分散剂。可以使用生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制活性成分的释放。在一个实施方案中，包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物是呈适合用于注射的水溶液的形式。在一个实施方案中，组合物包含抗-PDGF适体、VEGF拮抗剂、缓冲剂、pH-调节剂(或能够实现或维持期望的pH或pH范围的试剂)和注射用水。
在某些实施例中,也可以局部地施用本发明的组合物，例如，通过贴剂，或通过直接施用于易感新生血管病症或受新生血管病症影响的区域(诸如表皮或眼)，或通过离子透入法。
通过玻璃体内注射进眼以及通过结膜下和眼球筋膜下注射，可以眼内地施用本发明的组合物。其它施用途径包括经巩膜、眼球后、腹膜内、肌肉内和静脉内。可替换地，使用药物递送装置或眼内植入物，可以施用组合物。可用于眼科应用的组合物包括包含与药学上可接受的赋形剂(包括本文描述的那些)混合的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的药物组合物。这些赋形剂可以是，例如，缓冲剂、惰性稀释剂或 填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗粘着剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅胶、氢化植物油或滑石粉)。
在特定实施方案中，本发明的组合物会给存在于所述组合物中的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂中的一种或多种赋予物理或化学稳定性。在这些实施方案中，本发明的组合物是物理上或化学上稳定的组合物。例如，本发明的组合物可以在储存过程中给存在于所述组合物中的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂赋予物理或化学稳定性。可用于评价抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的稳定性的不同分析技术是本领域中可得到的，包括在附随实施例中描述的那些，和在Reubsaet等人(1998)J.Pharm.Biomed.Anal.17(6-7):955-78和Wang(1999)Int.J.Pharm.185(2):129-88中综述的那些，包括目检、SDS-PAGE、IEF、(高压)尺寸排阻色谱法(HPSEC)、RFFIT、κ/λELISA。在附随实施例中描述的方法包括SE-HPLC、AEX-HPLC和WCX-HPLC。
可以如下确定本发明的组合物中的抗-PDGF适体的或VEGF拮抗剂的物理稳定性，但不限于此：测量适体的或拮抗剂的物理完整性状态，在目检颜色或澄清度后确定它是否显示聚集、沉淀或变性的任何迹象，或执行紫外光散射，或通过尺寸排阻色谱法(SEC)或示差扫描量热法(DSC)。例如，可以使用微流分析来测量在显微镜下才能看到的颗粒在组合物中的存在和大小，例如，如在实施例4中所述。
可以如下确定本发明的组合物中的抗-PDGF适体的或VEGF拮抗剂的化学稳定性，但不限于此：测量它的化学完整性的状态，或确定它是否显示导致新化学实体形成的分解或改变的任何迹象。通过检测和定量适体或拮抗剂的化学改变形式，可以评估化学完整性。化学改变可以包括尺寸修饰(例如，裁剪)，其可以使用例如尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE、具有HPLC(以确定低分子量和高分子量物质的存在)的尺寸排阻色谱法或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)进行评价。用于进行这样的测量的合适系统是本领域 已知的，例如，HPLC系统(Waters,Milford,Mass.)和阳离子交换-HPLC(CEX-HPLC，用于检测变体和监测表面电荷)。另外，可以使用在附随实施例中描述的可用于测量抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂的稳定性的方法。这些包括SE-HPLC、WCX-HPLC和AEX-HPLC。其它类型的化学改变包括电荷改变(例如，由于脱酰胺化而发生)，其可以通过例如离子交换色谱法进行评价。氧化是另一种化学改变，其可以使用本文中公开的方法或本领域技术人员已知的方法来检测。
在特定实施方案中，如果至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的存在于所述组合物中的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂在目检颜色或澄清度后没有显示聚集、沉淀或变性的迹象，那么本发明的组合物是物理上稳定的，或如通过紫外光散射或通过尺寸排阻色谱法(SEC)或示差扫描量热法(DSC)所测得的。在特定实施方案中，如果至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的存在于所述组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂二者在目检颜色或澄清度后没有显示聚集、沉淀或变性的迹象，那么所述组合物是物理上稳定的，或如通过紫外光散射或通过尺寸排阻色谱法(SEC)或示差扫描量热法(DSC)所测得的。
在某些实施方案中，通过微流成像可以确定物理稳定性，其中检测到的颗粒的较大数目或颗粒的较大尺寸通常与降低的物理稳定性相关联。在特定实施方案中，在以下情况下，本发明的组合物是物理上稳定的：通过微流成像(例如，如在实施例4中所述)确定的它的颗粒计数例如小于约500,000、小于约100,000或小于约50,000个总颗粒/mL，其中所述颗粒具有在0μm至约100μm范围内的等同圆直径，或者，在另一个实施方案中，在0μm至约25μm的范围内。在另一个实施方案中，在以下情况下，认为本发明的组合物是物理上稳定的：通过微流成像(例如，如在实施例4中所述)确定的它的颗粒计数例如小于约100,000、小于约50,000、小于约20,000、小于约10,000、小于 约5,000、小于约2,500、小于约1,000或小于约500个颗粒/mL，其中所述颗粒具有在约1μm至约2μm范围内的等同圆直径，或者，在另一个实施方案中，在约1μm至约5μm的范围内。
在特定实施方案中，当至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的存在于所述组合物中的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂没有显示导致新化学实体形成的分解或改变时，本发明的组合物是化学上稳定的。
在特定实施方案中，当至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂没有显示导致新化学实体形成的分解或改变时，抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂是化学上稳定的。在特定实施方案中，如果至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的存在于所述组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂二者没有表现出导致新化学实体形成的分解或改变，那么本发明的组合物是化学上稳定的。在某些实施方案中，所述分解或改变是导致新化学实体形成的分解或改变，例如，通过化学键裂解。
在特定实施方案中，当在约室温储存至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少20天、至少30天、至少2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少16周或至少24周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少6个月或至少约1年、或可替换地至少约2年、或可替换地至少约3年、或可替换地至少约4年、或可替换地至少约5年时；或可替换地在约2.0℃至约8.0℃的温度储存至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少20天、至少30天、至少30天、至少2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少16周、至少24周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少6个月、或至少约1年、或可替换地至少约2年、或可替换地至少约3年、或可替换地至少约4年、或可替换地至少约5年时；或可替换地在约5.0℃的温度储存至少 2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少16周、至少24周、至少约1年或至少约2年、或可替换地至少约3年、或可替换地至少约4年、或可替换地至少约5年时，如果至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述组合物中的一种或多种抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂没有表现出导致新化学实体形成的分解或改变的迹象，那么本发明的组合物是化学上稳定的。在特定实施方案中，当存在于所述组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂是化学上稳定的时，所述组合物是物理上或化学上稳定的。在某些实施方案中，本发明的组合物在约40℃稳定(即，物理上或化学上稳定)多达或至少1周、多达或至少2周、或多达或至少1个月。在某些实施方案中，所述组合物在约-20℃稳定多达或至少1年、或可替换地多达或至少2年、3年、4年或5年。在某些实施方案中，所述组合物在约-80℃稳定多达或至少1年，可替换地多达或至少2年、3年、4年或5年。在某些实施方案中，在以下情况下，本发明的组合物是物理上或化学上稳定的：通过微流成像(例如，如在实施例4中所述)确定的它们的颗粒计数例如小于约500,000、小于约100,000、或小于约50,000个总颗粒/mL，其中所述颗粒具有在0μm至约100μm范围内的等同圆直径，或者，在另一个实施方案中，在0μm至约25μm的范围内；或者小于约100,000、小于约50,000、小于约20,000、小于约10,000、小于约5,000、小于约2,500、小于约1,000或小于约500个颗粒/mL，其中所述颗粒在约5℃或约30℃储存约4小时以后具有在1μm至2μm范围内的等同圆直径，或者，在另一个实施方案中，在1μm至5μm的范围内。
在特定实施方案中，在以下情况下，认为本发明的组合物是物理上或化学上稳定的：在储存以后，检测到的颗粒的平均数目没有超过约50个颗粒/mL(在所述颗粒具有>约10μm的直径的情况下)，和没有超过5个颗粒/mL(在所述颗粒具有>25μm的直径的情况下)，如通过在(788)Particulate Matter in Injections,修正公报,2011年10月1日官方发布,The United States Pharmacopeial Convention中描述的不 透光颗粒计数试验(Light Obscuration Particle Count Test)所测量的。如其中所述，使用合适的设备基于光封闭的原理进行该试验，其允许自动确定颗粒的尺寸和根据尺寸确定颗粒的数目。使用具有10μm至25μm的已知尺寸的球形颗粒的分散体，校准设备。将这些标准颗粒分散在无颗粒的水中。小心地避免颗粒在分散过程中的聚集。在限制向外来颗粒物的暴露的条件下进行该试验，例如，在层流柜中。除了膜滤器以外，将使用的玻璃器皿和过滤设备用温去污剂溶液小心地洗涤，并用大量水冲洗以除去所有痕量的去污剂。在即将使用之前，将该设备用无颗粒的水从上至下、先外后内冲洗。注意不向要测量的样品中引入气泡，特定当将制备的级分转移至要在其中进行测量的容器时。为了检查环境适合于试验、玻璃器皿被适当地清洁和要使用的水不含颗粒，如下面马上描述地确定5个无颗粒的水的样品(每个5mL)中的颗粒物。如果就组合的25mL而言，10μm或更大的颗粒的数目超过25个，为该试验采取的警惕是不足够的。然后重复警惕步骤，直到环境、玻璃器皿和水是合适的。
一旦环境、玻璃器皿和水适合于试验，就对试验样品进行试验。通过缓慢地接连反转样品的容器20次，混合样品的内容物。如果必要的话，小心地除去容器的密封闭合件，如果存在的话。使用无颗粒的水的射流清洁容器的外表面，并除去容器的密封闭合件(如果存在的话)，从而避免内容物的任何污染。通过适当的措施，诸如将容器静置2分钟或声处理，消除气泡。
对于大体积样品(大于25mL体积)而言，试验了单个单元。对于小体积样品(小于25mL体积)而言，将10个或更多个单元的内容物组合在清洁容器中以得到不小于25mL的体积；可以如下制备试验溶液：混合合适数目的管形瓶的内容物，并将得到的混合物用无颗粒的水或用适当的无颗粒的溶剂(当无颗粒的水不适用时)稀释至25mL。可以单个地试验具有25mL或更大体积的小体积胃肠外制品。用无颗粒的水或用适当的无颗粒的溶剂(当无颗粒的水不适用时)重构粉剂。 试验样品的数目应当足以提供统计上显著的评估。对于大体积样品或对于具有25mL或更大体积的小体积样品，使用适当的取样计划，可以试验少于10个单元。
从每个样品取出4个部分(每个不小于5mL)，并计数等于或大于10μm或25μm的颗粒数目。将关于第一部分得到的结果忽略，并计算检查的制品的颗粒的平均数目。
对于具有超过100mL的标称容积的容器中的样品，应当考虑本文描述的试验1.A的标准。
对于具有100mL或更小的标称容积的容器中的样品，应当考虑本文描述的试验1.B的标准。
如果颗粒的平均数目超过试验限度，应当使用显微颗粒计数试验来试验样品。
试验1.A.如果存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过25/mL，其中所述颗粒具有等于或大于10μm的直径，或如果存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过3/mL，其中所述颗粒具有等于或大于25μm的直径，那么样品符合试验限度。
试验1.B.如果存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过6000/容器，其中所述颗粒具有等于或大于10μm的直径，或如果存在于样品容器中的颗粒的平均数目没有超过600/容器，其中所述颗粒具有等于或大于25μm的直径，样品符合试验限度。
在特定实施方案中，在以下情况下，认为所述组合物是物理上或化学上稳定的：在储存以后，检测到的颗粒的平均数目没有超过50个颗粒/mL(在所述颗粒具有>10μm的直径的情况下)，和没有超过5 个颗粒/mL(在所述颗粒具有>25μm的直径的情况下)，和没有超过2个颗粒/mL(在所述颗粒具有>50μm的直径的情况下)，如通过在(788)Particulate Matter in Injections,修正公报,2011年10月1日官方发布,The United States Pharmacopeial Convention中描述的显微方法颗粒计数试验所测量的。
使用合适的双目显微镜、用于截留颗粒物的过滤器组件和用于检查的膜滤器，进行显微颗粒计数试验。将显微镜调至100±10放大率，并给其配备用物镜测微计校准的目镜测微计、能够保持和横过膜滤器的整个过滤区域的机械台、以及2个合适的照明器，所述照明器除了用于提供斜面照明以外还用于提供反射照明。所述目镜测微计是圆直径标线，并且由被十字准线分成四分圆的大圆、在100放大率直径为10μm和25μm的透明和黑色参比圆、以及具有10μm增量刻度的直线标尺组成。使用经过国内或国际标准机构检验的镜台测微计校准它。在±2％以内的标线的直线标尺的相对误差是可接受的。所述大圆被命名为标线视野(GFOV)。使用2个照明器。一个是在显微镜内部的反射亮视野照明器，另一个是外部可聚焦的辅助照明器，其可以被调节以产生10°至20°角的反射斜面照明。用于截留颗粒物的过滤器组件由从玻璃或其它合适材料制成的过滤器支架组成，并且配备有真空源和合适的膜滤器。所述膜滤器具有合适的尺寸，颜色为黑色或深灰色，没有网格或具有网格，并且具有1.0μm或更细的标称孔径。
在限制向外来颗粒物的暴露的条件下进行该试验，例如，在层流柜中。除了膜滤器以外，将使用的玻璃器皿和过滤器组件用温去污剂溶液小心地洗涤，并用大量水冲洗以除去所有痕量的去污剂。在即将使用之前，将膜滤器的两侧和该设备用无颗粒的水从上至下、先外后内冲洗。
为了检查环境适合于试验、玻璃器皿和膜滤器被适当地清洁和要使用的水不含颗粒，进行下述试验：根据下面马上描述的方法，确定 50-mL体积的无颗粒的水的颗粒物。如果在过滤区域内存在超过20个10μm或更大尺寸的颗粒或如果存在超过5个25μm或更大尺寸的颗粒，那么为该试验采取的警惕是不足够的。重复警惕步骤，直到环境、玻璃器皿膜滤器和水适合于试验。
通过缓慢地接连反转样品的容器20次，混合样品的内容物。如果必要的话，小心地除去容器的密封闭合件，如果存在的话。使用无颗粒的水的射流清洁容器开口的外表面，并除去密封闭合件(如果存在的话)，从而避免内容物的任何污染。
对于大体积样品，试验单个单元。对于小体积样品(小于25mL体积)，将10个或更多个样品容器的内容物组合在清洁容器中；可以如下制备试验溶液：混合合适数目的管形瓶的内容物，并用无颗粒的水或用适当的无颗粒的溶剂(当无颗粒的水不适用时)稀释至25mL。可以单个地试验具有25mL或更大体积的小体积样品。用无颗粒的水或用适当的无颗粒的溶剂(当无颗粒的水不适用时)构造用于胃肠外应用的粉剂。试验样品的数目应当足以提供统计上显著的评估。对于大体积样品或对于具有25mL或更大体积的小体积样品，使用适当的取样计划，可以试验少于10个单元。
将配备膜滤器的过滤器支架的内侧用几mL无颗粒的水润湿。将溶液池或单个样品容器的总容量转移至过滤漏斗，并施加真空。如果需要的话，逐步添加样品的一部分，直到整个容量被过滤。最后一次添加样品以后，使用无颗粒的水的射流冲洗过滤器支架的内壁。维持真空，直到膜滤器的表面不具有液体。将膜滤器放在培养皿中，并在稍微微开盖的情况下风干膜滤器。在已经干燥膜滤器以后，将培养皿放在显微镜的台上，并在来自照明装置的反射光下扫描整个膜滤器，并计数等于或大于10μm的颗粒的数目和等于或大于25μm的颗粒的数目。可替换地，可以进行部分膜滤器计数和通过计算来确定总滤器计数。确定要检查的制品的颗粒的平均数目。
通过与标线上的10μm和25μm参比圆相比估测颗粒的等同直径，使用圆直径标线进行颗粒尺寸分选过程。其中为了对比，颗粒没有从它们在标线视野内的最初位置移动，并且没有重叠在参比圆上。使用透明标线参比圆的内径来确定白色和透明颗粒的尺寸，同时使用黑色不透明标线参比圆的外径确定黑色颗粒的尺寸。
在膜滤器上具有污迹或变色外观的无定形的、半液体的或否则在形态学上不清楚的材料不应当确定尺寸或计数，因为这些材料几乎没有或根本没有表现出表面减轻，并且呈现凝胶状或膜样外观。在这样的情况下，通过用不透光颗粒计数试验来试验溶液样品，可以辅助计数的解释。
对于具有超过100mL的标称容积的容器中的样品，施加试验2.A的标准。
对于具有100mL或更小的标称容积的容器中的样品，施加试验2.B的标准。
试验2.A。如果存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过12/mL且所述颗粒具有等于或大于10μm的直径，或存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过2/mL且所述颗粒具有等于或大于25μm的直径，那么样品符合试验限度。
试验2.B。如果存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过3000/容器且所述颗粒具有等于或大于10μm的直径，或存在于试验的样品容器中的颗粒的平均数目没有超过300/容器且所述颗粒具有等于或大于25μm的直径，那么样品符合试验限度。
在某些实施方案中，本发明的组合物是呈低压冻干形式。
包含拮抗剂A和雷珠单抗的组合物
在某些实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度(拮抗剂A的质量减去它的-R基团的质量/组合物体积)与雷珠单抗的浓度(质量/组合物体积)的比率小于25.0、小于10.0、小于9.0、小于8.0、小于7.0、小于6.0、小于5.0、小于4.0、小于3.0、小于2.0或小于1.0。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度(拮抗剂A的质量减去它的-R基团的质量/组合物体积)与雷珠单抗的浓度(质量/组合物体积)的比率小于或等于25.0、小于或等于10.0、小于或等于9.0、小于或等于8.0、小于或等于7.0、小于或等于6.0、小于或等于5.0、小于或等于4.0、小于或等于3.0、小于或等于2.0或小于或等于1.0。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度(拮抗剂A的质量减去它的-R基团的质量/组合物体积)与雷珠单抗的浓度(质量/组合物体积)的比率是在约1至约10、约2至约5、约3至约4、或约5的范围内。
