MX2014014445A - Composiciones que comprenden un aptamero anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas (anti-pdgf) y un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un aptámero anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas (anti-PDGF) y un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En ciertas modalidades, las composiciones de la invención son útiles para tratar o prevenir una enfermedad oftálmica.

Description

COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UN APTÁMERO ANTI-FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE PLAQUETAS (ANTI-PDGF) Y UN ANTAGONISTA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica del beneficio de la solicitud provisional Norteamericana No. 61/654,672, presentada el Io de Junio de 2012, y la solicitud provisional Norteamericana no. 61/778,208, presentada el 12 de marzo de 2013, cada una de las cuales se incorpora en este documento en su totalidad como referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS El Listado de Secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y se incorpora por este medio en la especificación, como referencia. El nombre del archivo de texto que contiene el Listado de Secuencias es OPHT_010_02WO-ST25.txt. El archivo de texto es de aproximadamente 35 KB, fue creado el 29 de mayo de 2013, y se envía electrónicamente a través de EFS-Web.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a composiciones que comprenden un aptámero contra el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (anti PDGF) y un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Esta invención también se refiere a métodos para inhibir la hiperproliferación de células o la angiogénesis aberrante, asi como a métodos para tratar o evitar las enfermedades oftalmológicas, que comprenden administrar un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF. Además, esta invención se refiere a composiciones y dispositivos de administración de fármacos que proporcionan administración extendida de los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Varios trastornos de los ojos se caracterizan por, son provocados por, o resultan en la neovascularización de la retina o el iris o edema de la retina. Estos trastornos incluyen la degeneración macular, retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva, coriorretinopatia serosa central, edema macular cistoide, enfermedad de Coats y neoplasias oculares o anexiales, tales como hemangioma coroidal, carcinoma epitelial del pigmento retinal, y linfoma intraocular. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una enfermedad que afecta aproximadamente a uno de cada diez ciudadanos de los Estados Unidos de América mayores de 65 años. Un tipo de AMD "AMD húmeda", también se conoce como "AMD neovascular" y "AMD exudativa", representan solo el 10% de los casos de AMD pero resultan en el 90% de los casos de ceguera legal a partir de la degeneración macular en los ancianos. La retinopatia diabética puede afectar hasta el 80% de todos los pacientes que tienen diabetes durante 10 años o más y es la tercera causa principal de ceguera en los adultos, representando casi 7% de la ceguera en los Estados Unidos.

Se han hecho avances para entender los eventos moleculares que acompañan o que llevan a la neovascularización ocular, incluyendo el papel de los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Se ha demostrado que los agentes terapéuticos que inhiben la actividad de estos factores de crecimiento proporcionan un beneficio terapéutico para los pacientes que sufren de trastornos vasculares de los ojos, tales como AMD y retinopatia diabética, incluyendo los aptámeros compuestos de oligonucleótidos sintéticos. Más recientemente, está siendo explorado el uso combinado de los agentes terapéuticos que tienen como objetivo ya sea al PDGF o al VEGF.

La inhibición combinada tanto del PDGF y el VEGF puede llevar a un beneficio mayor en el tratamiento de vario trastornos de los ojos que se caracterizan por, son provocados por, o resultan en la neovascularización de la coroides, la retina o el iris, o el edema retinal. La inhibición combinada tanto del PDGF y el VEGF por agentes individuales específicos para cada factor de crecimiento se puede lograr mediante la coadministración simultánea de ambos agentes.

Desafortunadamente, los agentes terapéuticos polipeptídicos pueden ser susceptibles de degradación física y química. La estabilidad de los agentes terapéuticos polipeptídicos puede estar influenciada por una variedad de factores que incluyen el polipéptido en si, por ejemplo, su secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, el desarrollo de composiciones farmacéuticas estables que comprendan los agentes terapéuticos polipeptídicos presenta un desafío significativo. El desafío es aún mayor para el desarrollo de composiciones que comprendan un agente terapéutico polipeptídico y otro agente terapéutico, como por ejemplo un agente terapéutico polinucleotídico, ya que esto requiere la identificación de los excipientes y las condiciones que estabilizan dos agentes terapéuticos diferentes con compatibilidad aceptable.

Claramente existe una necesidad en la téenica por composiciones estables que comprendan múltiples agentes terapéuticos, incluyendo aquellos que comprenden un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones que comprenden una cantidad efectiva de: (a) un aptámero anti PDGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y (b) un antagonista de VEGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. Una composición que comprende una cantidad afectiva de (a) un aptámero anti PDGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo y (b) un antagonista de VEGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo es una "composición de la invención".

En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de ranibizumab o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición a aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En ciertas modalidades, el amortiguador es L-histidina a una concentración aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM o fosfato de sodio a una concentración aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, y el modificador de la tonicidad es NaCl a una concentración aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de sorbitol, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de trehalosa. En modalidades particulares, la composición de la invención comprende además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del antagonista A o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL de bevacizumab o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición en aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En ciertas modalidades, el amortiguador es fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM o Tris.HCl a una concentración de aproximadamente 5 M a aproximadamente 200 mM, y el modificador de la tonicidad es NaCl a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de sorbitol, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de trehalosa. En modalidades particulares, la composición de la invención comprende además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y uno o más de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición en pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; (d) un modificador de la tonicidad; y (e) 0 a aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa. En ciertas modalidades, el amortiguador es fosfato a una concentración de aproximadamente 5 molar a aproximadamente 50 mM, y el modificador de la tonicidad es NaCl a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. En modalidades particulares, la composición de la invención comprende además: (f) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 3 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL del Antagonista A o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; (b) aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL de ranibizumab o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición en aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM o histidina.HCl a una concentración de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 10 mM, y el modificador de la tonicidad es aproximadamente 0.5% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v) de trehalosa.

La presente invención proporciona además métodos para tratar o prevenir una enfermedad oftalmológica, que comprenden administrar a un mamífero en necesidad de la misma, una composición de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra cromatogramas de AEX-HPLC de las composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig.2 muestra cromatogramas de WCX-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig.3 muestra cromatogramas de SE-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig.4 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas a 37°C.

La Fig.5 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.6 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.7 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.8 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.9 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.10 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.11 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C, La Fig.12 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig. 13 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig. 14 muestra una gráfica de tendencia de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig.15 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

Las FIGS. 16A y 16B muestran gráficas de tenencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs almacenadas a 37°C. La Fig.16A muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden 5% de sorbitol durante el tiempo a varios pHs, y la Fig. 16B muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden NaCl 130 mM con el tiempo, a varios pHs.

Las FIGS.17A y 17B muestran gráficas de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig. 17A muestra la pureza por ciento del ranibizumab en composiciones que comprende 5% de sorbitol, con el tiempo, a varios pHs, y la Fig. 17B muestra la pureza por ciento del ranibizumab en composiciones que comprenden NaCl 130 mM a varios pHs.

La Fig.18 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C, Las FIGS. 19A y 19B muestran gráficas de tendencia de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig.19A muestra la pureza por ciento del ranibizumab en composiciones que comprenden 5% de sorbitol, y la Fig.19B muestra la pureza por ciento del ranibizumab en composiciones que comprende NaCl 130 mM.

La Fig. 20 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varios modificadores de la tonicidad a varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig. 21 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varios modificadores de la tonicidad a pH 8.0, almacenadas a 37°C.

La Fig. 22 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varios modificadores de la tonicidad, a varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig.23 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varios modificadores de la tonicidad, a varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig.24 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas a 37°C.

Las FIGS.25A y 25B muestran gráficas de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas a 25°C (Fig.25A) y 37°C (Fig.25B).

Las FIGS. 26A y 26B muestran gráficas de tendencia de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas a 25°C (Fig.26A) y 37°C (Fig.26B).

Las FIGS.27A, 27B, y 27C muestran cromatogramas de SE-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención almacenadas durante 8 semanas a 37°C (Fig.27A), 25°C (Fig.27B) y 4°C (Fig. 27C).

La Fig.28 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F6 almacenada a 4°C, 25°C y 37°C.

La Fig. 29 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en la composición F6 almacenada a 4°C, 25°C y 37°C.

La Fig.30 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F6 almacenada a 4°C, 25°C y 37°C.

La Fig.31 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del ranibizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C, 25°C y 37°C.

La Fig. 32 muestra cromatogramas de AEX-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas durante dos semanas a 37°C.

La Fig. 33 muestra cromatogramas de WCX-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención, almacenadas durante 8 semanas a 25°C.

La Fig.34 muestra cromatogramas de SE-HPLC de composiciones seleccionadas de la invención almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig.35 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.36 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.37 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig. 38 muestra una gráfica de tendencia de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.39 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.40 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.41 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.42 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 37°C.

La Fig.43 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.44 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.45 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.4 6 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig. 47 muestra una gráfica de tendencia de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig. 48 muestra una gráfica de tendencia de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.49 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.50 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 25°C.

La Fig.51 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig.52 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig.53 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la Estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig.54 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig.55 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención almacenadas a 4°C.

La Fig. 56 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que contienen sorbitol, que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig. 57 es una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención que contienen sorbitol, que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig.58 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que contienen sorbitol, que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C.

La Fig.59 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención que contienen sorbitol, que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C.

Las FIGS. 60A y 60B muestran gráficas de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig.60A muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden 5% de sorbitol, con el tiempo, a varios pHs, y la Fig. 60B muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden NaCl 130 mM o NaCl 150 mM, con el tiempo, a varios pHs.

Las FIGS. 61A y 61B muestran gráficas de tendencia de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig.61A muestra la pureza por ciento del bevacizumab en composiciones que comprenden 5% de sorbitol, y la Fig.61B muestra la pureza por ciento del bevacizumab en composiciones que comprenden NaCl 130 mM y NaCl 150 mM, con el tiempo, a varios pHs.

Las FIGS. 62A y 62B muestran gráficas de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig.62A muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden 5% de sorbitol, y la Fig.62B muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden NaCl 130 mM o NaCl 150 mM, con el tiempo, a varios pHs.

Las Figs. 63A y 63B muestran gráficas de tendencia de SE- HPLC de la estabilidad el bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención que tienen varios pHs, almacenadas a 37°C. La Fig.63A muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden 5% de sorbitol, y la Fig.63B muestra la pureza por ciento del Antagonista A en composiciones que comprenden NaCl 130 mM o NaCl 150 mM, con el tiempo, a varios pHs.

La Fig. 64 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varias concentraciones del Antagonista A, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig. 65 muestra una gráfica de tendencia de WXC-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varias concentraciones del Antagonista A, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig.66 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varias concentraciones del Antagonista A, almacenadas a 37°C.

La Fig. 67 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC en composiciones seleccionadas de la invención que comprenden varias concentraciones del Antagonista A, almacenadas durante 8 semanas a 37°C.

La Fig. 68 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F19, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig. 69 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en la composición F19, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig.70 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F19, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig.71 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en la composición F19, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig.72 muestra una gráfica de tendencia de AEX-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F19, en comparación con la composición F25, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig.73 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del Antagonista A en la composición F19, en comparación con la composición F25, a varias condiciones de almacenamiento.

La Fig.74 muestra una gráfica de tendencia de WCX-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en la composición F19, en comparación con la composición F18, a varias temperaturas de almacenamiento.

La Fig.75 muestra una gráfica de tendencia de SE-HPLC de la estabilidad del bevacizumab en la composición F19, en comparación con la composición F18, a varias condiciones de almacenamiento.

La Fig. 76 muestra una gráfica que representa la supresión de la expresión de TF inducida por VEGF, por varias composiciones de la invención.

La Fig. 77 muestra una gráfica que representa la supresión de la expresión de BTG2 inducida por PDGF, por varias composiciones de la invención.

La Fig.78 muestra la estructura del Antagonista A (paneles A-F), donde la designación ind^g^ jJgjcontinuación de un panel previo.

Las Figs. 79A y 79B muestran gráficas que representan los resultados de la formación de imágenes por micro flujo sustraídos (MFI) para la Composición F27 bajo condiciones de almacenamiento variables. Las gráficas proporcionan el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetro circular equivalente listados cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C ya sea en un frasco o una jeringa. La Fig.79A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mm a 100 mm, y la Fig. 79B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 pm a 100 pm. Las lcyendas desde la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetros de partícula.

Las Figs. 80A y 80B muestran gráficas que representan los resultados de MFI sustraídos para la composición F28 bajo condiciones de almacenamiento variables. La gráfica proporciona el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetros circulares equivalentes cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C ya sea en un frasco o en una jeringa. La Fig. 80A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mm a 100 mih y la Fig. 80B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 mm a 100 mih. Las lcyendas de la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetro de partícula.

Las Figs. 81A y 81B muestran gráficas que representan los resultados de MFI sustraídos para la Composición F29 bajo condiciones de almacenamiento variables. Las gráficas proporcionan el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetros circulares equivalentes listados cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C, ya sea en un frasco o en una jeringa. La Fig. 81A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mih a 100 mm, y la Fig.81B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 mih a 100 mth. Las leyendas de la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetro de partícula.

Las Figs. 82A y 82B muestran gráficas que representan los resultados de MFI sustraídos para la Composición F30 bajo condiciones de almacenamiento variables. Las gráficas proporcionan el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetros circulares equivalentes listados cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C, ya sea en un frasco o en una jeringa. La Fig. 82A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mm a 100 mm, y la Fig.82B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 mth a 100 mih. Las lcyendas de la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetro de partícula.

Las Figs. 83A y 83B muestran gráficas que representan los resultados de MFI sustraídos para la Composición F31 bajo condiciones de almacenamiento variables. Las gráficas proporcionan el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetros circulares equivalentes listados cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C, ya sea en un frasco o en una jeringa. La Fig. 83A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mth a 100 mta, y la Fig.83B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 mm a 100 mpi. Las leyendas de la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetro de partícula.

Las Figs.84A y 84B muestran gráficas que representan los resultados de MFI sustraídos para las Composiciones F27 a F31 bajo condiciones de almacenamiento variables. Las gráficas proporcionan el conteo de partículas (número de partículas/mL) determinado para cada uno de los rangos de diámetros circulares equivalentes listados cuando se almacenan ya sea a 5°C o 30°C, ya sea en un frasco o en una jeringa. La Fig. 84A proporciona los conteos de partículas dentro de varios rangos que abarcan el diámetro circular equivalente de 1 mm a 100 mih, y la Fig.84B proporciona los conteos de partículas dentro de los rangos seleccionados que abarcan el diámetro circular equivalente de 10 mih a 75 mih. En la Fig.84A, el conteo de partículas dentro del rango de diámetro circular equivalente de <1 mm a <2 mha obtenido para la composición F31 almacenada a 30°C en un frasco fue de 217,404, el cual excede los valores representados en el eje Y de la gráfica, de modo tal que este valor se indica arriba de la barra correspondiente. En la Fig. 84B, el conteo de partículas dentro del rango de diámetro circular equivalente de <10 mhi a <25 mih, obtenido para la Composición F31 almacenada a 30°C en un frasco fie de 3,044, el cual excede los valores representados en el eje Y de la gráfica, de modo tal que este valor se indica arriba de la barra correspondiente. Las lcyendas de la parte superior a la parte inferior corresponden a las barras de izquierda a derecha para cada rango de diámetro de partícula.

La Fig.85 muestra una gráfica que representa la expresión relativa del gen BTG2 por las células N1H 3T3 tratadas con PDGF-BB 1.65 nM y las concentraciones indicadas del Antagonista A (F32).

La Fig. 86 muestra una gráfica que representa la expresión relativa del gen BTG2 por células N1H 3T3 tratadas con PDGF-BB 1.65 nM y las concentraciones indicadas del Antagonista A en combinación con aflibercept (F33) o el Antagonista A solo (F34).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y Abreviaturas Como se usa en este documento, los siguientes términos y frasis tendrán los significados establecidos en este documento.

El término "aproximadamente", cuando se usa en conexión con una indicación numérica referenciada significa la indicación numérica referenciada más o menos hasta 10% de esa indicación numérica referenciada. Por ejemplo, "aproximadamente 100" significa desde 90 a 110.

El término "antagonista" se refiere a un agente que inhibe, ya sea parcialmente o completamente la actividad o la producción de moléculas especificas. En particular, el término "antagonista", como se aplica selectivamente en este documento, significa un agente capaz de reducir los niveles de la expresión genética, los niveles de ARNm, los niveles de proteina o la actividad de la protéína de moléculas especificas. Las formas ilustrativas de los antagonistas incluyen, por ejemplo, proteínas, polipéptidos, péptidos (tales como péptidos cíclicos), anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, péptido miméticos, moléculas de ácido nucleico, moléculas antisentido, ribozimas, aptámeros, moléculas de ARNi, y moléculas orgánicas pequeñas. Los mecanismos ilustrativos, no limitantes de la inhibición del antagonista incluyen la represión de la síntesis y la estabilidad del ligando o de ambos (por ejemplo, usando, ribozimas antisentido o composiciones de ARNi que tienen como objetivo el gen/ácido nucleico del ligando), el bloqueo del enlace del logando a su receptor cognado (por ejemplo, usando aptámeros anti ligando, anticuerpos, anticuerpos anti receptor, o un receptor cognado de señuelo o fragmentos del mismo), la represión de la síntesis y la estabilidad del receptor o ambas (por ejemplo usando, ribozimas o composiciones de ARNi, antisentido, que tienen como objetivo el gen/ácido nucleico del receptor del ligando), el bloqueo del enlace del receptor con su elemento de respuesta cognado (por ejemplo, usando anticuerpo anti receptor) y el bloqueo de la activación del receptor por su ligando cognado (por ejemplo, usando inhibidores de tirosina cinasa del receptor). Además, el antagonista puede inhibir directamente o indirectamente las moléculas específicas.

Como se usa aquí, un "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de enlace al antigeno o una cadena individual del mismo. Por lo tanto, el término "anticuerpo" incluye cualquier proteína o péptido que contiene moléculas que comprenden al menos una porción de moléculas de inmunoglobulina que tienen actividad biológica de enlace al antigeno. Los ejemplos de tales pueden comprender una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada o ligera o una porción de enlace al ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región estructural (FR), o cualquier porción de la misma, o al menos una porción de una proteína de enlace. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales.

El término "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo que es un fragmento de enlace al antígeno o las cadenas individuales del mismo. Un fragmento de anticuerpo puede ser un polipéptido diseñado por ingeniería sintéticamente o genéticamente. Los ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace al antígeno" de un anticuerpo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHi, (ii) un fragmento F(ab')2 un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra, (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHi, (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 544-546), el cual consiste de un dominio VH, y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, estos pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permita ser producidos como una cadena de proteina única en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como una cadena Fv individual (scFv), véase, por ejemplo, Bird et al., (1998) Science 242 423-426, y Huston et al., (1998) Proc Nati Acad Sci EUA 855879-5883). Tales anticuerpos de cadena individual también deben estar abarcados dentro del término "fragmento de enlace al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando las téenicas convencionales conocidas por aquellas personas experimentadas en la técnica, y los fragmentos pueden ser seleccionados por su utilidad de la misma forma como los anticuerpos completos.

El término "aptámero" se refiere a un péptido o ácido nucleico que tiene un efecto inhibidor sobre un objetivo. La inhibición del objetivo por el aptámero puede ocurrir por el enlace del objetivo, alterando catalíticamente el objetivo, haciéndolo reaccionar con el objetivo en una forma en la que se modifique el objetivo o la actividad funcional del objetivo, al enlazarse iónicamente o de forma covalente al objetivo como en un inhibidor suicida o facilitando la reacción entre el objetivo y otras moléculas. Los aptámeros pueden ser péptidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, otros ácidos nucleicos o una mezcla de diferentes tipos de ácidos nucleicos. Los aptámeros pueden comprender uno o más aminoácidos, bases, azucares, separadores de polietilenglicol o unidades de esqueleto de fosfato modificados, como se describe con más detalle en este documento. Los aptámeros pueden estar pegilados o no pegilados. Por ejemplo, una o más cadenas de polietilenglicol pueden ser enlazadas al extremo 5' de un aptámero de ácido nucleico a través de un enlazador.

Una "composición" puede comprender un agente activo y un portador, inerte o activo. Las composiciones son útiles para uso de diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo. En modalidades particulares, las composiciones son estériles, sustancialmente libres de endotoxinas o no toxicas para los receptores a la dosis o la concentración empleada.

El término "etiqueta" incluye, pero no se limita a, un isotopo radioactivo, un fluoróforo, una porción quimioluminiscente, una enzima, un sustrato enzimático, un cofactor enzimático, un inhibidor enzimático, un tinte, iones de metales, un ligando (por ejemplo biotina o un hapteno) y los similares. Los ejemplos de etiquetas de fluoróforo incluyen fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, y luminol. Otros ejemplos de etiquetas incluyen NADPH, alfa-beta-galactosidasa y peroxidasa de rábano.

El término "ácido nucleico" se refiere a un polinucleótido, como por ejemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). El término también incluye análogos de ARN o ADN construidos a partir de análogos de nucleótidos, y, cuando es aplicable para las modalidades que se describen, polinucleótidos de hebra simple (sentido o antisentido) o doble, etiquetas de secuencias expresadas (estas), cromosomas, ADNcs, ARNms, y ARNrs. Los ácidos nucleicos incluyen formas modificadas de ácidos nucleicos que se desvian estructuralmente de las estructuras de ácido nucleico de formación natural con base en bloques de construcción estándar (adenosina, citidina, guanosina, timidina y uridina). Las modificaciones pueden ser al esqueleto, los azúcares o las nucleobases y pueden ser de origen natural o introducidas artificialmente. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser modificados dentro de su esqueleto. Las modificaciones ilustrativas se describen en este documento. Los ácidos nucleicos pueden incluir aptámeros de ácido nucleico y spiegelmeros.

En algunas modalidades, el Antagonista A existe en una forma modificada. Una forma modificada del Antagonista A es aquella la cual comprende un nucleótido en una forma modificada como se describe en este documento, donde el nucleótido está presente en una forma no modificada en el Antagonista A.

Los términos "interferencia de ARN", "ARNi", "ARNim" y "ARNis" se refiere a cualquier método mediante el cual, la expresión de un gen o producto genético se reduce al introducir en células uno o más ARNs de hebra doble, los cuales son homólogos para un gen de interés (en partículas para el ARN mensajero del gen de interés, por ejemplo, PDGF o VEGF).

El término "neovascularización" se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos en el tejido anormal o en posiciones anormales.

El término "angiogénesis" se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos en el tejido o en posiciones normales o anormales.

El término "enfermedad oftalmológica" incluye enfermedades de los ojos y enfermedades de los anexos oculares.

El término "trastorno neovascular ocular" se refiere a un trastorno ocular caracterizado por la neovascularización. Ciertos canceres son trastornos neovasculares oculares. En una modalidad, el trastorno neovascular ocular es un trastorno distinto al cáncer. Los ejemplos de trastornos neovasculares oculares distintos al cáncer incluyen retinopatía diabética, y degeneración macular relacionada con la edad.

El término "mamífero" incluye mamíferos humanos y no humanos, tales como, por ejemplo, humanos, ratones, ratas, conejos, monos, vacas, cerdos, ovejas, caballos, perros y gatos.

El término "proteína" y "polipéptido" se usan de forma intercambiable y en su sentido más amplio, se refieren a un compuesto de dos o más aminoácidos subunidades, análogos de aminoácido o peptidomiméticos. Las subunidades pueden ser enlazadas por medio de enlaces peptídicos. En otra modalidad, las subunidades pueden ser enlazadas por otros enlaces, por ejemplo, ásteres, éteres, etc. No se sitúa limitación sobre el número máximo de aminoácidos los cuales pueden comprender una secuencia de proteína o de péptido.

Como se usa aquí, el término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y tanto el isómero D y L, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

El término "PDGF" se refiere a un factor de crecimiento derivado de las plaquetas que regula el crecimiento o la división celular. Como se usa aquí, el término "PDGF" incluye los varios subtipos de PDGF que incluyen PDGF-B (por ejemplo, Números de Acceso al GenBank: X02811 y CAA26579), PDGF-A (Números de Acceso al GenBank: X06374 y CAA29677), PDGF-C (Números de Acceso al GenBank: NM 016205 y NP 057289), PDGF-D, variantes 1 y 2 (Números de Acceso al GenBank: NM 025208, NP 079484, NM 033135, NP 149126), y las formas dimerizadas de los mismos, incluyendo PDGF- AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, y PDGF-DD. Los factores de crecimiento derivados de las plaquetas incluyen homo o heterodimeros de la cadena A (PDGF-A) y la cadena B (PDGF-B) que ejercen su acción a través del enlace y la dimerización de dos receptores de la superficie celular del factor de crecimiento derivado de las plaquetas de tirosina cinasa (es decir, PDGFRs), PDGFR-a (Véanse los números de Acceso al GenBank: NM 006206 y NP 006197) y PDGFR-b (véanse los Números de Acceso al GenBank: NM 002609 y NP002600). Véase también, la Publicación de la Solicitud PCT No. W02010/127029, la cual se incorpora en este documento cromó referencia, en su totalidad, para las secuencias de PDGF. Además, han sido identificados el PDGF-C y PDGF-D, dos ligandos activados por proteasa adicionales para los complejos de PDGFR (Li et al., (2000) Nat. Cell. Biol.2: 302-9; Bergsten et al., (2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512-6; y Untele et al., (2001) circulation 103: 2241-47). Debido a las diferentes especificidades de enlace de los PDGFRs, se sabe que el PDGFR-a/a enlaza el PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, y PDGF-CC; el PDGFR-b/b enlaza el PDGF-BB y el PDGF-DD; en tanto que el PDGFR-a/b enlaza el PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, y PDGF-DD (Betsholtz et al., (2001) BioEssavs 23: 494-507). Como se usa en este documento, el término "PDGF" también se refiere a aquellos miembros de la clase de los factores de crecimiento que indicen la síntesis y la mitogenesis a través del enlace y la activación de un PDGFR sobre un tipo respectivo de células. Los PDGFs pueden efectuar, por ejemplo: la migración dirigida de células (quimiotaxis) y la activación celular; la activación de la fosfolipasa; rotación aumentada de fosfatidilinositol y metabolismo de prostaglandinas; estimulación tanto del colágeno y la síntesis de la colagenasa por células sensibles; alteración de las actividades metabólicas celulares, incluyendo síntesis de la matriz, producción de citocina, y absorción de lipoproteínas; inducción, indirectamente, de una respuesta proliferativa en células que carecen de receptores de PDGF; y actividad vasoconstrictora potente. El término "PDGF" puede ser usado para hacer referencia a un polipéptido de "PDGF", un gen o ácido nucleico que codifica el "PDGF", o una forma dimerizada de los mismos. El término "PDGF-A" se refiere a polipéptido de cadena A del PDGF o a su gen o ácido nucleico codificante correspondiente. El término "PDGF-B" se refiere a un polipéptido de cadena B del PDGF o a su gen o ácido nucleico codificante correspondiente. El término "PDGF-C" se refiere a un polipéptido de cadena C del PDGF o a su gen o ácido nucleico codificante correspondiente. El término "PDGF-D" se refiere a un polipéptido de cadena D del PDGF o a sus genes o ácidos nucleicos codificantes correspondientes, incluyendo las variantes 1 y 2 del polipéptido de la cadena D del PDGF. El término "PDGF-AA" se refiere a un dímero que tiene dos polipéptidos de la cadena a de PDGF. El término "PDGF-AB" se refiere a un dímero que tiene un polipéptido de la cadena A de PDGF y un polipéptido de la cadena B de PDGF. El término "PDGF-BB" se refiere a un dimero que tiene dos polipéptidos de la cadena B de PDGF. El término "PDGF-CC" se refiere a un dimero que tiene dos polipéptidos de la cadena C de PDGF. El término "PDGF-DD" se refiere a un dimero que tiene dos polipéptidos de la cadena D de PDGF.

El término "VEGF" se refiere a un factor de crecimiento endotelial vascular que induce la angiogénesis o un proceso angiogénico. Como se usa aquí, el término "VEGF" incluye los varios subtipos de VEGF (conocido también como factor de permeabilidad vascular (VPF) y VEGF-A) (véase los Números de Acceso al GenBank: NM 003376 y NP 003367) que surgen, por ejemplo, mediante el empalme alternativo del gen VEGF-A/VPF que incluye VEGFi2i, VEGFI65 y VEGFi89. Véase también la Publicación de la Solicitud PCT No. W02010/127029, la cual se incorpora en este documento como referencia, en su totalidad, para las secuencias de VEGF. Además, como se usa en este documento, el término "VEGF" incluye los factores angiogénicos relacionados con el VEGF tales como, PIGF (factor de crecimiento de la placenta), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-e, los cuales actúan a través de un receptor de VEGF cognado (es decir, VEGFR) para inducir la angiogénesis o un proceso angiogénico. El término "VEGF" incluye cualquier miembro de la clase de los factores de crecimiento que se enlazan al receptor de VEGF tal como VEGFR-I (FIt-I) (Número de Acceso al GenBank: AF063657 y SID NO: 8 de la Publicación de la solicitud PCT No. 2010/127029), VEGFR-2 (KDR/Flk-1) (véase los Números de Acceso al GenBank: AG035121 y AAB88005), o VEGFR-3 (FLT-4). El término "VEGF" puede ser usado para hacer referencia a un polipéptido de "VEGF" o un gen o ácido nucleico codificante de "VEGF".

El término "antagonista de PDGF" se refiere de forma general a un agente que reduce, o inhibe ya sea parcialmente o completamente, la actividad o la producción de un PDGF. Un antagonista de PDGF puede reducir o inhibir directamente o indirectamente la actividad o la producción de un PDGF especifico tal como PDGF-B. Además, los "antagonistas de PDGF" consistentes con la definición anterior de "antagonista", incluyen los agentes que actúan sobre un ligando de PDGF o su receptor cognado para reducir o inhibir una señal del receptor asociado con PDGF. Los ejemplos de "antagonistas de PDGF" incluyen moléculas antisentido, ribozimas o ARNi que tienen como objetivo un ácido nucleico de PDGF; aptámeros anti PDGF, anticuerpos anti PDGF para el PDGF en si o su receptor, o señuelos del receptor de PDGF soluble que evitan el enlace de un PDGF a su receptor cognado; moléculas antisentido, ribozimas o ARNi que tienen como objetivo un ácido nucleico del receptor de PDGF cognado (PDGFR); aptámeros anti PDGFR o anticuerpos PDGFR que se enlazan a un receptor de PDGFR cognado; e inhibidores de tirosina cinasa de PDGFR.

El término "antagonista de "VEGF" se refiere de forma general a un agente que reduce, o inhibe, ya sea parcialmente o completamente, la actividad o la producción de un VEGF. Un antagonista de VEGF puede reducir o inhibir directamente o indirectamente la actividad o la producción de un VEGF especifico como por ejemplo VEGFI65. Además, "antagonistas de VEGF" consistentes con la definición anterior de "antagonista", incluyen agentes que actúan ya sea sobre un ligando de VEGF o su receptor cognado para reducir o inhibir una señal de receptor asociado con VEGF. Los ejemplos de "antagonistas de VEGF" incluyen moléculas antisentido, ribozimas o ARNi que tienen como objetivo un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti VEGF, anticuerpos anti VEGF para el VEGF en si o su receptor, o señuelos de VEGF solubles que evitan en enlace de un VEGF a su receptor cognado; moléculas, ribozimas, o ARNi antisentido que tiene como objetivo un ácido nucleico del receptor de VEGF cognado (VEGFR); aptámeros anti VEGFR o anticuerpos anti VEGFR que se enlazan a un receptor de VEGFR cognado; e inhibidores de tirosina cinasa. Como se usa aquí, el término "antagonista de VEGF" se usa para referirse colectivamente al ranibizumab, bevacizumab, y aflibercept.

