JP2019510078A - Ｉｌ−６アンタゴニスト製剤およびその使用 - Google Patents

Ｉｌ−６アンタゴニスト製剤およびその使用 Download PDF

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Abstract

被験体への投与のために設計されたインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６抗体分子を含有する医薬組成物および製剤を、本明細書で特徴付ける。本明細書で提供される医薬組成物および製剤は、ＩＬ−６関連疾患、例えば、ＩＬ−６の上昇したレベルと関連する眼性疾患を有する被験体を処置するための医薬の製造における使用、またはかかる被験体を処置する方法に適切である。一局面において、１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体またはその断片；１０〜５０ｍＭのヒスチジン；０．０１％〜０．１％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；１〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム；および１〜１０％のソルビトールを含む医薬製剤が提供され、この製剤のｐＨは５．５と７．５との間である。

Description

関連出願
この出願は、２０１６年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／２９８，７７４号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
本発明は、例えば、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストのための治療組成物製剤に関する。
ＩＬ−６は、炎症、造血発生、血管形成、細胞分化および神経生存における報告された役割を有する多面的サイトカインである。
とりわけ、ＩＬ−６ファミリーサイトカインおよびそのタンパク質複合体、ならびに／またはそれらのそれぞれの受容体（例えば、ＩＬ−６受容体）をモジュレートするため、障害を処置するため、ならびにＩＬ−６を検出および／またはＩＬ−６に結合するために使用され得る、ＩＬ−６アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−６抗体分子、例えば、ＷＯ２０１４／０７４９０５に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片）を含有する製剤（例えば、医薬組成物、例えば、安定な水性製剤）を、本明細書で特徴付ける。１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌのＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む医薬製剤が、本明細書に記載される。実施形態では、この医薬製剤は、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６抗体またはその断片；ならびに緩衝液（例えば、緩衝剤）、界面活性剤および／もしくは張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔ）のうちの１つもしくは複数、または全てを含む。一実施形態では、この医薬製剤は、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−６抗体またはその断片、緩衝剤、界面活性剤および２種の張度剤（例えば、糖および塩）を含む。
製剤
一態様では、本開示は、１〜１００ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６アンタゴニストを含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。一実施形態では、製剤は、５〜５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６アンタゴニストを含む。一実施形態では、製剤は、約５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６アンタゴニストを含む。一実施形態では、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬのそのＩＬ−６アンタゴニストを含む。任意の本明細書に記載の製剤において、ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６抗体分子、例えば、ＩＬ−６抗体もしくはその断片である。
一態様では、本開示は、１〜１００ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。一実施形態では、製剤は、５〜５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、１〜１０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、２〜３ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、３〜４ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、４〜５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５〜６ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、６〜７ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、７〜８ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、８〜９ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、９〜１０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５ｍｇ／ｍＬ、＋／〜１０％のＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５ｍｇ／ｍＬ、＋／−２０％のＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５ｍｇ／ｍＬ、＋／−３０％のＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、１０〜１００ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、２０〜８０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、４０〜６０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、２０〜３０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、３０〜４０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、４０〜５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５０〜６０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、６０〜７０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、７０〜８０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、８０〜９０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、９０〜１００ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。