拮抗剂A的-R基团描绘在图78A中。
在特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗，且所述组合物在特定pH就两种活性剂而言是稳定的或适合于胃肠外施用。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式不会不利地影响雷珠单抗的活性。在某些实施方案中，雷珠单抗不会不利地影响拮抗剂A或其修饰形式的活性。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式增强雷珠单抗的活性。在某些实施方案中，雷珠单抗增强拮抗剂A或其修饰形式的活性。确定拮抗剂A和VEGF拮抗剂的活性的方法是本领域已知的，且包括：分别测量拮抗剂A或VEGF拮抗剂对PDGF或VEGF调节的基因表达的表达的影响，如例如在实施例3和6中所述。
在某些实施方案中，所述组合物包含张度调节剂、表面活性剂、以及适合于达到或维持特定pH或适合于胃肠外施用的缓冲剂中的一种或多种。适当的缓冲剂包括本文描述的那些缓冲剂以及本领域已知的其它缓冲剂，例如，Good氏缓冲剂，例如，MES。
在某些实施方案中，本发明的组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度小于或为约100mg/mL、小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL、或小于约5mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约0.3mg/mL至约100mg/mL、约0.3mg/mL至约50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约100mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约5mg/mL、约5mg/mL至约100mg/mL、或约5mg/mL至约50mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL或约50mg/mL。
在某些实施方案中，本发明的组合物中的雷珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约1.0mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约2mg/mL至约10mg/mL或约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL或约12mg/mL。
在某些实施方案中，本发明的组合物中的雷珠单抗的浓度是约0.5 mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约1.0mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约2mg/mL至约10mg/mL或约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL或约12mg/mL，且所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度是小于约100mg/mL、小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL或小于约5mg/mL。
在某些实施方案中，本发明的组合物中的雷珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约2mg/mL至约10mg/mL、或约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、或约12mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约0.3mg/mL至约100mg/mL、0.3mg/mL至约50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约1.0mg/mL至约100mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约5mg/mL、约5mg/mL至约100mg/mL、或约5mg/mL至约50mg/mL。
在某些实施方案中，本发明的组合物中的雷珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约2mg/mL至约50mg/mL、约2mg/mL至约10mg/mL、或约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、或约10mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8 mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL或约50mg/mL。在一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约3mg/mL，且雷珠单抗的浓度是约5mg/mL。在一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约6mg/mL，且雷珠单抗的浓度是约10mg/mL。在一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约15mg/mL，且雷珠单抗的浓度是约5mg/mL。在一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约24mg/mL，且雷珠单抗的浓度是约8mg/mL。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含张度调节剂，所述张度调节剂是山梨醇或氯化钠或其混合物。在特定实施方案中，所述张度调节剂是山梨醇，且所述组合物的pH是约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约6.0或约7.0。在特定实施方案中，所述张度调节剂是氯化钠，且所述组合物的pH是约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.5、约6.0至约8.0、约8.0、约7.0或约6.0。在某些实施方案中，所述张度调节剂是约1％至约10％(w/v)、或约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的山梨醇。在特定实施方案中，所述张度调节剂是浓度为约10mM至约200mM、约50mM至200mM、约75mM至约200mM、约50mM至约150mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM或约150mM的氯化钠。在一个实施方案中，所述张度调节剂是浓度为约130mM的氯化钠。在其它实施方案中，所述张度调节剂是浓度为约75mM或约120mM的氯化钠。关于张度调节剂浓度，“mM”表示每升组合物的张度调节剂的毫摩尔数。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗的本发明的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含缓冲剂，所述缓冲剂能够实现或维持组合物的pH在期望的范围内。在某些实施方案中，所述组合物 包含组氨酸(例如，L-组氨酸或其药学上可接受的盐)或磷酸盐作为缓冲剂，例如，磷酸钠或磷酸钾(或组氨酸和磷酸盐二者)。在某些实施方案中，所述缓冲剂以以下浓度存在：约1mM至约200mM，约1mM至约150mM，约1mM至约20mM，约1mM至约10mM，约2mM至约100mM，约2mM至约20mM，约5mM至约20mM，或约10mM。在特定实施方案中，所述缓冲的组合物的pH是约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.5、约5.5至约7.0、或约6.0。在一个实施方案中，所述缓冲的组合物具有约5.5至约7.0的pH。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约1mM至约200mM、约1mM至约150mM、约2mM至约100mM、约5mM至约20mM、或约10mM的组氨酸，且所述缓冲的组合物具有约5.5至约7.0、或约6.0的pH。在一个特定实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约10mM的组氨酸，且所述组氨酸缓冲的组合物的pH是约6.0。关于缓冲剂浓度，“mM”表示每升组合物的缓冲剂(例如，组氨酸)的毫摩尔数。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗的组合物的某些实施方案中，所述缓冲剂包含单独的或与组氨酸组合的磷酸盐。所述磷酸盐缓冲剂可以是，例如，磷酸钠或磷酸钾缓冲剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约1mM至约200mM、约1mM至约50mM、约2mM至约200mM、约2mM至约50mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约5mM、约10mM、约25mM、或约50mM的磷酸盐。在特定实施方案中，所述缓冲的组合物的pH是约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约5.5至约7.5、约5.5至约7.0、约6.0、约7.0、或约8.0。在一个实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约6.0至约8.0的pH。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约5mM至约200mM、约5mM至约150mM、约5mM至约100mM、约5mM、约8mM、约10mM、约25mM、或约50mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约5.5至约7.5、约5.5至约7.0、或约6.0的pH。在一个特定实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约10 mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约6.2的pH。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含表面活性剂。在特定实施方案中，所述表面活性剂是浓度为约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.002％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、或约0.02％(w/v)的聚山梨酯20。
在一个实施方案中，组合物包含拮抗剂A或其修饰形式、雷珠单抗、组氨酸和NaCl。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗；拮抗剂A(或其修饰形式)的浓度与雷珠单抗的浓度的比率小于2；且所述组合物进一步包含浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约1mM至约100mM的组氨酸、和浓度为约0.005％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.0。
在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐，和雷珠单抗或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；和(b)约0.5mg/mL至约20mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含以下的一种或两种：(c)约1mM至约20mM L-组氨酸；和(d)约10mM至约200mM NaCl。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂，其任选地是聚山梨酯。在一个特定实施方案中，所述组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约0.5mg/mL至约20mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约1mM至约20mM L-组氨酸；和(d)约10mM至约200mM NaCl， 其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH 7.0。在另一个实施方案中，所述组合物包含：(a)约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约10mM L-组氨酸；和(d)约130mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 6.0。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.01％(w/v)聚山梨酯20。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含：(a)约1.0mg/mL至约100mg/mL、或约5.0mg/mL至约50mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；和(b)约1.0mg/mL至约50mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含以下的一种或两种：(c)约1mM至约20mM L-组氨酸；和(d)约10mM至约200mM NaCl。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂，其任选地是聚山梨酯。在一个特定实施方案中，所述组合物包含：(a)约5.0mg/mL至约50mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约1.0mg/mL至约50mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约1mM至约20mM L-组氨酸；和(d)约10mM至约200mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH 8.0、或约pH 5.5至约pH 7.5。在另一个实施方案中，所述组合物包含：(a)约15mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约5mM L-组氨酸；和(d)约75mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.5至约pH 7.5或约pH 6.0。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.005％(w/v)聚山梨酯20。在另一个实施方案中，所述组合物包含：(a)约24mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约8mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约2mM L-组氨酸；和(d)约120mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.5至约pH 7.5或约pH 6.0。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.002％(w/v)聚山梨酯20。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约0.5mg/mL至约20mg/mL雷珠单抗；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持所述组合物的pH在约pH 5.0至约pH 8.0；和(d)张度调节剂。在特定实施方案中，所述缓冲剂在存在时是约1mM至约20mM L-组氨酸或约1mM至约20mM磷酸钠；且所述张度调节剂在存在时是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。在某些实施方案中，所述缓冲剂是约1mM至约20mM L-组氨酸；且所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH 7.0。
本发明的任意组合物还可以包含表面活性剂，例如，约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
本发明的组合物的例子包括在表1、表3或表8中描述的组合物。在其它实施方案中，本发明包括在表1中描述的组合物，但是不含有聚山梨酯。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约3mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约5mg/mL的雷珠单抗、浓度为约10mM的组氨酸、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约5mg/mL雷珠单抗、约10mM磷酸钠、约5％(w/v)山梨醇和约0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约5mg/mL雷珠单抗、约10mM磷酸钠、约130mM NaCl和约0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约5mg/mL雷珠单抗、约5mM磷酸钠、约5mM组氨酸HCl、约75mM NaCl、约5％(w/v)海藻糖和约0.005％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 6.5。
在某些实施方案中本发明的组合物包含:(a)约3mg/mL至约90mg/mL拮抗剂A或其修饰形式；(b)约1.0mg/mL至约30mg/mL雷珠单抗；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持所述组合物的pH在约pH 5.0至约pH 8.0；和(d)张度调节剂。在特定实施方案中，所述缓冲剂在存在时包含约1mM至约100mM磷酸钠或约1.0mM至约10mM组氨酸.HCl；且所述张度调节剂在存在时是约0.5％(w/v)至约10％(w/v)海藻糖。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约15mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约5mg/mL的雷珠单抗、浓度为约5mM的组氨酸、浓度为约75mM的氯化钠和浓度为约0.005％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.5。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约24mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约8mg/mL的雷珠单抗、浓度为约2mM的组氨酸、浓度为约120mM的的氯化钠和浓度为约0.002％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.5。
在特定实施方案中，包含拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗的组合物在25℃化学上稳定至少8周或至少12周，或在4℃化学上稳定至少12周或至少16周或至少24周。在特定实施方案中，至少80％的拮抗剂A和雷珠单抗中的每一种在这些条件中的至少一种下没有表现出导致新化学实体形成的分解或改变的迹象。
包含拮抗剂A和贝伐珠单抗的组合物
在某些实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的拮抗剂A(或其修饰形式)的浓度(拮抗剂A的质量减去它的-R基团的质量/组合物体积)与贝伐珠单抗的浓度(质量/组合物体积)的比率小于25.0、小于10.0、小于9.0、小于8.0、小于7.0、小于6.0、小于5.0、小于4.0、小于3.0、小于2.0、小于1.0、或小于0.5。