Las "sales aceptables farmacéuticamente" incluyen sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isomcotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, gluaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, canforsulfonato, pamoato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, clorobenzoato, dimtrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, alfa-hidroxibutirato, butino-1,4-dicarboxilato, hexino-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato, glicolato, heptanoato, hipurato, malato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, ftalato, teraftalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etilsulfonato, 2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, naftaleno-1,5-sulfonato, xilenosulfonato, y tartrato. El término "sal aceptable farmacéuticamente" también se refiere a una sal de un antagonista de la presente invención gue tiene un grupo funcional ácido, como por ejemplo un grupo funcional ácido carboxilico. Y una base. Las bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio, hidróxidos de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, hidróxidos de otros metales, tales como aluminio y zinc, amoniaco, y aminas orgánicas, tales como mono, di, o trialquilaminas hidroxi-sustituidas, diciclohexilamina, tributilamina, piridina, N-metilo, N-etilamina, dietilamina, trietilamina, mono, bis, o tris-(2-OH-alquil inferior aminas), tales como mono, bis-, o tris- (2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-ter-butilamina, o tris- (hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquilo inferior N (hidroxilo-alquilo inferior)-aminas, tales como N,N-dimetil-N- (2-hidroxietil)amina o tri(2-hidroxietil)amina, N-metil-D-glucamina, y aminoácidos tales como arginina, U sina, y los similares. El término "sal aceptable farmacéuticamente" también incluye un hidrato de un compuesto de la invención.

El término "cantidad efectiva" cuando se usa en conexión con una composición de la invención o el tratamiento o la prevención de una enfermedad oftalmológica, se refiere a una cantidad combinada de un antagonista de PDGF y un antagonista de VEGF que es útil para tratar o prevenir una enfermedad oftalmológica. La "cantidad efectiva" puede variar dependiendo del modo de administración, el sitio especifico de la enfermedad oftalmológica, la edad, el cuerpo, el peso, y la salud general del mamífero. La cantidad efectiva de cada antagonista de una composición de la invención es la cantidad de cada uno que sea útil para tratar o prevenir una enfermedad oftalmológica con la composición, aun si la cantidad del antagonista de PDGF en ausencia del antagonista de VEGF, o el antagonista de VEGF en ausencia del antagonista de PDGF, no sea efectiva para tratar la enfermedad oftalmológica.

Una "variante" del polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido X que está alterada en uno o más residuos de aminoácidos. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde los aminoácidos sustituidos tienen propiedades estructurales o químicas similares (por ejemplo, reemplazo de leucina con isoleucina). De forma no tan frecuente, una variante puede tener cambios "no conservativos" (por ejemplo, el reemplazo de glicina con tritofano). Las variaciones inferiores análogas también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambos. La guia para determinar cuáles residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados, o eliminados sin eliminar la actividad biológica o inmunológica pueden ser determinados usando programas de computadora bien conocidos en la téenica, por ejemplo, el programa informático LASERGENE (DNASTAR).

El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con aquella de un gen, la secuencia codificante del mismo, el aptámero, u otra secuencia de polinucleótidos. La variante puede incluir una o más sustituciones, adiciones o inserciones de nucleótidos o nucleósidos en comparación con el gen, la secuencia codificante, el aptámero y otra secuencia de polinucleótidos de referencia. Esta definición también incluye, por ejemplo, variantes "alélicas", "de empalme", "de especies" o "polimórficas". Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con las moléculas de referencia, pero por lo general tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al empalme alternativo de los exones durante el procesamiento de ARNm. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidoss de un gen particular entre los individuos de una especie dada.

Como se usa aquí, el término "excipiente" se refiere a una sustancia típicamente inerte que se usa comúnmente como un agente diluyente, de vehículo, conservador, aglutinante, o estabilizante para los agentes activos e incluye, pero no se limita a proteínas (por ejemplo, albúmina de suero, etc.), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina, histidina, alanina, etc.), ácidos grados y fosfolipidos (por ejemplo, alquil sulfonatos, caprilato, etc.), surfactantes (por ejemplo, SDS, polysorbate, surfactantes no iónicos, etc.), sacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, etc.), y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). Véase también Remington's Pharmaceutical Sciences (de Joseph P. Remington, 18va ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.) y Handbook of Pharmaceutical Excipients (de Raymond C. Rowe, 5ta ed., APhA Publications, Washington, D.C.) los cuales se incorporan en el presente, en su totalidad. En ciertas modalidades, los excipientes imparten una propiedad física benéfica a la composición, tales como estabilidad aumentada de proteínas, polinucleótidos, aptámeros o moléculas pequeñas, estabilidad aumentada de las proteínas, polinucleótidos, aptámeros o moléculas pequeñas, o viscosidad aumentada. En algunas modalidades, la composición comprende una pluralidad de agentes activos, y los excipientes ayudan a estabilizar los agentes activos.

El término "amortiguador" como se usa aquí, denota un excipiente aceptable farmacéuticamente, el cual estabiliza el pH de una preparación farmacéutica. Los amortiguadores aceptables son bien conocidos en la téenica, los amortiguadores aceptables farmacéuticamente, adecuados incluyen, pero no se limitan a amortiguadores de acetato, amortiguadores de histidina, amortiguadores de citrato, amortiguadores de succinato, amortiguadores de tris y amortiguadores de fosfato. Los métodos para preparar tales amortiguadores son bien conocidos en la técnica. Independientemente de los amortiguadores usados, el pH puede ser ajustado a un valor desde aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.0 o alternativamente desde aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5 o alternativamente aproximadamente 6.0 con un ácido o una base conocidos en la téenica, por ejemplo, ácido succinico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido cítrico, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio. Los amortiguadores adecuados incluyen sin limitación, amortiguador de histidina, amortiguadores de ácido 2-morfolinoetanolsulfonico (MES), cacodilato, fosfato, acetato, succinato, y citrato. Los ejemplos adicionales de amortiguadores de fosfato también incluyen, sin limitación, amortiguadores de fosfato de sodio y amortiguadores de fosfato de potasio. Los amortiguadores de fosfato de sodio pueden ser preparados, por ejemplo, combinando una solución de Naf^PCh (monobásico) con una solución de Na2HP04 (dibásico) y entonces ajustando el pH de las soluciones combinadas ya sea con ácido fosfórico o hidróxido de sodio para lograr el pH deseado. Los amortiguadores de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris) pueden ser preparados, por ejemplo, ajustando el pH de una solución de Tris usando HCl para lograr el pH deseado, por ejemplo, un pH en el rango de aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente pH 9.0. La L-histidina también puede ser usada como un amortiguador de acuerdo con la invención. En ciertas modalidades, una amortiguador es capaz de lograr o mantener el pH de una composición de la invención dentro de un rango deseado o en o cerca de un pH deseado, por ejemplo, durante el almacenamiento, por ejemplo, durante el almacenamiento a la temperatura ambiente o a 4°C durante al menos una semana, al menos un mes, al menos dos meses, al menos cuatro meses, al menos seis meses, al menos un año, o al menos dos años. En ciertas modalidades, la concentración del amortiguador es desde aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 1000 mM, aproximadamente 0.1 molar a aproximadamente 1000 mM, aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente, 60 mM, aproximadamente 4 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 4 mM a aproximadamente 40 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM.

Los "crioprotectores" acatables farmacéuticamente son conocidos en la téenica e incluyen sin limitación, por ejemplo, sacarosa, trehalosa, y glicerol. Los crioprotectores aceptables farmacéuticamente proporcionan protección de estabilidad de las composiciones, o uno o más de los ingredientes activos en las mismas, contra los efectos del congelamiento o la liofilización.

El término "agente de tonicidad" o "modificador de tonicidad" como se usa en este documento denota los agentes aceptables farmacéuticamente usados para modular la tonicidad de una composición. Los agentes de tonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, sorbitol, trehalosa, cloruro de potasio, glicerina, y cualquier componente del grupo de los aminoácidos, azúcares, como se definen en este documento, asi como las combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, los agentes de tonicidad pueden ser usados en una cantidad de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 450 mM, aproximadamente 20 mM a aproximadamente 400 mM, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM. En ciertas modalidades, un agente de tonicidad comprende un aminoácido presente en una composición de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM.

El término ''estabilizador" indica un excipiente aceptable farmacéuticamente, el cual protege el o los ingredientes o agentes farmacéuticos activos o la composición contra la degradación química o física durante la fabricación, el almacenamiento y la aplicación. Los estabilizadores incluyen, pero no se limitan a azúcares, aminoácidos, polioles, surfactantes, antioxidantes, conservadores, ciclodextrinas, por ejemplo, hidroxipropil- -ciclodextrina, sulfobutiletil-b- ciclodextrina, b-ciclodextrina, polietilenglicoles, por ejemplo PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, albúmina, por ejemplo, albúmina de suero de humano (HSA), albúmina de suero de bovino (BSA), sales, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, y quelantes, por ejemplo, EDTA. Los estabilizadores pueden estar presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 1000 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mM, o aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM.

Como se usa aquí, el término "surfactante" se refiere a una sustancia orgánica aceptable farmacéuticamente, que tiene estructuras antipáticas; es decir, esta se compone de grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena de hidrocarbúrica soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los surfactantes pueden ser clasificados, dependiendo de la carga de la porción tensioactiva, en surfactantes aniónicos, catiónicos, y no iónicos. Los surfactantes pueden ser usados como agentes humectantes, emulgentes, solubilizantes y dispersantes, para las composiciones y preparaciones farmacéuticas de materiales biológicos. En algunas modalidades de las composiciones descritas en este documento, la cantidad del surfactante se describe como un porcentaje expresado en porciento de peso/volumen (% p/v). los surfactantes aceptables farmacéuticamente, adecuados, incluyen, pero no se limitan al grupo del polioxietilensorbitan ácido graso ésteres (Tween), polioxietilen alquil éteres (Brij), alquilfenilpolioxietileno éteres (Triton-X), copolimero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamero, Pluronic), o dodecil sulfato de sodio (SDS). Los polioxietilenosorbitan-ácido graso ésteres incluyen Polysorbate 20, (vendido con la marca Tween 20™) y polysorbate 80 (vendido con la marca Tween 80™). Los copolimeros de polietileno-polipropileno incluyen aquellos vendidos con los nombres Pluronic® F68 o Polaxamer 188™. Los polioxietileno alquil éteres incluyen aquellos vendidos con la marca Brij™. Los alquilfenolpolioxietileno éteres incluyen aquellos vendidos con la marca Triton-X. El polysorbate 20 (Tween 20™) y polysorbate 80 (Tween 80™) se usan por lo general en un rango de concentración de aproximadamente 0.001% p/v del volumen total de la composición, o alternativamente de aproximadamente 0.003% p/v a aproximadamente 0.007% p/v. en algunas modalidades, el Tween 80™ se usa a aproximadamente 0.003% p/v, aproximadamente 0.004% p/v, aproximadamente, 0.0045% p/v, aproximadamente 0.005% p/v, aproximadamente 0.0055% p/v, aproximadamente 0.006% p/v, o aproximadamente 0.007% p/v. En algunas modalidades, el Tween 80™ se usa en aproximadamente 0.005% p/v. En este aspecto, "p/v" significa el peso del surfactante por volumen total de la composición.

Un "lioprotector" se refiere a una sustancia aceptable farmacéuticamente que estabiliza una proteína, ácido nucleico u otros ingredientes o agentes farmacéuticos activos durante la liofilización. Los ejemplos de lioprotectores incluyen, sin limitación, sacarosa, trehalosa, o manitol.

Un "poliol" se refiere a un alcohol que contiene múltiples grupos hidroxilo, o un alcohol de azúcar. Un alcohol de azúcar es una forma hidrogenada de carbohidrato, cuyo grupo carbonilo (aldehido o cetona, que reduce el azúcar) ha sido reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario (por lo tanto al alcohol). Los alcoholes de azúcar tienen la fórmula general H(HCHO)n+iH, en tanto que los azúcares tienen la fórmula H(HCH0)nHC0.

Un "antioxidante" se refiere a las moléculas capaces de retrasar o evitar la oxidación de otras moléculas. Los antioxidantes son frecuentemente agentes reductores, agentes quelantes, y depuradores de oxígeno tales como tioles, ácido ascórbico o polifenoles. Los ejemplos no limitantes de antioxidantes incluyen ácido ascórbico (AA, E300), tiosulfato, metionina, tocoferoles (E306), galato de propilo (PG, E310), butilhidroquinona terciaria (TBHQ), hidroxianisol butilado (BHA, E320), e hidroxitolueno butilado (BHT, E321).

Un "conservador" es una sustancia química natural o sintética que se agrega a los productos tales como alimentos, composiciones farmacéuticas, pinturas, muestras biológicas, madera, etcétera, para evitar la descomposición por el crecimiento microbiano o por cambios químicos indeseables. Los aditivos conservadores pueden ser usados individualmente o en conjunción con otros métodos de conservación. Los conservadores pueden ser conservadores antimicrobianos, los cuales inhiben el crecimiento de bacterias y hongos, o antioxidantes tales como absorbedores de oxígeno, los cuales inhiben la oxidación de los constituyentes. Los ejemplos de conservadores antimicrobianos incluyen cloruro de benzalconio, ácido benzoico, clorohexidina, glicerina, fenol, sorbato de potasio, tiomerosal, sulfitos (dióxido de azufre, bisulfito de sodio, sulfito hidrógeno de potasio, etc.) y EDTA disódico. Otros conservadores incluyen aquellos usados comúnmente en las composiciones parenterales de proteína tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol, o metilparabeno.

La presente invención proporciona composiciones que comprenden al menos un aptámero anti PDGF y al menos un antagonista de VEGF, así como los métodos relacionados de fabricación y uso de las mismas.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad efectiva de: (a) un aptámero anti PDGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y (b) un antagonista de VEGF o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. En modalidades particulares, al menos aproximadamente 90% de uno o ambos del aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF es estable químicamente cuando la composición se almacena a una temperatura desde aproximadamente 2.0°C a aproximadamente 8.0°C durante al menos aproximadamente doce semanas.

En modalidades particulares de varias composiciones y métodos de la presente invención, el aptámero anti PDGF es el Antagonista A o una forma modificada del mismo. En modalidades particulares de varias composiciones y métodos de la presente invención, el antagonista de VEGF es ranibizumab, bevacizumab, o aflibercept, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos.

En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad oftalmológica, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de la misma una composición de la invención. La composición se administra en una cantidad efectiva para tratar o prevenir las enfermedades oftalmológicas. En varias modalidades, la enfermedad oftalmológica es la degeneración macular relacionada con la edad, vasculopatía coroidal polipoidal, condiciones asociadas con la neovascularización coroidal, retinopatía hipertensiva, retinopatía diabética, retinopatía de células falcifor es, condiciones asociadas con la neovascularización retinal periférica, retinopatía de premadurez, enfermedad oclusiva venosa, enfermedad oclusiva arterial, coriorretinopatia serosa central, edema macular cistoide, telangiectasia retinal, macroaneurisma arterial, angiomatosis retinal, retinopatia inducida por radiación, rubeosis iridis, o una neoplasia. En modalidades particulares, la enfermedad oftalmológica es la degeneración macular relacionada con la edad, y la degeneración macular relacionada con la edad es la degeneración macular relacionada con la edad húmeda, o degeneración macular relacionada con la edad seca. En ciertas modalidades, la composición está presente en un dispositivo de administración de fármacos. En ciertas modalidades, la composición se administra de forma infraocular. En modalidades especificas, la administración infraocular es administración intravitrea o la administración en la cámara anterior. En otras modalidades, los mamíferos son humanos.

Aptámeros de PDGF y Antagonistas de VEGF La presente invención proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF. En modalidades particulares, el aptámero anti PDGF es el Antagonista A o una forma modificada del mismo (o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo), y el antagonista de VEGF es ranibizumab, bevacizumab, o aflibercept (o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismos). La presente invención proporciona además composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF.

Aptámeros anti PDGF En ciertas modalidades, los aptámeros anti PDGF incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en la Patente Norteamericana No.8,039,443, incorporada en este documento como referencia, en su totalidad, los cuales incluyen aptámeros tanto específicos de PDGF y específicos de PDGF-VEGF.

Los ejemplos de aptámeros anti PDGF incluyen aptámeros cuya secuencia de oligonucleótidos comprende, consiste esencialmente de o consiste de una de las siguientes secuencias: ARC126: 5'- (5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [SEC ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [SEC ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3' [SEC ID NO:3])-3', en donde "HEG" = separador de hexaetilen glicol, "m" indica nucleótidos sustituidos con 2'-metoxi, "f" indica nucleótidos sustituidos con 2' fluoro, "d" indica desoxinucleótidos, y "[3T]" se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' en el azúcar ribosa; ARC127: 5'-[40K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [SEC ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [SEC ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3' [SEC ID NO:3])- 3 J' r en donde "HEG" = separador de hexaetilen glicol, "m" indica nucleótidos sustituidos con 2'-metoxi "f" indica nucleótidos sustituidos con 2' fluoro, "d" indica desoxinucleótidos, y "[3T]" se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' en el azúcar ribosa; ARC240: 5'-[20K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [SEC ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [SEC ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3' [SEC ID NO:3])-3', en donde "HEG" = separador de hexaetilen glicol, "m" indica nucleótidos sustituidos con 2'-metoxi, "f" indica nucleótidos sustituidos con 2' fluoro, "d" indica desoxinucleótidos, y "[3T]" se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' en el azúcar ribosa; ARC308: 5'-[30K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [SEC ID NO:1])-HEG-(5'-dC-dG- T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3 [SEC ID NO:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG- [3T]-3' [SEC ID NO:3])-3', en donde "HEG" = separador de hexaetilen glicol, "m" indica nucleótidos sustituidos con 2'-metoxi, "f" indica nucleótidos sustituidos con 2' fluoro, "d" indica desoxinucleótidos, y "[3T]" se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' en el azúcar ribosa; desoxiARC126: dCdAdGdGdCdTdAdCdGdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T]- 3' (SEC ID NO: 75), en donde "d" indica desoxinucleótidos no modificados y "[3T] " se refiere a un nucleótido de timidina que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' sobre el azúcar de ribosa, por lo tanto, el oligonucleótido tiene dos extremos 5' y por lo tanto es resistente a las nucleasas que actúan sobre el extremo de 3' hidroxilo; y ARC124: 5 '-CACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTG[3T]-3' (SEC ID NO:6), en donde "[3T] " se refiere a un nucleótido de timidina que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' sobre el azúcar de ribosa. Los ejemplos de aptámeros multivalentes de enlace PDGF-VEGF incluyen las quimeras de aptá ero PDGF-B-VEGF, TK.131.12 y TK.131.12.B, las cuales permiten la focalización simultánea de PDGF-B y VEGFR. Estas quimeras de aptámeros se describen en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente PCT Nos. W02006/0505498 y W02004/094614.

La secuencia de TK.131.012.A es: 5'-dCdAdGdGdCdTdAdCdGmAmUmGmCmAmGmümUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmUd CdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG[3T]-3' (SEC ID NO:4), en donde "m" indica nucleótidos 2'-OMe, y "d" y "[3T]" son como se definen anteriormente; y la secuencia de TK.131.012.B es: 5'dCdAdGdGdCdTdAdCdGmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmC mAdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T] (SEC ID NO:5), en donde "m", "d" y "[3T]" son como se definen anteriormente.

En modalidades particulares, un aptámero anti PDGF se enlaza a PDGF. En modalidades particulares, un aptámero anti PDGF se enlaza a PDGF-A o PDGF-B. Los ejemplos de aptámeros anti PDGF incluyen una serie de aptámeros de ácido nucleico de 31-35 nucleótidos de longitud (SEC ID NO:l a SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 a SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31 a SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, y SEC ID NO: 70 a SEC ID NO: 74 de la Patente Norteamericana No. 8,039,443), que se enlazan específicamente a la proteína PDGF-B in vitro y los cuales bloquean la actividad de PDGF-BB en ensayos in vivo y basados en células. En modalidades particulares, los aptámeros anti PDGF-B se derivan de la molécula progenitora ARC126, 5'—(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [SEC ID NO:l])-HEG- (5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [SEC ID NO:2])-HEG- (5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]-3' [SEC ID NO:3])-3', la cual contiene siete residuos individuales que contienen 2'F, y en donde HEG = separador de hexaetilen glicol, y [3T] se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' sobre el azúcar de ribosa. Los residuos que contienen 2'F pueden aumentar el suero in vitro y la estabilidad in vivo del aptámero al bloquear su degradación por las endonucleasas o la exonucleasas del suero. En modalidades particulares, los aptámeros anti PDGF son aptámeros completamente libres de 2'F que retienen una actividad de enlace y anti proliferativa in vitro potente y contienen nucleótidos sustituidos con 2'desoxi o 2'OMe. Además, en modalidades particulares, estos aptámeros retienen una estabilidad en suero sustancial cuando se determina a través de la resistencia a la degradación por nucleasas en un ensayo de estabilidad in vitro.

En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF es el Antagonista A o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. El nombre químico del Antagonista A es [(monometoxi 20K polietilen glicol carbamoil-N2-)(monometoxi 20K polietilen glicol carbamoil-Nb-)]-lisina-amido-6-hexandilil-(1,5') -2' -desoxicitidilil-(3'-5' ) -2’ -desoxiadenilil-(3'-5') -2' -desoxiguanilil- (3'-5') -2' -desoxiguanilil-(3'-5') -2' -desoxicitidilil- (3'-5') -2' -desoxi-2'-fluorouridilil-(3'-5')-2'-desoxiadenilil- (3'-5')-2'-desoxi-2'-fluorocitidilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-metoxiguanilil-(3'-1)-P03-hexa(etiloxi)-(18-5')-2'-desoxicitidilil- (3'-5')-2'-desoxiguanilil-(3'-5')-timidilil-(3'-5')-2'-desoxiadenilil-(3'-5'}-2'-desoxi-2'-metoxiguanilil-(3'-5')-2'-desoxiadenilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-metoxiguanilil-(3'-5')-2'-desoxicitidilil-(3'-5')-2'-desoxiadenilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-fluorouridilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-fluorocitidilil- (3'-5')-2'-desoxi-2'-metoxiadenilil-(3'-1)-P03-hexa(etiloxi)-(18- 5')-timidilil-(3'-5') -2' -desoxiguanilil-(3'-5') -2' -desoxiadenilil-(3'-5')-timidilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-fluorocitidilil-(3'-5')-2'-desoxi-2'-fluorocitidilil-(3'-5')-desoxi-2'-fluorouridilil-(3'-5')-2'-desoxi-metoxiguanilil-(3'-3')-timidina.

La estructura del Antagonista A se muestra en las Figs.78A-F, y también se describe en la Fig. 7 de la Publicación de la Solicitud PCT No. WO 2010/127029, la cual se incorpora en este documento en su totalidad.

La secuencia del Antagonista A es: 5'-[mPEG2 40kD]-[HN-(CH2)60]CAGGCUfACfGm(SEC ID NO:l) [P03(CH2CH2O)6]CGTAGmAGmCAUfCfAm(SEC ID NO :2)[P03(CH2CH20)6] TGATCfCfUfGm[3T] (SEC ID NO:3)-3', donde [3T] se refiere a un nucleótido de timidina invertida que se une al extremo 3' del oligonucleótido en la posición 3' en el azúcar ribosa, y [mPEG2 40 kD] representa dos cadenas poliméricas de polietilenglicol (PEG) de 20 kD, en una modalidad dos cadenas poliméricas de aproximadamente 20 kD, que se unen covalentemente a los dos grupos amino de un residuo de lisina a través de enlaces de carbamato. Esta porción se enlaza a su vez con el oligonucleótido a través del enlazador amino descrito a continuación.

[HN-(OH2)60] representa un enlazador a-hidroxi-co-amino que se une covalentemente al polímero de PEG a través de un enlace de amida. El enlazador se une al oligonucleótido en el extremo 5' del Antagonista A por medio de un enlace de fosfodiéster.

[P03(CH2CH2O)6] representa las porciones de hexaetilen glicol (HEX) que unen los segmentos del oligonucleótido a través de enlaces de fosfodiéster. El Antagonista A tiene dos enlaces HEX que unen el 9o y el 10° nucleótidos y el 21° y el 22° nucleótidos a través de enlaces de fosfodiéster entre el enlazador y los nucleótidos respectivos.

C, A, G, y T representan el código de una letra para los derivados de 2'-desoxi de los ácidos nucleicos citocina, adenosina, guanosina, y timidina, respectivamente. El Antagonista A tiene cuatro 2'-desoxirribocitocinas, seis 2'-desoxirribadenosina, cuatro 2'-desoxirriboguanosina, y cuatro 2 ' -desoxirribotimidina.

Gm y Am representan las formas 2'-metoxi sustituidas de guanosina y adenosina, respectivamente. El Antagonista A tiene cuatro 2'-metoxiguanosinas y una 2'-metoxiadenosin . Cf y Uf representan las formas 2'-fluoro sustituidas de citosina y uridina, respectivamente. El Antagonista A tiene cuatro 2'-fluorocitosinas y tres 2'-fluorouridinas.

Los enlaces de fosfodiéster en el oligonucleótido, con la excepción de la terminal 3', conectan los oxígenos de 5' y 3' del anillo de ribosa con enlaces estándar de fosfodiéster de nucleósido o nucleótido. El enlace de fosfodiéster entre la timidina de la 3'-terminal y la penúltima Gm enlaza sus oxígenos 3' respectivos, lo cual se conoce como la capsula 3, 3' .

El Antagonista A tiene un peso molecular desde aproximadamente 40,000 a aproximadamente 60,000 Dalton para la molécula completa (incluyendo el ácido nucleico, el enlazador de amino y las porciones de polietilenglicol), en una modalidad, desde 40,000 a 60,000 Dalton y puede ser incoloro a ligeramente amarillo en solución. En ciertas modalidades, el Antagonista A puede estar presente en una solución de monohidrato de fosfato monobásico de sodio y heptahidrato de fosfato dibásico de sodio como gentes de amortiguamiento y cloruro de sodio como un ajustador de la tonicidad. El Antagonista A es un polímero hidrofilico. La sal de sodio del Antagonista A es soluble en agua y en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), cuando se evalúa mediante inspección visual, al menos a aproximadamente 50 mg (con base en el peso del oligonucleótido)/mL de solución.

En una modalidad, el Antagonista A se prepara usando un procedimiento de síntesis química iterativa para producir la porción del oligonucleótido y el enlazador de amino, los cuales se enlazan entonces covalentemente con un reactivo de pegilación, como se describe en el Ejemplo 5, y como se describe en el Ejemplo 4 de la Publicación de la Solicitud PCT No. WO 2010/ 127029, la cual se incorpora como referencia en la presente, en su totalidad.

El Antagonista A puede poseer un grupo funcional suficientemente básico, el cual puede reaccionar con cualquier número de ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal aceptable farmacéuticamente. Una sal de adición de ácido aceptable farmacéuticamente se forma a partir de un ácido aceptable farmacéuticamente, como es bien conocido en la téenica. Tales sales incluyen aquellas descritas en este documento y las sales aceptables farmacéuticamente listadas en el Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) y The Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use, P H Stahl y C G Wermuth (ED s), Verlag, Zurich (Suiza) 2002, los cuales se incorpora como referencia en la presente, en su totalidad.

En otras modalidades, el aptámero anti PDGF es una forma modificada de un aptámero, tal como el Antagonista A, o de otro aptámero descrito en este documento, el cual puede incluir una o más de las modificaciones descritas en este documento. Aunque se discute específicamente con respecto al Antagonista A, se entiende que cualquiera de las modificaciones descritas en este documento puede estar presente en una forma modificada de cualquier otro aptámero anti PDGF descrito en este documento, cada una de las cuales puede ser útil en la presente invención. En modalidades particulares, una forma modificada de un aptámero, por ejemplo, una forma modificada del Antagonista A, comprende o consiste de la misma secuencia de nucleótidos y los ácidos nucleicos que el aptámero, pero comprende una o más cadenas diferentes de polímero de polietilenglicol en comparación con el aptámero, o comprende uno o más enlazadores diferentes que acoplan una o más de las cadenas de polímero de polietilenglicol a la porción de ácido nucleico del aptámero.

En algunas modalidades, una forma modificada de un aptámero, por ejemplo, una forma modificada del Antagonista A, puede tener nucleótidos modificados químicamente en comparación con el aptámero, incluyendo las sustituciones 5-X o 2'-Y en las bases de pirimidina y las sustituciones 8-X o 2'-Y en las bases de purina. Las modificaciones 2', tales como 2'-fluoro y 2'-O-Me, pueden ser utilizadas para la estabilización contra las nucleasas sin comprometer la interacción de enlace del aptámero con el objetivo. Véase, por ejemplo, Lin et al·., Nucleic Acids Res., 22, 5229-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry, 34, 11363-1137 (1995); Lin et al., Nucleic Acids Res., 22, 5229-5234 (1994); Rubik et al., J. Immunol., 159(1), 259-267 (1997); Pagratis et al., Nat. Biotechnol., 1, 68-73 (1997); y Wilson et al., Curr Opin Chem Biol, 10(6), 607-614 (2006). En algunas modalidades, la sustitución química puede ser una sustitución química en la posición de un azúcar, una sustitución química en la posición de una base, o una sustitución química en la posición de un fosfato.

Las modificaciones que pueden estar presentes en las formas modificadas de un aptámero, por ejemplo, el Antagonista A, incluyen, pero no se limitan a, aquellas las cuales proporcionan otros grupos químicos que incorporar una carga, polarizabilidad, hidrofobicidad, formación de puentes de hidrógeno, interacción electrostática, o fluxionalidad adicionales a las bases del aptámero en su conjunto. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a modificaciones del azúcar de la posición 2', modificaciones de la pirimidina de la posición 5, modificaciones de la purina de la posición 8, modificaciones en las aminas exocíclicas, sustitución de la 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo; modificaciones del esqueleto, modificaciones del fosforotioato o alquil fosfato, metilaciones, combinaciones inusuales de apareamiento de bases tales como isobases isocitidina e isoguanina y las similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones 3' y 5' como por ejemplo, encapsulación o modificación con porciones de azúcar. En algunas modalidades de la invención, las formas modificadas de un aptámero, por ejemplo las formas modificadas del Antagonista A, son moléculas de ARN que están 2'-fluoro modificadas (2'-F) en la porción de azúcar de los residuos de pirimidina. Los ejemplos de modificaciones que pueden estar presentes en las formas modificadas de un aptámero, por ejemplo, las formas modificadas del Antagonista A, así como los aptámeros estabilizados que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención se describen en la Patente Norteamericana No. 8,039,4443, la cual se incorpora como referencia en la presente, en su totalidad. En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF es un aptámero anti PDGF-B, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en la Patente Norteamericana No.8,039,443.

En algunas modalidades, la estabilidad del aptámero puede ser aumentada por la introducción de tales modificaciones y también por las modificaciones y sustituciones a lo largo del esqueleto de fosfato del ARN, las cuales también pueden estar presentes en las formas modificadas del aptámero, por ejemplo, las formas modificadas del Antagonista A. Además, una variedad de modificaciones pueden ser hechas sobre las nucleobases en si, las cuales inhiben la degradación y las cuales pueden aumentar las interacciones de los nucleótidos deseados o reducir las interacciones de los nucleótidos indeseables. Por consiguiente, una vez que se conoce la secuencia de un aptámero, se pueden hacer las modificaciones o las sustituciones mediante los procedimientos sintéticos descritos a continuación o mediante los procedimientos conocidos por aquellas personas experimentadas en la téenica. Cualquiera de tales modificaciones puede estar presente en una forma modificada del Antagonista A.