例示的なＩＬ−６抗体分子、例えば、ＩＬ−６抗体もしくはその断片が本明細書において提供される。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載のＩＬ−６抗体分子の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度のＩＬ−６抗体分子、例えば、ＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。例として、一実施形態では、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬ＋／−１０％のＩＬ−６分子、例えば、ＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬ、＋／−２０％のＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。一実施形態では、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬ、＋／−３０％のＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。
一実施形態では、製剤は、１〜５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、５〜４０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、１０〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤または１５〜２５ｍＭのヒスチジン緩衝剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、１〜１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、１０〜２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、２０〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、３０〜４０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、４０〜５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、５〜１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、１０〜１５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、１５〜２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、２０〜２５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、２５〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、３０〜３５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、３５〜４０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、４０〜４５ｍＭのヒスチジン緩衝剤または４５〜５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の緩衝剤の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の緩衝剤、例えば、ヒスチジン緩衝剤を含む。例として、一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−１０％のヒスチジン緩衝剤を含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−２０％のヒスチジン緩衝剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−３０％のヒスチジン緩衝剤をさらに含む。
一実施形態では、製剤は、０．０１％〜１％ｗ／ｖのポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８、例えば、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０１％〜０．０５％、０．０２％〜０．０４％ｗ／ｖのポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８をさらに含む。一実施形態では、製剤は、０．０１〜０．０２％、０．０２％〜０．０３％、０．０３〜０．０４％、０．０４％〜０．０５％、０．０５％〜０．０６％、０．０７％〜０．０８％、０．０８％〜０．０９％または０．０９％〜０．１％ｗ／ｖのポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８をさらに含む。一実施形態では、製剤は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．５％または１％ｗ／ｖのポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８をさらに含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の界面活性剤の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の界面活性剤、例えば、ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８を含む。例として、一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．００３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８を含む。一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．００６％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８をさらに含む。一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．０１％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８をさらに含む。任意の本明細書に記載の製剤において、ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、およびポロクサマー１８８は、互換的である。