拮抗剂A的-R基团描绘在图78A中。
在特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗，且所述组合物在适合于胃肠外施用的特定pH就两种活性剂而言是稳定的。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式不会不利地影响贝伐珠单抗的活性。在某些实施方案中，贝伐珠单抗不会不利地影响拮抗剂A或其修饰形式的活性。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式增强贝伐珠单抗的活性。在某些实施方案中，贝伐珠单抗增强拮抗剂A或其修饰形式的活性。确定拮抗剂A和VEGF拮抗剂的活性的方法是本领域已知的，且包括：分别测量拮抗剂A或VEGF拮抗剂对PDGF或VEGF调节的基因表达的表达的影响，如例如在实施例3和6中所述。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种张度调节剂、表面活性剂和适合于达到或维持特定pH的缓冲剂，或适合于胃肠外施用。适当的缓冲剂包括本文描述的那些缓冲剂以及本领域已知的其它缓冲剂，例如，Good氏缓冲剂，例如，MES。
在某些实施方案中，所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL、或小于约5mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度 是约0.3mg/mL至约50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、或约50mg/mL。
在某些实施方案中，所述贝伐珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1.0至约25mg/mL、约1.0至约20mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约20mg/mL、约12.5mg/mL、约25mg/mL、或约50mg/mL。
在某些实施方案中，所述贝伐珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1.0至约25mg/mL、约1.0至约20mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约20mg/mL、约12.5mg/mL、约25mg/mL、或约50mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL、或小于约5mg/mL。
在某些实施方案中，所述贝伐珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1.0至约25mg/mL、约1.0至约20mg/mL、约5mg/mL至约50 mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约20mg/mL、约12.5mg/mL、约25mg/mL、或约50mg/mL，且所述拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约0.3mg/mL至约50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL。
在某些实施方案中，所述贝伐珠单抗的浓度是约0.5mg/mL至约50mg/mL、约0.5mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1.0至约25mg/mL、约1.0至约20mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约20mg/mL、约12.5mg/mL、约25mg/mL、或约50mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、或约50mg/mL。在一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约3mg/mL，且所述贝伐珠单抗的浓度是约12.5mg/mL。在另一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约6mg/mL，且所述贝伐珠单抗的浓度是约25mg/mL或约50mg/mL。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含选自山梨醇、氯化钠和海藻糖的张度调节剂。在其它实施方案中，所述组合物包含山梨醇和氯化钠、氯化钠和海藻糖、或山梨醇和海藻糖。在特定实施方案中，所述组合物包含山梨醇，且所述组合物的pH是约7.0至约8.0。在特定实施方案中，所述组合物包含氯化钠，且所述组合物的pH是约6.0至约8.0。在某 些实施方案中，所述组合物包含海藻糖，且所述组合物的pH是约6.0至约7.0。在某些实施方案中，所述组合物包含约1％至约10％(w/v)、或约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、或约10％(w/v)的山梨醇。在特定实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM至约200mM、约50mM至200mM、约75mM至约200mM、约50mM至约150mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM或约150mM的氯化钠。在一个实施方案中，所述组合物包含浓度为约130mM的氯化钠。在某些实施方案中，所述组合物包含约1％至约10％(w/v)、或约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、或约10％(w/v)的海藻糖。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含缓冲剂，其能够实现或维持所述组合物的pH在期望的范围内。在某些实施方案中，所述组合物包含乙酸盐、磷酸盐和Tris中的一种或多种作为缓冲剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约25mM至约100mM、或约50mM的磷酸盐。所述磷酸盐缓冲剂可以是，例如，磷酸钠缓冲剂或磷酸钾缓冲剂。在特定实施方案中，所述缓冲的组合物的pH是约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约5.5至约7.0、约6.0、约7.0或约8.0。在一个实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸盐，且所述缓冲的组合物的pH是约5.5至约7.0。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约5mM至约200mM、约10mM至约150mM、约25mM至约100mM、或约50mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约5.5至约7.0、或约6.0的pH。在一个特定实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约50mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约6.0的pH。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗的组合物的某些实施 方案中，所述组合物进一步包含表面活性剂。在特定实施方案中，所述表面活性剂是浓度为约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、或约0.02％(w/v)的聚山梨酯20。
在一个实施方案中，包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗的组合物包含拮抗剂A、贝伐珠单抗、氯化钠和磷酸盐。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯。
在一个特定实施方案中，组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗；拮抗剂A(或其修饰形式)的浓度与贝伐珠单抗的浓度的比率小于1.5、小于1.2或小于1；且所述组合物进一步包含浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约5mM至约200mM的磷酸盐和浓度为约0.005％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.0。
在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐，和贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；和(b)约0.5mg/mL至约25mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含以下的一种或两种：(c)约5mM至约200mM磷酸盐缓冲剂；和(d)约10mM NaCl至约200mM NaCl。在其它实施方案中，所述组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约0.5mg/mL至约25mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约5mM至约200mM磷酸盐缓冲剂(例如，约5mM至约200mM磷酸钠)；和(d)约10mM NaCl至约200mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH 7.0。在包含贝伐珠单抗的组合物的特定实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂，其任选地是聚山梨酯。在一个特定实施方案中，所述组合物包含：(a)约3mg/mL拮抗剂 A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；(c)约50mM磷酸盐缓冲剂；和(d)约130mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 6.0。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)约0.01％(w/v)聚山梨酯20。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含:(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式；(b)约0.5mg/mL至约25mg/mL贝伐珠单抗；和以下的一种或两种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持所述组合物的pH在约pH 5.0至约pH 8.0；和(d)张度调节剂。在特定实施方案中，所述缓冲剂是约5mM至约200mM磷酸钠或约5mM至约200mM Tris.HCl；且所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。在某些实施方案中，所述缓冲剂是约5mM至约200mM磷酸钠；且所述张度剂是约10mM至约200mM NaCl，其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH7.0。在特定实施方案中，本发明的组合物包含表面活性剂，例如，约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
本发明的组合物的例子包括在表3中描述的组合物以及不含表面活性剂的这些组合物。
在一个实施方案中，组合物包含浓度为约3mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约12.5mg/mL的贝伐珠单抗、浓度为约50mM的磷酸钠、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗、约50mM磷酸钠、约5％(w/v)山梨醇和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 6.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或 其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗、约50mM磷酸钠、约5％(w/v)山梨醇和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗、约50mM磷酸钠、约150mM NaCl和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗、约50mM Tris.HCl、约130mM NaCl和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 8.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约15mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗、约30mM磷酸钠、约75mM NaCl、约3％(w/v)海藻糖和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 6.3。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含约3mg/mL拮抗剂A或其修饰形式、约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐、约30mM磷酸钠、约75mM NaCl、约3％(w/v)海藻糖和约0.02％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约pH 6.3。
在特定实施方案中，包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗的组合物在25℃在化学上稳定至少4周或至少8周，或在4℃在化学上稳定至少12周或至少24周。在特定实施方案中，至少70％的拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗中的每一种在这些条件下没有表现出导致新化学实体形成的分解或改变的迹象。
包含拮抗剂A和阿柏西普的组合物
在某些实施方案中，组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的拮抗剂A的浓度(拮抗 剂A的质量减去它的-R基团的质量/组合物体积)与阿柏西普的浓度(质量/组合物体积)的比率小于25.0、小于10.0、小于9.0、小于8.0、小于7.0、小于6.0、小于5.0、小于4.0、小于3.0、小于2.0、小于1.0、小于0.5或小于0.25。
拮抗剂A的-R基团描绘在图78A中。
在特定实施方案中，组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普，且所述组合物在特定pH就两种活性剂而言是稳定的或适合于胃肠外施用。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式不会不利地影响阿柏西普的活性。在某些实施方案中，阿柏西普不会不利地影响拮抗剂A或其修饰形式的活性。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式增强阿柏西普的活性。在某些实施方案中，阿柏西普增强拮抗剂A或其修饰形式的活性。确定拮抗剂A和VEGF拮抗剂的活性的方法是本领域已知的，且包括：分别测量拮抗剂A或VEGF拮抗剂对PDGF或VEGF调节的基因表达的表达的影响，如例如在实施例3和6中所述。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种张度调节剂、表面活性剂和适合于达到或维持特定pH的缓冲剂，或适合于胃肠外施用。适当的缓冲剂包括本文描述的那些缓冲剂以及本领域已知的其它缓冲剂，例如，Good氏缓冲剂，例如，MES。
在某些实施方案中，所述组合物中的拮抗剂A或其修饰形式的浓度小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL、或小于约5mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约0.3mg/mL至约50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、 约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL。在某些实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、或约50mg/mL。
在某些实施方案中，所述阿柏西普的浓度是约5mg/mL至约100mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约10mg/mL至约40mg/mL、约20mg/mL至约40mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、或约40mg/mL。
在某些实施方案中，所述阿柏西普的浓度是约5mg/mL至约100mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约10mg/mL至约40mg/mL、约20mg/mL至约40mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、或约40mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是小于约50mg/mL、小于约40mg/mL、小于约30mg/mL、小于约25mg/mL、小于约20mg/mL、小于约15mg/mL、小于约10mg/mL、或小于约5mg/mL。
在某些实施方案中，所述阿柏西普的浓度是约5mg/mL至约100mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约10mg/mL至约40mg/mL、约20mg/mL至约40mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、或约40mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约0.3mg/mL至约 50mg/mL、约0.3mg/mL至约40mg/mL、约0.3mg/mL至约30mg/mL、约0.3至约25mg/mL、约0.3mg/mL至约20mg/mL、约0.3mg/mL至约15mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约50mg/mL、约1mg/mL至约40mg/mL、约1mg/mL至约30mg/mL、约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL。