Otras modificaciones que pueden estar presentes en una forma modificada de un aptámero, por ejemplo, la forma modificada del antagonista A, incluyen la incorporación de bases modificadas (o nucleósidos modificados o nucleótidos modificados) que son variaciones de las bases, azúcares o las estructuras químicas del esqueleto de fosfato estándar que se presentan en los ácidos ribonucleico (es decir, A, C, G y U) y desoxirribonucleico (es decir, A, C, G y T). Incluidos dentro de este ámbito están, por ejemplo: Gm (ácido 2'-metoxiguanilico), Am (ácido 2'-metoxciadenilico), Cf (ácido 2'-fluorocitidilico), Uf (ácido fluorouridilico), Ar (ácido riboadenilico). Una forma modificada del Antagonista A puede incluir citosina o cualquier base relacionada con citosina incluyendo 5-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 3-metilcitosina, 5-hidroximetil citosina, 2-tiocitosina, 5-halocítosina (por ejemplo, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, 5-clorocitosina, y 5-yodocitosina), 5-propinil citosina, 6-azocitosina, 5-trifluorometilcitosina, N4,N4-etanocitosina, fenoxazina citidina, fenotiazina citidina, carbazol citidina o piridoindol citidina. Una forma modificada del Antagonista A puede incluir guanina o cualquier base relacionada con guanina incluyendo 6-metilguanina, 1-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metilguanina, 7-metilguanina, 2-propilguanina, 6-propilguanina, 8-haloguanina (por ejemplo, 8-fluoroguanina, 8-bromoguanina, 8-cloroguanina, y 8-yodoguanina), 8-aminoguanina, 8-sulfhidrilguanina, 8-tioalquilguanina, 8-hidroxilguanina, 7-metilguanina, 8-azaguanina, 7-desazaguanina o 3-desazaguanina. Una forma modificada de un aptámero, por ejemplo, una forma modificada del Antagonista A puede incluir adenina o cualquier base relacionada con adenina incluyendo 6- metiladenina N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, 1-metiladenina, 2-itietiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, 8-haloadenina (por ejemplo, 8-fluoroadenina, 8-bromoadenina, 8-cloroadenina y 8-yodoadenina), 8-aminoadenina, 8-sulfhidriladenina, 8-tioalquiladenina, 8-hidroxiadenina, 7-metiladenina, 2-haloadenina (por ejemplo, 2-fluoroadenina, 2-bromoadenina, 2-cloroadenina, y 2-yodoadenina), 2-aminoadenina, 8-azaadenina, 7-desazaadenina o 3-desazaadenina. También se incluyen uracilo y cualquier base relacionada con uracilo incluyendo 5-halouracilo (por ejemplo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo), 5- (carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, 1-metilpseudouracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido uracil-5-oxiacetico, ácido uracil-5-oxiacetico, pseudouracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, 5-metilaminometiluracilo, 5-propinil uracilo, b-azouracilo, o 4-tiouracilo.

Los ejemplos de otras variantes de bases modificadas conocidas en la téenica, las cuales pueden estar presentes en una versión modificada de un aptámero, por ejemplo, una versión modificada del Antagonista A, incluyen, sin limitación, 4- acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 2'-metoxicitidina, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, dihidrouridina, 2'-O-metilpseudouridina, b-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, b-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N- ((9-b-D-ribofuranosil-2-metiltiopurino-6-il)carba oil)treonina, N-((9-b-D-ribofuranosilpurino-6-il)N-metil-carbamoil)treonina, metiléster del ácido uridino-5-oxiacetico, ácido uridino-5-oxi acético, wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N-((9-b-D-ribofuranosilpurino-6-il)carbamoil)treonina, 2'-0-metil-5-metiluridina, 2'-O-metiluridina, wibutosina, 3- (3-amino-3-carboxipropil)uridina.

Los ejemplos de variantes del esqueleto de azúcar del nucleósido o el nucleótido conocidos en la téenica incluyen, sin limitación, aquellos que tienen sustituyentes de 2'-ribosilo tales como F, SH, SCH3 CON. Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02, CH3, 0NO2, NO2, N3, NH2, OCH2CH2OCH3, 0(CH2)20N (CH3)2, OCH2OCH2N(CH3)2, O(alquilo de Ci_i0), O(alquenilo de C2-io) O(alquinilo de C2-io), S(alquilo de C1-10), S(alquenilo de C2-io) , S(alquinilo de C2-io) r NH(alquilo de Ci-i0), NH(alquenilo de C2-io) , NH(alquinilo de C2-i0), y O-alquil-O-alquilo. Los sustituyentes de 2' ribosilo deseables incluyen, 2'-metoxi(2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2' OCH2CH2CH2NH2), 2'-alil (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alil (2'-0-CH2-CH=CH2), 2'-amino (2'-NH2), y 2'-fluoro (2'-F). Los sustituyentes 2' pueden estar en la posición arabino (arriba) o la posición ribo (abajo). Estos pueden estar presentes en una forma modificada del Antagonista A.

Los ejemplos de modificaciones incluyen: una sustitución de purina por una pirimidina; una sustitución de 2'-desoxi dihidrouridina por una uridina; una 2' -desoxi-5-metil citidina por una citidina; una sustitución de 2-amino purina por una puridina; un fosforotioato sustituido por un fosfodiéster; un fosforoditioato sustituido por un fosfodiéster; un desoxinucleótido sustituido por un 2' -OH nucleótido; un 2OMe nucleótido, un 2'-fluoro nucleótido, o un 2' -O-metoxietil nucleótido sustituido por un 2’ -OH o desoxinucleótido; la adición de un polímero de PEG o PAG; la adición de una molécula estérica grande; la adición de una capsula 3'; o cualquier otra modificación conocida por bloquear la degradación por nucleasa. Véase, por ejemplo, la Solicitud de la Patente Norteamericana No. 20090075342, la cual se incorpora como referencia en su totalidad.

Las formas modificadas de un aptámero, por ejemplo, las formas modificadas del Antagonista A, pueden ser formadas de nucleótidos o de análogos de nucleótidos tales como se describen en este documento, o una combinación de ambos, o son análogos de oligonucleótido. Las formas modificadas de un aptámero, por ejemplo, las formas modificadas del Antagonista A, pueden contener análogos de nucleótidos en posiciones las cuales no afecten la función del oligómero, por ejemplo, para cegar el PDGF.

Los aptámeros anti PDGF descritos en este documento pueden ser enlazados con uno o más grupos no fisiológicamente activos, tales como un compuesto lipofilico (por ejemplo, colesterol); enlazados con uno o más compuestos no inmunogénicos de peso molecular alto (por ejemplo, polialquilen glicol); o unidos con o encapsulados en un complejo que comprende un componente lipofilico (por ejemplo, liposomas). En una modalidad, los aptámeros enlazados mejoran la absorción celular de los aptámeros por las células, para la administración de los aptámeros a un objetivo intracelular. La Patente Norteamericana No.6,011,020, incorporada como referencia en este documento, en su totalidad, describe un método para preparar aptámeros enlazados con uno o más compuestos lipofilicos o compuestos no inmunogénicos de alto peso molecular.

Los aptámeros anti PDGF descritos en este documento pueden ser unidos a través de y enlazador a uno o más grupos no fisiológicamente activos, tales como compuestos lipofilicos o no inmunogénicos, de alto peso molecular, en un complejo de diagnóstico o terapéutico como se describe en la Patente Norteamericana No.6,011,020. Los aptámeros que se unen a través de un enlazador a un Compuesto Lipofilico, como por ejemplo diacil glicerol o dialquil glicerol, en un complejo de diagnóstico o terapéutico se describen en la Patente Norteamericana No.5,859,228. Los aptámeros que se unen a través de un enlazador a un Compuesto Lipofilico, como por ejemplo un lipido de glicerol, o a un Compuesto No Inmunogénico, de Alto Peso Molecular, como por ejemplo polialquilenglicol, se describen adicionalmente en la Patente Norteamericana No. 6,051,698. Los aptámeros que se unen a través de un enlazador a un compuesto No Inmunogénico de Alto Peso Molecular o a un compuesto lipofilico también se describen en PCT/US97/18944, presentada el 17 de octubre de 1997, titulada "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes". Cada una de las patentes y las solitudes de patente descritas en este documento se incorpora específicamente como referencia en su totalidad.

Uno o más aptámeros, por ejemplo, el Antagonista A puyen ser unidos a través de un enlazador a un compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico o y compuesto lipofilico. Un compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico puede ser un compuesto de Alto Peso Molecular lineal o ramificado que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 Da a 1,000,000 Da, aproximadamente 1000 Da a 500,000 Da, o aproximadamente 1000 Da a 200,000 Da, que típicamente no genera una respuesta inmunogénica. En una modalidad, el compuesto de Alto peso Molecular, No Inmunogénico puede ser un polialquilen glicol. En una modalidad, el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico comprende un polialquilen glicol. En una modalidad, el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico comprende una pluralidad de polialquilen glicoles. En una modalidad, el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico comprende dos polialquilen glicoles. En otra modalidad, el polialquilen glicol puede ser polietilenglicol (PEG). En algunas modalidades, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa o un peso molecular de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 kDa. En algunas modalidades, la pluralidad de pPEGs tiene un peso molecular combinado de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa o un peso molecular de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 kDa. En otras modalidades, el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico comprende dos polialquilen glicoles, cada uno de los cuales tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

Un aptámero, por ejemplo, el Antagonista A puede ser unido a través de un enlazador a uno o más compuestos lipofílicos. Los compuestos lipofilicos son compuestos que tienen la propensión a asociarse con o dividirse en lipidos u otros materiales o fases que tienen una constante dieléctrica baja, incluyendo compuestos basados principalmente en componentes lipofilicos. Los compuestos lipofilicos incluyen lipidos asi como no lipidos que contienen compuestos que tienen la propensión a asociarse con lipidos (u otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas). El colesterol, los fosfolipidos, y los lipidos de glicerol, tales como los lipidos de dialquil glicerol, diacil glicerol, y glicerol amida son ejemplos adicionales de compuestos lipofilicos. En una modalidad,, el compuesto lipofilico es un lipido de glicerol.

El compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico o el compuesto lipofilico puede ser enlazado covalentemente a una variedad de posiciones en el aptámero, como por ejemplo a un grupo amino exocielico en una base del nucleótido, la posición 5 de un nucleótido de pirimidina, la posición 8 de un nucleótido de purinas, el flujo hidroxilo de un fosfato de nucleótido, o un grupo hidroxilo u otro grupo en la terminal 5' o 3' del aptámero. En algunas modalidades donde el compuesto lipofilico es un lipido de glicerol, o el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico es polialquilen glicol o polietilen glicol, el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico puede ser enlazado a través de un enlazador al hidroxilo 5' o 3' de grupo fosfato del mismo. En una modalidad, el compuesto lipofilico o el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico se enlaza a través del enlazador al grupo fosfato 5' del aptámero. En enlace del compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico o el compuesto lipofilico al aptámero se puede hacer directamente o con el uso de uno o más enlazadores que se interponen entre el aptámero y el compuesto lipofilico o el compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico. Cuando en enlace se hace directamente, en algunas modalidades, no está presente el enlazador.

Un enlazador es una molécula que conecta dos o más entidades moleculares a través de enlaces covalentes e interacciones no covalentes, y puede permitir la separación espacial de las entidades moleculares en una manera que preserve las propiedades funcionales de una o más de las entidades moleculares.

En una modalidad de la invención, el Compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico es un polialquilen glicol y tiene la estructura (R(O(CH2)x)nO-, donde R es independientemente H o CH3, x=2-5, y n ~ PM del Polialquilen Glicol/(16+14x). en una modalidad de la presente invención, el peso molecular del Polialquilen Glicol está aproximadamente entre 10-80 kDa. En otra modalidad, de peso molecular del Polialquilen Glicol está aproximadamente entre 20-45 kDa. En aun otra modalidad, x=2 y n=9xl02. Puede haber uno o más Polialquilen Glicoles unidos a través de un enlazador al mismo aptámero. En una modalidad, una pluralidad de Polialquilen glicoles se unen a través de un enlazador al mismo aptámero. En otra modalidad, dos Polialquilen Glicoles se unen a través de un enlazador al mismo aptámero. En otra modalidad, los Polialquilen Glicoles son polialquilen glicoles que tienen un peso molecular de aproximadamente 40 kDa.

En una modalidad, un aptámero anti PDGF se une a través de un enlazador a un Compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico como por ejemplo Polialquilen Glicol o PEG, o a una pluralidad de Compuestos de Alto Peso Molecular, No Inmunogénicos. En esta modalidad, las propiedades farmacocinéticas del aptámero de PDGF enlazado se mejoran con relación al aptámero anti PDGF solo. El Polialquilen Glicol o PEG pueden ser enlazados covalentemente a través de un enlazador a una variedad de posiciones en aptámero de PDGF. En las modalidades donde se usa el Polialquilen Glicol o el PEG, el aptámero anti PDGF puede ser enlazado a través de un enlazador a través del grupo 5' hidroxilo a través de un enlace de fosfodiéster.

En algunas modalidades, una pluralidad de aptámeros puede estar asociada con un Compuesto de Alto Peso Molecular, No Inmunogénico, único, como por ejemplo Polialquilen Glicol o PEG, o un Compuesto Lipofilico, como por ejemplo un lipido de glicerol. Los aptámeros pueden ser todos para un objetivo o para diferentes objetivos. En las modalidades donde un compuesto comprende más de un aptámero anti PDGF, puede haber un aumento en la avidez debido a múltiples interacciones de enlace con el PDGF objetivo. En aun otras modalidades, una pluralidad de una o más de las moléculas de Polialquilen Glicol, PEG y lipido de glicerol pueden ser enlazadas entre si, al mismo enlazador, o a una pluralidad de enlazadores. En estas modalidades, uno o más aptámeros pueden estar asociados con cada Polialquilen glicol, PEG, o lipido de glicerol. Esto puede resultar en un aumento en la avidez de cada aptámero por su objetivo. Además, en las modalidades donde hay aptámeros para PDGF o aptámeros para PDGF y diferentes objetivos asociados con el Polialquilen Glicol, PEG, o lipido de glicerol, un fármaco también puede ser asociado, por ejemplo, enlazado covalentemente con, el Polialquilen Glicol, el PEG, o el lipido de glicerol. Por lo tanto, el compuesto proporcionaría la administración focalizada del fármaco, con el Polialquilen Glicol, el PEG o el lipido de glicerol que sirven como el enlazador, opcionalmente con uno o más enlazadores adicionales.

En modalidades particulares, los aptámeros pueden estar 5'-encapsulados y/o 3'-encapsulados con una estructura de cápsula de nucleótido 5'-5' invertida en el extremo 5' y/o una estructura de capsula de nucleótido 3'-3' invertida en el extremo 3'. En ciertas modalidades, el Antagonista A (o una forma modificada del Antagonista A) tiene el extremo 5' o 3' encapsulado. En otras modalidades, la cápsula de nucleótido es una timina invertida.

Antagonistas de VEGF Los antagonistas de VEGF útiles en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, ranibizumab, bevacizumab, aflibercept, y las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos.

En ciertas modalidades, un antagonista de VEGF es un anticuerpo, o fragmentos de los mismos, que se enlazan al VEGF humano, los cuales pueden ser anticuerpos anti VEGF humanizados o humanos. En modalidades particulares, un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti VEGF comprende la secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPT YAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYG X4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC ID NO:76), en donde Xi es T o D; X2 es N o H; X3 es Y o H; y X4 es S o T. En una modalidad particular, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYG NWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL (SEC ID NO:77). Estas secuencias del dominio variable de la cadena pesada pueden ser combinadas con las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, siempre que el anticuerpo asi producido se enlace al VEGF humano.

En ciertas modalidades, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo anti VEGF comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN [SEC ID NO:78]), CDRL2 (FTSSLHS [SEC ID NO:79]) y CDRL3 (QQYSTVPWT [SEC ID NO:80]). En modalidades particulares, Las tres regiones hipervariables de la cadena ligera se proporcionan en una región estructural humana, por ejemplo, como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4. En una modalidad, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo anti VEGF comprende la secuencia de aminoácidos: DIQXiTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC ID NO:81), en donde Cc es M o L. En modalidades particulares, el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEC ID NO:82). Estas secuencias del dominio variable de la cadena ligera pueden ser combinadas con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada identificadas anteriormente o con otras secuencias del dominio variable de la cadena pesada, siempre que el anticuerpo asi producido retenga la habilidad de enlazarse al VEGF humano.

En una modalidad particular, el antagonista de VEGF es el anticuerpo bevacizumab o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, el cual incluye las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera, respectivamente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL (SEC ID NO:77); y DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEC ID NO:82). El bevacizumab está disponible comercialmente bajo la marca Avastin® (Genetech, S. San Francisco, CA) y también se describe en la Patente Norteamericana No.6.054,297.

En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF es una variante de un anticuerpo anti VEGF progenitor (el cual progenitor es opcionalmente un anticuerpo anti VEGF humanizado o humano), en donde la variante se enlaza al VEGF humano y comprende una sustitución de aminoácidos en una región hipervariable del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti VEGF progenitor. En modalidades particulares, la variante tiene una o más sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo anti VEGF. En modalidades más particulares, las sustituciones están en del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo progenitor. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden estar en CDRH1 o CDRH3 del dominio variable de la cadena pesada, o puede haber sustituciones en ambas regiones hipervariables. En ciertas modalidades, tales variantes "maduradas por afinidad" se enlazan más fuertemente al VEGF humano que el anticuerpo anti VEGF progenitor a partir del cual se generan estas, es decir, estas tienen un valor de Kd el cual es significativamente menor que el valor del anticuerpo anti VEGF progenitor. En ciertas modalidades, la variante tiene un valor de ED50 para inhibir la proliferación inducida por VEGF, de las células endoteliales in vitro, lo cual es al menos aproximadamente 10 veces menor, al menos aproximadamente 20 veces menor, o al menos aproximadamente 50 veces menor, que el valor del anticuerpo anti VEGF progenitor. En una modalidad, una variante tiene una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos: GYDFTHYGMN (SEC ID NO:83) y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos: YPYYYGTSHWYFDV (SEC ID NO:84). Estas regiones hipervariables y CDRH2 pueden ser proporcionadas en una región estructural humana, resultando por ejemplo en un dominio variable de la cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL (SEC ID NO:77). Tales secuencias del dominio variable de la cadena pesada se combinan opcionalmente con un dominio variable de la cadena ligera que comprende el dominio de aminoácidos que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEC ID NO:82).

En una modalidad, el antagonista de VEGF es el fragmento de anticuerpo ranibizumab o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, el cual incluye las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera, respectivamente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL (SEC ID NO:77); y DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEC ID NO:82). El ranibizumab está disponible comercialmente con la marca Lucentis®, en el cual este se formula para administración intravitrea (Genetech, S. San Francisco, CA) y también se describe en la Patente Norteamericana No.7,060,269.

En otra modalidad, el antagonista de VEGF es un VEGF-Trap , tal como aflibercept o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo (véase Do et al. (2009) Br J Ophthalmol.93: 144-9, el cual se incorpora como referencia en el presente, en su totalidad). El aflibercept también se conoce con el nombre VEGF-Trap-Eye™ y está disponible comercialmente con la marca Eylea™ (Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, NY). En modalidades particulares, un VEGF-Trap™ comprende un polipéptido dimérico de fusión que comprende dos polipéptidos de fusión, cada polipéptido de fusión que comprende un componente receptor de VEGF que consiste de un dominio 2 similar a inmunoglobulina (Ig) de un primer Fltl humano del receptor de VEGF y un dominio 3 de Ig de un segundo Flkl humano del receptor de VEGF o Flt4 humano. El aflibercept es una proteina de fusión que comprende fragmentos Fe de IgG fusionados al dominio 2 del receptor de VEGF 1 y el dominio 3 del receptor de VEGF 2, los cuales se enlazan tanto al VEGF-A y el Factor de Crecimiento Placentario (PIGF). El aflibercept es una glicoproteina dimérica con un peso molecular de la proteina de 97 kilodalton (kDa) y contiene glicosilación, que constituye 15% adicional de la masa molecular total, resultando en un peso molecular total de 115 kDa. Los VEGF-Traps ilustrativos, que incluyen el aflibercept, y los métodos para la producción de los mismos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,306,799, 7,531,173, 7,608,261, 7,070,959, 7,374,757, y 7,374,758. En modalidades particulares, un VEGF-Trap™ es un polipéptido que comprende o que consiste de la siguiente secuencia de aminoácidos: MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEI1HMTEGRELVIPCRVTS PNITVTLKKFPLDTLIPDGKRII DSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFN EYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMK KFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEC ID NO:85).

Composiciones La presente invención proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, las composiciones proporcionan estabilidad con los aptámeros anti PDGF o los antagonistas de VEGF, o tanto con los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF, incluyendo aquellos útiles en el tratamiento o la prevención de enfermedades oftalmológicas. En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF no afecta adversamente la actividad del antagonista de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF no afecta adversamente la actividad del aptámero anti PDGF. En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF mejora la actividad del antagonista de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF mejora la actividad del aptámero anti PDGF. En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF no afecta adversamente, dentro de la significancia estadística, la actividad del antagonista de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF no afecta adversamente, dentro de la significancia estadística, la actividad del aptámero anti PDGF. En ciertas modalidades, el aptámero anti PDGF mejora, dentro de la significancia estadística, la actividad del antagonista de VEGF. En otras modalidades, el antagonista de VEGF mejora, dentro de la significancia estadística, la actividad del aptámero anti PDGF. En modalidades particulares, el uno o más aptámeros anti PDGF presentes en la composición es el Antagonista A del aptámero o una forma modificada del mismo. En modalidades particulares, el uno o más antagonistas de VEGF presentes en la composición es uno o más de ranibizumab, bevacizumab, y aflibercept. En modalidades particulares, las composiciones de la invención comprenden: (i) El Antagonista A (o una forma modificada del mismo) y ranibizumab; (ii) el Antagonista A (o una forma modificada del mismo) y bevacizumab; o (iii) el Antagonista A (o una forma modificada del mismo) y aflibercept. En ciertas modalidades, las composiciones comprenden una sal aceptable farmacéuticamente de cualquiera de los aptámeros anti PDGF o los antagonistas de VEGF. En modalidades particulares, al menos aproximadamente 90% del aptámero anti-PDGF o el antagonista de VEGF es estable químicamente cuando la composición se almacena a una temperatura desde aproximadamente 2.0°C a aproximadamente 8.0°C durante al menos aproximadamente doce semanas.

Las concentraciones relativas del aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF presentes en una composición de la invención pueden ser determinadas con base en la fuerza y la especificidad de estos antagonistas, y los tipos y la concentración de sus objeticos de enlace. En una modalidad, el aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF están presentes en concentraciones sustancialmente iguales en la composición. En otra modalidad, el aptámero anti PDGF o el antagonista de VEGF está presente en una concentración sustancialmente más alta que el otro, por ejemplo, la proporción de las concentraciones de aptámero anti PDGF: antagonista de VEGF en una composición es aproximadamente 1.5:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 2.5:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, o aproximadamente 5:1, o la proporción de las concentraciones de antagonista de VEGF: aptámero anti PDGF en una composición es aproximadamente 1.5:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 2.5:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1. En ciertas modalidades, la proporción de la concentración del aptámero anti PDGF: antagonista de VEGF en una composición está en el rango de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1.5:1 a aproximadamente 5:1, o aproximadamente 2.0:1 a aproximadamente 5:1; en otras modalidades, la proporción de la concentración del antagonista de VEGF: aptámero anti PDGF en una composición está en el rango de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1.5:1 a aproximadamente 5:1, o aproximadamente 2.0:1 a aproximadamente 5:1. A menos que se indique de otra manera, la concentración de un aptámero se basa únicamente en el peso molecular de la porción de ácido nucleico del aptámero, la cual puede comprender opcionalmente un polietilen glicol de cadena corta. Donde la porción de ácido nucleico comprende un polietilen glicol de cadena corta, el peso molecular de la porción de ácido nucleico incluye el peso molecular de todos los residuos de polietilen glicol de cadena corta.

En algunas modalidades, cada uno del aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF están presentes en la composición de la invención a una concentración desde aproximadamente 0.1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL. En algunas modalidades, el aptámero anti PDGF está presente en la composición a una concentración desde aproximadamente 0.1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF está presente en la composición a una concentración desde aproximadamente 0.1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a .aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL. En algunas modalidades, cada uno del aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF están presentes a una concentración de al menos aproximadamente 0.1 mg/mL, al menos aproximadamente 1 mg/mL, al menos aproximadamente 2 mg/mL, al menos aproximadamente 3 mg/mL, al menos aproximadamente 4 mg/mL, al menos aproximadamente 5 mg/mL, al menos aproximadamente 6 mg/mL, al menos aproximadamente 7 mg/mL, al menos aproximadamente 8 mg/mL, al menos aproximadamente 9 mg/mL, al menos aproximadamente 10 mg/mL, al menos aproximadamente 15 mg/mL, al menos aproximadamente 20 mg/mL, al menos aproximadamente 30 mg/mL, al menos aproximadamente 40 mg/mL, al menos aproximadamente 50 mg/mL, al menos aproximadamente 60 mg/mL, al menos aproximadamente 70 mg/mL, al menos aproximadamente 80 mg/mL, al menos aproximadamente 90 mg/mL, al menos aproximadamente 100 mg/mL, al menos aproximadamente 120 mg/mL, al menos aproximadamente 150 mg/mL, o al menos aproximadamente 200 mg/mL. En algunas modalidades, al menos uno del aptámero anti PDGF o el antagonista de VEGF está presente a una concentración de al menos aproximadamente 0.1 mg/mL, al menos aproximadamente 1 mg/mL, al menos aproximadamente 2 mg/mL, al menos aproximadamente 3 mg/mL, al menos aproximadamente 4 mg/mL, al menos aproximadamente 5 mg/mL, al menos aproximadamente 6 mg/mL, al menos aproximadamente 7 mg/mL, al menos aproximadamente 8 mg/mL, al menos aproximadamente 9 mg/mL, al menos aproximadamente 10 mg/mL, al menos aproximadamente 15 mg/mL, ·al menos aproximadamente 20 mg/mL, al menos aproximadamente 30 mg/mL, al menos aproximadamente 40 mg/mL, al menos aproximadamente 50 mg/mL, al menos aproximadamente 60 mg/mL, al menos aproximadamente 70 mg/mL, al menos aproximadamente 80 mg/mL, al menos aproximadamente 90 mg/mL, al menos aproximadamente 100 mg/mL, al menos aproximadamente 120 mg/mL, al menos aproximadamente 150 mg/mL, o al menos aproximadamente 200 mg/mL.

Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más excipientes, amortiguadores (es decir, agentes de amortiguamiento), crioprotectores, agentes de tonicidad (es decir, modificadores de la tonicidad), líquidos, estabilizadores, surfactantes (por ejemplo, surfactantes no iónicos), lioprotectores, antioxidantes, aminoácidos, agentes de ajuste de pH o conservadores, tales como cualquiera de aquellos descritos en este documento. Los agentes de amortiguamiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y acetato de sodio. En ciertas modalidades, un amortiguador es capaz de ajustar el pH de una composición a un pH deseado o dentro de un rango de pH deseado, y/o es capaz de lograr o mantener el pH de una composición a un pH deseado o dentro de un rango de pH deseado. Los surfactantes no iónicos adecuados incluyen pero no se limitan a, polioxietilen sorbitan ácido graso ásteres tales como polysorbate 20 y polysorbate 80. Los conservadores adecuados incluyen, pero no se limitan a alcohol bencílico. Los agentes de tonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a cloruro de sodio, manitol, y sorbitol. Los lioprotectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, y manitol. Los aminoácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a glicina e histidina. Los agentes adecuados de ajuste del pH (o agentes capaces de lograr o mantener un pH o rango de pH deseado) incluyen pero no se limitan a ácido clorhídrico, ácido acético, e hidróxido de sodio. En una modalidad, el agente o los agentes de ajuste del pH adecuados (o el o los agentes capaces de lograr o mantener un pH o rango de pH deseado) están presentes en una cantidad efectiva para proporcionar una composición con un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 4 a aproximadamente 7, aproximadamente 5 a aproximadamente 6, aproximadamente 6 a aproximadamente 7, aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5. Los excipientes adecuados para una composición también incluyen aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 7,365,166, los contenidos de la cual se incorporan como referencia en este documento, en su totalidad.

En modalidades particulares las composiciones de la invención comprende lo siguiente: (1) un aptámero anti PDGF; (2) un antagonista de VEGF; (3) un amortiguador; opcionalmente (4) un modificador de la tonicidad, y, opcionalmente, (5) un surfactante. En modalidades particulares, las composiciones de la invención comprenden lo siguiente: (1) un aptámero anti PDGF; (2) un antagonista de VEGF; (3) un modificador de la tonicidad; opcionalmente, (4) un amortiguador; y, opcionalmente, (5) un surfactante. En modalidades particulares, las composiciones de la invención comprenden lo siguiente: (1) un aptámero anti PDGF; (2) un antagonista de VEGF; (3) un amortiguador; (4) un modificador de la tonicidad, y, opcionalmente, (5) un surfactante. En modalidades especificas de tales composiciones, el amortiguador es un amortiguador de acetato, fosfato, Tris, o histidina, o una mezcla de los mismos; el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio, manitol, sorbitol o trehalosa, o una mezcla de los mismos y el surfactante es polysorbate 20. En varias modalidades, el aptámero anti PDGF está presente en la composición de la invención a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL; el antagonista de VEGF está presente a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL; el amortiguador está presente a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM; el modificador de la tonicidad está presente a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM (cloruro de sodio), aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/v) (sorbitol), o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) (trehalosa), y el surfactante, cuando está presente, está presente a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05% o una concentración de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.05%.

Las composiciones de la invención se administran, en un aspecto útil, de forma parenteral (por ejemplo, mediante inyección o implante intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraocular, intravitrea, reto-lobular, en la subconjuntiva, bajo la capsula de tenon o subcutánea) o sistémicamente. Las composiciones para administración parenteral o sistémica pueden incluir soluciones, suspensiones, o emulsiones estériles acuosas o no acuosa. Puede ser usada una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina y las similares. Los ejemplos de otros vehículos adecuados incluyen polipropilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales, gelatina, hidrogeles, naftalenos hidrogenados, y ásteres orgánicos inyectables, como por ejemplo oleato de etilo. Tales composiciones también pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes de conservación, humectantes, amortiguadores, emulgentes, o dispersantes. Polímero de láctido biodegradable, bioco patible, copolímero de láctido/glicolido o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno pueden ser usados para controlar la liberación de los ingredientes activos. En una modalidad, una composición que comprende un aptámero de PDGF y un antagonista de VEGF tiene la forma de una solución acuosa que es adecuada para inyección. En una modalidad, una composición comprende un aptámero anti PDGF, un antagonista de VEGF, un agente de amortiguamiento, un agente de ajuste del pH (o un agente capaz de lograr o mantener un pH o rango de pH deseado), y agua para inyección.

En algunos ejemplos, las composiciones de la invención también pueden ser administradas tópicamente, por ejemplo, mediante parches o la aplicación directa a una región, como por ejemplo, la epidermis o los ojos, susceptible de o afectada por un trastorno neovascular, o mediante iontoforesis.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas de forma intraocular mediante la inyección intra vitrea en los ojos, asi como mediante inyecciones dentro de la conjuntiva y debajo de la cápsula de tenon. Otras rutas de administración incluyen la ruta transesclerótica, retrobulbar, intraperitoneal, intramuscular, e intravenosa. Alternativamente, las composiciones pueden ser administradas usando un dispositivo de administración de fármacos, o un implante intraocular. Las composiciones útiles para uso oftálmico incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden un aptámero anti PDGF y un antagonista de VEGF combinadas con un excipiente aceptable farmacéuticamente, incluyendo aquellos descritos en este documento. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, amortiguadores, diluyentes o rellenadores inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, agentes de deslizamiento, y antiadhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o talco).