一実施形態では、製剤は、１〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム、例えば、１〜５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、５〜１００ｍＭ、１０〜７５ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、１０〜３０ｍＭまたは１５〜２５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。一実施形態では、製剤は、１〜１０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、５〜１５ｍＭ、５〜２５ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、１０〜３０ｍＭ、１５〜２５ｍＭ、１５〜３５ｍＭ、２０〜３０ｍＭ、３０〜４０ｍＭ、４０〜５０ｍＭ、５０〜６０ｍＭ、７０〜８０ｍＭ、８０〜９０ｍＭ、９０〜１００ｍＭ、１００〜１１０ｍＭ、１１０〜１２０ｍＭ、１２０〜１３０ｍＭ、１３０〜１４０ｍＭまたは１４０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。一実施形態では、製剤は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭまたは１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の塩化ナトリウムの濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の塩化ナトリウムを含む。例として、一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−１０％の塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−２０％の塩化ナトリウムをさらに含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−３０％の塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、製剤は、１〜１０％のソルビトール、例えば、１〜８％、１〜６％、２〜５％または３〜５％のソルビトールをさらに含む。一実施形態では、製剤は、１〜１０％のソルビトール、２％〜１２％、３％〜１３％、４％〜１４％、５％〜１５％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％または９％〜１０％のソルビトールをさらに含む。一実施形態では、製剤は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％のソルビトールをさらに含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載のソルビトールの濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度のソルビトールを含む。例として、一実施形態では、製剤は、４％＋／−０．４％のソルビトールを含む。一実施形態では、製剤は、４％＋／−０．８％のソルビトールをさらに含む。一実施形態では、製剤は、４％＋／−１．２％のソルビトールをさらに含む。
ある実施形態では、製剤のｐＨは、約５．５〜約７．５、例えば、約５．５〜約７．０、約６．０〜約７．０、約６．２〜約６．８である。一実施形態では、製剤のｐＨは、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９または約７．０である。一実施形態では、製剤のｐＨは、約６．５である。
一態様では、本開示は、１〜１００ｍｇ／ｍｌまたは５〜５０ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載される通りのＩＬ−６抗体もしくはその断片、１０〜５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤；０．０１％〜０．１％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；１〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム；および１〜１０％のソルビトールを、ｐＨ５．５〜７．５、例えば、６．５のｐＨで含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。別の態様では、本開示は、５〜５０ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載される通りのＩＬ−６抗体もしくはその断片；１０〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤；０．０１％〜０．０５％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；１０〜３０ｍＭの塩化ナトリウム；および１〜６％のソルビトールを、ｐＨ６〜７、例えば、６．５のｐＨで含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。なお別の態様では、本開示は、５〜５０ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載される通りのＩＬ−６抗体もしくはその断片；１５〜２５ｍＭのヒスチジン緩衝剤；０．０２％〜０．０４％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；１５〜２５ｍＭの塩化ナトリウム；および３〜５％のソルビトールを、ｐＨ６．２〜６．８、例えば、６．５のｐＨで含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。
別の態様では、本開示は、約５〜５０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載される通りの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。一実施形態では、製剤は、約５ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む。一実施形態では、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む。
別の態様では、本開示は、約５〜５０ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載される通りの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む製剤、例えば、医薬製剤を特徴付ける。一実施形態では、製剤は、約５ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片、２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む。一実施形態では、製剤は、約５０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体もしくはその断片；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば、ヒスチジンＨＣｌ；０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；２０ｍＭの塩化ナトリウム；および４％のソルビトールを、５．５のｐＨで含む。
本明細書に記載される製剤のいずれかでは、製剤は、キレート剤、保存剤、粘性剤、浸透増強剤もしくは生体接着剤、安定剤および／もしくは抗酸化剤のうちの１つもしくは複数、または全てをさらに含み得る。