在某些实施方案中，所述阿柏西普的浓度是约5mg/mL至约100mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、约5mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约10mg/mL至约40mg/mL、约20mg/mL至约40mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、或约40mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL to约5mg/mL，且拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、或约50mg/mL。在一个实施方案中，所述拮抗剂A的浓度是约3mg/mL，且所述阿柏西普的浓度是约20mg/mL。在一个实施方案中，所述拮抗剂A的浓度是约6mg/mL，且所述阿柏西普的浓度是约40mg/mL。在另一个实施方案中，拮抗剂A或其修饰形式的浓度是约12mg/mL，且所述阿柏西普的浓度是约80mg/mL。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种选自山梨醇和氯化钠的张度调节剂。在特定实施方案中，所述张度调节剂包含山梨醇，且所述组合物的pH是约6.0至约8.0。在特定实施方案中，所述张度调节剂包含氯化钠，且所述组合物的pH是约6.0至约8.0。在某些实施方案中，所述张度调节剂包含约1％至约10％(w/v)、或约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约 8％(w/v)、约9％(w/v)、或约10％(w/v)的山梨醇。在特定实施方案中，所述张度调节剂是浓度为约10mM至约200mM、约50mM至200mM、约75mM至约200mM、约25mM至约150mM、约50mM至约150mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM或约150mM的氯化钠。在一个实施方案中，所述张度调节剂是浓度为约40mM的氯化钠。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含缓冲剂，其能够实现或维持pH在期望的范围内。在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种选自乙酸盐、磷酸盐、组氨酸和Tris的缓冲剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约1mM至约200mM、约1mM至约50mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约5mM、约10mM、约25mM或约50mM的磷酸盐。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲剂是磷酸钠或磷酸钾。在特定实施方案中，所述缓冲的组合物的pH是约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约5.5至约7.0、约6.0、约7.0、或约8.0。在一个实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约6.0至约8.0的pH。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约5mM至约200mM、约5mM至约150mM、约5mM至约100mM、约5mM、约10mM、约25mM或约50mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约5.5至约7.0、或约6.0的pH。在一个特定实施方案中，所述缓冲剂包含浓度为约10mM的磷酸盐，且所述缓冲的组合物具有约6.2的pH。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含蔗糖。在特定实施方案中，蔗糖以约0％(w/v)至约10％(w/v)、约1％(w/v)至约10％(w/v)、约2％(w/v)至约10％(w/v)、或约5％(w/v)的浓度存在于所述组合物中。
在包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普的组合物的某些实施方案中，所述组合物进一步包含表面活性剂。在特定实施方案中，所述表面活性剂是浓度为约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.03％(w/v)、或约0.02％(w/v)的聚山梨酯20。
在一个实施方案中，包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式、阿柏西普、氯化钠和磷酸盐。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯或蔗糖(或二者)。
在一个特定实施方案中，组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普；拮抗剂A或其修饰形式的浓度与阿柏西普的浓度的比率小于1；且所述组合物进一步包含浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约5mM至约50mM的磷酸盐、浓度为约0％(w/v)至约10％(w/v)的蔗糖和浓度为约0.005％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物的pH是约6.0至约8.0。
在某些实施方案中，所述组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；和(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐。在特定实施方案中，所述组合物进一步包含以下的一种或两种：(c)约5mM至约50mM磷酸盐缓冲剂(例如，约5mM至约50mM磷酸钠)；和(d)约10mM至约200mM NaCl。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含：(e)0至约10％(w/v)蔗糖。在某些实施方案中，所述组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；(c)约5mM至约50mM磷酸盐缓冲剂；(d)约10mM至约200mM NaCl；和(e)0至约10％(w/v)蔗糖，其中所述组合物的pH是约pH 6.0至约pH 8.0。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含：(f)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)聚山梨酯。在一个特定实施方案中，所述组合物包含：(a) 约6mg/mL拮抗剂A或其修饰形式或其药学上可接受的盐；(b)约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；(c)约10mM磷酸盐缓冲剂；(d)约40mM NaCl；和(e)约5％(w/v)蔗糖，其中所述组合物的pH是约pH 6.2。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含：(f)约0.03％(w/v)聚山梨酯20。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含：(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式；(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普；和以下的一种或多种：(c)缓冲剂，其能够实现或维持所述组合物的pH在约pH 5.0至约pH 8.0；(d)张度调节剂；和(e)0至约10％(w/v)蔗糖。在特定实施方案中，所述缓冲剂在存在时是约5mM至约50mM磷酸盐，且所述张度调节剂在存在时是约10mM至约200mM NaCl。
在特定实施方案中，本发明的组合物包含(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其修饰形式；(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普；(c)约5mM至约50mM磷酸盐；(d)约10mM至约200mM NaCl；(e)0至约10％(w/v)蔗糖；和(f)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂，其中所述组合物的pH是约pH 6.0至约pH 8.0。
本发明的组合物也包括不含表面活性剂的本文描述的任意组合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约6mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约40mg/mL的阿柏西普、浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约40mM的氯化钠和浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨酯20，且所述组合物具有pH约6.2。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约3mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约20mg/mL的阿柏西普、浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约40mM的氯化钠和浓度为约0.03％(w/v)的 聚山梨酯20，且所述组合物具有pH约6.2。
在特定实施方案中，包含拮抗剂A和阿柏西普的组合物在25℃在化学上稳定至少4周或至少8周，或在4℃在化学上稳定至少12周或至少24周。在特定实施方案中，至少70％的两种拮抗剂在这些条件下没有表现出导致新化学实体形成的分解或改变的迹象。
制备本发明的组合物的方法
本发明的组合物，包括本文描述的那些，可以通过包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成的方法来制备：将拮抗剂(例如，一种或多种抗-PDGF适体和一种或多种VEGF拮抗剂)和有效量的缓冲剂(例如，组氨酸、磷酸盐、乙酸盐或Tris缓冲剂)混合，并任选地将得到的混合物的pH调至约5.5至约8.0的pH，和如本文中所述的二者之间的变化。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：混合所述抗-PDGF适体和所述VEGF拮抗剂和有效量的张度剂。在一个特定方面，所述张度剂是氯化钠或山梨醇。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：混合所述抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂和有效量的表面活性剂。在特定方面，所述表面活性剂是聚山梨酯，例如，吐温20或吐温80。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：混合所述抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂和有效量的稳定剂、冷冻保护剂或冷冻保护剂。所述稳定剂可以是至少一种糖、氨基酸、多元醇、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、环糊精、聚乙二醇、白蛋白或盐。
在所述方法的特定方面，如下制备所述组合物：在本文描述的浓度范围内，混合所述抗-PDGF适体和所述VEGF拮抗剂和存在于本文描述的各种组合物中的各种赋形剂，包括上述的包含与贝伐珠单抗、雷珠单抗或阿柏西普组合的拮抗剂A或其修饰形式的每种具体组合物。
因而，在一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备本发明的组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约3mg/mL的终浓度、贝伐珠单抗至约12.5mg/mL的终浓度、磷酸盐至约50mM的终浓度、氯化钠至约130mM的终浓度和聚山梨酯20至约0.02％(w/v)的终浓度。在另一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备本发明的组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约6mg/mL的终浓度、贝伐珠单抗至约25mg/mL的终浓度、磷酸盐至约50mM的终浓度、氯化钠至约130mM的终浓度和聚山梨酯20至约0.02％(w/v)的终浓度。在某些实施方案中，将所述组合物的pH调至约6.0。
在另一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约3mg/mL的终浓度、雷珠单抗至约5mg/mL的终浓度、组氨酸至约10mM的终浓度、氯化钠至约130mM的终浓度和聚山梨酯20至约0.02％(w/v)的终浓度。在另一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约6mg/mL的终浓度、雷珠单抗至约10mg/mL的终浓度、组氨酸至约10mM的终浓度、氯化钠至约130mM的终浓度和聚山梨酯20至约0.02％(w/v)的终浓度。在某些实施方案中，将所述组合物的pH调至约6.0。
在另一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约6mg/mL的终浓度、阿柏西普至约40mg/mL的终浓度、磷酸盐至约10mM的终浓度、氯化钠至约40mM 的终浓度、蔗糖至约5％(w/v)的终浓度和聚山梨酯20至约0.03％(w/v)的终浓度。在另一个实施方案中，通过混合下述物质至下述终浓度，制备组合物：拮抗剂A或其修饰形式至约3mg/mL的终浓度、阿柏西普至约20mg/mL的终浓度、磷酸盐至约10mM的终浓度、氯化钠至约40mM的终浓度、蔗糖至约5％(w/v)的终浓度和聚山梨酯20至约0.03％(w/v)的终浓度。在某些实施方案中，将所述组合物的pH调至约6.2。
在某些实施方案中，在玻璃瓶或注射器中混合所述组合物，或在玻璃瓶或注射器中混合以后进行储存。
治疗或预防眼科疾病的方法
本发明的组合物可用于治疗或预防多种眼科疾病。在某些实施方案中，所述眼科疾病是新生血管病症。在其它实施方案中，所述眼科疾病导致视网膜水肿。本文描述了通过本发明可以治疗或预防的示例性的眼科疾病。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗或预防眼科疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用本发明的组合物。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的抗-PDGF适体是拮抗剂A或其修饰形式。在特定实施方案中，存在于所述组合物中的VEGF拮抗剂是雷珠单抗、贝伐珠单抗或阿柏西普。在特定实施方案中，存在于本发明的组合物中的治疗剂包含有效量的：(i)拮抗剂A或其修饰形式和雷珠单抗；(ii)拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗；或(iii)拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式、雷珠单抗、组氨酸和氯化钠。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰 形式和雷珠单抗(拮抗剂A或其修饰形式的浓度与贝伐珠单抗的浓度的比率小于2)、浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约1mM至约100mM的组氨酸和浓度为约0.005％至约0.05％、或0.001％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约3mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约5mg/mL的雷珠单抗、浓度为约10mM的组氨酸、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。在另一个实施方案中，所述组合物包含浓度为约6mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约10mg/mL的雷珠单抗、浓度为约10mM的组氨酸、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式、贝伐珠单抗、氯化钠、磷酸盐和聚山梨酯。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和贝伐珠单抗(拮抗剂A或其修饰形式的浓度与贝伐珠单抗的浓度的比率小于1)、浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约5mM至约200mM的磷酸盐和浓度为约0.005％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物的pH是约5.5至约7.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约3mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约12.5mg/mL的贝伐珠单抗、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。在另一个实施方案中，所述组合物包含浓度为约6mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为 约25mg/mL的贝伐珠单抗、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为约130mM的氯化钠和浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物的pH是约6.0。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普、氯化钠和磷酸盐。所述组合物可以进一步包含聚山梨酯或蔗糖(或二者)。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物包含拮抗剂A或其修饰形式和阿柏西普(拮抗剂A的浓度与阿柏西普的浓度的比率小于1)、浓度为约10mM至约200mM的氯化钠、浓度为约5mM至约50mM的磷酸盐、浓度为约0％(w/v)至约10％(w/v)的蔗糖和浓度为约0.005％至约0.05％的聚山梨酯(例如，聚山梨酯20)，其中所述组合物具有约6.0至约8.0的pH。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约6mg/mL的拮抗剂A或其修饰形式、浓度为约40mg/mL的阿柏西普、浓度为约10mM的磷酸盐、浓度为约40mM的氯化钠和浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨酯20，其中所述组合物具有约6.2的pH。
眼科疾病
在某些实施方案中，所述眼科疾病是年龄相关的黄斑变性。年龄相关的黄斑变性的例子是非新生血管(也被称作“干性”)和新生血管(也被称作“湿性”)黄斑变性。在一个实施方案中，所述干性年龄相关的黄斑变性与玻璃疣形成有关。在某些实施方案中，治疗或预防干性黄斑变性包括治疗或预防视网膜色素上皮的异常。视网膜色素上皮的异常的例子包括地图样萎缩、非地图样萎缩、局部色素沉着不足和局部色素沉着过多。在某些实施方案中，治疗或预防湿性年龄相关的黄斑变性包括治疗或预防脉络膜新生血管形成或色素上皮脱离。
在其它实施方案中，所述眼科疾病是多息肉状脉络膜血管病。多息肉状脉络膜血管病的特征在于来自血管的内脉络膜血管网络的病变，终结于动脉瘤凸起或向外突出物(Ciardella等人(2004)Surv Ophthalmol 4925-37)。
在某些实施方案中，所述眼科疾病是与脉络膜新生血管形成有关的病症。与脉络膜新生血管形成有关的病症的例子包括变性的、炎症性的、创伤性的或特发性的病症。在某些实施方案中，治疗或预防与脉络膜新生血管形成有关的变性障碍包括治疗或预防遗传性变性障碍。遗传性变性障碍的例子包括卵黄状黄斑营养不良、眼底黄色斑点症和视神经头玻璃疣。与脉络膜新生血管形成有关的变性病症的例子包括近视性变性或血管样条纹症。在其它实施方案中，治疗或预防与脉络膜新生血管形成有关的炎症性障碍包括治疗或预防眼组织胞浆菌病综合征、多病灶性脉络膜炎、serpimnous脉络膜炎、弓形虫病、弓蛔虫病、风疹、伏格特-小柳-原田三氏综合征、白塞综合征或交感性眼炎。在其它实施方案中，治疗或预防与脉络膜新生血管形成有关的创伤性障碍包括治疗或预防脉络膜破裂或由强烈光凝固造成的创伤性病症。
在其它实施方案中，所述眼科疾病是高血压性视网膜病变或镰状红细胞性视网膜病变。
在一个实施方案中，所述眼科疾病是糖尿病性视网膜病变。糖尿病性视网膜病变可以是非增生性或增生性糖尿病性视网膜病变。非增生性糖尿病性视网膜病变的例子包括黄斑水肿和黄斑缺血。
在特定实施方案中，所述眼科疾病是与周围视网膜新生血管形成有关的病症。与周围视网膜新生血管形成有关的病症的例子包括缺血性血管疾病、可能缺血的炎性疾病、色素失调症、色素性视网膜炎、视网膜劈裂症或慢性视网膜脱离。缺血性血管疾病的例子包括增生性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉分枝阻塞、视网膜小动脉分枝阻塞、 颈动脉海绵窦瘘、镰状化血红蛋白病、非镰状化血红蛋白病、IRVAN综合征(以特发性视网膜血管炎、动脉瘤和视神经视网膜炎为特征的视网膜血管炎障碍)、视网膜栓塞、早产儿视网膜病变、家族性渗出性玻璃体视网膜病变、高粘滞综合征、主动脉弓综合征或伊尔斯病。镰状化血红蛋白病的例子包括SS血红蛋白病和SC血红蛋白病。非镰状化血红蛋白病的例子包括AC血红蛋白病和AS血红蛋白病。高粘滞综合征的例子包括白血病、Waldenstrom巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、红细胞增多症或骨髓增生性障碍。