En modalidades particulares, las composiciones de la invención confieren estabilidad química o mecánica a uno o más de los aptámeros anti PDGF o los antagonistas de VEGF presentes en la composición. En estas modalidades, las composiciones de la invención son composiciones estables físicamente o químicamente. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden volver a los aptámeros anti PDGF o los antagonistas de VEGF presentes en la composición estables físicamente o químicamente durante el almacenamiento. Varias téenicas analíticas útiles para evaluar la estabilidad de los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF están disponibles en la técnica, incluyendo aquellas descritas en los ejemplos anexos, y aquellos estudiados en Reubsaet et al. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal.17(6-7): 955-78 y Wang (1999) Int. J.. Pharm. 185(2): 129-88, que incluyen inspección visual, SDS-PAGE, IEF, cromatografía por exclusión de tamaños (alta presión) (HPSEC), RFFIT, ELISA kappa/lambda. Los Métodos descritos en los Ejemplos anexos incluyen SE-HPLC, AEX-HPLC, y WCX-HPLC.

La estabilidad física del aptámero anti PDGF o del antagonista de VEGF en una composición de la invención puede ser determinada por, pero no se limita a, la medición del estado de integridad física del aptámero o el antagonista, determinar si estos muestran algún signo de agregación, precipitación o desnaturalización por inspección visual del color o la claridad o llevando a cabo dispersión de luz UV o mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) o calorimetría diferencial de barrido (DSC). Por .ejemplo, se puede usar un análisis de micro flujo para medir la presencia y el tamaño de partículas subdivisibles en una composición, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4.

La estabilidad química de un aptámero anti PDGF o de un antagonista de VEGF en una composición de la invención puede ser determinada mediante, pero no se limita a, medición de su estado de integridad química o determinando si estos muestran alguna señal de descomposición o modificación que resulte en la formación de nuevas entidades químicas. La integridad química puede ser evaluada detectando y cuantificado las formas alteradas químicamente del aptámero o el antagonista. Las alteraciones químicas pueden involucrar modificación del tamaño (por ejemplo, recorte), la cual puede ser evaluada usando cromatografía de exclusión de tamaño, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaño con HPLC (para determinar la presencia de especies de BPM o APM) o espectrometría de masa de ionización por desorción láser asistida por matrices/tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Los sistemas adecuados para realizar tales mediciones se conocen en la téenica, por ejemplo, los sistemas HPLC (Walters, Milford, ass.) y HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC para detectar las variantes y monitorear la carga superficial). Además, se pueden usar los métodos descritos en los Ejemplos anexos, útiles para medir la estabilidad de los aptámeros anti PDGF o de los antagonistas de VEGF. Estos incluyen SE-HPLC, WCX-HPLC y AEX-HPLC. Otros tipos de alteraciones químicas incluyen la alteración de la carga (por ejemplo, que se presenta como resultado de la desamidación) la cual puede ser evaluada mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo. La oxidación es otra modificación química que puede ser detectada usando los métodos descritos en este documento o los métodos conocidos por aquellas personas experimentadas en la téenica.

En modalidades particulares, una composición de la invención es estable físicamente si al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de un aptámero anti PDGF o un antagonista de VEGF presente en la composición no muestra signos de agregación, precipitación, o desnaturalización por el examen visual del color o la claridad, o cuando se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) o calorimetría diferencial de barrido (DSC). En modalidades particulares, una composición es estable físicamente si al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% tanto de los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF presentes en la composición no muestran signos de agregación, precipitación o desnaturalización tras el examen visual del color o la claridad, o cuando se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) o calorimetría diferencial de barrido (DSC).

En ciertas modalidades, la estabilidad física puede ser determinada mediante formación de imágenes por micro flujo, donde el número más grande de partículas o el tamaño más grande de las partículas detectados se correlaciona por lo general con estabilidad física reducida. En modalidades particulares, una composición de la invención es físicamente estable si su conteo de partículas, cuando se determina mediante formación de imágenes de micro flujo, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4, por ejemplo, es menor a aproximadamente 500,000, menor a aproximadamente 100,000, o menos a aproximadamente 50,000 particular totales/mL, donde las partículas tienen un diámetro circular equivalente en el rango de 0 mm a aproximadamente 100 mm, en otra modalidad, en el rango de 0 a 25 mih. En otra modalidad, una composición de la invención se considera físicamente estable sí su conteo de partículas cuando se determina por formación de imágenes de micro flujo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4, es menor a aproximadamente 100.000, menor a aproximadamente 50,000, menor a aproximadamente 20.000, menor a aproximadamente 10,000, menor a aproximadamente 5.000, menor a aproximadamente 2,500, menor a aproximadamente 1.000, o menor a aproximadamente 500 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro circular equivalente en el rango de aproximadamente 1 mih a aproximadamente 2 mm, o en otra modalidad, en el rango de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 mpi.

En modalidades particulares, una composición de la invención es estable químicamente cuando al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de un aptámero anti PDGF o un antagonista de VEGF presente en la composición no muestra descomposición o modificaciones que resultan en la formación de nuevas entidades química.

En modalidades particulares, un aptámero anti PDGF o un antagonista de VEGF es estable químicamente cuando al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de un aptámero anti PDGF o un antagonista de VEGF no muestra descomposición o modificaciones que resultan en la formación de nuevas entidades químicas. En modalidades particulares, una composición de la invención es estable químicamente si al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF presentes en la composición no muestran descomposición o modificaciones que resulten en la formación de nuevas entidades químicas. En ciertas modalidades, la descomposición o la modificación son aquellas las cuales resultan en la formación de nuevas entidades químicas, por ejemplo, mediante escisión de los enlaces químicos.

En modalidades particulares, una composición de la invención es estable químicamente cuando al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o a menos aproximadamente 99% de uno o más de los aptámeros anti PDGF o los antagonistas de VEGF en la composición no muestran signos de descomposición o modificación que resulten en la formación de nuevas entidades químicas, cuando se almacenan a aproximadamente la temperatura ambiente durante al menos cinco días, al menos siete días, al menos 10 días, al menos 14 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos dos semanas, al menos cuatro semanas, al menos ocho semanas, al menos doce semanas, al menos dieciséis semanas, o al menos 24 semanas, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos seis meses, o al menos aproximadamente un año, o alternativamente durante al menos cinco años; o alternativamente a una temperatura desde aproximadamente 2.0°C a aproximadamente 8 .0°C durante al menos cinco días, al menos siete días, al menos 10 días, al menos 14 días, al menos 20 días, al menos 3 días, al menos 30 días, al menos dos semanas, al menos cuatro semanas, al menos ocho semanas, al menos doce semanas, al menos dieciséis semanas, al menos 24 semanas, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos seis meses, o al menos aproximadamente un año, o alternativamente durante al menos aproximadamente dos años, o alternativamente durante al menos aproximadamente tres años, o alternativamente durante al menos aproximadamente cuatro años, o alternativamente durante al menos aproximadamente cinco años; o alternativamente a una temperatura de aproximadamente 5.0°C durante al menos dos semanas, al menos cuatro semanas, al menos ocho semanas, al menos diez semanas, al menos dieciséis semanas, al menos 24 semanas, al menos aproximadamente un año, o al menos aproximadamente dos años, o alternativamente durante al menos aproximadamente tres años, o alternativamente durante al menos aproximadamente cuatro años, o alternativamente durante al menos aproximadamente cinco años. En modalidades particulares, una composición es estable físicamente o químicamente cuando los aptámeros anti PDGF y los antagonistas de VEGF presentes en la composición son estables químicamente. En algunas modalidades, las composiciones de la invención son estables, es decir, estables físicamente o químicamente, a aproximadamente 40°C hasta durante al menos una semana, hasta o al menos dos semanas, o hasta o al menos un mes. En algunas modalidades, las composiciones son estables aproximadamente -20°C hasta durante o al menos un año, o alternativamente hasta por al menos dos años, tres años, cuatro años, o cinco años. En algunas modalidades, las composiciones son estables a aproximadamente -80°C durante hasta o al menos un año, o alternativamente hasta o al menos dos veces, tres años, cuatro años, o cinco años. En ciertas modalidades, las composiciones de la invención son estables físicamente o químicamente si su conteo de partículas, cuando se determina por formación de imágenes de micro flujo como se describe, por ejemplo en el Ejemplo 4, por ejemplo, es menor a aproximadamente 500,000, menor a aproximadamente 100,000, o menor a aproximadamente 50,000 partículas totales/mL, donde las partículas tienen un diámetro circular equivalente en el rango de 0 mm a aproximadamente 100 mm, en otra modalidad, en el rango de 0 mih a aproximadamente 25 m; o es menor a aproximadamente 100.000, menor a aproximadamente 50,000, menor a aproximadamente 20.000, menor a aproximadamente, 10,000, menor a aproximadamente 5.000, menor a aproximadamente 2,500, menor a aproximadamente 1.000, o menor a aproximadamente 500 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro circular equivalente en el rango de 1 mih a 2 mm o, en otra modalidad, en el rango de 1 mih a 5 mih, después del almacenamiento a aproximadamente 5°C o aproximadamente 30°C durante aproximadamente cuatro horas.

En modalidades particulares, las composiciones de la invención se consideran estables físicamente o químicamente si después del almacenamiento, el número promedio de partículas detectadas no es superior a aproximadamente 50 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro > aproximadamente 10 mm y no es superior a 5 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro > 25 mm, cuando se mide mediante la Prueba de Conteo de Partículas por Oscurecimiento de la Luz, descrito en (788) Particulate Matter in Injections, Revised Bulletin, Official, 1° de octubre de 2011, The United States Pharmacopeial Convention. Como se describe en ese documento, esta prueba se lleva a cabo usando un aparato adecuado con base en el principio de bloqueo de la luz que permite una determinación automática del tamaño de las partículas y del número de partículas de acuerdo con el tamaño. El aparato se calibra usando dispersiones de partículas esféricas de tamaños conocidos de 10 mm a 25 mth. Estas partículas estándar se dispersan en agua libre de partículas. Se debe tener cuidado de evitar la agregación de las partículas durante la dispersión. La prueba se lleva a cabo bajo condiciones que limiten la exposición a materiales particulados extraños, en una cabina de flujo laminar. Los artículos de vidrio y el equipo de filtración usados, excepto por los filtros de membrana se lavan cuidadosamente con una solución de detergente calentada con cantidades abundantes de agua, para eliminar todos los rastros de detergente. Inmediatamente antes del uso, el equipo se enjuaga de arriba abajo, por fuera y después por dentro, con agua libre de partículas. Se debe tener cuidado de no introducir burbujas de aire en la muestra a ser medida, en especial cuando las fracciones de la preparación están siendo transferidas al recipiente en el cual se debe llevar a cabo la medición. Con el fin de verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que los artículos de vidrio han sido limpiados apropiadamente, y que el agua a ser usada está libre de partículas, se determina enseguida el material particulado en 5 muestras de agua libre de partículas, cada una de 5 mL. Si el número de partículas de 10 mm o más grandes es superior a 25 para los 25 mL combinados, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Las etapas preparatorias se repiten entonces hasta que el ambiente, los artículos de vidrio y el agua sean adecuados.

Una vez que el ambiente, los artículos de vidrio, y el agua son adecuados para la prueba, la prueba se lleva a cabo sobre la muestra de prueba. Los contenidos de la muestra se mezclan al invertir lentamente el recipiente de muestra 20 veces sucesivamente. Si es necesario, se remueve el sello del recipiente, si hay alguno, con precaución. Las superficies externas del recipiente se limpian usando un chorro de agua libre de partículas y el sello del recipiente, si hay alguno, se remueve, evitando cualquier contaminación de los contenidos. Las burbujas de gas se eliminan tomando las medidas apropiadas, tales como permitir que el recipiente repose durante 2 minutos, o sonificación.

Para las muestras de gran volumen, 25 mL o más de volumen, se evalúan las unidades individuales. Para las muestras de volumen pequeño, menor de 25 mL de volumen, los contenidos de 10 o más unidades se combinan en un recipiente limpio, para obtener un volumen no menor a 25 mL; la solución de prueba puede ser preparada mezclando los contenidos de un número adecuado de frascos y diluyendo la mezcla resultante a 25 mL con agua libre de partículas o con un solvente libre de partículas adecuado, cuando el agua libre de partículas no sea adecuada. Las soluciones parenterales de volumen pequeño que tienen un volumen de 25 mL o más pueden ser evaluadas individualmente. Los polvos se reconstituyen con agua libre de partículas o con un solvente libre de partículas apropiado, cuando el agua libre de partículas no sea adecuada. El número de muestras de prueba debe ser adecuado para proporcionar una evaluación estadísticamente significativa. Para las muestras de volumen grande o para las muestras de volumen pequeño que tienen un volumen de 25 L o más, se pueden evaluar menos de 10 unidades, usando un plan de muestreo apropiado.

Cuatrero porciones no menores a 5 mL cada una, se retiran de cada muestra, y el número de partículas de tamaño igual o mayor a 10 mm o 25 mm se contabiliza. El resultado obtenido para la primera porción se descarta, y se calcula el número promedio de partículas para la preparación que se está examinando.

Para las muestras en los recipientes que tienen un volumen nominal mayor a 100 mL, se deben considerar los criterios de la Prueba l.A descritos en este documento.

Para las muestras en los recipientes que tienen un volumen nominal de 100 mL o menos, se deben considerar los criterios de la Prueba l.B descritos en este documento.

Si el número promedio de partículas es superior a los límites de la prueba, la muestra debe ser evaluada usando la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas.

Prueba l.A. La muestra cumple con los límites de prueba si el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras evaluadas no es superior a 25 por mL, cuando las partículas tienen y diámetro que es igual o mayor a 10 mm, o si el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras evaluados no es superior a 3 por mL, cuando las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 25 mih.

Prueba l.B. Las muestras cumplen con los límites de prueba si el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras evaluados no es superior a 6000 por recipiente, cuando las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 10 mih, o si el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras no es superior a 600 por recipiente, cuando las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 25 mm.

En modalidades particulares, las composiciones se consideran estables físicamente o químicamente si después del almacenamiento, el número promedio de partículas detectadas no es superior a 50 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro > 10 mm; no es superior a 5 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro > 25 mm; y no es superior a 2 partículas/mL, donde las partículas tienen un diámetro >50 mm, cuando se mide mediante la prueba de conteo de partículas por el método microscópico descrito en 788) Particulate Matter in Injections, Revised Bulletin, Official, Io de octubre de 2011, The United States Pharmacopeial Convention.

La Prueba de Conteo Microscópico de Partículas se lleva a cabo usando un microscopio binocular, un montaje de filtro para retener el material particulado, y un filtro de membrana para la inspección. El microscopio se ajusta a 100 + 10 aumentos y se equipa con un micrómetro ocular calibrado con un micrómetro de objetivo, una plataforma mecánica capaz de sostener y atravesar el área de filtración del filtro de membrana, y dos iluminadores adecuados para proporcionar iluminación episcópica además de iluminación oblicua. El micrómetro ocular es una retícula de diámetro circular y consiste de un círculo grande divido por puntos de mira en cuadrantes, círculos de referencia transparentes y negros de 10 mth y 25 mih de diámetro a 100 aumentos, y una escala lineal graduada en incrementos de 10 mth. esta se calibre usando un micrómetro de plataforma que se certifica por una institución de normalización ya sea doméstica o internacional. Un error relativo de la escala lineal de la retícula dentro de ±2% es aceptable. El círculo grande se designa como el campo de visión de la retícula (GFOV). Se usan dos iluminadores. Uno es un iluminador de camp claro, episcópico, interno al microscopio, el otro es un iluminador auxiliare, enfocable, que puede ser ajustado para dar una iluminación oblicua reflejada a un ángulo de 10° a 20°. El montaje de filtro para retener el material particulado consiste de un sujetador de filtros construido de video o de otro material adecuado, y está equipado con una fuente de vacío y un filtro de membrana adecuado. El filtro de membrana es de un tamaño adecuado, de color negro o gros oscuro, no enrejillado o enrejillado, y con un tamaño nominal de poro de 1.0 mm o más fino.

La prueba se lleva a cabo bajo condiciones que limitan la exposición al material particulado externo, por ejemplo, en una cabina de flujo laminar. Los artículos de vidrio y el montaje de filtro usados, excepto por el filtro de membrana, se lava cuidadosamente con una solución de detergente calentada, y se enjuaga con cantidades abundantes de agua para remover todos los rastros de detergente. Inmediatamente antes del uso, ambos lados del filtro de membrana y del equipo se enjuagan de arriba a abajo, por afuera y luego por dentro, con el agua libre de partículas.

Con el fin de verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que los artículos de vidrio y el filtro de membrana han sido limpiados apropiadamente, y que el agua a ser usada está libre de partículas, se lleva cabo la siguiente prueba: el material particulado de un volumen de 50 mL de agua libre de partículas se determina de acuerdo con el método explicado inmediatamente a continuación, si más de 20 partículas con un tamaño de 10 mm o más grandes o si más de 5 partículas con un tamaño de 25 mm o más grandes están presentes dentro del área de filtración, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes.

Las etapas preparatorias se repiten entonces hasta que el ambiente, los artículos de vidrio y el agua sean adecuados para la prueba.

Los contenidos de la muestra se mezclan al invertir lentamente el recipiente de muestra 20 veces sucesivamente. Si es necesario, se remueve el sello del recipiente, si hay alguno, con precaución. Las superficies externas del recipiente se limpian usando un chorro de agua libre de partículas y el sello del recipiente, si hay alguno, se remueve, evitando cualquier contaminación de los contenidos.

Para las muestras de gran volumen, se evalúan las unidades individuales. Para las muestras de volumen pequeño, los contenidos de 10 o más unidades se combinan en un recipiente limpio; la solución de prueba puede ser preparada mezclando los contenidos de un número adecuado de frascos y diluyendo la mezcla resultante a 25 mL con agua libre de partículas o con un solvente libre de partículas adecuado, cuando el agua libre de partículas sea adecuado. Las soluciones parenterales de volumen pequeño que tienen un volumen de 25 mL o más pueden ser evaluadas individualmente. Los polvos para uso parenteral se reconstituyen con agua libre de partículas o con un solvente libre de partículas apropiado, cuando el agua libre de partículas no sea adecuada. El número de muestras de prueba debe ser adecuado para proporcionar una evaluación estadísticamente significativa. Para las muestras de volumen grande o para las muestras de volumen pequeño que tienen un volumen de 25 mL o más, se pueden evaluar menos de 10 unidades, usando un plan de muestreo apropiado.

El interior del sujetador de filtros equipado con el filtro de membrana se humedece con varios mL de agua libre de partículas. El volumen total de una reserva de solución de un recipiente de muestra individual se transfiere a un embudo de filtración, y se aplica el vacío. Si es necesario, una porción de la muestra se agrega por etapas hasta que se filtra el volumen completo. Después de la última adición de la muestra, las paredes interiores del sujetador de filtros se enjuagan usando un chorro de agua libre de partículas. El vacío se mantiene hasta que la superficie del filtro de membrana está libre de líquido. El filtro de membrana se coloca en una caja de Petri, y se permite que el filtro de membrana se seque al aire con la cubierta ligeramente entreabierta. Después que el filtro de membrana se ha secado, la caja de Petri se coloca sobre la plataforma del microscopio, el filtro de membrana completa se explora bajo la luz reflejada del dispositivo de iluminación, y se contabiliza el número de partículas que tienen un tamaño igual o mayor a 10 jum y el número de partículas que tienen un tamaño igual o mayor a 25 mm. Alternativamente, se puede llevar a cabo el conteo parcial del filtro de membrana y la determinación del conteo total del filtro mediante cálculos. El número promedio de partículas para la preparación se examina y se determina.

El proceso de determinación del tamaño de partícula con el uso de la retícula de diámetro circular se lleva a cabo estimando el diámetro equivalente de las partículas en comparación con los círculos de referencia de 10 mitiy 25 mih sobre la retícula. Por lo cual, las partículas no se mueven de sus ubicaciones iniciales dentro del campo de vista de la retícula y no se sobreponen a los círculos de referencia para la comparación. El diámetro interno de los círculos de referencia transparentes de la retícula se usa para determinar el tamaño de las partículas blancas y transparentes, en tanto que el tamaño de las partículas oscuras se determina usando los diámetros externos de los círculos de referencia opacos, negros, de la retícula.

Los materiales amorfos, semiliquidos o morfológicamente distintos de otra manera que tienen la apariencia de manchas o de descoloración sobre el filtro de membrana no deben ser dimensionados o contabilizados puestos que estos materiales muestran poca o nada de atenuación superficial y presentan apariencia gelatinoso o similar a una película. En tales casos, la interpretación de la enumeración puede ser auxiliada evaluando una muestra de la solución mediante la Prueba de Conteo de Partículas por Oscurecimiento de Luz.

Para las muestras en los recipientes que tienen un volumen nominal mayor a 100 mL, se aplican los criterios de la Prueba 2.A.

Para las muestras en los recipientes que tienen un volumen nominal de 100 mL o menos, se aplican los criterios de la Prueba 2.B.

Prueba 2.A. La mezcla cumple con los límites de prueba si el número promedio de partícula presentes en los recipientes de muestras no es superior a 12 por mL, y las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 10 mia, o el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras no es superior a 2 por mL y las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 25 mm.

Prueba 2.B. La muestra cumple con los límites de prueba si el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras no es superior a 3000 por recipiente y las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 10 jum, o el número promedio de partículas presentes en los recipientes de muestras evaluados no es superior a 300 por recipiente, y las partículas tienen un diámetro que es igual o superior a 25 mm.

En ciertas modalidades, las composiciones de la invención están en forma liofilizada.

Composiciones que Comprenden el Antagonista A y Ranibizumab En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab. En modalidades particulares, la proporción de la concentración (masa del Antagonista A menor que de su grupo - R/volumen de la composición) de Antagonista A o la forma modificada del mismo a la concentración (masa/volumen de la composición) de ranibizumab presente en la composición es menor a 25.0, menor a 10.0, menor a 9.0, menor a 8.0, menor a 7.0, menor a 6.0, menor a 5.0, menor a 4.0, menor a 3.0, menor a 2.0, o menor a 1.0. En modalidades particulares, la proporción de la concentración (masa del Antagonista A menor que de su grupo - R/volumen de la composición) del Antagonista A o la forma modificada del mismo a la concentración e (masa/volumen de la composición) de ranibizumab en la composición es menor o igual a 25.0, menor o igual a 10.0, menor o igual a 9.0, menor o igual a 8.0, menor o igual a 7.0, menor o igual a 6.0, menor o igual a 5.0, menor o igual a 4.0, menor o igual a 3.0, o menor o igual a 2.0 o menor o igual a 1.0. En modalidades particulares la proporción de la concentración (masa del Antagonista A menor que de su grupo -R/volumen de la composición) del Antagonista A o la forma modificada del mismo a la concentración (masa/volumen de la composición) de ranibizumab presente en la composición está en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 2 a aproximadamente 5, aproximadamente 3 a aproximadamente 4, o aproximadamente 5.

El grupo -R del Antagonista A se representa en la Fig.78A.

En modalidades particulares, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab, y la composición es estable con respecto a ambos agentes activos a un pH particular o adecuada para la administración parenteral. En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo no afecta adversamente la actividad del ranibizumab. En ciertas modalidades, el ranibizumab no afecta adversamente la actividad del Antagonista A o la forma modificada del mismo. En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo mejora la actividad del ranibizumab. En ciertas modalidades, el ranibizumab mejora la actividad del Antagonista A o de la forma modificada del mismo. Los métodos para determinar la actividad del Antagonista A y de los antagonistas de VEGF son conocidos en la téenica e incluyen medir el efecto del Antagonista A o de un antagonista de VEGF sobre la expresión del PDGF o la expresión genética regulada por VEGF, respectivamente, como se describe por ejemplo en los Ejemplos 3 y 6.

En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más de un modificador de la tonicidad, un surfactante, y un amortiguador adecuado para lograr o mantener el pH particular o que es adecuado para la administración parenteral. Los amortiguadores apropiados incluyen aquellos descritos en este documento asi como otros amortiguadores conocidos en la téenica, tales como, por ejemplo, amortiguadores de Good, por ejemplo, MES.

En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo en la composición de la invención es menor que o aproximadamente de 100 mg/mL, menor de aproximadamente 50 mg/mL, menor de aproximadamente 40 mg/mL, menor de aproximadamente 30 mg/mL, menor de aproximadamente 25 mg/mL, menor de aproximadamente 20 mg/mL, menor de aproximadamente 15 mg/mL, menor de aproximadamente 10 mg/mL o menor de aproximadamente 5 mg/mL. En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente mg/mL, aproximadamente 1 mg/ mL a aproximadamente mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, o aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL. En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 mg/ mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 24 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración del ranibizumab en la composición de la invención es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 11 mg/mL, o aproximadamente 12 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración del ranibizumab en la composición de la invención es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 11 mg/mL, o aproximadamente 12 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo en la composición es menor a aproximadamente 100 mg/mL, menor a aproximadamente 50 mg/mL, menor a aproximadamente 40 mg/mL, menor a aproximadamente 30 mg/mL, menor a aproximadamente 25 mg/mL, menor a aproximadamente 20 mg/mL, menor a aproximadamente 15 mg/mL, menor a aproximadamente 10 mg/mL, o menor a aproximadamente 5 mg/mL.

En ciertas modos, la concentración del ranibizumab en la composición dé la invención es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 11 mg/mL, o aproximadamente 12 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 1 mg/ mL a aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, o aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración del ranibizumab en las composiciones de la invención es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 2 mg /mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, o aproximadamente 10 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 g/ mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 24 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 3 mg/mL y la concentración del ranibizumab es de aproximadamente 5 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 6 mg/mL, y la concentración del ranibizumab es de aproximadamente 10 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 15 mg/mL, y la concentración del ranizumab es de aproximadamente 5 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 24 mg/mL, y la concentración del ranizumab es de aproximadamente 8 mg/mL.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o la forma modificada del mismo y ranibizumab, la composición comprende además un modificador de la tonicidad que es sorbitol o cloruro de sodio, o mezclas de los mismos. En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad es sorbitol, y el pH particular de la composición es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.0 o aproximadamente 7.0. En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio, y el pH de la composición es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 8.0, aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En ciertas modalidades, el modificador de la tonicidad es sorbitol a una concentración de aproximadamente 10 % (p/v), o aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v), o aproximadamente 10% (p/v). En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM to 200 mM, aproximadamente 75 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM aproximadamente 140 mM o aproximadamente 150 mM. En una modalidad, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM. En otras modalidades, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 75 mM o aproximadamente 120 mM. Con respecto a la concentración del modificador de la tonicidad, "mM" se refiere a milimoles del modificador de la tonicidad por litro de la composición.

En ciertas modalidades de una composición de la invención que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab, la composición comprende además un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición dentro de un rango deseado. En ciertas modalidades, la composición comprende histidina (por ejemplo, L-histidina o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo) o fosfato como el amortiguador, por ejemplo, fosfato de sodio o fosfato de potasio (o tanto histidina y fosfato). En ciertas modalidades, el amortiguador está presente a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 10 mM. En modalidades particulares, el pH de la composición amortiguada es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En una modalidad, la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende histidina a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 10 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En una modalidad particular, el amortiguador comprende histidina a una concentración de 10 mM y el pH de la composición amortiguada con histidina es de aproximadamente 6.0. Con respecto a la concentración del amortiguador "mM" se refiere a milimoles de amortiguador (por ejemplo, histidina) por litro de la composición.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab, el amortiguador comprende fosfato, individualmente o en combinación con histidina. El amortiguador de fosfato puede ser, por ejemplo, fosfato de sodio o un amortiguador de fosfato de potasio. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200. mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 50 mM. En modalidades particulares, el pH de la composición amortiguada es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, o aproximadamente 8.0. En una modalidad, el amortiguador comprende fosfato, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 50 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En una modalidad particular, el amortiguador comprende fosfato, a una concentración de aproximadamente 10 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 6.2.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab, la composición comprende además un surfactante. En modalidades particulares, el surfactante es polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.002% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.005% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.01% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), o aproximadamente 0.02% (p/v).

En una modalidad, una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo, ranibizumab, histidina, y NaCl. La composición puede comprender además, polysorbate.

En una modalidad particular, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una versión modificada del mismo y ranibizumab; la proporción de la concentración del Antagonista A (o de la forma modificada del mismo) a la concentración de ranibizumab es menor a 2; y la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, histidina a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, y polysorbate (por ejemplo, polysorbate 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%, donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden el Antagonista A o una forma modificada del mismo, o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismo, y ranibizumab, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo. En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismos; y (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo. En otras modalidades, las composiciones comprenden además uno o ambos de: (c) aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina ; y (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl. En otras modalidades, las composiciones comprenden además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante, el cual es polysorbate opcionalmente. En una modalidad particular, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina; y (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de las composiciones es de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0. En una modalidad adicional, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de L-histidina; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de las composiciones es de aproximadamente pH 6.0. En ciertas modalidades, las composiciones comprenden además: (e) aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20.

En ciertas modalidades, las composiciones de la invención comprenden: (a) aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, o aproximadamente 5.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, el Antagonista A o la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; y (b) aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo. En otras modalidades, las composiciones comprenden además uno o ambos de (c) aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina; y (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl. En otras modalidades, las composiciones comprenden además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante, el cual es opcionalmente polysorbate. En una modalidad particular, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 5.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina; y (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de las composiciones es de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0 o aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 7.5. En una modalidad adicional, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 15 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 5 M de L-histidina; y (d) aproximadamente 75 mM de NaCl, en donde el pH de las composiciones es de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 7.5 o aproximadamente pH 6.0. En ciertas modalidades, las composiciones comprenden además: (e) aproximadamente 0.005% (p/v) de polisorbato 20. En una modalidad adicional, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 24 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 8 mg/mL de ranibizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 2 mM de L- histidina; y (d) aproximadamente 120 mM de NaCl, en donde el pH de las composiciones es de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 7.5 o aproximadamente pH 6.0. En ciertas modalidades, las composiciones comprenden además: (e) aproximadamente 0.002% (p/v) de polisorbato 20.

En ciertas modalidades, las composiciones de la invención comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de ranibizumab; y uno o ambos de (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición a aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En modalidades particulares, el amortiguador, cuando está presente, es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de fosfato de sodio; y el modificador de la tonicidad, cuando está presente, es aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de sorbitol, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de trehalosa. En ciertas modalidades, el amortiguador es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM de L-histidina; y el modificador de la tonicidad es aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0.

Cualquiera de las composiciones de la invención también puede comprender un surfactante, por ejemplo, aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

Los ejemplos de las composiciones de la invención incluyen las composiciones descritas en la Tabla 1, la Tabla 3 o la Tabla 8. En otras modalidades, la invención incluye las composiciones descritas en la Tabla 1 pero sin el polysorbate.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 3 mg/mL, ranibizumab a una concentración de aproximadamente 5 mg/mL, histidina a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab, aproximadamenté 10 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol, y aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab, aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 130 mM de NaCl, y aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab, aproximadamente 5 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 5 mM de histidina HCl, aproximadamente 75 mM de NaCl, aproximadamente 5% (p/v) de trehalosa, y aproximadamente 0.005% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.5.

En ciertas modalidades las composiciones de la invención comprenden: (a) aproximadamente 3 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL del Antagonista A o una forma modificada del mismo; (b) aproximadamente 1.0 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL de ranibizumab; y uno o ambos de (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición a aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En modalidades particulares, el amortiguador, cuando está presente, comprende aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio o aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 10 mM de histidina.HC1; y el modificador de la tonicidad, cuando está presente, es aproximadamente 0.5% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v) de trehalosa.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 15 mg/mL, ranibizumab a una concentración de aproximadamente 5 mg/mL, histidina a una concentración de aproximadamente 5 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 75 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.005% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 24 mg/mL, ranibizumab a una concentración de aproximadamente 8 mg/mL, histidina a una concentración de aproximadamente 2 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 120 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.002% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5.

En modalidades particulares, una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab es estable químicamente durante al menos ocho semanas o al menos doce semanas a 25°C o durante al menos doce semanas o al menos dieciséis semanas o al menos 24 semanas a 4°C. En modalidades particulares, al menos 80% de cada uno del Antagonista A y ranibizumab no muestran señales de descomposición o modificación que resultan en la formación de nuevas entidades químicas bajo al menos una de estas condiciones.