本明細書に記載される製剤のいずれかでは、製剤は、第２の治療剤をさらに含む。一実施形態では、この第２の治療剤は、抗ＶＥＧＦ剤、抗ＰＧＤＦ剤またはステロイド、例えば、コルチコステロイドである。本明細書で使用する場合、この抗ＶＥＧＦ剤または抗ＰＤＧＦ剤は、ＶＥＧＦ経路の活性を阻害するかまたは減少させる小分子、ペプチド、抗体または核酸であり得る。一実施形態では、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ経路の構成要素、例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体の活性を阻害するかまたは減少させる抗体である。一実施形態では、この抗ＰＤＧＦ剤は、ＰＤＧＦ経路の構成要素、例えば、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ受容体の活性を阻害するかまたは減少させる抗体である。
任意の本明細書に記載の製剤において、製剤は、室温またはそれ未満、例えば、約２０℃またはそれ未満の温度で安定である。一実施形態では、製剤は、２０℃またはそれ未満、１０℃またはそれ未満、８℃またはそれ未満、４℃またはそれ未満、２℃またはそれ未満、−２０℃またはそれ未満、−６５℃またはそれ未満、−８０℃またはそれ未満、−１００℃またはそれ未満で安定である。一実施形態では、製剤は、２〜２０℃、例えば、２〜８℃で安定である。一実施形態では、製剤は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１６ヶ月、少なくとも２０ヶ月、少なくとも２４ヶ月、または少なくとも３６ヶ月にわたって安定である。一実施形態では、製剤は、−６５℃またはそれ未満の温度で少なくとも１または２年にわたって安定である。一実施形態では、製剤は、２〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月にわたって安定である。
ＩＬ−６抗体
任意の本明細書に記載の製剤において、ＩＬ−６抗体分子、例えば、抗体もしくはその断片は、表１あるいは図１Ａまたは１Ｂに提供される配列またはその部分を含む。一実施形態では、ＩＬ−６抗体分子、例えば、抗体もしくはその断片は、配列番号１９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号２２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２３の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む。別の実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；ならびに配列番号２２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２３の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号２８または配列番号２９に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である定常領域配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号２８または配列番号２９を含む定常領域配列を含む（例えば、からなる）。
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１７に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１７を含む重鎖可変領域配列を含む（例えば、からなる）。
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１３に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１３を含む重鎖配列を含む（例えば、からなる）。
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１８に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖可変領域配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１８を含む軽鎖可変領域配列を含む（例えば、からなる）、または
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１４に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１４を含む軽鎖配列を含む（例えば、からなる）。
一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む（例えば、からなる）。一実施形態では、ＩＬ−６抗体もしくはその断片は、配列番号１３を含む重鎖配列および配列番号１４を含む軽鎖配列を含む（例えば、からなる）。
一実施形態では、この抗ＩＬ−６抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、このＩＬ−６抗体は全長抗体である。本明細書にさらに記載されるように、ＩｇＧ２抗体は、抗体の重鎖と軽鎖との間の代替的ジスルフィド結合に起因する異なる構造的アイソフォーム、例えば、本明細書でアイソフォームＡ、アイソフォームＡ／ＢまたはアイソフォームＢとも呼ばれる、アイソフォームＩｇＧ２−Ａ、アイソフォームＩｇＧ２−Ａ／ＢおよびアイソフォームＩｇＧ２−Ｂで存在し得る。これらのアイソフォームの構造は、図１１にも示される。
一実施形態では、製剤に存在する抗体のうちの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、合わせて、アイソフォームＡまたはＡ／Ｂである。一実施形態では、製剤に存在する抗体のうちの少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％がアイソフォームＡである。一実施形態では、製剤に存在する抗体のうちの５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満がアイソフォームＢである。一実施形態では、製剤は、アイソフォームＢで存在する抗体を実質的に含まず、例えば、存在する抗体のうち５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満または０．５％未満がアイソフォームＢである。アイソフォームＡ、Ａ／Ｂ、および／またはＢで製剤中に存在する抗体の百分率、量（ａｍｏｕｎｔ）または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）は、ＨＰＬＣ、例えば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、または非還元条件下でのペプチド（ｐｅｐｔｉｉｄｅ）マッピングとその後の質量分析的（ＭＳ）分析とによって決定され得る。
治療適用
ＩＬ−６関連疾患または障害を有する被験体を処置するための組成物および方法もまた、本明細書で提供される。この方法は、本明細書に記載される製剤を含む組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む。実施形態では、この方法は、本明細書に記載されるＩＬ−６関連疾患または障害を有する被験体を同定すること；および本明細書に記載される製剤を含む組成物の治療有効量をこの被験体に投与することを含む。