在某些实施方案中，治疗或预防可能缺血的炎性疾病包括治疗或预防与全身性疾病有关的视网膜血管炎、与传染性病原体有关的视网膜血管炎、葡萄膜炎或鸟枪弹视网膜病变。全身性疾病的例子包括全身性红斑狼疮、贝赫切特病、炎性肠病、结节病、多发性硬化、韦格纳肉芽肿病和结节性多动脉炎。传染性病原体的例子包括作为梅毒、结核病、莱姆病或猫抓病的致病因子的细菌因子，病毒诸如疱疹病毒，或寄生虫诸如犬弓蛔虫(Toxocara canis)或刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。葡萄膜炎的例子包括睫状体扁平部炎或Fuchs葡萄膜炎综合征。
在某些实施方案中，所述眼科疾病是早产儿视网膜病变。早产儿视网膜病变可以源自支持发育视网膜的血管床中的血管的异常生长(Pollan C(2009)Neonatal Netw.28:93-101)。
在其它实施方案中，所述眼科疾病是静脉闭塞性疾病或动脉闭塞性疾病。静脉闭塞性疾病的例子包括视网膜静脉分枝阻塞和视网膜中央静脉闭塞。视网膜静脉分枝阻塞可以是排出视网膜的血液的循环部分的阻塞。所述阻塞可以造成微血管中的贮存(back-up)压力，这可以导致出血，并且也导致流体和血液的其它组分的渗漏。动脉闭塞性疾病的例子包括视网膜动脉分枝阻塞、视网膜中央动脉阻塞或眼缺血综合征。当供给视网膜的动脉分枝之一变得阻塞时，可以发生视网膜 动脉分枝阻塞(BRAO)。
在特定实施方案中，所述眼科疾病是中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSC)。在一个实施方案中，CSC的特征在于中央黄斑中的流体的渗漏。
在一个实施方案中，所述眼科疾病是囊样黄斑水肿(CME)。在某些实施方案中，CME影响中央视网膜或黄斑。在另一个实施方案中，CME在白内障外科手术之后发生。
在其它实施方案中，所述眼科疾病是视网膜毛细管扩张。在一个实施方案中，视网膜毛细管扩张的特征在于视网膜血管的扩张和扭曲以及多发性动脉瘤的形成。特发性JXT、莱贝尔氏粟粒性动脉瘤和冠茨病是视网膜毛细管扩张的3种类型。
在一个实施方案中，所述眼科疾病是动脉大动脉瘤。
在一个实施方案中，所述眼科疾病是视网膜血管瘤病。在一个实施方案中，当眼血管形成多发性血管瘤时，发生视网膜血管瘤病。
在一个实施方案中，所述眼科疾病是辐射诱导的视网膜病变(RIRP)。在一个实施方案中，RIRP可以表现出征状诸如黄斑水肿以及非增生性和增生性视网膜病变。
在某些实施方案中，所述眼科疾病是虹膜发红。在一个实施方案中，虹膜发红导致新生血管性青光眼的形成。在另一个实施方案中，虹膜发红由糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉闭塞、眼缺血综合征或慢性视网膜脱离造成。
在某些实施方案中，所述眼科疾病是肿瘤。肿瘤的例子包括眼睑 肿瘤、结膜肿瘤、脉络膜肿瘤、虹膜肿瘤、视神经肿瘤、视网膜肿瘤、浸润性眼内肿瘤或眶肿瘤。眼睑肿瘤的例子包括基底细胞癌、鳞状癌、皮脂腺癌、恶性黑素瘤、毛细血管瘤、水囊肿、痣或脂溢性角化病。结膜肿瘤的例子包括结膜卡波西氏肉瘤、鳞状癌、结膜的上皮内瘤形成、epibular皮样瘤、结膜的淋巴瘤、黑素瘤、睑裂黄斑或翼状胬肉。脉络膜肿瘤的例子包括脉络膜痣、脉络膜视网膜病变、转移性脉络膜肿瘤、脉络膜骨瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤或太田痣。虹膜肿瘤的例子包括前葡萄膜转移、虹膜囊肿、虹膜黑素细胞瘤、虹膜黑素瘤或虹膜的珍珠状囊肿。视神经肿瘤的例子包括视神经黑素细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、影响视神经的脉络膜黑素瘤、或具有视神经病的乳头周转移。视网膜肿瘤的例子包括视网膜色素上皮(RPE)肥大、RPE腺瘤、RPE癌、视网膜母细胞瘤、RPE的错构瘤或von Hippel血管瘤。浸润性眼内肿瘤的例子包括慢性淋巴细胞白血病、浸润性脉络膜病变或眼内淋巴瘤。眶肿瘤的例子包括泪腺的腺样囊性癌、眶的海绵状血管瘤、眶的淋巴管瘤、眶粘液囊肿、眶假瘤、眶横纹肌肉瘤、儿童眼周血管瘤或致硬化的眶假瘤。
本发明的组合物可以单独施用，或与另一种疗法结合施用，并且可以在家中、医生诊室、诊所、医院门诊部或医院提供。施用的持续时间可以取决于要治疗或预防的眼科疾病的类型、哺乳动物的年龄和病症、哺乳动物疾病的阶段和类型、以及哺乳动物对治疗如何应答。在特定实施方案中，所述哺乳动物是人。另外，具有较大发展眼科疾病的风险的哺乳动物(例如，糖尿病患者)可以接受治疗来抑制或延迟征状的发作。在一个实施方案中，与当使用治疗剂时利用的剂量相比，本发明的方法或组合物允许施用相对更低剂量的一种或多种存在于所述组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂。
本发明的组合物的施用可以是通过任意合适的方式，所述方式导致可有效地治疗或预防眼科疾病的量的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂。在一个实施方案中，以有效地治疗或预防眼科疾病的量施用所述组合 物。
施用的组合物的剂量可以取决于几个因素，包括病症的严重程度、要治疗还是预防病症、以及要治疗的人的年龄、重量和健康。另外，关于特定患者的药物基因组(基因型对治疗剂的药代动力学、药效动力学或效力特性的影响)信息可能影响使用的剂量。此外，可以根据多种因素稍微调节确切的个别剂量，所述因素包括存在于组合物中的治疗剂的具体组合、给药时间、给药途径、组合物的性质、排泄速率、要治疗的特定眼科疾病、障碍的严重程度、和障碍的解剖学位置。与载体材料混合以产生单次剂量的每种拮抗剂的量可以随要治疗的哺乳动物和特定施用模式而变化。
对于通过胃肠外注射施用组合物而言，抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂中的每一种的剂量通常是0.1mg至250mg/天、1mg至20mg/天、或3mg至5mg/天。可以施用注射多达每天4次。通常，当胃肠外地施用时，用在本发明中的抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂的剂量通常是0.1mg至1500mg/天、或0.5mg至10mg/天、或0.5mg至5mg/天。可以施用至少多达3000mg/天的剂量。
当眼科学地(例如玻璃体内地)施用给人时，存在于本发明的组合物中的抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂中的每一种的剂量通常是0.003mg至5.0mg/眼/施用、或0.03mg至3.0mg/眼/施用、或0.1mg至1.0mg/眼/施用。在一个实施方案中，所述组合物中的一种或多种抗-PDGF适体的剂量是0.03mg、0.3mg、1.5mg或3.0mg/眼。在另一个实施方案中，所述组合物中的VEGF拮抗剂的剂量是约0.5mg/眼。所述剂量的范围可以是每只眼施用0.01mL至0.2mL，或每只眼施用0.03mL至0.15mL，或每只眼施用0.05mL至0.10mL。例如，在某些实施方案中，以至多100μL的注射体积，以至多30mg/ml玻璃体内地递送抗-PDGF适体拮抗剂A。
本发明的组合物的施用可以是每天1-4次、或每月1-4次、或每年1-6次、或每2、3、4或5年1次。施用可以持续1天或1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年，并且可以甚至是患者的终生。在一个实施方案中，每个月1次地进行所述施用，持续3个月。在许多情况下，指示慢性长期施用。可以施用所述剂量作为单剂量或分成多剂量。一般而言，应当在设定的间隔施用期望的剂量经历长时间段，经常至少经历几周或几个月，尽管可能需要几个月或几年或更长的较长施用时段。
除了治疗预存眼科疾病以外，可以预防性地施用所述组合物，以便预防或减慢这些障碍的发作。在预防性应用中，可以将所述组合物施用给易感或在其它方面处于特定眼科疾病风险中的哺乳动物。
在一个实施方案中，将本发明的组合物施用给需要其治疗的哺乳动物，通常以可注射的药物组合物的形式。所述施用可以是通过注射，例如通过眼内注射，或通过使用药物递送装置。胃肠外、全身性或透皮施用也在本发明范围内。
使用控释组合物，可以将组合物配制成基本上在施用后立即或者在施用后的任何预定时间段释放抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂。例如，可以以持续释放形式提供组合物。立即或持续释放组合物的使用取决于要治疗的病症的性质。例如，如果所述病症由急性障碍组成，可以在延长的释放组合物中使用采用立即释放形式的治疗。对于某些防止性或长期治疗，还可以使用持续释放的组合物。
可以采用多种策略来得到控释，其中，释放速度超过了治疗剂的降解或代谢的速度。例如，通过适当选择组合物参数和成分(包括、例如，适当的控释组合物和包衣剂)可以获得控释。例子包括油溶液、混悬液、乳剂、微胶囊、微球、纳米颗粒、贴剂和脂质体。也可以使用贮库制剂，例如，以原位形成的微粒、植入物或固体大丸剂的形式。 贮库制剂可以包含可生物降解的聚合物赋形剂，其控制药物释放速率并在药物释放过程中或以后再吸收。一类可生物降解的聚合物是丙交酯/乙交酯聚合物。这些可吸收的聚合物是生物相容的，并且被认为通过水解再吸收，最初水解为乳酸和羟乙酸，最终水解为二氧化碳和水。
使用药物递送装置诸如植入物，也可以递送本发明的组合物。这样的植入物可以是可生物降解的或生物相容的，或者可以是不可生物降解的。所述植入物可以是抗-PDGF适体或VEGF拮抗剂可透过的，或者通过生物侵蚀而递送药剂。可以将眼科药物递送装置插入眼的室(诸如前房或后房)中，或者可以植入巩膜、脉络膜空间或在玻璃质外部的血管化区域的内部或表面。在一个实施方案中，所述植入物可以定位在血管区域上面，诸如在巩膜表面上，从而允许抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂经巩膜扩散至期望的治疗部位，例如，眼内空间和眼的黄斑。此外，经巩膜扩散部位可以是在新生血管形成部位的近侧，诸如在黄斑近侧的部位。合适的药物递送装置描述在，例如，美国公开号2008/0286334；2008/0145406；2007/0184089；2006/0233860；2005/0244500；2005/0244471；和2005/0244462，和美国专利号6,808,719和5,322,691，它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，所述植入物包含分散在可生物降解的聚合物基质中的本发明的组合物。所述基质可以包含PLGA(聚乳酸-聚乙醇酸共聚物)、酯端加帽的聚合物、酸端加帽的聚合物或其混合物。在另一个实施方案中，所述植入物包含含有抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物、表面活性剂和亲脂化合物。所述亲脂化合物可以以植入物的约80-99重量％的量存在。合适的亲脂化合物包括、但不限于硬脂酸棕榈酸甘油酯、二乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、单亚油酸甘油酯、单油酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、二油酸甘油酯、单亚油酸甘油酯、二亚油酸甘油 酯、单二十烷酸甘油酯、双二十烷酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、二山嵛酸甘油酯、及其混合物。
在另一个实施方案中，所述植入物包含被容纳在中空套管内的本发明的组合物。如下将包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物递送至眼：将所述套管插入眼中，将植入物从所述套管释放进眼中，然后从眼取出所述套管。该递送装置的一个例子描述在美国公开号2005/0244462中，其特此通过引用整体并入。
在一个实施方案中，所述植入物是柔性眼睛插入物装置，其适用于抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂向眼睛中的受控持续释放。在一个实施方案中，所述装置包括呈棒或管(其含有包含抗-PDGF适体和VEGF拮抗剂的组合物)的形式的长形聚合材料主体，并且具有至少2个从所述主体向外径向地伸出的锚定突出物。所述装置可以具有至少8mm的长度和没有超过1.9mm的它的主体部分(包括突出物)的直径。持续释放机制可以是例如通过扩散或通过渗透或生物侵蚀。借助于穹窿解剖结构，可以将所述插入物装置插入眼的上或下穹窿，从而独立于眼的活动。所述突出物可以具有多种形状，例如，肋状物、螺纹、微坑或肿块、截短的圆锥形区段或缠绕的编织物区段。在另一个实施方案中，将所述主体的聚合材料选择为在液体环境中膨胀的材料。因而，可以采用具有较小初始尺寸的装置。所述插入物装置可以具有这样的尺寸和构型：使得在插入上或下穹窿中以后，所述装置保留在视野之外，从而在延长的使用时段内较好地保持就位且难以被受体觉察。所述装置可以在上或下穹窿中保留7-14天或更久。该装置的一个例子描述在美国专利号5,322,691中，其特此通过引用整体并入。
在某些实施方案中，使用药物递送装置诸如外植物(exoplant)，例如，巩膜上外植物，诸如在Pontes de Carvalho,R.A.等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.2006,47(1):4532-9(通过引用整体并入)中描述的那种，也可以递送本发明的组合物。这样的外植物可以是可生物降解 的或生物相容的，或者可以是不可生物降解的。
在其它实施方案中，使用药物递送装置诸如可再填充的眼内贮库，也可以递送本发明的组合物。
定量施用通常依赖于要治疗的病症的严重程度和应答性，疗程持续几天至几个月，或直到达到治愈或实现疾病状态的减少。从身体中或在局部部位处的药物蓄积的测量结果，或基于患者的应答，可以计算最佳定量施用方案。技术人员可以优化剂量、定量施用方法和重复比率。最适剂量可以随抗-PDGF激动剂和VEGF拮抗剂的效能而变化，且也可以基于在体外和体内动物研究中的EC50来估测。
实施例
实施例1
包含拮抗剂A和雷珠单抗的组合物的稳定性
在一定范围的条件下检查了在不同组合物中的拮抗剂A和雷珠单抗(可作为从Genentech(S.San Francisco,CA)商购得到)的组合物稳定性。使用不同pH(5.0-8.0)和张度调节剂(氯化钠、山梨醇和海藻糖)来优化在不同储存条件(4℃、25℃和37℃)和在物理应力(搅拌)下的组合物稳定性。通过目视观察、pH测量和各种HPLC方法(阴离子交换[AEX-HPLC]、弱阳离子交换[WCX-HPLC]和尺寸排阻[SE-HPLC])，表征拮抗剂A和雷珠单抗的组合物稳定性。
在16周的研究中，确定了在检查的组合物中，包含在10mM L-组氨酸pH 6.0、130mM NaCl、0.01％(w/v)聚山梨酯20(F6)中的3mg/mL的拮抗剂A和5mg/mL的雷珠单抗的组合物是最稳定的，并且提供针对拮抗剂A和雷珠单抗的降解的最大保护。在本文中提供了进行的实验的更详细描述。
组合物参数 
检查了下述组合物参数：
(1)pH:4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.3、8.0
(2)缓冲剂:乙酸盐、磷酸盐、组氨酸和2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇(“Tris”)
(3)张度调节剂：氯化钠、山梨醇和海藻糖
(4)表面活性剂：聚山梨酯20[0.01％和0.005％(％w/v)]
固定下述参数：
(1)填充体积为300μL，在由Ophthotech Corp.(得自Mglas AG,Munnerstadt,德国)提供的改进的3cc管形瓶中
(2)雷珠单抗的浓度为5mg/mL
(3)拮抗剂A的浓度固定在3mg/mL
下面的表1总结了在该研究中使用的组合物基质。
表1.组合物基质
“Ant.A”是拮抗剂A；“ran.”是雷珠单抗
样品制备
为了得到3mg/mL的拮抗剂A在组合物中的浓度，在10mM磷 酸盐、150mM NaCl和pH 7.3制备6mg/mL的拮抗剂A储备溶液。将得到的储备溶液与稀释形式的市售(10mg/mL)1:1混合，从而产生3mg/mL拮抗剂A和5mg/mL雷珠单抗的终浓度(F11)。将所述组合物放在10kDa分子量截止值透析盒中，并在表1中所列出的不同组合物缓冲液中进行约1,000,000倍透析(组合物编号F2-F3、F5-F10)。
组合物研究 
在下述条件下试验所述组合物(尽管某些组合物由于在早前时间点的降解而没有在所有时间点进行试验)：
表2.试验条件
条件 时间点
4℃ 0、2、4、8、12和16周
25℃ 2、4、8和12周
37℃ 2、4、8和12周
搅拌 4小时
分析方法
为了测量各种组合物中在应力下产生的任何降解产物的浓度，使用下述指示稳定性的测定：
(1)SE-HPLC(拮抗剂A和雷珠单抗的分析)
●流动相：50mM磷酸盐缓冲剂,100mM氯化钠,pH 7.0
●柱：Tosoh TSKgel G3000SWXL 7.8mm x 300mm,5μm颗粒
●柱温度：周围
●流速：1.0mL/min
●波长：信号，280nm；参比，360nm
●注射体积：5μL
●样品制备：没有稀释
●基于鉴别的拮抗剂A和雷珠单抗的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比。
(2)WCX-HPLC(雷珠单抗的分析)
●流动相A：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0
●流动相B：10mM磷酸盐缓冲液，500mM氯化钠,pH 7.0
●柱：Dionex ProPac WCX-10,4x 250mm
●柱温度：周围
●流速：1.0mL/min
●波长：信号，214nm；参比，360nm
●注射体积：5μL
●样品制备：没有稀释
●基于鉴别的拮抗剂A和雷珠单抗的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比。
(3)AEX-HPLC(拮抗剂A的分析)
●流动相A：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0
●流动相B：10mM磷酸盐缓冲液，500mM氯化钠,pH 7.0
●柱：Dionex DNA Pac PA-100,4x 250mm
●柱温度：40℃
●流速：1.2mL/min
●波长：信号，258nm；参比，360nm
●注射体积：5μL
●样品制备：没有稀释
●基于鉴别的拮抗剂A和雷珠单抗的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比。
(4)pH
●VWR symphony SB70P
(5)目视观察
●从Sony Cyber-shot DSC-H9Digital Still照相机(810万像素)拍摄照片
(6)渗量(osmolarity)
●Advanced Instruments,Inc.The Advanced Osmometer Model 3D3
稳定性概述 
分析了搅拌(4小时)和不同储存温度(4℃、25℃和37℃)对不同拮抗剂A和雷珠单抗组合物的影响。在研究中，所有试验的组合物能够在所有储存和应力条件下维持它们的靶pH值，即，滴定的最初pH。
指示稳定性的测定
在37℃储存过程中在2周以后，组合物F2形成可见的沉淀物(数据未显示)。没有进行沉淀物的定量测量的其它测定。
通过AEX-HPLC有效地分析了拮抗剂A在储存过程中的降解(图1)。当在高温温育样品时，观察到前峰和后峰的形成(图1)。在组合物F2中，拮抗剂A的AEX-HPLC纯度在37℃储存8周过程中下降了接近20％。
WCX-HPLC也有效地表征了雷珠单抗在储存过程中的降解(图2)。当在高温温育雷珠单抗时，观察到前峰和后峰的形成(图2)。
SE-HPLC测定可用于表征雷珠单抗的可溶性聚集或片段化(图3)。拮抗剂A没有表现出通过SE-HPLC可发现的显著变化，尽管它的聚集形式的分辨率可能超过Tosoh TSKgel G3000SWXL柱的能力。在37℃储存过程中，组合物F3和组合物F5中的雷珠单抗经历聚集或片段化(图3)。
搅拌对稳定性的影响
在表1中列出的所有组合物经历4小时搅拌，将一组未搅拌的对照组合物在室温静置。在任何分析方法上，在对照样品和搅拌样品之间没有观察到差异(数据未显示)。
储存温度对稳定性的影响
在37℃的储存会产生研究的不同组合物中的拮抗剂A和雷珠单抗的显著的、但是不同水平的降解。在2周之前，组合物F2形成沉淀(数据未显示)。所有其它组合物保持澄清直到8周，且对于几种组合物(组合物F1、F4、F6、F8和F11)而言直到12周。