Composiciones que Comprenden el Antagonista A y Bevacizumab En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab. En modalidades particulares, la proporción de la concentración (masa del Antagonista A menor que de su grupo -R/volumen de la composición) del Antagonista A (o de la forma modificada del mismo) a la concentración (masa/volumen de la composición) del bevacizumab presente en la composición es menor a 25.0, menor a 10.0, menor a 9.0, menor a 8.0, menor a 7.0, menor a 6.0, menor a 5.0, menor a 4.0, menor a 3.0, menor a 2.0, menor a 1.0, o menor a 0.5.

El grupo -R del Antagonista A se representa en la Fig.78A.

En modalidades particulares, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab, y la composición es estable con respecto a ambos agentes activos a un pH particular adecuado para la administración parenteral. En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo no afecta adversamente la actividad del bevacizumab. En ciertas modalidades, el bevacizumab no afecta adversamente la actividad del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo mejora la actividad del bevacizumab. En ciertas modalidades, el bevacizumab mejora la actividad del Antagonista A o de una forma modificada del mismo. Los métodos para determinar la actividad del Antagonista A y de los antagonistas de VEGF se conocen en la téenica e incluyen medir el efecto del Antagonista A o de un antagonista de VEGF sobre la expresión del PDGF o la expresión genética regulada por VEGF, respectivamente, como se describe, por ejemplo en los Ejemplos 3 y 6.

En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más modificadores de la tonicidad, surfactantes, y amortiguadores adecuados para lograr o mantener el pH particular o que son adecuados para la administración parenteral. Los amortiguadores apropiados incluyen aquellos descritos en este documento, asi como otros descritos en la técnica, tales como, por ejemplo, amortiguadores de Good, por ejemplo, MES.

En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo en la composición es menor a aproximadamente 50 mg/mL, menor a aproximadamente 40 mg/mL, menor a aproximadamente 30 mg/mL, menor a aproximadamente 25 mg/mL, menor a aproximadamente 20 mg/mL, menor a aproximadamente 15 mg/mL, menor a aproximadamente 10 mg/mL, o menor a aproximadamente 5 mg/mL. En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 10 mg/mL aproximadamente mg/ mL a aproximadamente 5 mg/mL En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 g/ mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 12.5 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 12.5 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL, y la concentración de Antagonista A o de la forma modificada del mismo es menor a aproximadamente 50 mg/mL, menor a aproximadamente 40 mg/mL, menor a aproximadamente 30 mg/mL, menor a aproximadamente 25 mg/mL, menor a aproximadamente 20 mg/mL, menor a aproximadamente 15 mg/mL, menor a aproximadamente 10 mg/mL, o menor a aproximadamente 5 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 12.5 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 1 mg/ mL aproximadamente 5 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 12.5 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 mg/ mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 3 mg/mL y la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 12.5 mg/mL. En otra modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 6 mg/mL, y la concentración de bevacizumab es de aproximadamente 25 mg/mL o aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab, la composición comprende además un modificador de la tonicidad seleccionado de entre sorbitol, cloruro de sodio y trehalosa. En otras modalidades, la composición comprende tanto sorbitol y cloruro de sodio, tanto cloruro de sodio y trehalosa, o tanto sorbitol y trehalosa. En modalidades particulares, la composición comprende sorbitol, y el pH de la composición es de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0. En modalidades particulares, la composición comprende cloruro de sodio, y el pH de la composición es de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, la composición comprende trehalosa, y el pH de la composición es de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.0. En ciertas modalidades, la composición comprende sorbitol a aproximadamente 1% a aproximadamente 10 % (p/v), o aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v), o aproximadamente 10% (p/.v). En modalidades particulares, la composición comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM to 200 mM, aproximadamente 75 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM aproximadamente 140 mM o aproximadamente 150 mM. En una modalidad, la composición comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM. En ciertas modalidades, la composición comprende trehalosa a aproximadamente 1% a aproximadamente 10 % (p/v), o aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v), o aproximadamente 10% (p/v).

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab, la composición comprende además un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición dentro de un rango deseado. En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más de acetato, fosfato, y Tris como el amortiguador. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 M, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 mM. El amortiguador de fosfato puede ser, por ejemplo, amortiguador de fosfato de sodio o un amortiguador de fosfato de potasio._En modalidades particulares, el pH de la composición amortiguada es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, o aproximadamente 8.0. En una modalidad, el amortiguador comprende fosfato, y el pH de la composición amortiguada es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 5 M a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En una modalidad particular, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 6.0.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab, la composición comprende además un surfactante. En modalidades particulares, el surfactante es polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.005% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.01% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), o aproximadamente 0.02% (p/v).

En una modalidad, una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab comprende el Antagonista A, bevacizumab, cloruro de sodio, y fosfato. La composición puede comprender además polysorbate.

En una modalidad particular: una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab; la proporción de la concentración del Antagonista A (o de la forma modificada del mismo) a la concentración de bevacizumab es menor a 1.5, menor a 1.2 o menor a 1; y la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 M, y polysorbate (por ejemplo, polysorbate 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden el Antagonista A o una forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos, y bevacizumab, o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo. En ciertas modalidades, una composición de la invención comprende: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; y (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL de bevacizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo. En otras modalidades, la composición comprende además uno o ambos de (c) aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de amortiguador de fosfato; y (d) aproximadamente 10 mM de NaCl a aproximadamente 200 mM de NaCl. En otras modalidades, la composición comprende: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL de bevacizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de amortiguador de fosfato, (por ejemplo, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio); y (d) aproximadamente 10 mM de NaCl a aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0. En modalidades particulares de las composiciones que comprenden bevacizumab, la composición comprende además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante, el cual es opcionalmente polysorbate. En una modalidad particular, la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de amortiguador de fosfato; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0. En otra modalidad, la composición comprende además: (e) aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20.

En ciertas modalidades, las composiciones de la invención comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una forma modificada del mismo; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL de bevacizumab; y uno o ambos de (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición en aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de la tonicidad. En modalidades particulares, el amortiguador es aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de Tris.HCl; y el modificador de la tonicidad es aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de sorbitol, o aproximadamente 1% a aproximadamente 20% (p/v) de trehalosa. En ciertas modalidades, el amortiguador es aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio; y el agente de tonicidad es aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0. En modalidades particulares, las composiciones de la invención comprenden un surfactante, por ejemplo, aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

Los ejemplos de las composiciones de la invención incluyen las composiciones descritas en la Tabla 3, asi como aquellas composiciones que no contienen el surfactante.

En una modalidad, una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 3 mg/mL, bevacizumab a una concentración de aproximadamente 12.5 mg/mL, fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab, aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A, o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab, aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A, o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab, aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 150 mM de NaCl, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab, aproximadamente 50 mM de Tris.HCl, aproximadamente 130 mM de NaCl, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 8.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 15 mg/mL del Antagonista A, o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab, aproximadamente 30 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 75 mM de NaCl, aproximadamente 3% (p/v) de trehalosa, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.3.

En una modalidad, una composición de la invención comprende aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A, o de la forma modificada del mismo, aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo, aproximadamente 30 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 75 mM de NaCl, aproximadamente 3% (p/v) de trehalosa, y aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.3.

En modalidades particulares, una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab es estable químicamente durante al menos cuatro semanas o al menos ocho semanas at 25°C o durante al menos doce semanas o al menos 24 semanas a 4°C. En modalidades particulares, al menos 70% de cada uno del Antagonista A o de la forma modificada del mismo y bevacizumab no muestran señales de descomposición o modificación que resultan en la formación de nuevas entidades químicas bajo estas condiciones.

Composiciones que Comprenden el Antagonista A y Aflibercept En ciertas modalidades, una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept. En modalidades particulares, la proporción de la concentración (masa de Antagonista A menor que de su grupo -R /volumen de la composición) del Antagonista A a la concentración (masa/volumen de la composición) de aflibercept presente en la composición es menor a 25.0, menor a 10.0, menor a 9.0, menor a 8.0, menor a 7.0, menor a 6.0, menor a 5.0, menor a 4.0, menor a 3.0, menor a 2.0, menor a 1.0, menor a 0.5, o menor a 0.25.

El grupo -R del Antagonista A se representa en la Fig.78A.

En modalidades particulares, una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, y la composición es estable con respecto a ambos agentes activos a un pH particular o adecuado para la administración parenteral. En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo no afecta adversamente la actividad del aflibercept. En ciertas modalidades el aflibercept no afecta adversamente la actividad del Antagonista A o de la forma modificada del mismo. En ciertas modalidades, el Antagonista A o una forma modificada del mismo mejora la actividad del aflibercept. En ciertas modalidades, el aflibercept mejora la actividad del Antagonista A o de la forma modificada del mismo. Los métodos para determinar la actividad del Antagonista A y de los antagonistas de VEGF se conocen en la téenica e incluyen medir el efecto del Antagonista A o de un antagonista de VEGF sobre la expresión del PDGF o la expresión genética regulada o el VEGF, respectivamente, como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 3 y 6.

En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más modificadores de la tonicidad, surfactantes, y amortiguadores adecuados para lograr o mantener el pH particular o que sea adecuado para la administración parenteral. Los amortiguadores apropiados incluyen aquellos descritos en este documento asi como otros conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, amortiguadores de Good, por ejemplo, Mes.

En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo en la composición es menor a aproximadamente 50 mg/mL, menor a aproximadamente 40 mg/mL, menor a aproximadamente 30 mg/mL, menor a aproximadamente 25 mg/mL, menor a aproximadamente 20 mg/mL, menor a aproximadamente 15 mg/mL, menor a aproximadamente 10 mg/mL, o menor a aproximadamente 5 mg/mL. En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aapprrooxxiimmaaddaammeennttee 1I mmgg// mmLL a aproximadamente 5 mg/mL. En ciertas modalidades, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 mg/ mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de aflibercept es de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, o aproximadamente 40 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de aflibercept es de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, o aproximadamente 40 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es menor a aproximadamente 50 mg/mL, menor a aproximadamente 40 mg/mL, menor a aproximadamente 30 mg/mL, menor a aproximadamente 25 mg/mL, menor a aproximadamente 20 mg/mL, menor a aproximadamente 15 mg/mL, menor a aproximadamente 10 mg/mL, o menor a aproximadamente 5 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de aflibercept es de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, o aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 1 mg/ mL a aproximadamente 5 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 0.3 mg/mL Í aproximadamente 10 mg/mL, aapprrooxxiimmaaddaammeennttee 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, aapprrooxxiimmaaddaammeennttee 1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 1 mg/ mL a aproximadamente 5 mg/mL.

En ciertas modalidades, la concentración de aflibercept es de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, o aproximadamente 40 mg/mL, aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 1 mg/ mL a aproximadamente 5 mg/mL, y la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 1 mg/mL, aproximadamente 2 mg/mL, aproximadamente 3 mg/mL, aproximadamente 4 mg/mL, aproximadamente 5 mg/mL, aproximadamente 6 mg/mL, aproximadamente 7 mg/mL, aproximadamente 8 mg/mL, aproximadamente 9 mg/mL, aproximadamente 10 mg/mL, aproximadamente 15 mg/mL, aproximadamente 20 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 30 mg/mL, aproximadamente 40 mg/mL, o aproximadamente 50 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A es de aproximadamente 3 mg/mL, y la concentración de aflibercept es de aproximadamente 20 mg/mL. En una modalidad, la concentración del Antagonista A es de aproximadamente 6 mg/mL, y la concentración de aflibercept es de aproximadamente 40 mg/mL. En otra modalidad, la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo es de aproximadamente 12 mg/mL, y la concentración de aflibercept es de aproximadamente 80 mg/mL.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, la composición comprende además uno o más modificadores de la tonicidad seleccionados de entre sorbitol y cloruro de sodio. En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad comprende sorbitol, y el pH de la composición es de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad comprende cloruro de sodio, y el pH de la composición es de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, el modificador de la tonicidad comprende sorbitol a aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/v), o aproximadamente 1% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 9% (p/v), o aproximadamente 10% (p/v). En modalidades particulares, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM to 200 mM, aproximadamente 75 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 25 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM aproximadamente 140 mM o aproximadamente 150 mM. En una modalidad, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 40 mM.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, la composición comprende además un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH dentro de un rango deseado. En ciertas modalidades, la composición comprende uno o más amortiguadores seleccionados de entre acetato, fosfato, histidina y Tris. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 M a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 50 mM. En ciertas modalidades, el amortiguador de fosfato es fosfato de sodio o fosfato de potasio. En modalidades particulares, el pH de la composición amortiguada es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, o aproximadamente 8.0. En una modalidad, el amortiguador comprende fosfato, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 50 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6.0. En una modalidad particular, el amortiguador comprende fosfato a una concentración de aproximadamente 10 mM, y la composición amortiguada tiene un pH de aproximadamente 6.2.

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, la composición comprende además sacarosa. En modalidades particulares, la sacarosa está presente en la composición a una concentración de aproximadamente 0% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v), aproximadamente 1% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v), aproximadamente 2% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v), o aproximadamente 5% (p/v).

En ciertas modalidades de una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, la composición comprende además un surfactante. En modalidades particulares, el surfactante es polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.005% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.01% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v), aproximadamente 0.03% (p/v), o aproximadamente 0.02% (p/v).

En una modalidad, una composición que comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept comprende el Antagonista A o la forma modificada del mismo, aflibercept, cloruro de sodio, y fosfato. La composición puede comprender además polysorbate o sacarosa (o ambos).

En una modalidad particular, una composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept; la proporción de la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo a la concentración de aflibercept es menor a 1; y la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 M, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, sacarosa a una concentración de aproximadamente 0% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v), y polysorbate (por ejemplo, polysorbate 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0.

En ciertas modalidades, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; y (b) aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo. En modalidades particulares, las composiciones comprenden además uno o ambos de (c) aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de amortiguador de fosfato (por ejemplo, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio); y (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl. En otras modalidades, las composiciones comprenden además: (e) 0 a aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa. En ciertas modalidades, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo, o las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos; (b) aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de amortiguador de fosfato; (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl; y (e) 0 a aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente pH 8.0. En otra modalidad, las composiciones comprenden además: (f) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de polisorbato. En una modalidad particular, las composiciones comprenden: (a) aproximadamente 6 mg/mL del Antagonista A o de la forma modificada del mismo o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (b) aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o las sales aceptables farmacéuticamente del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de amortiguador de fosfato; (d) aproximadamente 40 mM de NaCl; y (e) aproximadamente 5% (p/v) de sacarosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.2. En una modalidad adicional, las composiciones comprenden además: (f) aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 20.

En ciertas modalidades de una composición de la invención comprenden: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A, o una forma modificada del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept; y uno o más de (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición a aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0; (d) un modificador de la tonicidad; y (e) 0 a aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa. En modalidades particulares, el amortiguador, cuando está presente, es aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de fosfato, y el modificador de la tonicidad, cuando está presente, es aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl.

En modalidades particulares, una composición de la invención comprende (a) aproximadamente 0.3 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A, o una forma modificada del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept; (c) aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de fosfato; (d) aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl; (e) 0 a aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa; y (f) aproximadamente 0.001% (p/v) a aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente pH 8.0.

Las composiciones de la invención también incluyen cualquiera de las composiciones descritas en este documento, que no contienen el surfactante.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 6 mg/mL, aflibercept a una concentración de aproximadamente 40 mg/mL, fosfato a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 40 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.03% (p/v), y la composición tiene un pH aproximadamente 6.2.

En otra modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 3 mg/mL, aflibercept a una concentración de aproximadamente 20 mg/mL, fosfato a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 40 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.03% (p/v), y la composición tiene un pH aproximadamente 6.2.

En modalidades particulares, una composición que comprende el Antagonista A y aflibercept es estable químicamente durante al menos cuatro semanas o al menos ocho semanas a 25°C o durante al menos doce semanas o al menos 24 semanas a 4°C. En modalidades particulares, al menos 70% de ambos antagonistas no muestran señales de descomposición o modificación que resultan en la formación de nuevas entidades químicas bajo estas condiciones.

Métodos para Preparar las Composiciones de la Invención Las composiciones de la invención, incluyendo aquellas descritas en este documento, pueden ser preparadas mediante un método que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de, combinar los antagonistas (por ejemplo uno o más aptámeros anti PDGF, y uno o más antagonistas de VEGF) y una cantidad efectiva de un amortiguador, por ejemplo, amortiguador de histidina, fosfato, acetato o Tris y opcionalmente ajustar el pH de la mezcla resultante de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.0 y las variaciones intermedias, como se describe en este documento.

En algunas modalidades, el método comprende además, consiste esencialmente de, o consiste de combinar el aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF y una cantidad efectiva de un agente de tonicidad. En un aspecto particular, el agente de tonicidad es cloruro de sodio o sorbitol.

En algunas modalidades, el método comprende además, consiste esencialmente de, o consiste de combinar el aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF y una cantidad efectiva de un surfactante. En aspectos particulares, el surfactante es un polysorbate, por ejemplo, Tween 20 o Tween 80.

En algunas modalidades, el método comprende además, consiste esencialmente de, o consiste de, combinar el aptámero anti PDGF y el antagonista del VEGF y una cantidad efectiva de un estabilizador, crioprotectores, o lioprotector. El estabilizador puede ser al menos uno de un azúcar, un aminoácido, un poliol, un surfactante, un antioxidante, un conservador, una ciclodextrina, un polietilenglicol, albúmina o una sal.

En aspectos particulares del método, las composiciones se preparan mezclando el aptámero anti PDGF y el antagonista de VEGF y varios excipientes presentes en las varias composiciones descritas en este documento y en el rango de concentraciones descrito aquí, incluyendo cada una de las composiciones especificas descritas anteriormente que comprenden el Antagonista A o una forma modificada del mismo en combinación ya sea con bevacizumab, ranibizumab o aflibercept.

Por lo tanto, en una modalidad, una composición de la invención se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 3 mg/mL, bevacizumab a una concentración final de aproximadamente 12.5 mg/mL, fosfato a una concentración final de aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 130 mM, y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.02% (p/v). En otra modalidad, una composición de la invención se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 6 mg/mL, bevacizumab a una concentración final de aproximadamente 25 mg/mL, fosfato a una concentración final de aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 130 mM, y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.02% (p/v). En ciertas modalidades, el pH de la composición se ajusta a aproximadamente 6.0.

En otra modalidad, una composición se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 3 mg/mL, ranibizumab a una concentración final de aproximadamente 5 mg/mL, histidina a una concentración final de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.02% (p/v). En otra modalidad, una composición se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 6 mg/mL, ranibizumab a una concentración final de aproximadamente 10 mg/mL, histidina a una concentración final de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.02% (p/v). En ciertas modalidades, el pH de la composición se ajusta a aproximadamente 6.0.

En otra modalidad, una composición se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 6 mg/mL, aflibercept a una concentración final de aproximadamente 40 mg/mL, fosfato a una concentración final de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 40 mM, sacarosa a una concentración final de aproximadamente 5% (p/v) y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.03% (p/v). En otra modalidad, una composición se prepara combinando lo siguiente: el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración final de aproximadamente 3 mg/mL, aflibercept a una concentración final de aproximadamente 20 mg/mL, fosfato a una concentración final de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración final de aproximadamente 40 mM, sacarosa a una concentración final de aproximadamente 5% (p/v) y polysorbate 20 a una concentración final de aproximadamente 0.03% (p/v). En ciertas modalidades, el pH de la composición se ajusta a aproximadamente 6.2.

En ciertas modalidades, las composiciones se mezclan en frascos de vidrio o jeringas o se almacenan después de la combinación en frascos de vidrio o jeringas.

Métodos Para Tratar o Prevenir Enfermedades Oftalmológicas Las composiciones de la invención son útiles para tratar o prevenir una variedad de enfermedades oftalmológicas. En algunas modalidades, la enfermedad oftalmológica es un trastorno neovascular. En otras modalidades, la enfermedad oftalmológica resulta en edema retinal. Las enfermedades oftalmológicas ilustrativas que pueden ser tratadas o prevenidas por la presente invención se describen en este documento.

En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad oftalmológica, que comprenden administrar a un mamífero en necesidad de la misma, una composición de la invención. En modalidades particulares, un aptámero anti PDGF presente en la composición es el Antagonista A o una forma modificada del mismo. En modalidades particulares, un antagonista de VEGF presente en la composición es ranibizumab, bevacizumab, o aflibercept. En modalidades particulares, los agentes terapéuticos presentes en las composiciones de la invención comprenden una cantidad efectiva de: (i) el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab; (ii) un Antagonista A o una forma modificada del mismo y bevacizumab; o (iii) el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo, ranibizumab, histidina, y cloruro de sodio. La composición puede comprender además polysorbate.

En una modalidad particular, la composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y ranibizumab a una proporción de la concentración del Antagonista A o una forma modificada del mismo a la concentración de bevacizumab menor a 2, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, histidina a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, y polysorbate (por ejemplo, polysorbate 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05% o 0.001% a aproximadamente 0.05%, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0.

En una modalidad, la composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 3 mg/mL, ranibizumab a una concentración de aproximadamente 5 mg/mL, histidina a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0. En una modalidad adicional, la composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 6 mg/mL, ranibizumab a una concentración de aproximadamente 10 mg/mL, histidina a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo, bevacizumab, cloruro de sodio, fosfato, y polysorbate. La composición puede comprender además polysorbate.

En una modalidad particular, la composición de la invención comprende el Antagonista A o de la forma modificada del mismo y bevacizumab a una proporción de la concentración del Antagonista A o de la forma modificada del mismo to la concentración de bevacizumab menor a 1, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, y polysorbate (por ejemplo, polysorbate 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0.

En una modalidad, la composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 3 mg/mL, bevacizumab a una concentración de aproximadamente 12.5 mg/mL, fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0. En otra modalidad, la composición comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 6 mg/mL, bevacizumab a una concentración de aproximadamente 25 mg/mL, fosfato a una concentración de aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM y polysorbate 20 a una concentración de aproximadamente 0.02% (p/v), en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6.0.

En una modalidad, una composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept, cloruro de sodio y fosfato. La composición puede comprender además polisorbato o sucrosa (o ambos).

En una modalidad particular, la composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo y aflibercept en una proporción de la concentración del Antagonista A a la concentración de aflibercept de menos de 1, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, fosfanto a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, sucrosa a una concentración de aproximadamente 0% (p/v) a aproximadamente 10% (p/v), y polisorbato (por ekjemplo, polisorbato 20) a una concentración de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.05%, en donde la composicón tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0.

En una modalidad, la composición de la invención comprende el Antagonista A o una forma modificada del mismo a una concentración de aproximadamente 6 mg/mL, aflibercept a una concentración de aproximadamente 40 mg/mL, fosfato a una concentración de aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 40 mM y polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.03% (p/v), en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 6.2.

Padecimientos Oftalmológicos En ciertas modalidades, el padecimiento oftalmológico es degeneración macular relacionada con la edad. Los ejemplos de degeneración macular relacionada con la edad son la degeneración macular nonneovascular (también conocida como "Seca") y neovascular (también conocida como "Húmeda). En una modalidad, la degeneración macular seca relacionada con la edad está asociada con la formación de drusas. En algunas modalidades, el tratamiento o prevención de la degeneración macular seca incluye tratar o prevenir una anormalidad del epitelio del pigmento de la retina. Los ejemplos de anormalidades del epitelio del pigmento de la retina incluyen atrofia geográfica, atrofia no geográfica, hipopigmentación focal, e hiperpigmentación focal. En algunas modalidades, el tratamiento o prevención de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad incluye tratar o prevenir neovascularización coroidea o desprendimiento epitelial de pigmento.

En otras modalidades, el padecimiento oftalmológico es vasculopatia coroidea polipoidea. La vasculopatia coroidea polipoidea se caracteriza por una lesión de una red vascular coroidea interna de vasos que termina en una protuberancia por aneurisma o proyección hacia el exterior (Ciardella et al (2004) Surv Ophthalmol 4925-37).

En ciertas modalidades, el padecimiento oftalmológico es una condición asociada con neovascularización coroidea. Los ejemplos de condiciones asociadas con neovascularización coroidea incluyen una condición degenerativa, inflamatoria, traumática o idiopática. En algunas modalidades, el tratamiento o prevención de un padecimiento degenerativo asociado con la neovascularización coroidea incluye tratar o prevenir un padecimiento heredodegenerativo. Los ejemplos de padecimientos heredodegenerativos incluyen distrofia macular viteliforme, fundus flavimaculatus y drusas de la papila del nervio óptico. Los ejemplos de condiciones degenerativas asociados con la neovascularización coroidea incluyen degeneración por miopía o rayas angioideas . En otras modalidades, el tratamiento o prevención de un padecimiento inflamatorio asociado con neovascularización coroidea abarca tratar o prevenir síndrome de histoplasmosis ocular, coroiditis multifocal, coroiditis serpimnousa, toxoplasmosis, toxocariasis, rubeola, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, síndrome de Behcet u oftalmía simpática. En todavía otras modalidades, el tratamiento o prevención de un padecimiento traumático asociado con neovascularización coroidea abarca tratar o prevenir ruptura coroidea o una condición traumática causada por fotocoagulación intensa.

En otras modalidades, el padecimiento oftalmológico es retinopatía hipertensiva o retinopatía por células falciformes.

En una modalidad, el padecimiento oftalmológico es retinopatía diabética. La retinopatía diabética puede ser retinopatía diabética proliferativa o no proliferativa. Los ejemplos de retinopatía diabética no proliferativa incluyen edema macular e isquemia macular.

En modalidades particulares, el padecimiento oftalmológico es una condición asociada con neovascularización periferia de la retina. Los ejemplos de condiciones asociadas con neovascularización periferia de la retina incluyen padecimiento vascular isquémico, padecimiento inflamatorio con posible isquemia, incontinencia pigmentaria, retinitis pigmentosa, retinosquisis o desprendimiento de la retina crónico. Los ejemplos de padecimiento vascular isquémico incluyen retinopatia diabética proliferativa, oclusión de la ramificación de las venas retinianas, oclusión de la ramificación de las arterias retinianas, fístula cavernosa carótida, hemoglobinopatía drepanocítica, hemoglobinopatía no drepanocítica, síndrome IRVAN (padecimiento por vasculitis retiniana caracterizado por vasculitis retiniana idiopática, un aneurisma, y neuro-retinitis), embolización retiniana, retinopatia de prematuridad, vítreo-retinopatía exudativa familiar, síndrome de hiperviscosidad, síndrome del arco aórtico o padecimiento de Eales. Los ejemplos de hemoglobinopatía drepanocítica incluyen hemoglobinopatía SS y hemoglobinopatía SC. Los ejemplos de hemoglobinopatía no drepanocítica incluyen hemoglobinopatía AC y hemoglobinopatía AS. Los ejemplos del síndrome de hiperviscosidad incluyen leucemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, policitemia o padecimiento mieloproliferativo.

En algunas modalidades, el tratamiento o prevención de un padecimiento inflamatorio con posible isquemia abarca tratar o prevenir la vasculitis retiniana asociada con padecimiento sistémico, vasculitis retiniana asociada con un agente infeccioso, uveítis o retinopatia por tiro de salva. Los ejemplos de padecimiento sistémico incluyen lupus sistémico eritematoso, granulomatosis de Wegener, y poliarteritis nodosa. Los ejemplos de agentes infecciosos incluyen un agente bacteriano que es el agente causante de sífilis, tuberculosis, enfermedad de Lyme o enfermedad por arañazo de gato, un virus tal como virus herpes, o un parasito tal como Toxocara canis o Toxoplasma gondii. Los ejemplos de uveítis incluyen pars planitis o síndrome de uveítis de Fuchs.

En ciertas modalidades, el padecimiento oftalmológico es retinopatía de prematuridad. La retinopatía de prematuridad puede ser consecuencia del crecimiento anormal de vasos sanguíneos en el lecho vascular que sostiene la retina en desarrollo (Pollan C (2009) Neonatal Netw.28:93-101).

En otras modalidades, el padecimiento oftalmológico es un padecimiento oclusivo venoso o padecimiento oclusivo arterial. Los ejemplos de padecimiento oclusivo venoso incluyen oclusión de la ramificación de las venas retinianas y oclusión central de las venas retinianas. Una oclusión de la ramificación de las venas retinianas puede ser un bloqueo de la porción de la circulación que drena la retina de la sangre. El bloqueo puede causar presión por acumulación en las capilaridades, que pueden llevar a hemorragias y también a derrame de fluido y otros constituyentes de la sangre. Los ejemplos de padecimiento oclusivo arterial incluyen oclusión de la ramificación de las arterias retinianas, oclusión central de las arterias retinianas o síndrome isquémico ocular. Una oclusión de la ramificación de las arterias retinianas (BRAO) puede ocurrir cuando una de las ramificaciones del suministro arterial a la retina se ocluye.

En modalidades particulares, el padecimiento oftalmológico es corio-retinopatía seroso central (CSC). En una modalidad, la CSC se caracteriza por derrame de fluido en la macula central.

En una modalidad, el padecimiento oftalmológico es edema macular cistoide (CME). En ciertas modalidades, el CME afecta la retina central o macula. En otra modalidad, el CME ocurre después de una cirugía de cataratas.

En otras modalidades, el padecimiento oftalmológico es telangiectasia retiniana. En una modalidad, la telangiectasia retiniana se caracteriza por la dilatación y tortuosidad de vasos retiñíanos y formación de múltiples aneurismas. El JXT idiopático, aneurismas miliares de Leber, y enfermedad de Coats son tres tipos de telangiectasias retinianas.

En una modalidad, el padecimiento oftalmológico es macroaneurisma arterial.

En una modalidad, el padecimiento oftalmológico es angiomatosis retiniana. En una modalidad, angiomatosis retiniano ocurre cuando los vasos oculares forman múltiples angiomas.

En una modalidad, el padecimiento oftalmológico es retinopatía inducida por radiación (RIRP). En una modalidad, la RIRP puede mostrar sintomas tales como edema macular y retinopatia proliferativa y no proliferativa.

En ciertas modalidades, el padecimiento oftalmológico es rubeosis del iris. En una modalidad, la rubeosis del iris da como resultado la formación de glaucoma neovascular. En otra modalidad, la rubeosis del iris es causada por retinopatia diabética, oclusión de las venas retinianas centrales, síndrome isquémico ocular, o desprendimiento retiniano crónico.

En ciertas modalidades, el padecimiento oftalmológico es neoplasma. Los ejemplos de neoplasmas incluyen un tumor del párpado, un tumor conjuntival, un tumor coroideo, un tumor del iris, un tumor del nervio óptico, un tumor de la retina, un tumor intraocular infiltrante o un tumor de la órbita. Los ejemplos de un tumor en el párpado incluyen carcinoma de células básales, carcinoma escamoso, carcinoma sebáceo, melanoma maligno, hemangioma capilar, hidrocistoma, queratosis nevosa o seborreica. Los ejemplos de un tumor conjuntival incluyen sarcoma conjuntival de Kaposi, carcinoma escamoso, neoplasia intraepitelial de la conjuntiva, epibulbar dermoide, linfoma de la conjuntiva, melanoma, pinguecula, o pterigio. Los ejemplos de un tumor coroideo incluyen nevo coroideo, hemangioma coroideo, tumor coroideo etastásico, osteoma coroideo, melanoma coroideo, melanoma del cuerpo ciliar o nevo de Ota. Los ejemplos de un tumor en el iris incluyen metástasis uveal anterior, quiste en el iris, melanocitoma del iris, melanoma del iris, o quiste perlado del iris. Los ejemplos de un tumor del nervio óptico incluyen melanocitoma del nervio óptico, meningioma de la envoltura del nervio óptico, melanoma coroideo que afecta el nervio óptico, o metástasis circumpapilar con neuropatía óptica. Los ejemplos de un tumor de la retina incluyen hipertrofia epitelial del pigmento retiniano (RPE), adenoma RPE, carcinoma RPE, retinoblastoma, hamartoma del RPE, o angioma de von Hippel. Los ejemplos de un tumor intraocular infiltrante incluyen leucemia linfocítica, coroidopatía infiltrante, o linfoma intraocular. Los ejemplos de un tumor orbital incluyen carcinoma cístico adenoideo de la glándula lagrimal, hemangioma cavernoso de la órbita, linfangioma de la órbita, mucocele, pseudotumor orbital, rabdomiosarcoma orbital, hemangioma periocular de la infancia, o pseudotumor orbital esclerosante.