被験体においてＩＬ−６活性を阻害する方法もまた、本明細書に記載される。この方法は、本明細書に記載される製剤を被験体に投与することを含む。実施形態では、この被験体は、本明細書に記載されるＩＬ−６関連疾患または障害を有する。
被験体においてＩＬ−６関連疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造における、例えば、被験体においてＩＬ−６関連疾患または障害を処置または予防するための、被験体への投与に適切な医薬の製造における、本明細書に記載される組成物の使用もまた、本明細書に開示される。実施形態では、この医薬は、眼への投与、例えば、眼性投与のためのものである。
例えば、本明細書に記載される組成物または製剤を投与することによって処置するための、ＩＬ−６関連疾患または障害は、増加したまたは上昇したＩＬ−６発現または活性と関連し得る。一実施形態では、このＩＬ−６関連疾患または障害の１つまたは複数の症状は、増加したまたは上昇したＩＬ−６発現または活性と関連する。増加したまたは上昇したＩＬ−６発現は、疾患または疾患の症状の発症前のＩＬ−６発現のレベルと比較して、被験体において決定され得る。増加したまたは上昇したＩＬ−６発現は、ＩＬ−６関連疾患または障害を有さない別の被験体と比較して、被験体において決定され得る。ＩＬ−６関連疾患の例には、これらに限定されないが、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（例えば、ウエット型（滲出型）もしくはドライ型（萎縮型）ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、角膜移植、角膜上皮剥離、近視性脈絡膜血管新生、眼性がん（例えば、眼または眼の周辺の領域、例えば、眼窩および／または眼瞼を冒すがん）または眼に対する物理的傷害が含まれる。
一部の実施形態では、第２の治療剤が、本明細書に記載される製剤と組み合わせて被験体に投与される。一実施形態では、この第２の治療剤は、本明細書に記載される製剤とは別の組成物で投与される。一実施形態では、本明細書に記載される製剤は、第２の治療剤を含む。適切な第２の治療剤には、本明細書に記載されるＩＬ−６関連疾患または障害を処置するための、市販のまたは公知の任意の治療剤が含まれる。一実施形態では、この第２の治療剤は、抗ＶＥＧＦ剤、抗ＰＤＧＦ剤またはステロイドである。
一般に、本明細書に記載されるように処置される被験体は、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、イヌまたはネコである。一部の実施形態では、この被験体は、抗ＶＥＧＦ剤またはステロイドで以前に処置されている。一部の実施形態では、この被験体は、抗ＶＥＧＦ剤またはステロイド処置に対して耐性または不応性であり、例えば、この被験体は、抗ＶＥＧＦ剤またはステロイドによる処置に応答しなかった。実施形態では、所与の処置に応答しない被験体は、疾患または障害、例えば、ＩＬ−６関連疾患の１つまたは複数の症状が、所与の処置の投与後に好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）も低減もされない被験体である。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される製剤を含むデバイス、例えば、薬物送達デバイスを特徴付ける。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される製剤を含む容器またはデバイスを特徴付ける。一実施形態では、この容器は多用量容器である。一実施形態では、この容器は、０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．３ｍｌ、０．４ｍｌ、０．５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．７ｍｌ、０．８ｍｌ、０．９ｍｌまたは１．０ｍｌの容積を保持する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される製剤、および任意選択で、使用のための指示を含むキットを特徴付ける。一実施形態では、このキットは、本明細書に記載される製剤を含む１つまたは複数の容器またはデバイス、および任意選択で、使用のための指示を含む。
特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」とは、その冠詞の文法的対象のうちの１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指す。例として、「１つの（ａｎ）要素」とは、１つの要素または１つよりも多くの要素を意味する。
用語「約」とは、例えば、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合、特定された値からの、±２０％、または一部の例では±１０％、または一部の例では±５％、または一部の例では±１％、または一部の例では±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示された方法を実施するために適切である。
本明細書で引用される全ての特許、公開された特許出願および公開された参考文献は、全ての目的のために参照によって組み込まれる。
図１Ａは、ＥＢＩ−０２９（配列番号１）、ＥＢＩ−０３０（配列番号１３）およびＥＢＩ−０３１（ＥＢＩ−０３１は、本明細書でＥＢＩ−０３０−Ｈ３１１Ａとも呼ばれる）（配列番号２５）の重鎖配列中のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の位置を示す。
図１Ｂは、軽鎖配列（ＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０およびＥＢＩ−０３１は、同じ軽鎖配列を有する）（配列番号３）中のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４およびＣＫの位置を示す。
図２Ａおよび２Ｂは、試験した異なる緩衝液に従って増加するｐＨ（図２Ａ）または試験した異なる賦形剤（図２Ｂ）を用いた、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した主要ピーク純度（％）間の関係を示すグラフである。 図２Ａおよび２Ｂは、試験した異なる緩衝液に従って増加するｐＨ（図２Ａ）または試験した異なる賦形剤（図２Ｂ）を用いた、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した主要ピーク純度（％）間の関係を示すグラフである。
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、実施例３に記載される、７日目に実施したＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を示す。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、実施例３に記載される、７日目に実施したＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を示す。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、実施例３に記載される、７日目に実施したＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を示す。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、実施例３に記載される、７日目に実施したＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を示す。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、実施例３に記載される、７日目に実施したＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を示す。