在37℃储存2周以后，基于AEX-HPLC，组合物F2中的拮抗剂A纯度已经下降了接近20％。在相同储存条件下，组合物F3和F5在4周以后也显示出增加的拮抗剂A降解(图4)。在8周之前，组合物F8似乎给拮抗剂A提供比F6和F7更大的保护。在12周之前，F8继续显示更高的拮抗剂A纯度(图4)。
组合物F2也不能阻止雷珠单抗的降解，因为WCX-HPLC检测到在2周之前接近20％的纯度损失(图5)。在第四周之前，许多组合物(F3、F5、F7、F8、F9和F10)表现出与F6相比显著的雷珠单抗降解(图5)。组合物F6维持雷珠单抗的最佳纯度多达12周(图5)。
基于在4℃得自2、8和12周的结果(其显示了天然形式的雷珠单抗的单个峰)，所有组合物通过SE-HPLC表现出拮抗剂A和雷珠单抗的类似纯度特性多达4周(图14和图15)。对于拮抗剂A而言，在所有储存条件没有观察到显著的变化，包括在37℃储存12周(图6)。但是，雷珠单抗在25℃和37℃储存过程中发生聚集。在相同储存条件下，用稀释形式的市售(F4)没有观察到显著的聚集(图7)。
与在37℃相比，所有组合物在25℃储存过程中表现出更好的视觉稳定性。在8周中，所有组合物保持澄清。2种组合物(F6和F8)在另外12周时间点保持澄清。
对于在25℃的前4周，所有组合物维持相当的拮抗剂A纯度，如通过AEX-HPLC所表征的(图8)。组合物F2在8周之前经历拮抗剂A 降解的显著增加(图8)。并且，组合物F3和F5在相同时间范围内显示出纯度的大量下降(图8)。组合物F6、F7和F8能够维持拮抗剂A的纯度多达12周(图8)。
雷珠单抗的WCX-HPLC分析显示出组合物之间微小的、但是鉴别性的纯度特性变化。在25℃储存2周以后，组合物F2形成雷珠单抗的大量降解(图9)。剩余的组合物维持雷珠单抗的相当纯度直到第8周，此时pH 8.0组合物(F9和F10)揭示雷珠单抗纯度的大量下降(图9)。组合物F6能够阻止雷珠单抗在25℃的降解，如通过WCX-HPLC分析所确定的(图9)。
除了它的固有变异性以外，SE-HPLC测定表明在25℃储存过程中拮抗剂A特性没有显著变化(图10)。一般而言，所有组合物似乎会在8周中阻止拮抗剂A的聚集或片段化，且对于组合物F6和F8而言，在12周中(图10)。组合物F8和F6在25℃维持良好的雷珠单抗纯度达12周(图11)。
拮抗剂A和雷珠单抗在4℃在大多数组合物中保持稳定。通过目检，所有组合物保持澄清。此外，除了产生大量可溶性的雷珠单抗聚集体的F2、F3和F5(图15)以外，通过所有HPLC方法，大多数组合物维持与起始原料相当的纯度(图12-15)。
组合物特征/组分对稳定性的影响
为了确定pH和不同的组合物组分对拮抗剂A和雷珠单抗的稳定性具有的影响，将拮抗剂A和雷珠单抗在不同的pH水平(5.0-8.0)并与不同的张度调节剂(氯化钠和山梨醇)一起共同配制。本部分描述了当在不同温度储存时pH和组合物组分对拮抗剂A和雷珠单抗中的一种或两种的稳定性的影响。
pH对稳定性的影响
通过在含有山梨醇的且含有NaCl的组合物中在37℃储存，最佳地区分pH对拮抗剂A和雷珠单抗的稳定性的影响(图16)。基于AEX-HPLC，拮抗剂A的降解与pH相反地关联，在pH 5.0具有最大降解(图16)。pH的变化会造成含有山梨醇的组合物中的雷珠单抗的纯度特性的不太显著的变化。基于WCX-HPLC，在pH 5.0配制会产生在37℃保持4周以后雷珠单抗的更快降解，但是在37℃保持8周以后产生与pH 6.0组合物类似的降解(图17)。在含有NaCl的组合物中，雷珠单抗至少在pH 6.0降解，而pH 7.0在含有山梨醇的组合物中是最佳的。使用SE-HPLC评价拮抗剂A(图18)和雷珠单抗(图19)，雷珠单抗的聚集速率在pH 7.0的组合物中是最慢的，而对于拮抗剂A降解而言没有观察到变化。
张度调节剂对稳定性的影响
通过对比得自37℃储存的结果，区分张度调节剂对拮抗剂A和雷珠单抗的稳定性的影响。如通过AEX-HPLC所表征的，在pH 5.0-7.0、在8周中，拮抗剂A在NaCl组合物中比在山梨醇组合物中更稳定(图20)。在pH 8.0，在4周中在含有氯化钠或山梨醇的组合物之间不可做出可辨别的差异(图21)。对于雷珠单抗组合物，如通过WCX-HPLC所表征的，氯化钠组合物在试验的pH范围(pH 5.0-8.0)内胜过山梨醇组合物(图22)。还通过SE-HPLC揭示了氯化钠组合物在稳定雷珠单抗中的优越性能(图23)。对于含有两种张度调节剂的组合物，可溶性的聚集水平在pH 7.0为最低，在pH 5.0为最高(图23)。
拮抗剂A和的1:1混合物的稳定性
研究的另一个方面涉及表征混合拮抗剂A和市售的作用。为此，将拮抗剂A在10mM磷酸钠和150mM NaCl的组合物(pH7.3)中从它的原始浓度30mg/mL稀释至6mg/mL，随后将得到的组合物与等体积(1:1)的市售(10mg/mL)组合。通过在37℃储存，检查1:1混合物(F11)的稳定性，并与在类似浓度和储存温度的单独F1和F4进行对比。
对于拮抗剂A，SE-HPLC分析指示，在12周中在37℃，1:1混合物(F11)中的拮抗剂A的稳定性与单独F1相当(图24)。尽管通过AEX-HPLC表明，拮抗剂A在37℃储存过程中在较早时间点在1:1混合物中发生较快的降解，但是F1和1:1混合物(F11)在12周之前表现出可比较的纯度(图25)。当在25℃储存样品时，没有观察到AEX-HPLC纯度特性的差异(图25)。
在类似的储存条件下，雷珠单抗在1:1混合物中遇到比拮抗剂A更多的稳定性问题。F11中的雷珠单抗维持与F4中的雷珠单抗可比较的WCX-HPLC特性直到在37℃储存4周，此后雷珠单抗在混合物(F11)中发生更快的降解(图26)。但是，当在25℃储存样品时，雷珠单抗在混合物中保持相当稳定(图26)。在25℃，在混合物和F4之间没有观察到雷珠单抗的WCX-HPLC纯度特性的显著差异。SE-HPLC揭示了在37℃储存8周以后1:1混合物中聚集的雷珠单抗与F4相比的显著增加(图27a)。混合物中的聚集当在25℃储存时大幅降低，且在4℃没有观察到(图27b-c)。
组合物F6的稳定性
拮抗剂A的AEX-HPLC分析指示，F6组合物维持拮抗剂A的纯度直到在25℃保持12周和直到在4℃保持至少16周(试验的最后时间点)(图28)。在37℃，在早至2周观察到拮抗剂A降解(图28)。用F6配制会帮助保护雷珠单抗免于在37℃降解多达4周，然后在8周之前形成通过WCX-HPLC发现的纯度显著下降(图29)。但是，雷珠单抗在25℃在组合物F6中稳定多达至少12周且在4℃稳定多达至少16周，通过WCX-HPLC未发现纯度的任何实质损失(图29)。
SE-HPLC结果指示，拮抗剂A在所有储存条件下在16周中保持稳定(图30)。对于雷珠单抗而言，当在F6组合物中在37℃温育12周时，没有观察显著聚集(图31)。当在4℃或25℃储存时，F6组合物表 现得更好，在2种温度在8周中具有可比较的纯度。在F6组合物中的雷珠单抗在25℃和37℃的聚集比在F4中更快。
从这些排列研究，在所有储存温度和用于该研究的分析方法，组合物F6平均而言表现出最好稳定性。
实施例2
包含拮抗剂A和贝伐珠单抗的组合物的稳定性
在许多条件下检查了组合物中的拮抗剂A的稳定性，所述组合物也包括抗-VEGF单克隆抗体(mAb)贝伐珠单抗，其可作为阿伐他汀从Genentech(S.San Francisco,CA)商购得到。使用不同pH(4.0-8.0)和张度调节剂(氯化钠、山梨醇和海藻糖)来优化当在不同温度(4℃、25℃和37℃)储存时和对抗物理应力(搅拌)的拮抗剂A和贝伐珠单抗的组合物稳定性。通过目视观察、pH测量和各种HPLC方法(阴离子交换[AEX-HPLC]、弱阳离子交换[WCX-HPLC]和尺寸排阻[SE-HPLC])，表征拮抗剂A和贝伐珠单抗的稳定性。
当将二者一起组合在某些试验的组合物中时，拮抗剂A与贝伐珠单抗相容，没有可辨别的稳定性问题。基于得自24周稳定性研究的结果，用组合物F19观察到最佳稳定性。在F19组合物中，拮抗剂A和贝伐珠单抗在4℃保持稳定24周，且在25℃保持稳定多达至少4周。
组合物参数 
检查了下述组合物参数：
(1)pH:4.0、5.0、6.0、6.2、6.3、7.0、7.3、8.0
(2)缓冲剂:乙酸盐、磷酸盐和Tris
(3)张度调节剂：氯化钠、山梨醇和海藻糖
(4)表面活性剂：聚山梨酯20
(5)拮抗剂A浓度：30mg/mL、15mg/mL和3mg/mL
固定下述参数：
(1)填充体积为300μL，在由Ophthotech Corp.(得自Mglas AG,Munnerstadt,德国)提供的改进的3cc管形瓶中
(2)贝伐珠单抗的浓度为12.5mg/mL。
下面的表3总结了在该研究中使用的组合物基质。
表3.拮抗剂A的组合物基质：贝伐珠单抗组合物
样品制备
在10mM磷酸盐、150mM NaCl(pH 7.3)中，制备6mg/mL的拮抗剂A储备溶液。将得到的储备溶液与市售阿伐他汀(25mg/mL)1:1混合，得到3mg/mL拮抗剂A和12.5mg/mL贝伐珠单抗的终浓度(组合物F26)。将所述组合物放在10kDa分子量截止值透析盒中，并在表3列出的不同组合物缓冲液(组合物编号F13-F17、F19-F23)中进行约 1,000,000倍透析。例外包括下述的：
●组合物F12n不需要额外稀释或透析。
●将市售阿伐他汀用含有6％(w/v)海藻糖和0.02％(w/v)聚山梨酯20的50mM磷酸盐缓冲剂(pH 6.2)进行1:1稀释，以提供组合物F18。
●通过将组合物F12与市售阿伐他汀进行1:1混合，制备组合物F24。
●通过用含有150mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)将组合物F12稀释10倍，制备组合物F25。
应力研究
在下述应力条件下试验表3的组合物： 
表4.应力条件
分析方法
为了分析在应力下产生的降解产物，开发了下述指示稳定性的测定，并用在该研究中。
(1)SE-HPLC(拮抗剂A和贝伐珠单抗的分析)
●流动相:50mM磷酸盐缓冲剂,100mM氯化钠,pH 7.0
●柱：TOSOH TSKgel G3000SWXL
●柱温度：周围
●流速：1.0mL/min
●波长：信号，214nm；参比，360nm
●注射体积：1μL
●样品制备： 
-对于30mg/mL适体样品，在Milli-Q水中稀释10倍
-对于其它样品，不进行稀释
●基于鉴别的拮抗剂A和贝伐珠单抗的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比
(2)WCX-HPLC(贝伐珠单抗的分析)
●流动相A：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0
●流动相B：10mM磷酸盐缓冲液，500mM氯化钠,pH 7.0
●柱：Dionex ProPac WCX-10,4x 250mm
●柱温度：周围
●流速：1.0mL/min
●波长：信号，214nm；参比，360nm
●注射体积：10μL
●样品制备:在Milli-Q水中稀释10倍
●基于鉴别的贝伐珠单抗的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比
(3)AEX-HPLC(拮抗剂A的分析)
●流动相A：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0
●流动相B：10mM磷酸盐缓冲液，500mM氯化钠,pH 7.0
●柱：Dionex DNA Pac PA-100,4x 250mm
●柱温度：40℃
●流速：1.2mL/min
●波长：信号，258nm；参比，360nm
●注射体积：5μL
●样品制备： 
-对于3.0mg/mL适体样品，在Milli-Q水中稀释10倍
-对于15mg/mL适体样品，在Milli-Q水中稀释50倍
-对于30mg/mL适体样品，在Milli-Q水中稀释100倍
●基于鉴别的拮抗剂A的主峰的积分面积百分比，报告纯度百分比
(4)pH
●VWR symphony SB70P
(5)目视观察
●从Sony Cyber-shot DSC-H9Digital Still照相机(810万像素)拍摄照片
(6)渗量(osmolarity)(在时间点0)
●Advanced Instruments,Inc.Advanced Osmometer Model 3D3 
稳定性概述 
本部分描述了搅拌(4小时)和在不同温度(4℃、25℃和37℃)储存对拮抗剂A和贝伐珠单抗的作用。在研究中，对于所有物理应力，每种组合物能够维持靶pH值。
指示稳定性的测定
通过目视观察，注意到组合物F15、F16和F24在37℃在2周储存过程中形成沉淀物(数据未显示)。由于有限的体积可用于研究，没有进行其它测定来定量测量沉淀物。
通过AEX-HPLC，有效地分析了拮抗剂A在储存过程中的稳定性。当将某些组合物中的拮抗剂A在37℃的高温温育时，观察到前峰和后峰的形成。例如，在组合物F14中，拮抗剂A的AEX-HPLC纯度在37℃储存2周的过程中已经下降了接近50％(图32)。
WCX-HPLC也有效地表征了贝伐珠单抗的稳定性。当将某些组合物中的贝伐珠单抗在25℃的温度温育时，观察到前峰和后峰的形成。例如，在组合物F22中，贝伐珠单抗纯度在25℃储存8周的过程中下降了接近30％(图33)。
SE-HPLC被证实可用于表征贝伐珠单抗的可溶性聚集或片段化。拮抗剂A没有表现出通过SE-HPLC发现的显著变化，尽管由于测定对稳定性的敏感性，它的聚集形式的分辨率可能超过TSKgel G3000SWXL柱的能力。在37℃储存8周以后，在组合物F15中看到贝伐珠单抗的降解(图34)。
搅拌对稳定性的影响
评估了搅拌对拮抗剂A和贝伐珠单抗中的一种或两种的影响。将表3中列出的组合物用自制搅拌器搅拌4小时，同时将对照组的组合物在室温保持不搅拌。在搅拌样品和对照之间没有观察到目视观察、pH、AEX-HPLC和WCX-HPLC的差异(数据未显示)。但是，SE-HPLC(其评估拮抗剂A和贝伐珠单抗的聚集或片段化)在F23和F24样品中表现出搅拌样品和对照样品之间的稍微变化(表5和表6)。搅拌4小时以后，在F23样品以及30mg/mL拮抗剂A和25mg/mL阿伐他汀的直接1:1混合物(F24)中形成更可溶性的聚集体(前拮抗剂A峰和前贝伐珠单抗峰)。这提示，用氯化钠在pH 8.0配制，或具有较高浓度的与贝伐珠单抗共配制的拮抗剂A，会导致拮抗剂A或贝伐珠单抗在剪应力下形成可溶性的聚集体或片段。如通过SE-HPLC所确定的，其它组合物似乎维持拮抗剂A和贝伐珠单抗的完整性。这些结果提示，除了在上面指出的条件下以外，通过搅拌没有诱导共配制的拮抗剂A或贝伐珠单抗的明显降解。
表5.样品在搅拌之前的SE-HPLC结果
“Ant.A”是拮抗剂A；“bev.”是贝伐珠单抗；“NA”是指不适用
表6.样品在搅拌4小时以后的SE-HPLC结果
“Ant.A”是拮抗剂A；“bev.”是贝伐珠单抗；“NA”是指不适用
储存温度对稳定性的影响
在24-周研究过程中，将表3中列出的组合物放在4℃、25℃和37℃稳定性室中，以研究温度对拮抗剂A和贝伐珠单抗稳定性中的一种或两种的影响。基于色谱测定，拮抗剂A和贝伐珠单抗二者表现出随储存温度增加而更大的降解。
在37℃的储存诱导显著升高的拮抗剂A和贝伐珠单抗的降解水平。在2周之前，观察到F15、F16和F24中的拮抗剂A或贝伐珠单抗的沉淀(数据未显示)。在4周之前，F14也开始显示拮抗剂A或贝伐珠单抗的不溶性聚集(数据未显示)。所有其它组合物在12周中保持澄清。
AEX-HPLC揭示了在pH 4.0和5.0时组合物样品(F13、F14、F15 和F16)中显著的拮抗剂A降解，而F17中的共配制的样品显示更好的稳定性(图35)。拮抗剂A在37℃的12周储存中在pH 6.0-7.0维持相当的纯度，但是除了F20和F26以外，其中在12周观察到拮抗剂A纯度的下降(图36)。
在37℃储存2周以后，WCX-HPLC揭示pH 4.0组合物(F13和F14)中贝伐珠单抗纯度的显著下降，从而表明低至没有完整的贝伐珠单抗剩余(图37)。在37℃储存12周的过程中，观察到在除了F19以外的所有其它组合物中的加速降解，这一致地揭示比其它组合物更慢的降解(图38)。
SE-HPLC揭示了应力样品中的可溶性聚集体的形成。对于拮抗剂A，在37℃储存2周造成pH 4.0-5.0的组合物快速地形成可溶性聚集体(图39)。在F17中配制的拮抗剂A也表现出可溶性聚集，但是在较低速率(图39)。在第四周之前，大多数拮抗剂A组合物表现出较低拮抗剂A纯度，但是除了F19和2种1:1混合物(F24和F26)以外，它们能够维持高拮抗剂A纯度(图40)。该趋势维持至第12周，此时F26揭示了稍微降低的拮抗剂A纯度，剩下F19作为就稳定性而言拮抗剂A的候选组合物。对于贝伐珠单抗，在pH 6.0之外配制会造成mAb纯度的显著下降(图41)。该趋势继续至在37℃储存12周，剩下F19作为给贝伐珠单抗提供最大稳定性的组合物(图42)。
一些组合物在25℃储存过程中会提供更好的稳定性。所有组合物在25℃储存24周以后保持澄清，但是F14除外，其中在8周时观察到沉淀(数据未显示)。
基于AEX-HPLC，在pH 4.0配制拮抗剂A(F13和F14)会造成在储存仅2周以后适体的降解(图43)。F15揭示在25℃储存4周的降解；但是，F16表现出改善的稳定性直到8周(图43)。对于组合物F19、F20、F21和F23，在pH 6.0-8.0配制拮抗剂A维持相当的稳定性至在25℃ 储存8周和至在4℃储存至少24周(图44)。
WCX-HPLC指示，与拮抗剂A相比，pH对贝伐珠单抗的稳定性具有相反作用。在25℃储存2周以后，pH 8.0样品揭示贝伐珠单抗的显著降解(图45和图46)。在25℃储存4周之前，pH 4.0和pH 7.0组合物开始显现贝伐珠单抗降解的征象(图45和图46)。在pH 5.0-6.0的组合物提供相当的贝伐珠单抗稳定性直到在25℃储存12周，在此时，所有主要候选物表现出加速的降解征象。但是，在pH 6.0的F19组合物在25℃储存12-24周没有经历贝伐珠单抗的进一步加速降解(图45和图46)。
通过SE-HPLC，观察到在AEX-HPLC和WCX-HPLC中看到的类似降解趋势。当在25℃储存时，在pH 4.0配制的拮抗剂A不能维持拮抗剂A纯度(图47)。在8周之前，在pH 5.0配制的拮抗剂A经历显著的聚集或片段化(图47)。在6.0-8.0的pH范围中配制拮抗剂A会提供相当纯度直到25℃储存至少24周(图21)。贝伐珠单抗的纯度依赖于组合物的pH和组合物中的拮抗剂A的浓度。在25℃储存4周以后，在pH 4.0和pH 8.0配制会造成贝伐珠单抗纯度的加速下降(图49和图50)。在相同的时间和储存条件下，在15mg/mL共配制的拮抗剂A似乎会不利地影响贝伐珠单抗的纯度(图49)。在pH 5.0-7.0的组合物会8周的25℃中提供更好的稳定性(图49和图50)。其它时间点揭示，主要组合物(pH 6.0和7.0)能够维持相当的纯度(图50)。
在该研究过程中，在4℃的储存会给大多数组合物提供最佳稳定性。对于组合物F19、F20、F21和F23，目视观察揭示在4℃储存过程中没有不溶性聚集直到至少24周。
对于拮抗剂A，所有组合物在储存8周以后维持通过AEX-HPLC发现的相当纯度，且对于组合物F19、F20、F21和F23而言，直到在4℃储存24周(图51)。但是，如通过WCX-HPLC观察到的，在4℃储 存8周以后，在pH 8.0配制贝伐珠单抗会造成降解的显著增加，该趋势持续至24周(图52)。
SE-HPLC揭示了几种组合物中的拮抗剂A的一些片段化或贝伐珠单抗的聚集。对于拮抗剂A，大多数组合物维持它们的纯度至在4℃储存8周，而在pH 4.0-5.0的组合物揭示显著的纯度损失(图53)。组合物F19、F20、F21和F23维持相当的拮抗剂A纯度直到在4℃储存12周；但是，12和24周以后，在F23中的拮抗剂A纯度大幅下降，而其它3种选定组合物的拮抗剂A纯度保持类似地升高(图54)。在pH 8.0配制会造成在初步透析过程中形成贝伐珠单抗的可溶性聚集体；但是，在4℃的储存维持贝伐珠单抗的纯度直到至少8周，这类似于其它组合物(图55)。一个例外是组合物F24，其中在15mg/mL的拮抗剂A的浓度在8周储存中影响贝伐珠单抗的纯度(图55)。
组合物特征/组分对稳定性的影响
在不同的pH且用不同的张度调节剂共配制拮抗剂A和贝伐珠单抗，以便确定这些因素对稳定性的影响。本部分描述了所述组合物对拮抗剂A和贝伐珠单抗中的一种或两种的稳定性的影响。
pH对稳定性的影响
通过在37℃储存，区分pH对拮抗剂A和贝伐珠单抗的稳定性的影响。如通过AEX-HPLC观察到的，与其中发生加速降解的pH 4.0-6.0的含有山梨醇的组合物F13、F15和F17相比，拮抗剂A在pH 7.0和pH 8.0的含有山梨醇的组合物F20和F22中在37℃是稳定的(图56)。对于贝伐珠单抗，如通过WCX-HPLC观察到的，在pH 5.0-6.0之外的含有山梨醇的组合物(F13、F20和F22)在37℃表现出贝伐珠单抗的加速降解(图57)。类似于AEX-HPLC结果，SE-HPLC揭示，含有山梨醇的组合物F13和F15(pH 4.0-5.0)中的拮抗剂A在37℃经历片段化或聚集(图58)。但是，尽管通过WCX-HPLC看到在pH 5.0-6.0的范围之外的含有山梨醇的组合物的降解，但是SE-HPLC揭示，当在37 ℃储存时，在pH 5.0-8.0的含有山梨醇的组合物中的贝伐珠单抗经历更慢的聚集或片段化(图59)。在37℃储存的pH 4.0的含有山梨醇的组合物F13的SE-HPLC揭示了贝伐珠单抗的显著降解。与针对含有山梨醇的组合物测定的其它pH水平相比，在pH 6.0配制(F17)似乎会更好地维持贝伐珠单抗的纯度(图58和图59)。