Las composiciones de la invención se pueden administrar solas o en conjunción con otra terapia y se pueden proveer en casa, un consultorio médico, una clínica, un departamento de consulta externa, o un hospital. La duración de la administración puede depender del tipo de padecimiento oftalmológico que se trata o previene, la edad y condición del mamífero, la etapa y tipo de padecimiento del mamífero, y cómo responde el mamífero al tratamiento. En modalidades particulares, el mamífero es un humano. Adicionalmente, un mamífero que tiene un enorme riesgo de desarrollar un padecimiento oftalmológico (por ejemplo, un paciente diabético) puede recibir tratamiento para inhibir o retardar la aparición de síntomas. En una modalidad, los presentes métodos o composiciones permiten la administración de una dosis relativamente más baja de uno o más del(los) aptómero(s) anti-PDGF y antagonista(s) VEGF presentes en la composición, cuando se comparan con la dosis utilizada cuando el agente terapéutico se utiliza solo.

La administración de la composición de la invención puede ser mediante cualquier medio adecuado que dé como resultado una cantidad de aptómero anti-PDGF y antagonista VEGF que sea efectiva para el tratamiento o prevención de un padecimiento oftalmológico. En una modalidad, la composición se administra en una cantidad efectiva para tratar o prevenir un padecimiento oftalmológico.

La dosificación de composición administrada puede depender de varios factores que incluyen la severidad de la condición, la condición ya sea a tratar o prevenir, y la edad, peso, y estado de salud de la persona a tratar. Adicionalmente, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo en el perfil farmacocinético, farmacodinámico o perfil de eficacia de un agente terapéutico) acerca de un paciente particular puede afectar la dosificación utilizada. Además, las dosificaciones individuales exactas se pueden ajustar un poco dependiendo de la variedad de factores, incluyendo la combinación especifica de agentes terapéuticos presentes en la composición, el tiempo de administración, la via de administración, la naturaleza de la composición, el indice de excreción, el padecimiento oftalmológico particular a tratarse, la severidad del padecimiento, y la ubicación anatómica del padecimiento. La cantidad de cada antagonista que se combina con los materiales portadores para producir una dosificación individual puede depender del mamífero que se trata y el modo particular de administración.

Para la administración de composiciones mediante inyección parenteral, la dosificación de cada uno del aptómero anti-PDGF y antagonista VEGF típicamente es de 0.1 mg a 250 mg por día, 1 g a 20 mg por día, o de 3 mg a 5 mg por día. Las inyecciones pueden suministrarse hasta cuatro veces al día. Generalmente, cuando se administran parenteralmente, la dosificación de un aptómero anti-PDGF o antagonista VEGF para usarse en la presente invención típicamente es de 0.1 mg a 1500 mg por día, o 0.5 mg a 10 mg por día, o 0.5 mg a 5 mg por dia. Una dosificación de al menos hasta 3000 mg por día se puede administrar.

Cuando se administra oftalmológicamente a un humano, por ejemplo intravitrealmente, la dosificación de cada uno del aptómero anti-PDGF y antagonista VEGF presentes en la composición de la invención típicamente es de 0.003 mg a 5.0 mg por ojo según la administración, o de 0.03 mg a 3.0 mg por ojo según la administración, o 0.1 mg a 1.0 mg por ojo según la administración. En una modalidad, la dosificación de uno o más aptómero anti-PDGF en la composición es de 0.03 mg, 0.3 mg, 1.5 mg o 3.0 mg por ojo. En otra modalidad, la dosificación de antagonista VEGF en la composición es de aproximadamente 0.5 mg por ojo. La dosificación puede variar de 0.01 mL a 0.2 mL administrados por ojo, o de 0.03 mL a 0.15 mL administrados por ojo, o de 0.05 mL a 0.10 mL administrados por ojo. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el Antagonista A del aptómero anti-PDGF se suministra intravitrealmente en hasta 30 mg/ml con volúmenes de inyección de hasta 100 pL.

La administración de la composición de la invención puede ser una a cuatro veces al día o una o cuatro veces al mes o una a seis veces al año o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco años. La administración puede ser de duración de un día o un mes, dos meses, tres meses, seis meses, un año, dos años, tres años, y puede ser de por vida para el paciente. En una modalidad, la administración se realiza una vez al mes durante tres meses. La administración crónica a largo plazo será indicada en muchos casos. La dosificación puede administrarse como una dosis individual o dividirse en múltiples dosis. En general, la dosificación deseada deberá administrarse en intervalos establecidos durante un periodo prolongado, usualmente al menos durante varias semanas o meses, aunque pueden ser necesarios periodos más prolongados de administración de varios meses o años o más.

Además de tratar padecimientos oftalmológicos preexistentes, las composiciones se pueden administrar profilácticamente a fin de prevenir o retardar la aparición de estos padecimientos. En aplicaciones profilácticas, la composición se puede administrar a un mamífero susceptible a o de algún otro modo en riesgo de un padecimiento oftalmológico particular.

En una modalidad, las composiciones de la invención se administran a un mamífero en necesidad de tratamiento del mismo, típicamente en la forma de una composición farmacéutica inyectable. La administración puede ser mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intraocular, o utilizando un dispositivo de suministro de fármacos. La administración parenteral, sistémica, o transdérmica también está dentro del alcance de la invención.

Las composiciones pueden formularse para liberar el aptómero anti-PDGF o antagonista VEGF de manera sustancial inmediatamente después de la administración o a cualquier periodo de tiempo predeterminado después de su administración, utilizando composición de liberación controlada. Por ejemplo, una composición se puede proporcionar en forma de libración sostenida. El uso de composiciones de liberación inmediata o sostenida depende de la naturaleza de la condición a tratarse. Por ejemplo, si la condición consiste de una enfermedad aguda, el tratamiento con una forma de liberación inmediata en una composición de liberación prolongada. Para ciertos tratamientos preventivos o a largo plazo, también se puede utilizar una composición de liberación sostenida.

Se pueden seguir muchas estrategias para obtener una liberación controlada en la cual el indice de liberación supere el indice de degradación o metabolismo de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, la liberación controlada se puede obtener mediante la selección apropiada de parámetros e ingredientes de la composición, incluyendo, por ejemplo, composiciones y recubrimientos de liberación controlada apropiados. Los ejemplos incluyen soluciones en aceite, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanoparticulas, parches, y liposomas. Las formulaciones de depósito o de efecto prolongado también pueden utilizarse, por ejemplo, en la forma de macropartículas, implantes, o bolos sólidos que se formen in situ. Las formulaciones de depósito pueden comprender un excipiente de polímero biodegradable que controla el índice de liberación del fármaco y se reabsorben durante o después de la liberación del fármaco. Una clase de polímeros biodegradables es polímeros de lactido/glicólido. Estos polímeros reabsorbibles son biocompatibles y se cree que se reabsorben mediante hidrólisis, inicialmente en ácido láctico y ácido glicólico, y eventualmente en dióxido de carbón y agua.

Las composiciones de la invención también se pueden suministrar utilizando un dispositivo de suministro de fármacos tal como un implante. Tales implantes pueden ser biodegradables o biocompatibles, o pueden ser no biodegradables. Los implantes pueden ser permeables al aptómero anti-PDGF o antagonista VEGF o suministrar los agentes mediante bioerosión. Los dispositivos de suministro de fármacos oftálmicos se pueden insertar en una cámara del ojo, tal como la cámara anterior o posterior o se pueden implantar en o sobre la esclerótica, espacio coroideo, o una región avascularizada exterior al humor vitreo. En una modalidad, el implante se puede posicionar sobre una región avascular, tal como en la esclerótica, a fin de permitir una difusión transclerótica del aptómero anti-PDGF o antagonista VEGF al sitio deseado de tratamiento, por ejemplo, el espacio infraocular y macula del ojo. Además, el sitio de difusión transclerótica puede estar próxima a un sitio de neovascularización tal como un sitio próximo a la macula. Los dispositivos de suministro de fármacos adecuados se describen, por ejemplo, en la Publicación Norteamericana Nos.2008/0286334; 2008/0145406; 2007/0184089; 2006/0233860; 2005/0244500; 2005/0244471; y 2005/0244462, y las Patentes Norteamericanas Nos. 6,808,719 y 5,322,691, el contenido de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, el implante comprende una composición de la invención dispersada en una matriz de polímero biodegradable. La matriz puede comprender PLGA (copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico), un polímero con el extremo encapsulado con éster, un polímero con el extremo encapsulado con ácido o una mezcla de los mismos. En otra modalidad, el implante comprende una composición que comprende un aptómero anti-PDGF y un antagonista VEGF, un surfactante, y un compuesto lipófilo. El compuesto lipófilo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 80-99% en peso del implante. Los compuestos lipófilos adecuados incluyen, pero no están limitados a, palmitostearato de glicerilo, monostearato de dietilenglicol, monostearato de propilenglicol, monostearato de glicerilo, monolinoleato de glicerilo, monooleato de glicerilo, monopalmitato de glicerilo, monolaurato de glicerilo, dilaurato de glicerilo, monomiristato de glicerilo, dimiristato de glicerilo, monopalmitato de glicerilo, dipalmitato de glicerilo, monostearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, monooleato de glicerilo, dioleato de glicerilo, monolinoleato de glicerilo, dilinoleato de glicerilo, monoaraquidato de glicerilo, diaraquidato de glicerilo, monobehenato de glicerilo, dibehenato de glicerilo, y mezclas de los mismos.

En otra modalidad, el implante comprende una composición de la invención alojado dentro de un funda hueca. La composición comprende el aptómero anti-PDGF y antagonista VEGF se suministran en el ojo insertando la funda en el ojo, liberando el implante de la funda al ojo, y luego removiendo la funda del ojo. Un ejemplo de este dispositivo de suministro se describe en la Publicación Norteamericana No.2005/0244462, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad, el implante es un dispositivo de instalación ocular flexible adaptado para la liberación sostenida controlada de un aptómero anti-PDGF y un antagonista VEGF en el ojo. En una modalidad, el dispositivo incluye un cuerpo alargado de un material polimérico en la forma de una varilla o tubo que contiene una composición que comprende un aptómero anti-PDGF y un antagonista VEGF, y con al menos dos protrusiones de anclaje que se extienden radialmente hacia afuera del cuerpo. El dispositivo puede tener una longitud de al menos 8 mm y el diámetro de su porción del cuerpo que incluye las protrusiones no exceden 1.9 mm. El mecanismo de liberación sostenida, por ejemplo, puede ser mediante difusión o mediante osmosis o bioerosión. El dispositivo de instalación se puede insertar en la bóveda superior o inferior del ojo de manera que sea independiente al movimiento del ojo en virtud de la anatomía de la bóveda. Las protrusiones pueden ser de varias formas tales como, por ejemplo, ranuras, pasos de rosca, abolladuras, o salientes, segmentos truncados en forma de cono o segmentos de cordones bobinados. En una modalidad adicional, el material polimérico para el cuerpo se selecciona como uno que se hincha en un ambiente liquido. Por consiguiente se puede emplear un dispositivo de tamaño inicial más pequeño. El dispositivo de instalación puede ser de un tamaño y configuración de modo tal que, después de su inserción en la bóveda superior o inferior, el dispositivo permanece fuera del campo de visión a fin de mantenerla adecuadamente en su lugar e imperceptible para el receptor durante un periodo prolongado de uso. El dispositivo se puede mantener en la bóveda superior o inferior durante 7 a 14 dias o más. Un ejemplo de este dispositivo se describe en la Patente Norteamericana No. 5,322,691, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En ciertas modalidades, las composiciones de la invención también se pueden suministrar utilizando un dispositivo para el suministro de fármacos como un exoplante, por ejemplo, un oxplante episcleral, tal como el descrito en Pontes de Carvalho, R.A. et al., Invest Ophthamol Vis Sci . 2006, 47(1):4532-9, incorporada como referencia en su totalidad. Tales exoplantes pueden ser biodegradables o biocompatibles, o pueden ser no biodegradables.

En otras modalidades, las composiciones de la invención también se pueden suministrar utilizando un dispositivo de suministro de fármaco tal como un depósito intraocular recargable.

La dosificación generalmente depende de la severidad y grado de reacción de la condición a tratar, con un tratamiento que dura de varios dias a varios meses o hasta que se efectúa una cura o se logra una disminución del estado del padecimiento. Los esquemas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo o en un sitio localizado o en base a la respuesta del paciente. Las personas expertas pueden optimizar las dosificaciones, metodologías de dosificación, y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia de los agonistas anti-PDGF y antagonistas VEGF, y también pueden estimarse en base a las EC50s en estudios en animales in vitro e m v vo.

Ejemplos EJEMPLO 1 ESTABILIDAD DE COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN EL AGONISTA A Y RANIBIZUMAB La estabilidad de composición del Antagonista A y el ranibizumab, comercialmente disponible como Lucentis® de Genentech (S. San Francisco, CA), en varias composiciones, se examinó bajo un rango de condiciones. Varios pHs (5.0-8.0) y modificadores de tonicidad (cloruro de sodio, sorbitol, y trehalosa) se utilizaron para optimizar la estabilidad de composición a varias condiciones de almacenamiento (4°C, 25°C, y 37°C) y bajo un estrés físico (agitación). La estabilidad de composición del Antagonista A y ranibizumab se caracterizó por observación visual, medición del pH, y varios métodos de HPLC (intercambio aniónico [AEX-HPLC], intercambio catónico débil [WCX-HPLC], y exclusión por tamaño [SE-HPLC]).

A lo largo de las 16 semanas del estudio, se determinó que entre las composiciones examinadas una composición que comprende el Antagonista A, a 3 mg/mL y ranibizumab a 5 mg/mL en L-histidina 10 mM a pH 6.0, NaCl 130 mM, polisorbato 20 (F6) al 0.01% (p/v) fue el más estable y proporcionó la mayor protección contra la degradación del Antagonista A ranibizumab. En la presente se proporciona una descripción más detallada de los experimentos realizados.

Parámetros de Composición Los siguientes parámetros de composición se examinaron: (1) pH: 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 8.0 (2) Amortiguadores: Acetato, Fosfato, Histidina y 2-Amino-2-hidroximetil-propan-1,3-diol ("Tris") (3) Modificadores de Tonicidad: Cloruro de Sodio, Sorbitol, y Trehalosa (4) Surfactantes: Polisorbato 20 [0.01% y 0.005% (% p/v)] Se fijaron los siguientes parámetros: (1) El volumen de llenado fue de 300 mL en viales de 3 cc modificados provistos por Ophthotech Corp. (obtenidos de Mglas AG, Munnerstadt, Alemania) (2) La concentración de ranibizumab fue de 5 mg/mL (3) La concentración del Antagonista A se fijó a 3 mg/mL La Tabla 1 de abajo resume la matriz de composición utilizada en este estudio.

Tabla 1. Matriz de Composición "Ant. A" es Antagonista A; "ran." es ranibizumab Preparación de la Muestra A fin de obtener una concentración de 3 mg/mL del Antagonista A en la composición, una solución madre de Antagonista A se preparó a 6 mg/mL en fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, y pH 7.3. La solución madre resultante se mezcló 1:1 con una forma diluida de Lucentis® comercial (10 mg/mL), da como resultado concentraciones finales de 3 mg/mL de Antagonista A y 5 mg/mL de ranibizumab (Fll). La composición se colocó en cartuchos de diálisis de corte con peso molecular de 10 kDa y se dializó ~1,000,000 veces contra los diversos amortiguadores de composición en la Tabla 1 (Comp. Nos. F2-F3, F5-F10).

Estudios de Composición Las composiciones se analizaron bajo las siguientes condiciones (aunque ciertas composiciones no se analizaron en todos los puntos de tiempo debido a la degradación en puntos de tiempo previos): Tabla 2. Condiciones de Análisis Métodos Analíticos Para medir la concentración de cualquier producto de degradación generado bajo estrés en las diversas composiciones, se utilizaron los siguientes ensayos indicadores de estabilidad: (1) SE-HPLC (Análisis del Antagonista A y ranibizumab) • Fase Móvil: Amortiguador de fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7.0 • Columna: Tosoh TSKgel G3000SWXL 7.8 mm x 300 m, partículas de 5 mm • Temperatura de Columna: Ambiente • Velocidad de Flujo: 1.0 mL/min • Longitud de onda: Señal, 280 n ; Referencia, 360 nm · Volumen de inyección: 5 mL • Preparación de la Muestra: Sin dilución • Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje de área integrada de los principales picos identificados tanto para el Antagonista A y ranibizumab. (2) WCX-HPLC (Análisis del ranibizumab) • Fase Móvil A: Amortiguador de fosfato 10 mM, pH 7.0 • Fase Móvil B: Amortiguador de fosfato 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7.0 • Columna: Dionex ProPac WCX-10, 4 x 250 mm · Temperatura de Columna: Ambiente • Velocidad de Flujo: 1.0 mL/min • Longitud de onda: Señal, 214 nm; Referencia, 360 nm • Volumen de inyección: 5 pL • Preparación de la Muestra: Sin dilución · Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje de área integrada de los principales picos identificados tanto para el Antagonista A y ranibizumab. (3) AEX-HPLC (Análisis del Antagonista A) • Fase Móvil A: Amortiguador de fosfato 10 mM, pH 7.0 • Fase Móvil B: Amortiguador de fosfato 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7.0 • Columna: Dionex DNA Pac PA-100, 4 x 250 m • Temperatura de Columna: 40°C • Velocidad de Flujo: 1.2 mL/min • Longitud de onda: Señal, 258 nm; Referencia, 360 nm • Volumen de inyección: 5 mL • Preparación de la Muestra: Sin dilución • Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje de área integrada de los principales picos identificados tanto para el Antagonista A y ranibizumab. (4) pH • Sinfonía VWR SB70P (5) Observación Visual • Fotos tomadas de una Cámara Fotográfica Digital Sony Cyber-shot DSC-H9 (8.1 Megapíxeles) (6) Osmolaridad • Os ómetro Advanced Modelo 3D3 de Advanced Instruments, Inc.

Resumen de Estabilidad Se analizaron los efectos tanto de la agitación (4 horas) como las diversas temperaturas de almacenamiento (4°C, 25°C, y 37°C) en varias composiciones de Antagonista A y ranibizumab. A lo largo del estudio, todas las composiciones analizadas pudieron mantener sus valores de pH objetivo, es decir, pH inicial titulado, a través de todo el almacenamiento y condiciones de estrés.

Ensayos Indicadores de Estabilidad La composición F2 desarrolló una precipitación visible durante su almacenamiento a 37°C después de dos semanas (datos no mostrados). No se realizaron otros ensayos para la medición cuantitativa de la precipitación.

La degradación del Antagonista A durante el almacenamiento se analizó efectivamente mediante AEX-HPLC (Fig.1). La formación de pre-picos y post-picos se observó cuando las muestras se incubaron a temperatura elevada (Fig.1). En la composición F2, la pureza de AEX-HPLC del Antagonista A disminuyó a casi 20% durante el almacenamiento de 8 semanas a 37°C.

La WCX-HPLC también fue efectiva en la caracterización de la degradación del ranibizumab durante el almacenamiento (Fig.2). La formación de tanto los pre-picos como post-picos se observó cuando el ranibizumab se incubó a temperatura elevada (Fig.2).

El ensayo con SE-HPLC fue útil para caracterizar la agregación soluble o fragmentación del ranibizumab (Fig.3). El Antagonista A no mostró cambios significativos mediante SE-HPLC, aunque la resolución de su forma agregada puede ser más allá de la capacidad de la columna Tosoh TSKgel G3000SWXL. El ranibizumab se sometió agregación o fragmentación en la composición F3 y composición F5 durante el almacenamiento a 37°C (Fig.3).

Efecto de la Agitación en la Estabilidad Todas las composiciones listadas en la Tabla 1 se sometieron a 4 horas de agitación, con un conjunto de composiciones de control no agitadas se dejaron a temperatura ambiente. No se observaron diferencias entre las muestras de control y las muestras agitadas en cualquier método analítico (datos no mostrados).

Efecto de la Temperatura de Almacenamiento en la Estabilidad El almacenamiento a 37°C produjo niveles de degradación significativos aunque variables tanto del Antagonista A como del ranibizumab en las diversas composiciones investigadas. Por dos semanas, la composición F2 desarrolló precipitación (datos no mostrados). Todas las demás composiciones permanecieron claras dentro de las ocho semanas, y hasta 12 semanas en varias composiciones (Composiciones Fl, F4, F6, F8, y Fll).

Después de dos semanas a 37°C, la pureza del Antagonista A en la composición F2 ha disminuida a casi 20% en base a la AEX-HPLC. Las composiciones F3 y F5 también revelaron degradación incrementada del Antagonista A después de cuatro semanas bajo las mismas condiciones de almacenamiento (Fig. 4). A las ocho semanas, parece que la composición F8 ofreció mayor protección al Antagonista A que el F6 y F7. A las 12 semanas, la F8 continúo exhibiendo la mayor pureza del Antagonista A (Fig.4).

La composición F2 tampoco pudo prevenir la degradación del ranibizumab, puesto que la WCX-HPLC detectó casi 20% de pérdida de pureza a las 2 semanas (Fig.5). A la cuarta semana, muchas composiciones (F3, F5, F7, F8, F9, y FIO) exhibieron degradación significativa de ranibizumab en comparación con el F6 (Fig.5). La composición F6 mantuvo la mejor pureza del ranibizumab durante hasta 12 semanas (Fig.5).

En base a los resultados de las 2, 8, y 12 semanas a 4°C, que mostró un solo pico de la forma nativa del ranibizumab, todas las composiciones exhibieron perfiles de pureza similares del Antagonista A y ranibizumab durante hasta 4 semanas mediante SE-HPLC (Fig. 14 y Fig.15). No se observó un cambio significativo del Antagonista A en todas las condiciones de almacenamiento, incluyendo el almacenamiento de 12 semanas a 37°C (Fig.6). Sin embargo, el ranibizumab se sometió a agregación durante el almacenamiento a 25°C y 37°C. No se observó agregación significativa con una forma diluida de Lucentis® comercial (F4) bajo la misma condición de almacenamiento (Fig.7).

Todas las composiciones mostraron mejor estabilidad visual durante el almacenamiento a 25°C que a 37°C. Durante 8 semanas, todas las composiciones permanecieron claras. Dos composiciones (F6 y F8) permanecieron claras en el punto de tiempo adicional de 12 semanas.

Durante las primeras cuatro semanas a 25°C, todas las composiciones mantuvieron una pureza comparable del Antagonista A cuando se caracterizó mediante AEX-HPLC (Fig.8). La composición F2 experimentó un incremento significativo en la degradación del Antagonista A, a las 8 semanas (Fig. 8) . También, las composiciones F3 y F5 exhibieron disminuciones considerables en la pureza durante el mismo margen de tiempo (Fig. 8). Las composiciones F6, F7, y F8 pudieron mantener la pureza del Antagonista A por hasta 12 semanas (Fig.8).

El análisis con WCX-HPLC de ranibizumab exhibió cambios sutiles pero distintivos en perfiles de pureza entre las composiciones. Después de dos semanas de almacenamiento a 25°C, la composición F2 desarrolló una considerable degradación del ranibizumab (Fig.9). Las composiciones restantes mantuvieron una pureza comparable de ranibizumab hasta ocho semanas, cuando las composición con pH 8.0 (F9 y FIO) revelaron una disminución considerable en la pureza del ranibizumab (Fig. 9). La composición F6 fue capaz de prevenir la degradación del ranibizumab a 25°C como se determinó por el análisis con WCX-HPLC (Fig.9).

A excepción de su inherente variabilidad, el ensayo con SE-HPLC no mostró un cambio significativo del perfil del Antagonista A durante el almacenamiento a 25°C (Fig.10). En general, todas las composiciones parecieron prevenir la agregación o fragmentación del Antagonista A durante ocho semanas, y durante doce semanas en las composiciones F6 y F8 (Fig. 10). Las composiciones F8 y F6 mantuvieron una buena pureza del ranibizumab durante doce semanas a 25°C (Fig.11).

El Antagonista A y el ranibizumab permanecieron estables en la mayoría de las composiciones a 4°C. Todas las composiciones permanecieron claras mediante inspección visual. Además, la mayoría de las composiciones mantuvieron una pureza comparable respecto al material de partida mediante todos los métodos de HPLC (Fig. 12-15), excepto la F2, F3, y F5, que produjeron cantidades sustanciales de agregados solubles de ranibizumab (Fig.15).

Efecto de las Características de Composición/Componentes en la Estabilidad Para determinar el efecto en el que el pH y diferentes componentes de composición tienen en la estabilidad del Antagonista A y ranibizumab, el Antagonista A y ranibizumab se co-formularon a varios niveles de pH (5.0 - 8.0) y con diferentes modificadores de tonicidad (cloruro de sodio y sorbitol). Esta sección describe los efectos del pH y componentes de composición en la estabilidad de uno o ambos del Antagonista A y ranibizumab cuando se almacenaron a varias temperaturas.

Efecto del pH en la Estabilidad El efecto del pH en la estabilidad del Antagonista A y ranibizumab fue mejor diferenciado mediante almacenamiento a 37°C en composiciones que contienen tanto sorbitol como NaCl (Fig. 16). En base a la AEX-HPLC, la degradación del Antagonista A se correlacionó inversamente con el pH, con la mayor degradación a pH 5.0 (Fig.16). Los cambios en el pH causaron cambios menos significativos al perfil de pureza del ranibizumab en composiciones que contenían sorbitol. En base a la WCX-HPLC, formulando a pH 5.0 produjo una degradación más rápida de ranibizumab después de cuatro semanas a 37°C, aunque produjo degradación similar a las composiciones de pH 6.0 después de ocho semanas a 37°C (Fig.17). El ranibizumab se degradó menos a pH de 6.0 entre las composiciones que contienen NaCl, aunque a pH de 7.0 fue la mejor entre las composiciones que contenían sorbitol. Utilizando SE-HPLC para la evaluación tanto del Antagonista A (Fig. 18) como del ranibizumab (Fig. 19), la velocidad de agregación del ranibizumab fue más lenta en las composiciones a pH 7.0, aunque no se observaron cambios en la degradación del Antagonista A.

Efecto del Modificador de Tonicidad en la Estabilidad El efecto de los modificadores de tonicidad en la estabilidad del Antagonista A y ranibizumab se diferenció comparando los resultados del almacenamiento a 37°C. Como se caracterizó mediante AEX-HPLC, el Antagonista A permaneció más estable en composiciones de NaCl que en composiciones de sorbitol a pH 5.0 - 7.0 durante 8 semanas (Fig.20). A pH de 8.0, no pudo hacerse una diferencia discernible entre las composiciones que contenían cloruro de sodio o sorbitol durante 4 semanas (Fig. 21). Para las composiciones de ranibizumab, como se caracteriza por WCX-HPLC, composiciones de cloruro de sodio excedieron a las composiciones de sorbitol a través del rango de pH analizado (pH 5.0 - 8.0) (Fig.22). El desempeño superior de las composiciones de cloruro de sodio para estabilizar el ranibizumab también se reveló mediante SE-HPLC (Fig.23). Para composiciones con ambos modificadores de tonicidad, el nivel de agregación soluble fue más bajo a pH de 7.0 y más alto a pH 5.0 (Fig.23).

Estabilidad de la Mezcla 1:1 del Antagonista A y Lucentis® Otro aspecto del estudio involucró caracterizar el efecto de mezclas el Antagonista A y Lucentis® comercial. Para lograr esto, el Antagonista A se diluyó a 6 mg/mL de su concentración original de 30 mg/mL en una composición de fosfato de sodio 10 mM y NaCl 150 mM, pH 7.3, seguido por la combinación de la composición resultante con un volumen igual (1:1) de Lucentis® comercial (10 mg/mL). La estabilidad de la mezcla 1:1 (Fll) se examinó mediante el almacenamiento a 37°C, y se comparó con F1 y F4 solos a concentraciones similares y temperaturas de almacenamiento.

Para el Antagonista A, el análisis con SE-HPLC indicó que la estabilidad del Antagonista A en la mezcla 1:1, Fll, es comparable con F1 solo durante doce semanas a 37°C (Fig.24). Aunque parece mediante AEX-HPLC que el Antagonista A experimentó degradación más rápida en la mezcla 1:1 en puntos de tiempo previos durante el almacenamiento a 37°C, tanto F1 como la mezcla 1:1 (Fll) mostró una pureza comparable a las 12 semanas (Fig. 25). No se observó diferencia en el perfil de pureza con AEX-HPLC cuando las muestras se almacenaron a 25°C (Fig.25).

El ranibizumab encontró más problemas de estabilidad en la mezcla 1:1 que el Antagonista A, a condiciones de almacenamiento similares. El ranibizumab en Fll mantuvo un perfil WCX-HPLC comparable respecto al ranibizumab en F4 hasta 4 semanas de almacenamiento a 37°C, después de lo cual el ranibizumab padeció una degradación más rápida en la mezcla (Fll) (Fig. 26). El ranibizumab, sin embargo, permaneció bastante estable en la mezcla cuando las muestras se almacenaron a 25°C (Fig.26). No se observó una diferencia significativa en el perfil de pureza con WCX-HPLC del ranibizumab entre la mezcla y F4 a 25°C. La SE-HPLC reveló un incremento notable en el ranibizumab agregado en la mezcla 1:1 después de 8 semanas de almacenamiento a 37°C en comparación con F4 (Fig.27a). La agregación en la mezcla fue sustancialmente más baja cuando se almacenó a 25°C, y no se observó a 4°C (Fig.27b-c).

Estabilidad de la Composición F6 El análisis con AEX-HPLC del Antagonista A indicó que la composición F6 mantuvo la pureza del Antagonista A hasta doce semanas a 25°C, y hasta al menos dieciséis semanas (el último punto de tiempo analizado) a 4°C (Fig. 28). A 37°C, la degradación del Antagonista A se observó ya en las dos semanas (Fig. 28). La formulación con F6 ayudó a proteger al ranibizumab de la degradación a 37°C durante hasta cuatro semanas antes de una disminución significativa en la pureza mediante WCX-HPLC desarrollada a las ocho semanas (Fig. 29). Sin embargo, el ranibizumab estuvo estable en la composición F6 durante hasta al menos doce semanas a 25°C, y durante hasta al menos dieciséis semanas a 4°C, sin ninguna pérdida sustancial en la pureza mediante WCX-HPLC (Fig.29).

Los resultados de SE-HPLC indicaron que el Antagonista A permaneció estable durante dieciséis semanas en todas las condiciones de almacenamiento (Fig.30). En el ranibizumab, no se observó una agregación significativa cuando se incubó durante doce semanas a 37°C en la composición F6 (Fig. 31). La composición F6 se desempeñó mejor cuando se almacenó ya sea a 4°C o 25°C, con pureza comparable durante ocho semanas a ambas temperaturas. La agregación de ranibizumab a 25°C y 37°C fue más rápida en la composición F6 que en F4.

A partir de estos estudios de determinación, la composición F6, en promedio, demostró la mejor estabilidad en todas las temperaturas de almacenamiento y métodos de análisis empleados para este estudio.