図４は、試験した異なる緩衝液に従って増加するｐＨを用いた、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した主要ピーク純度（％）間の関係を示すグラフである。試験した各緩衝液は、図４に示す、９６ウェルプレートレイアウトからのウェル指定によってｘ軸上に示される。
図５は、試験した異なる緩衝液に従って増加するｐＨを用いた、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定したＨＭＷピーク間の関係を示すグラフである。試験した各緩衝液は、図４に示す、９６ウェルプレートレイアウトからのウェル指定によってｘ軸上に示される。
図６は、ヒスチジン緩衝液を含有する試料についての、異なる塩濃度および賦形剤に関する主要ピーク純度（％）を示すグラフである。ｘ軸上の数１〜１２は、図４に列挙される列１〜１２中に存在する塩濃度および賦形剤を示す。
図７は、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した、実施例４に記載される第１の撹拌研究からの結果をまとめる。
図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した、実施例４に記載される第２の撹拌研究からの結果をまとめる。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した、実施例４に記載される第２の撹拌研究からの結果をまとめる。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって決定した、実施例４に記載される第２の撹拌研究からの結果をまとめる。
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、使用した異なる撹拌条件下での試験した各賦形剤に関する総ピーク面積（図９Ａ）、ＩｇＧ主要ピーク純度（図９Ｂ）、高分子量（ＨＭＷ）種（図９Ｃ）および低分子量（ＬＭＷ）種（図９Ｄ）を示すグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、使用した異なる撹拌条件下での試験した各賦形剤に関する総ピーク面積（図９Ａ）、ＩｇＧ主要ピーク純度（図９Ｂ）、高分子量（ＨＭＷ）種（図９Ｃ）および低分子量（ＬＭＷ）種（図９Ｄ）を示すグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、使用した異なる撹拌条件下での試験した各賦形剤に関する総ピーク面積（図９Ａ）、ＩｇＧ主要ピーク純度（図９Ｂ）、高分子量（ＨＭＷ）種（図９Ｃ）および低分子量（ＬＭＷ）種（図９Ｄ）を示すグラフである。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、使用した異なる撹拌条件下での試験した各賦形剤に関する総ピーク面積（図９Ａ）、ＩｇＧ主要ピーク純度（図９Ｂ）、高分子量（ＨＭＷ）種（図９Ｃ）および低分子量（ＬＭＷ）種（図９Ｄ）を示すグラフである。
図１０は、ジスルフィドシャッフリングに起因するＩｇＧ２抗体の３つの異なる構造的アイソフォームの模式図を示す。
図１１は、ＥＢＩ−０３１試料：未処理（上のパネル）、５ｍＭ ＤＴＴ（中央のパネル）、１０ｍＭシステイン（下のパネル）のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図１２は、異なるＥＢＩ−０３１細胞株：クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物（上のパネル）、親細胞株由来の１０Ｌスケールの培養物（中央のパネル）、および細胞の安定にトランスフェクトされたプール（下のパネル）から収集したＥＢＩ−０３１試料のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図１３は、クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物から収集したＥＢＩ−０３１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、どのアイソフォームがクロマトグラム中の各ピークによって示されるかを指定し、定量化している。
ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６抗体またはその断片を、かかる製剤による処置を必要とする被験体に提供するために有用な製剤が、本明細書で提供される。実施形態では、この被験体は、ＩＬ−６関連疾患もしくは障害、例えば、上昇したもしくは増加したＩＬ−６発現および／もしくは活性と関連する疾患を有するか、またはかかる疾患を有する危険性がある。かかる製剤を調製および投与する方法もまた、本明細書に開示される。
本明細書に記載される製剤は、患者への投与に適切であるように、ならびに変動する温度および延長された期間における改善された安定性を提供するために、製剤化および最適化されている。
特に、ＩｇＧ２抗体に由来する定常領域、例えば、本明細書に記載されるＩｇＧ２定常領域を含むＩＬ−６抗体を含む本明細書に記載される製剤では、製剤は、最適な分布の異なるＩｇＧ２構造的アイソフォーム、例えば、主にアイソフォームＡおよびアイソフォームＡ／Ｂ、ならびにごく僅かなまたは無視できる量のアイソフォームＢを含む。構造的アイソフォームＢは、抗体の凝集、減少した機能および減少した安定性と関連し得る。したがって、本発明の抗体を含む組成物および製剤は、当該分野で公知のＩｇＧ２抗体を含む他の組成物または製剤よりも不均一性が低い。
ＩＬ−６アンタゴニスト
本開示は、本明細書でＩＬ−６ａとも呼ばれるＩＬ−６アンタゴニストの送達のための製剤を提供する。一般に、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニスト（ＩＬ−６ａ）は、ＩＬ−６に結合でき、少なくとも１つのＩＬ−６活性を阻害するかまたは低減させる。ＩＬ−６活性には、以下のうちの１つまたは複数が含まれ得る：ｇｐ１３０への結合；ＩＬ−６シグナル伝達経路の活性化；ＪＡＫキナーゼの活性化、例えば、ＪＡＫキナーゼの標的のリン酸化；ＳＴＡＴタンパク質の活性化、例えば、ＳＴＡＴタンパク質のリン酸化；および／またはＳＴＡＴ標的遺伝子の発現。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩ（部位２）に特異的に結合し、ＩＬ−６関連疾患、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６関連眼疾患およびある特定の他の疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、以下の特性のうちの１つまたは複数を特色とする：遊離ＩＬ−６（例えば、可溶性ＩＬ−６）もしくは結合したＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６受容体に結合したＩＬ−６）のいずれか、または遊離ＩＬ−６および結合したＩＬ−６の両方に対する高い親和性を有する；生物中で比較的安定である；ＩＬ−６Ｒに結合したＩＬ−６（本明細書で、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒと呼ぶ）の、ｇｐ１３０への結合を阻害できる；ならびに／あるいは治療効果を有し得る。