张度调节剂对稳定性的影响
通过在37℃储存，区分张度调节剂对拮抗剂A和贝伐珠单抗的稳定性的影响。山梨醇或氯化钠的益处依赖于组合物的pH。
如通过AEX-HPLC观察到的，在pH 5.0和6.0，山梨醇组合物(F15和F17)中的拮抗剂A在8周研究中经历降解(图60)。但是，用氯化钠作为张度调节剂的在这些pH水平的组合物(F16和F19)没有经历这样的降解(图60)。含有氯化钠的pH 4.0组合物(F14)被证实在4周的加速应力以后具有降低的稳定性，从而导致山梨醇成为在pH 4.0的优良张度调节剂(图60)。在pH 7.0和pH 8.0，用氯化钠或山梨醇作为张度调节剂的组合物(F20、F21、F22和F23)维持相当的稳定性。通过WCX-HPLC对贝伐珠单抗的分析揭示，在pH 6.0-7.0用氯化钠配制会比山梨醇改善稳定性(图61)。但是，对于pH 5.0组合物而言则相反，其中在37℃的4周储存中，山梨醇比氯化钠限制降解(图61)。通过SE-HPLC，氯化钠或山梨醇的存在会影响拮抗剂A稳定性，而贝伐珠单抗的稳定性在两种张度调节剂之间保持相当。对于pH 5.0-6.0组合物，氯化钠的存在比山梨醇更好地保护拮抗剂A免于聚集或片段化(图62)。对于测定的其它pH，使用山梨醇时拮抗剂A在pH 4.0表现出较低纯度(图62)。使用山梨醇或氯化钠作为张度调节剂时，在pH 7.0和pH 8.0配制的拮抗剂A(图62)和在pH 4.0、pH 7.0和pH 8.0配制的贝伐珠单抗(图63)维持相当的纯度。
1:1混合物对稳定性的影响
分析的另一种参数是混合拮抗剂A和市售贝伐珠单抗的作用。并 且，分析了含有不同浓度的拮抗剂A和固定浓度的贝伐珠单抗(1:1混合物(F24)和1:1混合物(F26)的组合物。并且，在37℃使所述组合物遭受应力会提供关于拮抗剂A和贝伐珠单抗的降解的信息。
对于单独的拮抗剂A，通过AEX-HPLC和SE-HPLC，在30mg/mL(F12)或3mg/mL(F25)配制不会产生稳定性谱的差异。在将市售阿伐他汀与不同拮抗剂A浓度(15mg/mL和3mg/mL)混合以后，两种组合物中的拮抗剂A维持相当的稳定性直到在37℃储存8周，而将15mg/mL的拮抗剂A与12.5mg/mL的贝伐珠单抗一起配制会产生轻微降解，如通过AEX-HPLC观察到的(图64)。
尽管在该研究中在所有组合物中的贝伐珠单抗的浓度是恒定的，不同浓度的拮抗剂A会影响贝伐珠单抗的稳定性。在37℃储存8周以后，WCX-HPLC揭示当与3mg/mL拮抗剂A(F26)或15mg/mL拮抗剂A(F24)一起配制时贝伐珠单抗的降解特性的微小差异(图65)。通过SE-HPLC，与在2种浓度的直接1:1混合(F24和F26)相比，没有观察到30mg/mL和3mg/mL的拮抗剂A的纯度特性的显著差异(图66)。但是，对于贝伐珠单抗，与3mg/mL组合物1:1混合物(F26)相比和与稀释形式的市售阿伐他汀(F18；图67)相比，含有15mg/mL拮抗剂A的组合物(F24)产生贝伐珠单抗的更可溶性的聚集和片段化。
F19组合物的稳定性
在24-周研究中，在所有测定的组合物中，组合物F19表现出最佳稳定性。在研究中，所有F19组合物保持视觉上澄清并维持靶pH值。本部分突出该组合物的稳定性谱。
通过AEX-HPLC分析，F19组合物在24周中在4℃和25℃维持相当的拮抗剂A纯度(图68)。但是，当在37℃储存时，拮抗剂A的纯度在第2周之前降低了大约5％(图68)。在37℃的该趋势在接下来的12周中继续，因为与拮抗剂A的其它储存条件相比，拮抗剂A纯度下降 了大约20％(图68)。
WCX-HPLC分析揭示了储存温度和F19组合物中的贝伐珠单抗降解速率之间的关联。在37℃保存2周以后，贝伐珠单抗纯度与4℃样品相比下降了大约10％(图69)。该趋势继续至12周，其中在37℃储存的贝伐珠单抗的纯度与4℃相比下降了大约50％(图69)。在25℃储存会维持与4℃相当的纯度直到4周(图42)。但是，在第八周之前，25℃样品与4℃样品相比遭受纯度的7％下降(图69)。增加的在25℃储存的贝伐珠单抗降解在研究的剩余24周中继续，其中在结束时，贝伐珠单抗纯度比在4℃储存的样品低大约20％(图69)。在4℃的储存似乎会在24周研究中维持与开始值相当的纯度(图69)。
通过SE-HPLC，组合物F19阻止与开始值相当的拮抗剂A的额外可溶性聚集或片段化(图70)。在37℃储存的F19中的贝伐珠单抗维持与在4℃和25℃储存相当的纯度直到2周，此后在4周之前发生可溶性聚集(图71)。在12周之前发生显著的可溶性聚集之前，贝伐珠单抗纯度在25℃维持直到8周(图71)。在4℃，贝伐珠单抗维持与初始时间点相当的纯度值持续24周(图71)。
当将组合物F19与仅包含拮抗剂A或贝伐珠单抗的组合物对比时，看到拮抗剂A和贝伐珠单抗之间的纯度的反差。通过AEX-HPLC分析，在37℃储存2-8周，组合物F25维持比F19高5-8％的拮抗剂A纯度。但是，在第12周之前，两种组合物下降至类似的纯度水平(图72)。此外，在4℃和25℃，两种组合物维持相当的纯度水平(图72)。通过SE-HPLC，组合物F12在每种储存条件下显得优于F19，在4℃看到最大差异，尽管观察到一些测定变异性(图73)。
与稀释形式的市售阿伐他汀(F18)相比，在F19中配制贝伐珠单抗会提供更好的稳定性。基于WCX-HPLC，在25℃和特别是在37℃，F19比F18更好地稳定贝伐珠单抗，从而揭示2-12周的8％-11％改善(图 74)。类似地，SE-HPLC分析表明，与在37℃储存的F18相比，贝伐珠单抗的聚集或片段化的更好预防(图75)。
基于在24周稳定性试验中收集的数据，确定F19是拮抗剂A和贝伐珠单抗的最稳定组合物。当在4℃储存多达至少24周时，在试验的组合物中，F19帮助稳定3mg/mL拮抗剂A和12.5mg/mL贝伐珠单抗。并且，F19组合物中的拮抗剂A和贝伐珠单抗的纯度在25℃维持多达至少4周。
实施例3
包含雷珠单抗和拮抗剂A的组合物的生物活性
该研究的目的是，与仅包含雷珠单抗或拮抗剂A的组合物相比，评价包含雷珠单抗和拮抗剂A的组合物的生物活性。使用实时PCR，通过基因表达水平测量活性，作为VEGF和PDGF-BB与它们各自的细胞受体的结合的抑制的函数。分析了3种不同的雷珠单抗+拮抗剂A组合物：F6、F8和F11(参见实施例1)。在将它们用在该研究中之前，将这些组合物在4℃储存12个月。
通过它的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的组织因子(TF)基因的VEGF诱导的能力，确定雷珠单抗(单独的，或存在于也包含拮抗剂A的组合物中)的抗-VEGF活性。一式三份地分析所述样品，并将所有数据相对于仅VEGF处理得到的数据进行归一化。如在图76中所示，在95％置信区间内，为所有组合物和单独确定的抗-VEGF EC50(nM)值是相同的。
通过它的抑制3T3成纤维细胞细胞中的BTG2基因表达的PDGF-BB诱导的能力，确定拮抗剂A(单独的，或存在于也包含雷珠单抗的组合物中)的抗-PDGF活性。一式两份地分析所述样品，并将所有数据相对于仅PDGF-BB处理得到的数据进行归一化。如在图77中所示，在95％置信区间内，为所有组合物和单独拮抗剂A确定的抗 -PDGF EC50(nM)值是相同的。这些结果证实，当在4℃储存时，包含雷珠单抗和拮抗剂A的组合物显示出每种试剂的活性至少12个月。
具体地，确定了存在于在4℃储存12个月的共同制剂中的拮抗剂A的抗-PDGF活性和雷珠单抗的抗-VEGF活性，以便证实拮抗剂A和雷珠单抗的共同制剂不会不利地影响拮抗剂A或雷珠单抗的活性。在4℃储存12个月以后，在将它们用在该研究中之前，分析了3种包含拮抗剂A和雷珠单抗的不同组合物：F6、F8和F11(参见实施例1)。另外，分析了包含拮抗剂A或雷珠单抗的组合物作为对照。
雷珠单抗活性 
将雷珠单抗的抗-VEGF活性测量为它的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的VEGF-可诱导的基因组织因子(TF)基因的VEGF诱导的能力。
将HUVEC(第8-9代；Lonza Group Ltd.,巴塞尔,瑞士)接种在24孔板(50,000个细胞/孔)上，并在37℃、5％CO2下在不含氢化可的松的内皮生长培养基(EGM2；Lonza)中培养。次日，在处理之前，将细胞在含有0.5％FBS和50μg/ml庆大霉素的EGM基础培养基(饥饿培养基)中血清饥饿4小时。
为了确定雷珠单抗的EC50，仅用VEGF(阳性对照；328pM人VEGF165(Preprotech))或用与F6、F8、F11、拮抗剂A或组合的VEGF处理细胞。对于这些处理，在饥饿培养基中制备下述组合物中的每一种的系列稀释物，并试验：F6、F8、F11和在各种系列稀释物中的雷珠单抗和拮抗剂A浓度如下：雷珠单抗＝200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM(9.6、1.92、0.38、0.077、0.015μg/ml)；和拮抗剂A＝580nM、116nM、23.2nM、4.64nM、0.928nM(5.97、1.19、0.24、0.048、0.009μg/ml)。对于VEGF+拮抗剂A处理，仅试验了拮抗剂A的一种浓度(580nM＝5.97μg/ml)。用上述浓度的、单独的 或与上述系列稀释物之一组合的VEGF在37℃、5％CO2下处理细胞1.5小时。额外的对照细胞保持不处理。
处理以后，立即使用RNeasy Mini旋转柱试剂盒(Qiagen)根据生产商的方案从每个孔收获RNA样品。将得到的总RNA用DNA酶I处理以除去任何污染性的基因组DNA，并通过260nm的光密度(O.D.)来定量。然后使用QuantiTect RT试剂盒(Qiagen)根据生产商的说明书，将总RNA用于反转录。为了评估组合物的抑制VEGF活性的能力，使用特异性的人TaqMan探针(Applied Biosystems)，对TF基因进行定量实时PCR。将人HPRT TaqMan基因测定用作对照管家基因(Applied Biosystems)。
一式三份地进行实验，数据代表平均值±SEM。将GraphPad Prism软件用于统计和非线性回归分析。将所有得自实时PCR的数据相对于仅VEGF处理(阳性对照)归一化，以确定每种条件的TF基因表达变化(即，VEGF诱导的基因表达的抑制)的水平。在图76中显示了为每种试验组合物的不同浓度确定的相对TF基因表达水平。如在表7中所示，在95％置信区间内，为没有拮抗剂A存在下的雷珠单抗和为所有共配制的样品确定的抗-VEGF EC50(nM)值是相同的。没有观察到单独的拮抗剂A(即，在没有雷珠单抗存在下)对VEGF活性的抑制(数据未显示)。
表7.在不同组合物中的拮抗剂A和雷珠单抗的EC5095％置信区间值
组合物 EC5095％CI(nM)
雷珠单抗 0.5235-1.134
F6 0.7847-1.452
F8 0.6257-1.451
F11 0.4417-0.9030
拮抗剂A活性
通过它的抑制NIH-3T3成纤维细胞中的PDGF-可诱导的基因B-细胞易位基因2(BTG2)的PDGF-BB诱导的能力，确定拮抗剂A的抗-PDGF活性。
将NIH 3T3细胞接种在24孔板(50000个细胞/孔)上，并在37℃、5％CO2下在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM(Gibco)中培养。次日，在处理之前将细胞在含有1％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM(饥饿培养基)中血清饥饿16小时。
为了确定拮抗剂A的EC50，仅用PDGF-BB(阳性对照)或用与F6、F8、F11、拮抗剂A或组合的PDGF-BB处理细胞。以1.65nM的浓度使用PDGF-BB(40ng/ml；Peprotech)。对于这些处理，在饥饿培养基中制备下述组合物中的每一种的系列稀释物，并试验：F6、F8、F11和拮抗剂A。各种系列稀释物中的拮抗剂A和雷珠单抗浓度如下：拮抗剂A＝580nM、116nM、23.2nM、4.64nM、0.928nM(5.97、1.19、0.24、0.048、0.009μg/ml)；和雷珠单抗＝200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM(9.6、1.92、0.38、0.077、0.015μg/ml)。对于处理，仅试验了雷珠单抗的一种浓度(200nM＝9.6μg/ml)。用上述浓度的、单独的或与上述系列稀释物之一组合的PDGF-BB在37℃、5％CO2下处理细胞1.5小时。额外的对照细胞保持不处理。
处理以后，立即使用RNeasy Mini旋转柱试剂盒(Qiagen)根据生产商的方案从每个孔收获RNA样品。将得到的总RNA用DNA酶I处理以除去任何污染性的基因组DNA，并通过260nm的O.D.来定量。然后使用QuantiTect RT试剂盒(Qiagen)根据生产商的说明书，将总RNA用于反转录。为了评估组合物的抑制PDGF-BB活性的能力，使用特异性的小鼠TaqMan探针(Applied Biosystems)，对BTG2基因进行定量实时PCR。将小鼠GAPDH基因测定用作对照管家基因(Applied Biosystems)。
一式两份地进行实验，数据代表平均值±SEM。将GraphPad Prism软件用于统计和非线性回归分析。将所有得自实时PCR的数据相对于仅PDGF处理(阳性对照)归一化，以确定每种条件的BTG2基因表达变化(即，PDGF诱导的基因表达的抑制)的水平。在图77中显示了为每种试验组合物的不同浓度确定的相对BTG2基因表达。如在表8中所示，在95％置信区间内，为单独拮抗剂A和为所有共配制的样品确定的抗-PDGF EC50(nM)值是相同的。没有观察到单独的雷珠单抗(即，在没有拮抗剂A存在下)对PDGF-BB活性的抑制(数据未显示)。
表8:在不同组合物中的拮抗剂A和雷珠单抗的EC5095％置信区间
组合物 EC5095％CI(nM)
拮抗剂A 0.8287-3.656
F6 0.7018-3.987
F8 0.7102-3.852
F11 0.7024-3.602
这些研究证实，拮抗剂A对雷珠单抗的抑制VEGF活性的能力不具有不利影响，并且雷珠单抗对拮抗剂A的抑制PDGF-BB活性的能力不具有不利影响，即使在将拮抗剂A和雷珠单抗的示例性共同制剂在4℃储存至少12个月以后。
实施例4
储存条件对包含拮抗剂A和雷珠单抗的组合物的稳定性的影响
使用在显微镜下才能看到的颗粒分析，检查了不同组合物中的拮抗剂A和雷珠单抗的稳定性，以评价不同储存温度和不同储存容器的影响。通过微流成像(MFI)，针对拮抗剂A(30mg/mL)、雷珠单抗(10mg/mL和40mg/mL)和拮抗剂A和雷珠单抗的不同组合，进行在显微镜下才能看到的颗粒分析。按照不同的储存条件，分析了共5种单独的组合物，以评价储存温度(5℃和30℃保持4小时)和储存容器(2cc管 形瓶和1mL注射器)对每种制剂的在显微镜下才能看到的颗粒计数的影响。将每个样品的MFI结果以特定颗粒尺寸范围(包括总计、≥2μm、≥5μm、≥10μm和≥25μm)的形式呈现。对于在相同条件下储存的不同样品，观察到颗粒计数的某种相对关联。
材料
在研究中使用下述拮抗剂A和雷珠单抗组合物：
(1)30个含有0.23mL 30mg/mL拮抗剂A(在10mM磷酸钠和150mM氯化钠中,pH 7.3)的管形瓶(组合物F27)。
(2)9个含有0.5mL 10mg/mL雷珠单抗(在10mM组氨酸HCl、10％α,α-海藻糖和0.01％聚山梨酯20中,pH 5.5)的管形瓶(组合物F28；Genentech,South San Francisco,CA)。
(3)7个含有0.5mL 40mg/mL雷珠单抗(在10mM组氨酸HCl、10％α,α-海藻糖和0.01％聚山梨酯20中，pH 5.5)的管形瓶(组合物F29；Genentech,South San Francisco,CA)。
用于组合物制备的容器材料列出在表9中。
表9:在样品制备中使用的容器材料
将管形瓶用Milli-Q水冲洗，并在用前干燥
*推荐与Protein Simple的MFI仪器一起使用
组合物制备 
为了制备在该研究中检查的组合物，将相同样品(即，拮抗剂A或雷珠单抗)的管形瓶合并在一起。在该过程中，将30个30mg/mL拮抗剂A的管形瓶(0.20mL/瓶)合并在5cc玻璃瓶中，将7个10mg/mL雷珠单抗的管形瓶(0.5mL/瓶)合并在单独的5cc玻璃瓶中，并将7个40mg/mL雷珠单抗的管形瓶(0.5mL/瓶)合并在第三个5cc玻璃瓶中。尽管30mg/mL拮抗剂A的管形瓶意图含有0.23mL，当合并时从每个瓶仅回收约0.2mL。如下进行合并：从每个瓶除去帽，并经由移液器以无菌方式转移内容物。用合并的材料的不同组合，在清洁的玻璃管形瓶中制备另外2个样品。表10详述了为该研究制备的5个样品的每一个的内容物。为了确保样品清洁度和防止颗粒污染，在100级生物安全柜(Nuaire NU-425-600)中进行所有合并和样品制备。
表10:用于MFI分析的组合物基质
*没有足够体积的F31可用于填充一个瓶；因此，对于该制剂仅填充2个管形瓶。
“Ant.A”是拮抗剂A
在该过程中，除了F31(其在2个注射器和2个管形瓶中制备)以外，以0.5mL填充体积在共计2个1mL注射器和3个2cc玻璃管形瓶中制备每个样品。个别地制备各种组合物，以允许在MFI仪器上的精确时间点分析。制备以后，给每个容器配备塞子，并对样品施加稳定性研究条件。
储存条件
将每种组合物的样品在管形瓶或注射器中在5℃或30℃储存4小时，以确定储存温度和容器类型对在显微镜下才能看到的颗粒的水平的影响。在填充以后，立即对玻璃管形瓶中的样品进行T＝0分析。该研究的温度条件和分析时间点显示在表11中。
表11:温度条件和分析时间点
样品类型 储存温度 时间点
在管形瓶中的组合物 5℃和30℃ 0和4小时
在注射器中的组合物 5℃和30℃ 4小时
分析性分析和数据处理
使用得自Brightwell Technologies的MFI仪器(型号DPA-4200)，收集尺寸测量和在显微镜下才能看到的颗粒计数。使用移液器尖头，经由固定在流动池顶部的入口端口，直接施加0.5mL每个样品进行分析。在该过程中，将流动池用0.17mL样品净化，由此提供大约0.30mL用于颗粒评价。
对MFI数据施加减法，以减少在总颗粒计数中包含的气泡和非蛋白性颗粒的数目。在该过程中，从数据除去粘性颗粒、缓慢移动的颗粒和具有高圆形度的气泡样颗粒，以尝试分离和评价每个样品中的寡核苷酸或蛋白性颗粒。还在该减法中除去边缘颗粒，使得可以适当地 筛选每个颗粒的性能。
将得自MFI分析的结果表示为每个样品的颗粒计数。如下将这些数据转化成每mL样品的颗粒单位：将获得的颗粒计数除以分析的精确体积(大约0.30mL)。将每mL样品的颗粒值四舍五入至最接近的整数。
结果和讨论 
表12总结了在该研究中分析的5种组合物F27至F31的MFI分析的结果。以总颗粒计数/mL、以及颗粒计数/mL(在≥2μm、≥5μm、≥8μm、≥10μm和≥25μm的颗粒尺寸)的方式，呈现所述组合物在每种储存条件下的原始和减去后的MFI数据。在不同的温度和容器条件下，观察不同的结果。
表12.在不同条件下储存的组合物F27至F31的MFI结果
*没有足够的F31体积可用于分析该特定条件。
Δ由于F31的低体积，从最初抽入注射器中的F31部分制备该样品。
在T＝0的温度为室温。
在不同的储存条件以后，组合物F27至F31的减法MFI结果分别图示为图79-83中的直方图。这些直方图代表不同尺寸范围(包括1-2μm、2-5μm、5-10μm、10-25μm、25-50μm、50-75μm和75-100μm)的每个样品的颗粒计数。这些图也显示了所述组合物在不同储存条件下的不同结果。
图84对比了每个样品在不同储存条件下的减法MFI结果。在该图中，在1-2μm、2-5μm、5-10μm、10-25μm、25-50μm和50-75μm评价了颗粒计数。在30℃在4小时以后关于玻璃瓶中的F31观察到的高颗粒计数可能源自样品操作问题。但是，没有额外的样品可用于重新分析。
结论
通过MFI，进行了拮抗剂A、雷珠单抗、以及拮抗剂A和雷珠单抗的不同组合的颗粒分析。在2cc玻璃管形瓶或1mL注射器中在5℃和30℃储存4小时以后，在该研究中分析了5种组合物的共24个不同样品。将每个样品的结果呈现在特定颗粒尺寸范围内，包括≥2μm、≥5μm、≥10μm、≥25μm和总颗粒计数。没有观察到显著的差异；但是，在30℃储存以后，在玻璃瓶中检测到F31的较高颗粒计数。
实施例5
拮抗剂A的合成
使用穿流反应器设计，在固相反转脱氧核糖胸苷可控孔度玻璃(CPG)支持物上进行拮抗剂A的32-聚体寡核苷酸的反复化学合成。所述寡核苷酸合成方法包括以下述顺序进行的4个化学反应：(a)去封闭二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的核苷或新生的寡核苷酸(去三苯甲基化)；(b)活化和偶联新来的氨基亚磷酸酯(酰胺化)；(c)将得到的亚磷酸三酯氧化成五价磷酸酯键；和(d)将没有成功偶联的寡核苷酸链加帽。