EJEMPLO 2 ESTABILIDAD DE LAS COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN EL ANTAGONISTA A Y BEVACIZUMAB La estabilidad del Antagonista A en una composición que también incluye el anticuerpo monoclonal (mAb) bevacizumab anti-VEGF, comercialmente disponible como Avastin© de Genentech (S. San Francisco, CA), se examinó bajo un rango de condiciones. Varios pHs (4.0-8.0) y modificadores de tonicidad (cloruro de sodio, sorbitol, y trehalosa) se utilizaron para optimizar la estabilidad de composición del Antagonista A y bevacizumab cuando se almacenaron a varias temperaturas (4°C, 25°C, y 37°C) y contra un estrés físico (agitación). La estabilidad del Antagonista A y bevacizumab se caracterizó por observación visual, medición del pH, y varios métodos de HPLC (intercambio aniónico [AEX-HPLC], intercambio catiónico débil [WCX-HPLC], y exclusión por tamaño [SE-HPLC]).

El Antagonista A fue compatible con el bevacizumab sin problema de estabilidad discernible cuando ambos se combinaron conjuntamente en ciertas de las composiciones analizadas. En base a los resultados de un estudio de estabilidad de 24 semanas, la mejor estabilidad se observó con la Composición F19. En la composición F19, tanto el Antagonista A como el bevacizumab permanecieron estables a lo largo de 24 semanas a 4°C, y durante hasta al menos 4 semanas a 25°C.

Parámetros de Composición Los siguientes parámetros de composición se examinaron: (1) pH: 4.0, 5.0, 6.0, 6.2, 6.3, 7.0, 7.3, 8.0 (2) Amortiguadores: Acetato, Fosfato, y Tris (3) Modificadores de Tonicidad: Cloruro de Sodio, Sorbitol, y Trehalosa (4) Surfactantes: Polisorbato 20 (5) Concentración del Antagonista A: 30 mg/mL, 15 mg/mL, y 3 mg/mL Se fijaron los siguientes parámetros: (1) El volumen de llenado fue de 300 mL en viales de 3 cc modificados provistos por Ophthotech Corp. (obtenidos de Mglas AG, Munnerstadt, Alemania) (2) La concentración de bevacizumab fue de 12.5 mg/mL.

La Tabla 3 de abajo resume la matriz de composición utilizada en este estudio.

Tabla 3. Matriz de Composición para Composiciones de Antagonista A:Bevacizumab Preparación de Muestras Se preparó una solución madre del Antagonista A, a 6 mg/mL en fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, y pH 7.3. La solución madre resultante se mezcló 1:1 con Avastin® comercial (25 mg/mL), da como resultado concentraciones finales de 3 mg/mL del Antagonista A y 12.5 mg/mL de bevacizumab (Composición F26). La composición se colocó en cartuchos de diálisis de corte con peso molecular de 10 kDa y se dializó ~1,000,000 veces contra los diversos amortiguadores de composición en la Tabla 3 (Comp. Nos. F13-F17, F19-F23). Las excepciones incluyen lo siguiente: •La Composición F12 no necesita dilución adicional o diálisis.

•El Avastin® comercial se diluyó 1:1 con amortiguador de fosfato 50 mM (pH 6.2) que contiene Trehalosa al 6% (p/v) y polisorbato al 0.02% (p/v) para proporcionar la Composición F18.

•La Composición F24 se hizo mezclando 1:1 de la composición F12 con Avastin® comercial.

•La Composición F25 se creó con la dilución 10X de la Composición F12 con amortiguador de fosfato 10 mM (pH 7.3) que contiene NaCl 150 mM.

Estudios de Estres Las composiciones de la Tabla 3 se analizaron bajo las siguientes condiciones de estrés: Tabla 4. Condiciones de Estrés Métodos Analíticos A fin de analizar los productos de degradación generados bajo estrés, se desarrollaron los siguientes ensayos de indicación de estabilidad y se utilizaron en este estudio. (1) SE-HPLC (Análisis del Antagonista A y bevacizumab) •Fase Móvil: Amortiguador de fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7.0 • Columna: Tosoh TSKgel G3000SWXL • Temperatura de Columna: Ambiente • Velocidad de Flujo: 1.0 L/min • Longitud de onda: Señal, 214 nm; Referencia, 360 nm • Volumen de inyección: 1 mL • Preparación de la Muestra: - Dilución 10X en agua Milli-Q para muestras de aptómeros de 30 mg/mL - Sin dilución para otras muestras • Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje del área integrada de los principales picos identificados tanto para el Antagonista A como para bevacizumab. (2) WCX-HPLC (Análisis del bevacizumab) • Fase Móvil A: Amortiguador de fosfato 10 mM, pH 7.0 • Fase Móvil B: Amortiguador de fosfato 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7.0 • Columna: Dionex ProPac WCX-10, 4 x 250 mm • Temperatura de Columna: Ambiente • Velocidad de Flujo: 1.0 mL/min • Longitud de onda: Señal, 214 nm; Referencia, 360 nm • Volumen de inyección: 10 mL • Preparación de Muestras: Dilución 10X en agua Milli-Q • Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje del área integrada de los principales picos identificados tanto de bevacizumab. (3) AEX-HPLC (Análisis del Antagonista A) • Fase Móvil A: Amortiguador de fosfato 10 mM, pH 7.0 • Fase Móvil B: Amortiguador de fosfato 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7.0 • Columna: Dionex DNA Pac PA-100, 4 x 250 mm • Temperatura de Columna: 40°C • Velocidad de Flujo: 1.2 mL/min • Longitud de onda: Señal, 258 nm; Referencia, 360 nm • Volumen de inyección: 5 pL • Preparación de Muestra: • Dilución 10X en agua Milli-Q para muestras de aptómeros de 3.0 mg/mL • Dilución de 50X en agua Milli-Q para muestras de aptómerQS de 15 mg/mL • Dilución de 10X en agua Milli-Q para muestras de aptómeros de 3.0 mg/mL • Dilución de 100X en agua Milli-Q para muestras de aptómeros de 30 mg/mL • Porcentaje de pureza reportado en base al porcentaje del área integrada de los principales picos identificados para el Antagonista A. (4) pH • Sinfonía VWR SB70P (5) Observación Visual • Fotos tomadas de una Cámara Fotográfica Digital Sony Cyber-shot DSC-H9 (8.1 Megapixeles) (6) Osmolaridad (en el punto de tiempo cero) • Osmómetro Advanced Modelo 3D3 de Advanced Instruments, Inc.

Resumen de Estabilidad Esta sección describe el efecto tanto de la agitación (4 horas) como el almacenamiento a diversas temperaturas de (4°C, 25°C, y 37°C) en el Antagonista A y bevacizumab. A lo largo del estudio, cada composición fue capaz de mantener los valores de pH objetivo, a través de todos los estreses físicos.

Ensayos Indicadores de Estabilidad Mediante observación visual, se observó que las composiciones F15, F16, y F24 desarrollaron precipitación durante 2 semanas de almacenamiento a 37°C (datos no mostrados). Debido a los volúmenes limitados disponibles para el estudio, no se realizó otro ensayo para la medición cuantitativa de la precipitación.

La estabilidad del Antagonista A durante el almacenamiento se analizó efectivamente mediante AEX-HPLC. La formación tanto de pre-picos como de post-picos se observó cuando el Antagonista A en ciertas composiciones se incubó a temperatura elevada de 37°C. Por ejemplo, en la composición F14, la pureza del Antagonista A por AEX-HPLC ha disminuido a casi 50% durante el almacenamiento durante 2 semanas a 37°C (Fig.32).

La WCX-HPLC también fue efectiva en la caracterización de la estabilidad del bevacizumab. La formación de tanto los pre-picos como post-picos se observó cuando el bevacizumab en ciertas composiciones se incubó a temperatura de 25°C. Por ejemplo, en la Composición F22, la pureza del bevacizumab disminuyó casi al 30% durante 8 semanas de almacenamiento a 25°C (Fig.33).

La SE-HPLC probó ser útil para caracterizar la agregación soluble o fragmentación del bevacizumab. El Antagonista A no mostró cambios significativos mediante SE-HPLC, aunque la resolución de su forma agregada puede ir más allá de la capacidad de la columna Tosoh TSKgel G3000SWXL debido a la sensibilidad del ensayo a la estabilidad. La degradación del bevacizumab se observó en la composición F15 después de 8 semanas de almacenamiento a 37°C (Fig.34).

Efecto de la Agitación en la Estabilidad El efecto de la agitación en uno o ambos del Antagonista A y bevacizumab se evaluó. Las composiciones listadas en la Tabla 3 se agitaron durante 4 horas con un agitador interno, mientras que un conjunto de composiciones de control se dejó sin agitar a temperatura ambiente. No se observaron diferencias en la observación visual, pH, AEX-HPLC, y WCX-HPLC entre las muestras agitadas y controles (datos no mostrados). Sin embargo, la SE-HPLC, que evalúa la agregación o fragmentación tanto de Antagonista A como de bevacizumab, mostró ligeras variaciones entre las muestras agitadas y de control en las muestras F23 y F24 (Tabla 5 y Tabla 6). Después de 4 horas de agitación, los agregados más solubles (pre-pico del Antagonista A y pre-pico de bevacizumab) formados en las muestras F23 y la mezcla 1:1 directa de 30 mg/mL de Antagonista A y 25 mg/mL de Avastin® (F24). Esto sugiere que la formulación a pH 8.0 con cloruro de sodio, o que tiene una concentración de Antagonista A co-formulada con bevacizumab, lleva a un Antagonista A o bevacizumab que forma agregados solubles o fragmentos durante la tensión de corte. Las otras composiciones parecen mantener la integridad del Antagonista A y bevacizumab como se determina por SE-HPLC. Estos resultados sugieren que excepto bajo las condiciones observadas anteriormente, no se dijo degradación aparente del Antagonista A o bevacizumab co-formulados por agitación.

Tabla 5. Resultados de SE-HPLC para las muestras antes de la agitación "Ant. A" es Antagonista A; "bev." es bevacizumab; "NA" significa no aplica.

Tabla 6. Resultados de SE-HPLC para las muestras después de 4 horas de agitación "Ant. A" es Antagonista A; "bev." es bevacizumab; "NA" significa no aplica Efecto de la Temperatura del Almacenamiento en la Estabilidad Durante el estudio de 24 semanas, las composiciones listadas en la Tabla 3 se colocaron en cámaras de estabilidad a 4°C, 25°C, y 37°C para estudiar los efectos de la temperatura en la estabilidad de uno o ambos del Antagonista A y bevacizumab. Tanto el Antagonista A como el bevacizumab exhibieron mayor degradación con una temperatura de almacenamiento en aumento, en base a los ensayos cromatográficos.

El almacenamiento a 37°C indujo niveles significativamente elevados de degradación del Antagonista A y bevacizumab. A las 2 semanas, la precipitación del Antagonista A o bevacizumab se observó en F15, F16, y F24 (datos no mostrados). A las 4 semanas, F14 también comenzó a mostrar agregación insoluble del Antagonista A o bevacizumab (datos no mostrados). Todas las otras composiciones permanecieron claras a lo largo de las 12 semanas.

AEX-HPLC reveló una degradación significativa del Antagonista A en las muestras de composición a pH 4.0 y 5.0 (F13, F14, F15, y F16), mientras que las muestras co-formuladas en F17 exhibieron mejor estabilidad (Fig.35). El Antagonista A mantuvo una pureza comparable a pH 6.0 - 7.0 a dentro de las 12 semanas de almacenamiento a 37°C, con la excepción de F20 y F26, donde se observaron disminuciones en la pureza del Antagonista A, a las 12 semanas (Fig.36).

Después de 2 semanas de almacenamiento a 37°C, WCX-HPLC reveló disminuciones significativas en la pureza del bevacizumab en la composición a pH 4.0 (F13 y F14), que exhibió un bevacizumab restante bajo hasta no intacto (Fig.37). Se observó degradación acelerada dentro de las 12 semanas de almacenamiento a 37°C en todas las otras composiciones excepto la F19, que revelaron consistentemente una degradación más lenta que la otra composición (Fig.38).

SE-HPLC reveló la formación de agregados solubles en las muestras estresadas. En el Antagonista A, 2 semanas de almacenamiento a 37°C hizo que la composición a pH 4.0-5.0 formara rápidamente agregados solubles (Fig.39). El Antagonista A formulado en F17 también mostró agregación soluble aunque a una velocidad más lenta (Fig.39). A la cuarta semana, la mayoría de las composiciones del Antagonista A exhibieron una pureza más baja del Antagonista A, con la excepción de la F19 y las dos mezclas 1:1 (F24 y F26), que fueron capaces de mantener una pureza elevada del Antagonista A (Fig. 40). Esta tendencia se mantuvo hasta la Semana 12, cuando F26 reveló una pureza ligeramente reducida del Antagonista A, dejando la F19 como la composición preferida para el Antagonista A con respecto a la estabilidad. Para el bevacizumab, la formulación fuera del pH 6.0 provocó una disminución significativa en la pureza del mAb (Fig. 41). Esta tendencia continuó a lo largo de las 12 semanas de almacenamiento a 37°C, dejando a la F19 como la composición que provee al bevacizumab la mayor estabilidad (Fig.42).

Algunas composiciones proporcionaron mejor estabilidad durante el almacenamiento a 25°C. Todas las composiciones permanecieron claras después de 24 semanas a 25°C excepto la F14, en la cual se observó precipitación a las 8 semanas (datos no mostrados).

En base a la AEX-HPLC, formulando el Antagonista A, a un pH de 4.0 (F13 y F14) se provocó la degradación del aptómero después de solo 2 semanas de almacenamiento (Fig. 43). F15 reveló degradación a las 4 semanas de almacenamiento a 25°C; sin embargo, F16 exhibió estabilidad mejorada hasta las 8 semanas (Fig. 43). La formulación del Antagonista A, a pH de 6.0 - 8.0 mantuvo estabilidad comparable dentro de las 8 semanas de almacenamiento a 25°C, y hasta al menos 24 semanas de almacenamiento a 4°C con las composiciones F19, F20, F21, y F23 (Fig. 44).

La WCX-HPLC indicó que el pH tenia el efecto opuesto en la estabilidad del bevacizumab en comparación con el Antagonista A. Después de 2 semanas a 25°C, las muestras a pH 8.0 revelaron degradación sustancial del bevacizumab (Fig.45 y Fig.46). A las 4 semanas a 25°C, las composiciones de pH 4.0 y pH 7.0 comenzaron a exhibir signos de degradación del bevacizumab (Fig.45 y Fig. 46). Las composiciones a pH 5.0-6.0 proporcionaron estabilidad comparable del bevacizumab hasta 12 semanas a 25°C, tiempo en el cual todos los principales candidatos exhibieron signos de degradación acelerada. Sin embargo, la composición F19, a pH 6.0, no experimentó degradación acelerada adicional del bevacizumab de 12 a 24 semanas de almacenamiento a 25°C (Fig.45 y Fig.46).

Las tendencias de degradación similares vistas se observaron mediante SE-HPLC. El Antagonista A formulado a pH 4.0 fue incapaz de mantener la pureza del Antagonista A cuando se almacenó a 25°C (Fig.47) . A las 8 semanas, el Antagonista A formulado a pH 5.0 experimentó agregación o fragmentación significativa (Fig.47).

La formulación del Antagonista A en el rango de pH de 6.0 - 8.0 provisto para la pureza comparable dentro de hasta al menos 24 semanas de almacenamiento a 25°C (Fig. 21). La pureza del bevacizumab depende del pH de la composición y la concentración del Antagonista A en la composición. Después de 4 semanas de almacenamiento a 25°C, la formulación a pH 4.0 y pH 8.0 causó una disminución acelerada en la pureza del bevacizumab (Fig. 49 y Fig. 50). Bajo el mismo tiempo y condiciones de almacenamiento, el Antagonista A co-formulado a 15 mg/mL parece afectar adversamente la pureza del bevacizumab (Fig. 49) . Las composiciones a pH 5.0 - 7.0 proporcionó mejor estabilidad a 25°C durante 8 semanas (Fig. 49 y Fig. 50). Además los puntos de tiempo revelaron que las composiciones principales (pH 6.0 y 7.0) fueron capaces de mantener una pureza comparable (Fig.50).

El almacenamiento a 4°C proporcionó la mejor estabilidad a la mayoría de composiciones durante este estudio. Una observación visual no reveló agregación insoluble durante el almacenamiento a 4°C durante hasta al menos 24 semanas en las composiciones F19, F20, F21, y F23.

Para el Antagonista A, todas las composiciones mantuvieron una pureza comparable mediante AEX-HPLC después de ocho semanas de almacenamiento, y dentro de 24 semanas a 4°C con las composiciones F19, F20, F21, y F23 (Fig.51). Sin embargo, como se observa mediante la WCX-HPLC, la formulación del bevacizumab a pH 8.0 causó un incremento considerable en la degradación después de ocho semanas a 4°C, una tendencia que continuó dentro de 24 semanas (Fig.52).

SE-HPLC reveló algo de fragmentación del Antagonista A o la agregación del bevacizumab en unas cuantas composiciones. En el Antagonista A, la mayoría de las composiciones mantuvo su pureza hasta 8 semanas a 4°C, mientras que las composiciones a pH 4.0 -5.0 revelaron pérdidas significativas de pureza (Fig. 53). Las composiciones F19, F20, F21 y F23 mantuvieron una pureza comparable del Antagonista A hasta 12 semanas de almacenamiento a 4°C; sin embargo, después de 12 y 24 semanas, la pureza del Antagonista A en F23 disminuyó sustancialmente, aunque la de las otras tres composiciones seleccionadas permaneció similarmente elevada (Fig.54). La formulación a pH 8.0 causó la formación de agregados solubles de bevacizumab durante la diálisis inicial; sin embargo, el almacenamiento a 4°C mantuvo la pureza del bevacizumab dentro de al menos ocho semanas, similar a las otras composiciones (Fig. 55). La única excepción fue la composición F24, donde la concentración del Antagonista A, a 15 mg/mL afectó la pureza del bevacizumab durante las ocho semanas de almacenamiento (Fig.55).

Efecto de las Características de Composición/Componentes en la Estabilidad El Antagonista A y el bevacizumab se co-formularon a pH variable y con diferentes modificadores de tonicidad a fin de determinar los efectos de estos factores en la estabilidad. Esta sección describe los efectos de la composición en la estabilidad de uno o ambos del Antagonista A y bevacizumab.

Efecto del pH en la Estabilidad Los efectos del pH en la estabilidad del Antagonista A y bevacizumab se diferenciaron mediante almacenamiento a 37°C. Como se observó mediante AEX-HPLC, el Antagonista A estuvo estable a 37°C en las composiciones F20 y F22 que contienen sorbitol a pH 7.0 y pH 8.0 en contraste con las composiciones F13, F15, y F17 que contienen sorbitol a pH 4.0-6.0, donde ocurrió degradación acelerada (Fig. 56). Para el bevacizumab, como se observa mediante WCX-HPLC, las composiciones que contienen sorbitol fuera del pH de 5.0 - 6.0 (F13, F20, y F22 exhibieron degradación acelerada de bevacizumab a 37°C (Fig. 57). Similar a los resultados de la AEX-HPLC, la SE-HPLC reveló que el Antagonista A en las composiciones F13 y F15 que contienen sorbitol (pH 4.0 -5.0) experimentaron fragmentación o agregación a 37°C (Fig.58). Sin embargo, a pesar de la degradación vista por WCX-HPLC para las composiciones que contienen sorbitol fuera del rango de pH 5.0 - 6.0, la SE-HPLC reveló que bevacizumab experimentó una agregación más lenta o fragmentación en composiciones que contienen sorbitol a pH 5.0 - 8.0 cuando se almacenaron a 37°C (Fig.59) . La SE-HPLC de la composición F13 que contiene sorbitol a pH 4.0 almacenada a 37°C reveló la degradación sustancial del bevacizumab. La formulación a pH 6.0 (F17) pareció mantener la pureza del bevacizumab mejor que los oros niveles de pH examinados de las composiciones que contienen sorbitol (Fig.58 y Fig. 59).

Efecto del Modificador de Tonicidad en Estabilidad El efecto de los modificadores de tonicidad en la estabilidad del Antagonista A y bevacizumab se diferenció por almacenamiento a 37°C. Los beneficios de ya sea el sorbitol o cloruro de sodio dependieron del pH de la composición.

A pH 5.0 y 6.0, el Antagonista A experimentó degradación en composiciones de sorbitol (F15 y F17) en todo el estudio de ocho semanas como se observa mediante AEX-HPLC (Fig.60). Sin embargo, las composiciones a estos niveles de pH con cloruro de sodio como modificador de tonicidad (F16 y F19) no experimentaron tal degradación (Fig. 60). La composición a pH 4.0 que contiene cloruro de sodio (F14) probó tener estabilidad reducida después de 4 semanas de estrés acelerado, dando como resultado que el sorbitol sea el modificador de tonicidad superior a pH 4.0 (Fig. 60). A pH 7.0 y pH 8.0, las composiciones con ya sea cloruro de sodio o sorbitol como modificador de tonicidad (F20, F21, F22, y F23) mantuvo estabilidad comparable. El análisis del bevacizumab mediante WCX-HPLC reveló que la formulación con cloruro de sodio de pH 6.0-7.0 mejor la estabilidad en relación con el sorbitol (Fig. 61). Sin embargo, lo opuesto fue verdadero para composiciones de pH 5.0, donde el sorbitol limitó la degradación en relación al cloruro de sodio durante 4 semanas de almacenamiento a 37°C (Fig.61). Mediante SE-HPLC, la estabilidad del Antagonista A fue impactada por la presencia del cloruro de sodio o sorbitol, mientras gue la estabilidad del bevacizumab permaneció comparable entre ambos modificadores de tonicidad. Para las composiciones de pH 5.0 - 6.0, la presencia de cloruro de sodio protegió al Antagonista A de agregación o fragmentación mejor que el sorbitol (Fig.62). Con los otros pHs evaluados, el Antagonista A exhibió una pureza más baja a pH 4.0 con sorbitol (Fig.62). El Antagonista A formulado a pH 7.0 y pH 8.0 (Fig.62) y bevacizumab formulado a pH 4.0, pH 7.0, y pH 8.0 (Fig. 63) mantuvo una pureza comparable ya sea con sorbitol o cloruro de sodio como modificador de tonicidad.

Efecto de la Mezcla 1:1 en la Estabilidad Otro parámetro analizado fue el efecto de la mezcla del Antagonista A y bevacizumab comercial. También, las composiciones que contienen diferentes concentraciones del Antagonista A con una concentración fijada de bevacizumab (Mezcla 1:1 (F24) y Mezcla 1:1 (F26) se analizaron. También, el estrés de las composiciones a 37°C proporciona información sobre la degradación tanto del Antagonista A como del bevacizumab.

Para el Antagonista A solo, la formulación a 30 mg/mL (F12) o 3 mg/mL (F25) no produjo ninguna diferencia en los perfiles de estabilidad mediante AEX-HPLC y SE-HPLC. Después de mezclar el Avastin® comercial con concentraciones variables de Antagonista A (15 mg/mL y 3 mg/mL). El Antagonista A en ambas composiciones mantuvo una estabilidad comparable hasta 8 semanas a 37°C, mientras que la formulación del Antagonista A, a 15 mg/mL con 12.5 mg/mL del bevacizumab produjo una ligera degradación que se observó mediante AEX-HPLC (Fig.64).

Incluso aunque la concentración del bevacizumab fue constante en todas las composiciones en este estudio, las concentraciones variables del Antagonista A afectó la estabilidad del bevacizumab. Después de 8 semanas de almacenamiento a 37°C, la WCX-HPLC reveló diferencias menores en el perfil de degradación del bevacizumab cuando se formuló ya sea con 3 mg/mL del Antagonista A (F26) o 15 mg/mL del Antagonista A.(F24) (Fig. 65). Mediante SE-HPLC, no se observaron diferencias significativas en los perfiles de pureza entre el Antagonista A, a 30 mg/mL y 3 mg/mL en comparación con la mezcla 1:1 directa a dos concentraciones (F24 y F26) (Fig. 66). Sin embargo, para el bevacizumab, las composiciones con 15 mg/mL del Antagonista A (F24) produjo una agregación más soluble y la fragmentación del bevacizumab en comparación con la Mezcla 1:1 de la composición de 3 mg/mL (F26) y a una forma diluida de Avastin® comercial (F18; Fig. 67).

Estabilidad de la Composición F19 A lo largo del estudio de 24 semanas, la composición F19 exhibió la mejor estabilidad entre todas las composiciones evaluadas. En todo el estudio, todas las composiciones F19 permanecieron visualmente claras y mantuvieron los valores de pH objetivo. Esta sección resalta el perfil de estabilidad de esta composición.

Mediante análisis con AEX-HPLC, la composición F19 mantuvo la pureza comparable del Antagonista A, a lo largo de 24 semanas tanto a 4°C como a 25°C (Fig. 68). Sin embargo, cuando se almacenó a 37°C, la pureza del Antagonista A fue aproximadamente 5% más baja a la segunda semana (Fig.68). Esta tendencia a 37°C continuó durante las siguientes 12 semanas, cuando la pureza del Antagonista A cayó aproximadamente al 20% en comparación con las otras condiciones de almacenamiento para el Antagonista A (Fig. 68).

El análisis con WCX-HPLC reveló una correlación entre la temperatura de almacenamiento y la velocidad de degradación del bevacizumab en la composición F19. Después de 2 semanas a 37°C, la pureza del bevacizumab cayó aproximadamente 10% en comparación con las muestras a 4°C (Fig.69). Esta tendencia continuó hasta 12 semanas, cuando la pureza del bevacizumab almacenado a 37°C cayó aproximadamente 50% en comparación con 4°C (Fig. 69). El almacenamiento a 25°C mantuvo una pureza comparable a 4°C hasta 4 semanas (Fig.42) . Sin embargo, a la octava semana, las muestras a 25°C sufrieron una caída del 7% en la pureza en relación a las muestras a 4°C (Fig. 69). La degradación incrementada del bevacizumab almacenado a 25°C continuó durante el resto de las 24 semanas del estudio, cuando al final del cual la pureza del bevacizumab fue aproximadamente 20% más baja gue las muestras almacenadas a 4°C (Fig. 69). El almacenamiento a 4°C parece mantener una pureza comparable con los valores iniciales a lo largo de las 24 semanas del estudio (Fig.69).

La composición F19 previno la agregación soluble adicional o fragmentación del Antagonista A comparable con los valores iniciales mediante SE-HPLC (Fig. 70). El bevacizumab en F19 almacenó a 37°C mantuvo una pureza comparable a almacenamiento a 4°C y 32°C durante hasta 2 semanas, después de lo cual la agregación soluble desarrollada a las 4 semanas (Fig. 71). La pureza del bevacizumab se mantuvo durante hasta 8 semanas a 25°C antes de la agregación soluble significativa desarrollada a las 12 semanas (Fig.71). A 4°C, el bevacizumab mantuvo valores de pureza comparables con el punto de tiempo inicial durante 24 semanas (Fig.71).

Los contrastes de pureza entre el Antagonista A y el bevacizumab se observaron al comparar la composición F19 con las composiciones que comprenden solamente el Antagonista A o bevacizumab. De 2 a 8 semanas a 37°C, la Composición F25 mantuvo una pureza 5-8% mayor del Antagonista A que la F19 mediante análisis con AEX-HPLC. Sin embargo, a la Semana 12, ambas composiciones cayeron a niveles de pureza similares (Fig.72). Además, a 4°C y 25°C, ambas composiciones mantuvieron niveles de pureza comparables (Fig. 72). Mediante SE-HPLC, la composición F12 parece mejor que la F19 en cada condición de almacenamiento con la mayor diferencia vista a 4°C, aunque se observó cierta variabilidad en el ensayo (Fig.73).

La formulación del bevacizumab en F19 proporcionó mejor estabilidad en comparación con una forma diluida de Avastin® comercial (F18). En base a WCX-HPLC, F19 estabilizó al bevacizumab mejor que F18 a 25°C y especialmente a 37°C, que revela una mejora del 8%-ll% de 2-12 semanas (Fig. 74). Similarmente, el análisis con SE-HPLC mostró mejor prevención de agregación o fragmentación de bevacizumab en comparación con el F18 almacenado a 37°C (Fig.75).

En base a los datos recolectados durante las 24 semanas del análisis de estabilidad, se determinó que el F19 es la composición más estable del Antagonista A y bevacizumab. Entre las composiciones analizadas, el F19 ayudó a estabilidad tanto el Antagonista A 3 mg/mL y bevacizumab 12.5 mg/mL cuando se almacenó a 4°C durante hasta al menos 24 semanas. También, la pureza tanto del Antagonista A como del bevacizumab en la composición F19 se mantuvo durante hasta al menos 4 semanas a 25°C.

EJEMPLO 3 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN TANTO RANIBIZUMAB COMO ANTAGONISTA A El propósito de este estudio fue evaluar la actividad biológica de las composiciones que comprenden tanto ranibizumab como Antagonista A, en comparación con las composiciones que comprende solamente ranibizumab (Lucentis®) o Antagonista A. La actividad se midió a través del nivel de expresión genética, utilizando PCR en tiempo real, como una función de inhibición del enlace de VEGF y PDGF-BB a sus respectivos receptores celulares. Se analizaron tres diferentes composiciones de ranibizumab+Antagonista A: F6, F8, y Fll (ver el Ejemplo 1).

Estas composiciones se almacenaron a 4°C durante 12 meses antes de su uso en este estudio.

La actividad anti-VEGF del ranibizumab, solo o presente en una composición también comprende el Antagonista A, se determinó por su capacidad de inhibir la inducción de VEGF del gen del Factor de Tejido (TF) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Las muestras se analizaron por triplicado y todos los datos normalizados con los obtenidos para el VEGF solamente para tratamiento. Como se muestra en la Fig. 76, los valores de EC5o anti-VEGF (nM) se determinaron para todas las composiciones y para el Lucentis® solo fueron idénticos dentro de un intervalo de confianza del 95%.

La actividad anti-PDGF del Antagonista A, solo o presente en una composición también comprende ranibizumab, se determinó por su capacidad de inhibir la inducción PDGF-BB de la expresión del gen BTF2 en la célula del fibroblasto 3T3. Las muestras se analizaron por duplicado y todos los datos se normalizaron con los obtenidos para el tratamiento solo para PDGF-BB. Como se muestra en la Fig. 77, los valores EC50 anti-PDGF (nM) determinados para todas las composiciones y para el Antagonista A solo fueron idénticos dentro de un intervalo de confianza del 95%. Estos resultados demuestran que una composición que comprende tanto ranibizumab como Antagonista A muestra la actividad de cada agente durante al menos 12 meses cuando se almacenan a 4°C.

Específicamente, la actividad anti-PDGF del Antagonista A y la actividad anti-VEGF del ranibizumab presente en co-formulaciones almacenadas a 4°C durante 12 meses se determinó, a fin de demostrar que la co-formulación del Antagonista A y ranibizumab no afecta adversamente la actividad del Antagonista A o ranibizumab. Tres diferentes composiciones que comprenden tanto el Antagonista A como el ranibizumab se analizaron después de almacenarse a 4°C durante 12 meses antes de su uso en este estudio: F6, F8, y Fll (ver el Ejemplo 1). Además, las composiciones que comprenden ya sea el Antagonista A o ranibizumab (Lucentis®) se analizaron como controles.

Actividad de Ranibizumab La actividad anti-VEGF del ranibizumab se midió como su capacidad para inhibir la inducción de VEGF del gen inducible con VEGF, gen del factor de tejido (TF), en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC).

Se sembraron HUVECs (pasaje 8 a 9; Lonza Group Ltd., Basilea, Suiza) en una plaza de 24 pozos (50,000 células/pozo) y se dejaron crecer a 37°C, CO2 al 5% en medio de crecimiento endotelial (EGM2; Lonza) sin hidrocortisona. Al siguiente dia, las células se privaron de suero en un medio basal EGM que contenía FBS al 0.5% y 50 mg/ml de gentamicina (medio de inanición) 4 horas antes del tratamiento.