用反转胸苷CPG支持物(3'-DMT-5'-dT-CPG)开始，将上面4个步骤重复，以序列次序添加氨基亚磷酸酯直到期望的寡核苷酸，终止于己基氨基接头，进行合成。以与其它氨基亚磷酸酯相同的方式偶联内部六乙二醇间隔物。
所述循环中的第一步包括除去新生寡核苷酸链的末端羟基上的二 甲氧基三苯甲基保护基。这如下实现：用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液处理CPG上的DMT保护的寡核苷酸。该反应产生未保护的末端羟基。用二氯乙酸/二氯甲烷(DCA/DCM)溶剂除去切割的DMT基团。然后用乙腈(ACN)洗涤CPG。
第二步包括用乙基硫代四唑(ETT)活化新来的氨基亚磷酸酯，以产生与在前一步中产生的末端羟基快速偶联的物质。将得到的亚磷酸三酯用ACN洗涤，以除去活化剂和未反应的氨基亚磷酸酯。
第三步是将新形成的亚磷酸三酯氧化成五价磷酸盐。这通过在水中使亚磷酸三酯与碘和吡啶的混合物反应来实现。用ACN从CPG洗掉未使用的氧化剂。
第四步包括将已经偶联失败的任何未反应的羟基加帽。用CAP NMI(N-甲基咪唑在ACN中的溶液)和CAP ALA(乙酸酐,2,6-二甲基吡啶,ACN)的混合物处理CPG。用ACN从CPG洗掉这些试剂。
将4个反应的该循环重复，直到在固体支持物上装配正确长度和序列的寡核苷酸。使最后一个氨基亚磷酸酯(在寡核苷酸的5'末端处的己基氨基接头)以与在合成中使用的其它氨基亚磷酸酯相同的方式反应；但是，该接头没有加帽。
通过用叔丁胺/氢氧化铵溶液处理含有粗制的合成寡核苷酸的固体支持物，将寡核苷酸去保护和切割。从去保护的和切割的寡核苷酸分离CPG。通过分析型阴离子交换色谱法确定粗制的完全去保护的寡核苷酸的纯度，并满足大于50％的规范。
将得到的寡核苷酸在氯化钠中渗滤以除去胺盐。
然后在寡核苷酸的5'末端处的伯胺与聚乙二醇化试剂 (mPEG2-NHS酯)之间形成共价键。在硼酸钠缓冲液中在pH 9进行反应。使用上述的聚乙二醇化条件，已经证实该反应对寡核苷酸的5'末端处的己基氨基接头是位点特异性的。
通过制备型阴离子交换色谱法(AX HPLC)，从未缀合的PEG试剂、未聚乙二醇化的适体和其它副产物中纯化聚乙二醇化的寡核苷酸。通过分析型AX HPLC，分析各种级分。将全长聚乙二醇化的寡核苷酸的选定级分合并，并将得到的库脱盐、浓缩和过滤。
将得到的拮抗剂A真空冷冻干燥以降低含水量。
实施例6
拮抗剂A和拮抗剂A+阿柏西普共同制剂对3T3成纤维细胞中的PDGF-BB诱导的BTG2表达的抑制 
确定了包含拮抗剂A或拮抗剂A和阿柏西普的组合物的抑制PDGF-BB活性的能力，以便证实拮抗剂A与阿柏西普的共同制剂不会不利地影响拮抗剂A的活性。
材料和方法 
通过它的抑制NIH 3T3细胞中PDGF-BB应答基因B-细胞易位基因2(BTG2)的PDGF-BB诱导的能力，确定了拮抗剂A的抗-PDGF活性。
在0.5ml含有Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM；Gibco)、10％小牛血清(CS)、2mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的培养基中，将NIH3T3细胞接种在24-孔板上(4x 104个细胞/孔)，并在37℃、5％CO2下培养。24小时以后，在处理之前将细胞在含有1％CS、2mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM(饥饿培养基)中血清饥饿9小时。
为了确定拮抗剂A的EC50，用PDGF-BB(阳性对照)或用与下述组合物之一组合的PDGF-BB处理细胞：拮抗剂A(组合物F32)；拮抗剂A+阿柏西普(组合物F33)；或拮抗剂A+PBS(组合物F34)。以1.65nM的浓度使用PDGF-BB(人PDGF-BB；Preprotech,伦敦，英国)。用于制备组合物的拮抗剂A的储备溶液是在10mM Na磷酸盐和150mM NaCl中的30mg/ml拮抗剂A，pH 7.3。使用商购可得的(40mg/mL阿柏西普，在10mM磷酸钠、40mM氯化钠、0.03％聚山梨酯20和5％蔗糖中,pH 6.2)作为储备溶液来制备组合物F33。对于组合物F33，将拮抗剂A和阿柏西普以等摩尔浓度温育，并在使用前在4℃储存过夜。作为组合物F33的对照，将拮抗剂A与PBS一起在4℃温育过夜(组合物F34)。对于这些处理，在即将使用之前在饥饿培养基中制备组合物F32、F33和F34的系列稀释物。所述系列稀释物中的拮抗剂A浓度分别如下：400nM、80nM、16nM、3.2nM和0.64nM。组合物F33的系列稀释物中的阿柏西普的摩尔浓度与组合物F33的每种系列稀释物中的拮抗剂A的摩尔浓度相同。用上述浓度的、单独的或与上述系列稀释物之一组合的PDGF在37℃、5％CO2下处理细胞1小时。额外的对照细胞保持不处理。
处理以后，立即使用RNeasy Mini旋转柱试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)根据生产商的方案收获用于RNA分离的细胞。将得到的总RNA通过260nm的光密度(O.D.)来定量，随后用DNA酶I处理以除去任何污染性的基因组DNA。然后使用反转录试剂盒(Qiagen)根据生产商的说明书，通过反转录进行cDNA合成。为了评估在没有阿柏西普存在下的拮抗剂A(组合物F32和F34)和拮抗剂A+阿柏西普混合物(组合物F33)的抑制PDGF-BB活性的能力，使用特异性的小鼠TaqMan探针(Applied Biosystems；Foster City,CA)，对BTG2基因进行定量实时PCR。将小鼠β-肌动蛋白TaqMan基因测定用作内部对照(Applied Biosystems)。
一式三份地进行实验，数据代表平均值±标准差(SD)。将GraphPad  Prism软件用于统计和非线性回归分析。将所有得自实时PCR实验的数据相对于在没有拮抗剂A存在下的PDGF-BB处理过的样品(阳性对照)归一化，以确定每种条件的BTG2基因表达的相对变化。
结果
拮抗剂A能够有效地抑制3T3细胞中的PDGF-BB诱导的BTG2基因表达(图85)。此外，与阿柏西普一起预温育不会损害拮抗剂A的抑制BTG2表达的能力(图86)。为拮抗剂A确定的EC50值显示在表13中。
表13.在不同组合物中的拮抗剂A的EC5095％置信区间
组合物 EC5095％CI(nM)
F32 0.530-1.547
F33 0.537-1.701
F34 0.351-0.659
这些研究证实，当在4℃储存过夜时，拮抗剂A和阿柏西普的共同制剂能够维持拮抗剂A的稳定性，如通过它的抗-PDGF生物活性所测量的。拮抗剂A与阿柏西普的共同制剂对拮抗剂A的活性没有不利作用。
在本说明书中提及的或在任何申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开都通过引用整体并入本文。
从前述内容应当理解，尽管出于例证的目的已经在本文中描述了本发明的具体实施方案，但是可以进行各种修饰而不脱离本发明的精神实质和范围。

Claims (49)

1.一种组合物，其包含有效量的：
(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约0.5mg/mL至约20mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：
(c)缓冲剂，所述缓冲剂能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和
(d)张度调节剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述缓冲剂是约1mM至约20mM L-组氨酸或约1mM至约20mM磷酸钠；且
所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述缓冲剂是约1mM至约20mM L-组氨酸；且
所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约10mM L-组氨酸；和
(d)约130mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 6.0。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.01％(w/v)聚山梨酯20。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约10mM磷酸钠；和
(d)约5％(w/v)山梨醇，
其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.01％(w/v)聚山梨酯20。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约10mM磷酸钠；和
(d)约130mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
10.根据权利要求9所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.01％(w/v)聚山梨酯20。
11.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约5mM磷酸钠；
(d)约5mM组氨酸HCl；
(e)约75mM NaCl；和
(f)约5％(w/v)海藻糖)，
其中所述组合物的pH是约pH 6.5。
12.根据权利要求11所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(g)约0.005％(w/v)聚山梨酯20。
13.一种组合物，其包含有效量的：
(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；和
(b)约0.5mg/mL至约25mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：
(c)缓冲剂，所述缓冲剂能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和
(d)张度调节剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述缓冲剂是约5mM至约200mM磷酸钠或约5mM至约200mM Tris.HCl；且
所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl、约1％至约20％(w/v)山梨醇或约1％至约20％(w/v)海藻糖。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述缓冲剂是约5mM至约200mM磷酸钠；且
所述张度剂是约10mM至约200mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 5.0至约pH 7.0。
16.根据权利要求13-15中的任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约50mM磷酸钠；和
(d)约130mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 6.0。
18.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
19.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约50mM磷酸钠；和
(d)约5％(w/v)山梨醇，
其中所述组合物的pH是约pH 6.0。
20.根据权利要求19所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
21.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约50mM磷酸钠；和
(d)约5％(w/v)山梨醇，
其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
22.根据权利要求21所述的组合物，所述组合物进一步包含：
e)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
23.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约50mM磷酸钠；和
(d)约150mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 7.0。
24.根据权利要求23所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
25.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约50mM Tris.HCl；和
(d)约130mM NaCl，
其中所述组合物的pH是约pH 8.0。
26.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(e)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
27.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约15mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约30mM磷酸钠；
(d)约75mM NaCl；和
(e)约3％(w/v)海藻糖，
其中所述组合物的pH是约pH 6.3。
28.根据权利要求27所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(f)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
29.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约3mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约12.5mg/mL贝伐珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约30mM磷酸钠；
(d)约75mM NaCl；和
(e)约3％(w/v)海藻糖，
其中所述组合物的pH是约pH 6.3。
30.根据权利要求29所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(f)约0.02％(w/v)聚山梨酯20。
31.一种组合物，其包含有效量的：
(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；和以下的一种或多种：
(c)缓冲剂，所述缓冲剂能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；
(d)张度调节剂；和
(e)0至约10％(w/v)蔗糖。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述缓冲剂是约5mM至约50mM磷酸盐；且
所述张度调节剂是约10mM至约200mM NaCl。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约0.3mg/mL至约30mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL至约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；
(c)约5mM至约50mM磷酸盐；
(d)约10mM至约200mM NaCl；和
(e)0至约10％(w/v)蔗糖，
其中所述组合物的pH是约pH 6.0至约pH 8.0。
34.根据权利要求31-33中的任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(f)约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)表面活性剂。
35.根据权利要求32所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约6mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约40mg/mL阿柏西普或其药学上可接受的盐；
(c)约10mM磷酸盐；
(d)约40mM NaCl；和
(e)约5％(w/v)蔗糖，
其中所述组合物的pH是约pH 6.2。
36.根据权利要求35所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(f)约0.03％(w/v)聚山梨酯20。
37.一种组合物，其包含有效量的：
(a)约3mg/mL至约90mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约1.0mg/mL至约30mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；和以下的一种或两种：
(c)缓冲剂，所述缓冲剂能够实现或维持约pH 5.0至约pH 8.0的组合物pH；和
(d)张度调节剂。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述缓冲剂包含约1mM至约100mM磷酸钠或约1.0mM至约10mM组氨酸.HCl；且
所述张度调节剂是约0.5％(w/v)至约10％(w/v)海藻糖。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约15mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约5mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约5mM磷酸盐；
(d)约75mM NaCl；
(e)约5mM组氨酸.HCl；和
(f)约5％(w/v)海藻糖。
40.根据权利要求39所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(g)约0.005％(w/v)聚山梨酯20。
41.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)约24mg/mL拮抗剂A或其药学上可接受的盐；
(b)约8mg/mL雷珠单抗或其药学上可接受的盐；
(c)约8mM磷酸盐；
(d)约120mM NaCl；
(e)约2mM组氨酸.HCl；和
(f)约2％(w/v)海藻糖。
42.根据权利要求41所述的组合物，所述组合物进一步包含：
(g)约0.002％(w/v)聚山梨酯20。
43.一种用于治疗或预防眼科疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用根据权利要求1、13、31和37中的任一项所述的组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述眼科疾病是年龄相关的黄斑变性、多息肉状脉络膜血管病、与脉络膜新生血管形成有关的病症、高血压性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、镰刀状细胞视网膜病变、与周围视网膜新生血管形成有关的病症、早产儿视网膜病变、静脉闭塞性疾病、动脉闭塞性疾病、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、囊样黄斑水肿、视网膜毛细管扩张、动脉大动脉瘤、视网膜血管瘤病、辐射诱导的视网膜病变、虹膜发红或肿瘤。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述眼科疾病是湿性年龄相关的黄斑变性或干性年龄相关的黄斑变性。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述组合物存在于药物递送装置中。
47.根据权利要求43-46中的任一项所述的方法，其中眼内地施用所述组合物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述眼内施用是玻璃体内施用或前房施用。
49.根据权利要求43-48中的任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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