Para determinar la EC5o de ranibizumab, las células se trataron solamente con VEGF (control positivo; VEGF165 humano 328 pM (Preprotech)) o con VEGF en combinación con F6, F8, Fll, Antagonista A o Lucentis®. Para estos tratamientos, se prepararon diluciones en serie de cada una de las siguientes composiciones en medio de inanición y se analizaron; F6, F8, Fll, y Lucentis®. Las concentraciones de ranibizumab y el Antagonista A en las respectivas diluciones en serie fueron como sigue: ranibizumab = 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM (9.6, 1.92, 0.38, 0.077, 0.015 pg/ml); y Antagonista A = 580 nM, 116 nM, 23.2 nM, 4.64 nM, 0.928 nM (5.97, 1.19, 0.048, 0.009 pg/ml). Para el tratamiento de VEGF+Antagonista A, solamente se analizó una concentración de Antagonista A (580 nM=5.97 mg/ml). Las células se trataron con VEGF, solo o en combinación con una de las diluciones en serie descritas anteriormente, en las concentraciones descritas anteriormente, durante 1.5 horas a 37°C, CO2 al 5%. Las células de control adicionales se dejaron sin tratar.

Inmediatamente después del tratamiento, se cosecharon muestras de ARN de cada pozo utilizando el kit de columna RNeasy Mini spin (Qiagen) de acuerdo al protocolo del fabricante. El ARN total resultante se trató con DNAsa I para remover cualquier ADN genómico contaminante y se cuantificó mediante la densidad óptica (O.D.) a 260 nm. El ARN total se utilizó entonces para transcripción reversa utilizando el kit QuantiTect RT (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para evaluar la capacidad de las composiciones para inhibir la actividad VEGF, se realizó una PCR en tiempo real cuantitativa en el gen TF utilizando una sonda TaqMan humana (Applied Biosystems). Se utilizó un ensayo con genes TaqMan FPRT humanos como el gen de mantenimiento de control (Applied Biosystems).

El experimento se realizó por triplicado y los datos representan el promedio±SEM. Se utilizó el programa GraphPad Prism para los análisis de regresión estadística y no lineal. Todos los datos de la PCR en tiempo real se normalizaron con el tratamiento solo para VEGF (control positivo) para determinar el nivel de cambio de expresión del gen TF para cada condición (es decir, la inhibición de la expresión genética inducida por VEGF). Los niveles de expresión del gen TF relativos determinados para las diferentes concentraciones de cada composición analizada se muestran en la Fig. 76. Como se muestra en la Tabla 7, los valores de EC5o anti-VEGF (nM) determinados para ranibizumab en la ausencia del Antagonista A y para todas las muestras coformuladas fueron idénticos dentro de un intervalo de confianza del 95%. No se observó supresión de la actividad del VEGF por medio del Antagonista A solo (es decir, en la ausencia del ranibizumab) (datos no mostrados).

Tabla 7. Valores de los Intervalos de Confianza del 95% de la EC5Q del Antagonista A y Ranibizumab en Varias Composiciones Actividad del Antagonista A La actividad anti-PDGF del Antagonista A se determinó por su capacidad de inhibir la inducción PDGF-BB del gen inducible con PDGF, el gen 2 de translocación de células B (BTG2) en las células del fibroblasto N1H-3T3.

Las células N1H 353 se sembraron en una placa de 24 pozos (50000 células/pozo) y se dejaron crecer a 37°C, CO2 al 5% en DMEM (Gibco), FBS al 10%, Penicilina/Estreptomicina al 1%. Al siguiente día, las células se privaron de suero durante 16 horas en DMEM, FBS al 1%, Penicilina/Estreptomicina al 1% (medio de inanición) antes del tratamiento.

Para determinar la EC50 del Antagonista A, las células se trataron con solamente PDGF-BB (control positivo) o con PDGF-BB en combinación con F6, F8, Fll, Antagonista A o Lucentis®. El PDGF-BB se utilizó a una concentración de 1.65 M (40 ng/ml; Preprotech). Para estos tratamientos, se prepararon diluciones en serie de cada una de las siguientes composiciones en medio de inanición y se analizaron: F6, F8, Fll, y Antagonista A. Las concentraciones del Antagonista A y ranibizumab en las respectivas diluciones en serie fueron como sigue: Antagonista A = 580 nM, 116 nM, 23.2 nM, 4.64 nM, 0.928 nM (5.97, 1.19, 0.24, 0.048, 0.009 mg/ml); y ranibizumab = 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM (9.6, 1.92, 0.38, 0.077, 0.015 pg/ml) . Para el tratamiento con PDGF-BB+Lucentis®, solamente se analizó una concentración de ranibizumab (200 nM=9.6 pg/ml). Las células se trataron con PDGF-BB, solo o en combinación con una de las diluciones en serie descritas anteriormente, a las concentraciones descritas anteriormente, durante 1.5 horas a 37°C, CO2 al 5%. Las células de control adicionales se dejaron sin tratar.

Inmediatamente después del tratamiento, se cosecharon muestras de ARN de cada pozo utilizando el kit de columna RNeasy Mini spin (Qiagen) de acuerdo al protocolo del fabricante. El ARN total resultante se trató con DNAsa I para remover cualquier ADN genómico contaminante y se cuantificó mediante O.D. a 260 nm. Se utilizó entonces ARN total para transcripción inversa utilizando el kit QuantiTect RT (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para evaluar la capacidad de las composiciones de inhibir la actividad PDGF-BB, se realizó una PCR en tiempo real cuantitativa en el gen BTG2 utilizando una sonda TaqMan de ratón especifica (Applied Biosystems). Se utilizó un ensayo con gen GAPDH de ratón como el gen de mantenimiento de control (Applied Biosystems).

El experimento se realizó por duplicado y los datos representan el promedio+SEM. Se utilizó el programa GraphPad Prism para los análisis de regresión estadística y no lineal. Todos los datos de la PCR en tiempo real se normalizaron con el tratamiento solo para PDGF (control positivo) para determinar el nivel de cambio de expresión del gen BTG2 para cada condición (es decir, la inhibición de la expresión genética inducida por PDGF). La expresión del gen BTG2 relativo determinada para las diferentes concentraciones de cada composición analizada se muestra en la Fig.77. Como se muestra en la Tabla 8, los valores de EC5o anti-PDGF (nM) determinados para el Antagonista A solo y para todas las muestras co-formuladas fueron idénticos dentro de un intervalo de confianza del 95%. No se observó supresión de la actividad del PDGF-BB por medio del ranibizumab solo (es decir en la ausencia del Antagonista A) (datos no mostrados).

Tabla 8. Intervalos de Confianza del 95% de la EC5o del Antagonista A y Ranibizumab en Varias Composiciones Estos estudios demuestran que el Antagonista A no tiene un efecto adverso en la capacidad del ranibizumab de inhibir la actividad del VEGF y que el ranibizumab no tiene un efecto adverso en la capacidad del Antagonista A de inhibir la actividad PDGF-BB, incluso después de que las co-formulaciones del Antagonista A y ranibizumab se almacenaron a 4°C durante al menos 12 meses.

EJEMPLO 4 EFECTO DE LAS CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO EN LA ESTABILIDAD DE LAS COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN EL ANTAGONISTA A Y EL RANIBIZUMAB La capacidad del Antagonista A y ranibizumab en varias composiciones se examinó durante un análisis de partículas subvisibles para evaluar los efectos de diferente temperatura de almacenamiento y diferentes contenedores de almacenamiento. El análisis de partículas subvisibles se realizó en el Antagonista A (30 mg/mL), ranibizumab (10 mg/mL y 40 mg/mL), y varias combinaciones del Antagonista A y ranibizumab mediante imágenes de micro-flujo (MFI). Un total de cinco composiciones separadas se analizaron siguiente las diferentes condiciones de almacenamiento para evaluar los efectos de la temperatura de almacenamiento (5°C y 30°C durante 4 horas) y contenedor de almacenamiento (viales de 2 cc y jeringas de 1 mL) en el conteo de partículas subvisibles de cada formulación. Los resultados de MFI de cada muestra se presentaron en rangos de tamaño de partícula particulares (incluyendo en total, ³ 2 gm, ³ 5 gm, ³ 10 pm y ³ 25 pm). Se observó cierta correlación relativa de los conteos de partículas de diferentes muestras almacenadas bajo las mismas condiciones.

Materiales Las siguientes composiciones del Antagonista A y ranibizumab se utilizaron en el estudio: (1) 30 viales gue contenían 0.23 mL del Antagonista A 30 mg/mL en fosfato de sodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM, pH 7.3 (Composición F27). (2) 9 viales que contenían 0.5 mL de ranibizumab 10 mg/mL en HCl de histidina 10 mM, a,a-trehalosa al 10% y polisorbato 20 al 0.01%, pH 5.5 (Composición F28; Genentech, South San Francisco, CA). (3) 7 viales gue contenían 0.5 mL de ranibizumab 40 mg/mL en HCl de histidina 10 mM, a,a-trehalosa al 10 y polisorbato 20 al 0.01%, pH 5.5 (Composición F29; Genentech, South San Francisco, CA).

Los materiales del contenedor utilizados para la preparación de la composición se listan en la Tabla 9.

Tabla 9: Materiales del contenedor utilizados en las preparaciones de muestras † Viales frascos se enjuagaron con agua Milli-Q y se secaron antes de usarse * Recomendado para usarse con el instrumento MFI por Protein Simple Preparación de Composiciones A fin de preparar las composiciones examinadas en este estudio, los viales de la misma muestra, es decir, el Antagonista A o ranibizumab se combinaron conjuntamente. En este proceso, se combinaron 30 viales de Antagonista A 30 mg/mL (0.20 mL/vial) en un vial de vidrio de 5 cc, 7 viales o frascos de ranibizumab 10 mg/mL (0.5 mL/vial se combinaron en un vial de vidrio de 5 cc separado, y 7 viales de ranibizumab 40 mg/mL (0.5 mL/vial) se combinaron en un tercer vial de vidrio de 5 cc. Aunque los viales del Antagonista A 30 mg/mL se propuso que contuviera 0.23 mL, solamente se recuperó ~0.2 mL por cada vial cuando se combinaron. La combinación se realizó removiendo la tapa de cada vial y transfiriendo el contenido a través de una pipeta de una manera aséptica. Se prepararon dos muestras adicionales en viales de vidrio limpios con varias combinaciones de los materiales combinados. La Tabla 10 detalla el contenido de cada una de las cinco muestras preparadas para este estudio. Para asegurar la limpieza de las muestras y para prevenir· la contaminación por partículas, todas las preparaciones de combinación y de muestras se realizaron en un Gabinete de Seguridad Biológica clase 100 (Nuaire UN-425-600).

Tabla 10: Matriz de composición para el análisis MFI * No estuvo disponible suficiente volumen de F31 para llenar el vial; por consiguiente solamente se llenaron dos viales para esa formulación.

"Ant. A" es el Antagonista A En este proceso, cada muestra se preparó en un total de dos jeringas de 1 iL y tres viales de vidrio de 2 cc a un volumen de llenado de 0.5 mL, excepto para la F31, que se preparó en dos jeringas y dos viales. Las diversas composiciones se prepararon individualmente para permitir un análisis preciso de puntos de tiempo en el instrumento MFI. Después de la preparación, cada contenedor se equipó con un tapón, y las muestras se sometieron a las condiciones del estudio de estabilidad.

Condiciones de Almacenamiento Las muestras de cada composición se almacenaron ya sea a 5°C o 30°C durante 4 horas, en ya sea viales o jeringas, para determinar los efectos de la temperatura de almacenamiento y tipo de contenedor en los niveles de partículas subvisibles. Se realizó un análisis T=0 en las muestras en viales de vidrio inmediatamente después del llenado. Las condiciones de temperatura y puntos de tiempo de análisis para este estudio se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11: Condiciones de temperatura y puntos de tiempo de Análisis Analítico y Procesamiento de Datos Se recolectaron mediciones de tamaños y conteos de partículas subvisibles utilizando un instrumento MFI de Brightwell Technologies, modelo # DPA-4200. 0.5 mL de cada muestra se aplicó directamente utilizando la punta de una pipeta a través del orificio de entrada montado en la parte superior de la celda de flujo para su análisis. En este proceso, la celda de flujo se purgó con 0.17 mL de la muestra, dando por consiguiente aproximadamente 0.30 mL para la evaluación de partículas.

Se aplicaron substracciones a los datos MFI para reducir el número de burbujas de aire y partículas no proteínicas incluidas en el conteo total de partículas. En este proceso, se removieron partículas pegadas, partículas de movimiento lento, y partículas parecidas a burbujas con una alta circularidad de los datos en un intento por aislar y evaluar el oligonucleótido o partículas proteínicas en cada muestra. Las partículas del borde también se removieron en esta substracción, de modo que las propiedades de cada partícula puedan detectarse apropiadamente.

Los resultados del análisis MFI se obtuvieron como conteos de partículas por muestra. Estos datos se convirtieron en unidades de partículas por mL de muestra dividiendo el conteo de partículas adquiridas entre el volumen exacto analizado (aproximadamente 0.30 mL). Los valores de las partículas por mL de la muestra se redondearon al número entero más cercano.

Resultados y Discusión La Tabla 12 resume los resultados del análisis MFI para las cinco composiciones, F27 a F31, analizado en este estudio. Los datos de MFI tanto en bruto como substraídos para las composiciones bajo cada condición de almacenamiento se presentan en términos de conteo total de partículas/mL, así como conteos de partículas/mL en tamaños de partículas de ³ 2 mm, ³ 5 pm, ³ 8 pm, ³ 10 mm y ³ 25 pm. Se observaron varios resultados durante las diferentes condiciones de temperatura y del contenedor.

Tabla 12. Resultados de MFI de las Composiciones F27 a F31 almacenados a varias condiciones * No hubo suficiente volumen de F31 disponible para analizar esta condición particular.

D Debido al bajo volumen de F31, esta muestra se preparó de una porción de F31 que inicialmente se extrajo de una jeringa.

La temperatura a T=0 fue temperatura ambiente.

Los resultados MFI substraídos para las Composiciones F27 a F31, después de las diferentes condiciones de almacenamiento, se exhiben gráficamente como histogramas en las Figs. 29 a 83, respectivamente. Estos histogramas presentan los conteos de partículas de cada muestra en varios rangos de tamaño, incluyendo 1 a 2 gm, 2 a 5 mm, 5 a 10 pm, 25 a 50 pm, 50 a 75 mm y 75 a 100 pm. Estas Figs. También muestran resultados variables para las composiciones después de diferentes condiciones de almacenamiento.

La Fig.28 compara los resultados de MFI sustraídos de cada muestra en las diferentes condiciones de almacenamiento. En esta Fig., se evaluaron los conteos de partículas de 1 a 2 pm, 2 a 5 pm, 5 a 10 pm, 10 a 25 pm, 25 a 50 p y 50 a 75 pm. Los conteos de partículas elevados observados en F31 en un vial de vidrio después de 4 horas a 30°C pueden dar como resultado problemas de manejo de las muestras. Sin embargo, no hubo una muestra adicional disponible para re-análisis.

Conclusión La ejecución del análisis de partículas del Antagonista A, y ranibizumab y varias combinaciones del Antagonista A y ranibizumab se realizó mediante MFI. Un total de 24 diferentes muestras de 5 composiciones se analizaron en este estudio después de 4 horas de almacenamiento a 5°C y 30°C ya sea en viales de vidrio de 2 cc o jeringas de 1 mL. Los resultados de cada muestra se presentaron en rangos de tamaño de partícula particulares incluyen ³ 2 mm, ³ 5 mih, ³ 10 mih, ³ 25 mm y conteos totales de partículas. No se observaron diferencias considerables; sin embargo, se detectaron conteos de partículas más altas en F31 en un vial de vidrio después del almacenamiento a 30°C.

EJEMPLO 5 SÍNTESIS DEL ANTAGONISTA A Una síntesis química iterativa del oligonucleótido 32-m34 del Antagonista A se realizó en un soporte de vidrio de poro controlado (CPG) de desoxirribotimidina en fase invertida sólida utilizando un diseño de reactor de flujo directo. El proceso de síntesis de oligonucleótidos estuvo comprendido de cuatro reacciones químicas llevadas a cabo en la siguiente secuencia: (a) desbloqueo del nucleósido protegido con dimetioxitritilo (DMT) u oligonucleótido emergente (destritilación); (b) activación y acoplamiento de la fosforamidita entrante (amidita); (c) oxidación del triéster de fosfito resultante en el enlace de fosfato pentavalente; y (d) tapado de las cadenas de oligonucleótidos que falla en un acoplamiento exitoso.

Comenzando con un soporte CPG de timidina invertida (3'-DMT-5'-dT-CPG), se repitieron las cuatro etapas anteriores para agregar fosforamiditas en el orden de la secuencia hasta que el oligonucleótido deseado, que termina en el enlace de hexilamino, se sintetizó. Los espaciadores de hexaetilenglicol interno se acoplaron de la misma manera que las otras fosforamiditas.

La primera etapa en el ciclo involucró la remoción del grupo protector de dimetioxitritilo en el grupo hidroxilo terminal de la cadena de oligonucleótido emergente. Esto se logró tratando el oligonucleótido protegido con DMT en CPG con una solución de ácido dicloroacético. Esta reacción produjo el grupo hidroxilo terminal no protegido. El grupo DMT escindido se removió con el solvente de ácido dicloroacético/diclorometano (DCA/DCM). El CPG se lavó entonces con acetonitrilo (ACN).

La segunda etapa involucró la activación de la fosforamidita entrante con etiltiotetrazol (ETT) para producir una muestra que podría acoplarse rápidamente con el grupo hidroxilo terminal producido en la etapa previa. El triéster de fosfito resultante se lavó con ACN para remover el activador y la fosforamidita sin reaccionar.

La tercera etapa fue la oxidación del triéster de fosfito recién formado al fosfato pentavalente. Esto se logró haciendo reaccionar el triéster de fosfito con una mezcla de yodo y piridina en agua. El oxidante no utilizado se lavó del CPG con ACN.

La cuarta etapa involucró tapar cualquier hidroxilo sin reaccionar que habían fallado en acoplarse. El CPG se trató con una mezcla de CAP NMI (N-metilimidazol en ACN) y CAP ALA (anhídrido acético, 2,6-lutidina, ACN). Estos reactivos se lavaron del CPG con ACN.

Este ciclo de cuatro reacciones se repitió hasta un oligonucleótido de la longitud y secuencia correctas se ensambló en el soporte sólido. La última fosforamidita (enlace de hexilamino en extremo terminal 5' del oligonucleótido) se hizo reaccionar de la misma manera que las otras fosforamiditas utilizadas en la síntesis; sin embargo, este enlace no se tapó.

El oligonucleótido se desprotegió y escindió tratando el soporte sólido, que contenía el oligonucleótido sintetizado crudo, con una solución de amina de t-butilo/hidróxido de amonio. El CPG se separó del oligonucleótido desprotegido y escindido. La pureza del oligonucleótido completamente desprotegido crudo se determinó mediante cromatografía de intercambio aniónico analítica y cumplió una específica mayor al 50%.

El oligonucleótido resultante se diafiltró contra cloruro de sodio para remover las sales de amina.

Una unión covalente se formó entonces entre la amina primaria en el extremo 5' del oligonucleótido y el reactivo de pegilación (éster mPEG2-NHS). La reacción se realizó a pH 9 en amortiguador de borato de sodio. La reacción había demostrado estar en un sitio específico en el enlace de hexilamino en el extremo 5' del oligonucleótido utilizando las condiciones de pegilación descritas.

El oligonucleótido pegilado se purificó a partir del reactivo de PEG no conjugado, aptómero no pegilado, y otros subproductos mediante cromatografía de intercambio aniónico preparativa (AX HPLC). Las fracciones individuales se analizaron mediante HPLC AX analítica. Se combinaron fracciones seleccionadas de oligonucleótido de longitud completa y la combinación resultante se desalinizó, concentró, y filtró.

El Antagonista A resultante se liofilizó a vacío para reducir el contenido de agua.

EJEMPLO 6 INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE BTG2 INDUCIDA POR PDGF-BB EN CÉLULAS DE FIBROBLASTO 3T3 MEDIANTE EL ANTAGONISTA A Y MEDIANTE CO-FORMULACIONES DEL ANTAGONISTA A + AFLIBERCEPT La capacidad de las composiciones que comprenden ya sea el Antagonista A o tanto el Antagonista A como el aflibercept para inhibir la actividad de PDGF-BB se determinó, a fin de demostrar que la co-formulación del Antagonista A con aflibercept no afectó adversamente la actividad del Antagonista A.

Materiales y Metodos La actividad anti-PDGF del Antagonista A se determinó por su capacidad de inhibir la inducción de PDGF-BB del gen que responde al PDGF-BB, gen 2 de translocación de células B (BTG2), en células N1H 3T3.

Se sembraron células N1H3T3 en una placa de 24 pozos (4 x 104 células/pozo) en 0.5 mi de medio de cultivo que contiene Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco), suero de ternera al 10% (CS), glutamina 2 mM y Penicilina/Estreptomicina al 1%, y se dejó crecer a 37°C, CO2 al 5%. Después de 24 horas, las células se privaron de suero en DMEM que contenia CS al 1%, glutamina 2 mM y Penicilina/Estreptomicina al 1% (medio de inanición) 9 horas antes del tratamiento.

Para determinar la EC50 del Antagonista A, las células se trataron con PDGF-BB (control positivo) o con PDGF-BB en combinación con una de las siguientes composiciones: Antagonista A (Composición F32); Antagonista A + aflibercept (Composición F33); o Antagonista A + PBS (Composición F34). Se utilizó PDGF-BB a una concentración de 1.65 nM (PDGF-BB humano; Preprotech, Londres, Reino Unido). La solución madre del Antagonista A utilizado para preparar las composiciones fue Antagonista A 30 mg/mL en fosfato de Na 10 mM y NaCl 150 mM, pH 7.3. El Eylea® comercialmente disponible) (aflibercept 40 mg/mL en fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 40 mM, polisorbato 20 al 0.03%, y sacarosa al 5%, pH 6.2) se utilizó como la solución madre para preparar la Composición F33. Para la Composición F33, el Antagonista A y aflibercept se incubaron a concentraciones equimolares y se almacenaron toda la noche a 4°C antes de usarse. Como un control para la Composición F33, el Antagonista A se incubó toda la noche a 4°C con PBS (Composición F34). Para estos tratamientos, se prepararon diluciones en serie de las Composiciones F32, F33 y F34 en medio de inanición inmediatamente antes de usarse. Las concentraciones del Antagonista A en diluciones en serie fueron como sigue: 400 nM, 80 nM, 16 nM, 3.2 nM y 0.64 nM, respectivamente. Las concentraciones molares de aflibercept en las diluciones en serie de la Composición F33 fueron iguales a las concentraciones molares del Antagonista A en cada una de las diluciones en serie de la Composición F33. Las células se trataron con PDGF, solo o en combinación con una de las diluciones en serie descritas anteriormente, a las concentraciones descritas anteriormente, durante 1 hora a 37°C, C02 al 5%. Las células de control adicionales se dejaron sin tratar.

Inmediatamente después del tratamiento, las células se cosecharon para aislamiento de ARN utilizando el kit de columna RNeasy Mini spin (Qiagen, Germantown, MD) de acuerdo al protocolo del fabricante. El ARN total resultante se cuantificó mediante densidad óptica (O.D.) a 260 nm y subsecuentemente se trató con DNAsa I para remover cualquier ADN genómico contaminante. La síntesis de ADNc se realizó entonces mediante transcripción inversa utilizando el kit de Transcripción Inversa QuantiTect® (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para evaluar la capacidad del Antagonista A en la ausencia del aflibercept (Composiciones F32 y F34) y la mezcla de Antagonista A + aflibercept (Composición F33) para inhibir la actividad de PDGF-BB, se realizó PCR en tiempo real cuantitativa en el gen BTG2 utilizando una sonda TaqMan de ratón especifica (Applied Biosystems; Foster City, CA). Se utilizó un ensayo con genes TaqMan de beta-actina de ratón como un control interno (Applied Biosystems).

El experimento se realizó por triplicado, y los datos representan los valores promedio ± desviación estándar (SD). Se utilizó un programa GraphPad Prism para análisis de regresión estadística y no lineal. Todos los datos de los experimentos de PCR en tiempo real se normalizaron con las muestras tratadas con PDGF-BB en la ausencia del Antagonista A (control positivo) para determinar el cambio relativo en la expresión del gen BTF2 para cada condición.

Resultados El Antagonista A fue capaz de inhibir efectivamente la expresión del gen BTG2 inducida por PDGF-BB en células 3T3 (Fig. 85). Además, la capacidad del Antagonista A para inhibir la expresión BTG2 no estuvo comprendida por pre-incubación con aflibercept (Fig. 86). Los valores EC5o determinados para el Antagonista A se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13. Intervalos de Confianza del 95% de la EC50 del Antagonista A en Varias Composiciones Estos estudios demostraron que las co-formulaciones del Antagonista A y aflibercept fueron capaces de mantener la estabilidad del Antagonista A, que se midió por su actividad biológica anti-PDGF, cuando se almacenó a 4°C toda la noche. La co-formulación del Antagonista A con aflibercept no tuvo un efecto adverso en la actividad del Antagonista A.

Todas las patentes norteamericanas, las publicaciones de solicitudes de patentes norteamericanas, las solicitudes de patentes norteamericanas, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones que no son de patente se mencionan en esta especificación o se listan en cualquier Hoja de Datos de Solicitud se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

A partir de lo citado anteriormente se apreciará que, aunque se han descrito modalidades especificas de la invención en la presente para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (49)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 0.5 mg/mL hasta aproximadamente 20 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición aproximadamente a pH de 5.0 hasta aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de tonicidad.

2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el amortiguador es de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM de L-histidina o aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM de fosfato de sodio; y el modificador de tonicidad es de aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM de NaCl, sorbitol aproximadamente al 1% hasta aproximadamente 20% (p/v), o trehalosa de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% (p/v).

3. La composición de la reivindicación 2, caracterizado porque el amortiguador es L-histidina de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM; y el modificador de tonicidad es NaCl de aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) hasta aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

5. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de L-histidina; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0.

6. La composición de la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20

7. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

8. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20.

9. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

10. La composición de la reivindicación 9, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.01% (p/v) de polisorbato 20.

11. La composición de la reivindicación 2, caracterizado porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 5 mM de fosfato de sodio; (d) aproximadamente 5 mM de HCl de histidina; (e) aproximadamente 75 mM de NaCl; y (f) aproximadamente 5% (p/v) de trehalosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.5.

12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque comprende además: (g) aproximadamente 0.005% (p/v) de polisorbato 20.

13. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (b) aproximadamente 0.5 mg/mL hasta aproximadamente 25 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición aproximadamente a pH 5.0 hasta aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de tonicidad.

14. La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque el amortiguador es de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio o aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 200 mM de HCl de Tris; y el modificador de tonicidad es de aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM de NaCl, aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% (p/v) de sorbitol, o aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% (p/v) de trehalosa.

15. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque el amortiguador es de aproximadamente 5 M hasta aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio; y el agente de tonicidad es de aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 5.0 hasta aproximadamente pH de 7.0.

16. La composición de cualquier de las reivindicaciones 13-15, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.001% (p/v) hasta aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

17. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0.

18. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

19. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0.

20. La composición de la reivindicación 19, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

21. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 5% (p/v) de sorbitol. en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

22. La composición de la reivindicación 21, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

23. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio; y (d) aproximadamente 150 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 7.0.

24. La composición de la reivindicación 23, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

25. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 50 mM de HCl de Tris; y (d) aproximadamente 130 mM de NaCl, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 8.0.

26. La composición de la reivindicación 25, caracterizada porque comprende además: (e) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

27. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 15 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 30 mM de fosfato de sodio; (d) aproximadamente 75 mM de NaCl; y (e) aproximadamente 3% (p/v) de trehalosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.3.

28. La composición de la reivindicación 27, caracterizada porque comprende además: (f) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

29. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 3 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 12.5 mg/mL de bevacizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 30 M de fosfato de sodio; (d) aproximadamente 75 mM de NaCl; y (e) aproximadamente 3% (p/v) de trehalosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.3.

30. La composición de la reivindicación 29, caracterizada porque comprende además: (f) aproximadamente 0.02% (p/v) de polisorbato 20.

31. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 0.3 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o más de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición aproximadamente a pH 5.0 hasta aproximadamente pH 8.0; (d) un modificador de tonicidad; y (e) 0 hasta aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa.

32. La composición de la reivindicación 31, caracterizada porque el amortiguador es de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 50 mM de fosfato; y el modificador de tonicidad es de aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM de NaCl.

33. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque comprende: (a) aproximadamente de 0.3 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 50 mM de fosfato; (d) aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM de NaCl; y (e) O hasta aproximadamente 10% (p/v) de sacarosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.0 hasta aproximadamente pH 8.0.

34. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 31- 33, caracterizada porque comprende además: (f) aproximadamente 0.001% (p/v) hasta aproximadamente 0.05% (p/v) de surfactante.

35. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 6 mg/mL de Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 40 mg/mL de aflibercept o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 10 mM de fosfato; (d) aproximadamente 40 mM de NaCl; y (e) aproximadamente 5% (p/v) de sacarosa, en donde el pH de la composición es de aproximadamente pH 6.2.

36. La composición de la reivindicación 35, caracterizada porque comprende además: (f) aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 20.

37. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de: (a) aproximadamente 3 mg/mL hasta aproximadamente 90 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 1.0 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o ambos de: (c) un amortiguador capaz de lograr o mantener el pH de la composición aproximadamente a pH 5.0 hasta aproximadamente pH 8.0; y (d) un modificador de tonicidad.

38. La composición de la reivindicación 37, caracterizada porque el amortiguador comprende aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 100 mM de fosfato de sodio o aproximadamente 1.0 mM hasta aproximadamente 10 mM de HCl de histidina; y el modificador de tonicidad es de aproximadamente 0.5% (p/v) hasta aproximadamente 10% (p/v) de trehalosa.

39. La composición de la reivindicación 38, caracterizada porque la composición comprende: (a) aproximadamente 15 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 5 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 5 mM de fosfato; (d) aproximadamente 75 mM de NaCl; (e) aproximadamente 5 mM de HCl de histidina; y (f) aproximadamente 5% (p/v) de trehalosa.

40. La composición de la reivindicación 39, caracterizada porque comprende además: (g) aproximadamente 0.005% (p/v) de polisorbato 20.

41. La composición de la reivindicación 38, caracterizada porque comprende: (a) aproximadamente 24 mg/mL del Antagonista A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (b) aproximadamente 8 mg/mL de ranibizumab o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (c) aproximadamente 8 mM de fosfato; (d) aproximadamente 120 mM de NaCl; (e) aproximadamente 2 mM de HC1 de histidina; y (f) aproximadamente 2% (p/v) de trehalosa.

42. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque comprende además: (g) aproximadamente 0.002% (p/v) de polisorbato 20.

43. Un método para tratar o prevenir un padecimiento oftalmológico, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo la composición de cualquier de las reivindicaciones 1, 13, 31 y 37.

44. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque el padecimiento oftalmológico es degeneración macular relacionada con la edad, vasculopatía coroidea polipoidea, condición asociada con neovascularización coroidea, retinopatia hipertensiva, retinopatia diabética, retinopatia de células falciformes, condición asociada neovascularización retiniana periférica, retinopatia de prematuridad, padecimiento oclusivo venoso, padecimiento oclusivo arterial, corio-retinopatia serosa central, edema macular cistoide, telangiectasia retiniana, macroaneurisma arterial, angiomatosis retiniana, retinopatia inducida por radiación, rubeosis del iris, o un neoplasma.

45. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque el padecimiento oftalmológico es degeneración húmeda macular relacionada con la edad o degeneración macular seca relacionada con la edad.

46. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque la composición está presente en un dispositivo de suministro de fármacos.

47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 43-46, caracterizado porque la composición se administra intraocularmente.

48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque la administración intraocular es administración intra-vitrea o administración en la cámara anterior.

49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 43-48, caracterizado porque el mamífero es un humano.