一実施形態では、このＩＬ−６ａは、抗体である、または抗体に由来する断片である。例えば、ＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに特異的に結合できる高親和性のヒト化Ｆａｂであり、シス−ＩＬ−６シグナル伝達およびトランス−ＩＬ−６シグナル伝達の両方を強力に遮断する。別の例では、このＩＬ−６ａは、全長抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。
一実施形態では、ＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに選択的に結合し、ＩＬ−６シグナル伝達の広い阻害を提供するが、それは、かかる分子が、ＩＬ−６が遊離であるか膜のＩＬ−６ＲまたはｓＩＬ−６Ｒに結合しているかに関わらず、ＩＬ−６へのｇｐ１３０の結合を阻害できるからである。さらに、ＩＬ−６受容体とは反対にリガンド（ＩＬ−６）を標的化することで、受容体媒介性のクリアランスおよびＡＤＣＣ（抗体依存的細胞媒介性細胞傷害）に起因する毒性を回避できる。
ＩＬ−６は、疾患において病理的役割および保護的役割の両方を果たすので、増加したＩＬ−６に関連する疾患を処置するためのＩＬ−６アンタゴニスト（ＩＬ−６ａ）の使用は、状態のある特定の態様を改善できるが、顕著な有害作用、例えば全身作用もまた引き起こし得る。ＩＬ−６経路のこの二重性（即ち、望ましいおよび／または望ましくない作用を有する能力）は、全身性阻害剤を用いてＩＬ−６関連障害を処置することを望ましくないものにし得る。したがって、本明細書で提供される組成物および方法は、少なくとも１つのＩＬ−６活性を阻害するが、ＩＬ−６の正の活性に対して過度の影響を有さない処置のために有用であり得るが、これは一部には、これらの組成物が、局所的送達、例えば、眼への局所的送達のために製剤化され得るからである。例えば、ある特定の態様では、このＩＬ−６ａは、特定の部位への送達のために適切なサイズのものであるように設計される。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは全長抗体である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、抗体に由来し、眼の特定のコンパートメント、例えば、眼の硝子体におけるより長い滞留性および限定的な全身性漏出を有し得る形式である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、対応する未改変の抗体と比較して、眼の硝子体におけるより長い滞留性および／またはより限定的な全身性漏出を有する改変された抗体（例えば、改変されたＦｃドメインを有する抗体）である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａはＩｇＧ２抗体である。
一部の態様では、このＩＬ−６ａは、比較的小さいＩＬ−６ａ、例えば、ＩＬ−６抗体の断片、または全長抗体未満である抗体の他の誘導体、例えば、ＩＬ−６抗体に由来するＦａｂである。一部の場合には、ＩＬ−６ａは、組織の１つの部分から、対応する全長ＩＬ−６抗体と比較して増加した動態で別の部分へと通過できる形式である。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、Ｆａｂ単独と比較して、それが送達される位置における増加した滞留を有する可能性がより高いより大きい分子になるように工学的に操作されたＦａｂであり、例えば、このＩＬ−６ａは、Ｆｃドメインを介してダイマー化される。ある特定の実施形態では、このＦｃドメインは、Ｆｃ部分が、野生型Ｆｃを含む同じＩＬ−６結合性実体と比較して全身蓄積を低減させ得る消失または低減されたＦｃＲｎ結合を有するように工学的に操作されている。この操作されたＦｃドメインは、例えば、ＩｇＧ１ドメインまたはＩｇＧ２ドメインであり得る。
典型的には、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の少なくとも１つの望ましくない作用を好転させる際に有効であるように、それらの標的ＩＬ−６に対する十分に高い親和性を有し、治療剤として有用であるのに十分に安定である。
一般に、ＩＬ−６ａ、例えば、眼における使用に適切なＩＬ−６ａのＰＫは、治療効果を提供するために、送達の部位、例えば硝子体における、十分に長い半減期を有する。非限定的な例では、ＰＫは、少なくとも８日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間または３０日間の半減期であり得る。
部位ＩＩに結合するＩＬ−６アンタゴニストの同定
一般に、当該分野で公知の任意の方法が、ＩＬ−６に結合し得る分子を生成するために使用され得、例えば、ポリペプチドライブラリーまたは分子ライブラリーが、ＩＬ−６に結合するポリペプチドまたは化合物の能力についてのアッセイにおいて、候補化合物についてスクリーニングされ得る。かかる候補化合物が同定されると、その化合物の結合部位は、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。例えば、分子は、部位Ｉ、部位ＩＩまたは部位ＩＩＩにおいて変異したＩＬ−６に結合するその化合物の能力と比較して、野生型ＩＬ−６に結合する能力および結合について試験され得る。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体に結合する能力およびＩＬ−６に結合する能力を保持し、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒαのｇｐ１３０への結合を防止する。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合することによって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体への結合についてｇｐ１３０と競合し得る。かかる結合活性は、当該分野で公知の方法を使用してアッセイされ得る。
ＩＬ−６ａ候補は、例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６アッセイシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して試験され得る。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−６細胞は、ヒトＩＬ−６ＲおよびＳＴＡＴ３誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞である。ＩＬ−６の存在下では、ＳＴＡＴ３は活性化され、ＳＥＡＰが分泌される。ＳＥＡＰは、例えば、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して評価される。これらの細胞へのＩＬ−６アンタゴニストの添加は、遊離ＩＬ−６および可溶性受容体結合型ＩＬ−６の両方を阻害した結果として、ＳＥＡＰの分泌を防止する、またはＳＥＡＰのレベルを減少させる。
ＫＤとは、特定の抗体−抗原相互作用または抗体断片−抗原相互作用の結合親和性平衡定数を指す。実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片は、２５０ｐＭ未満またはそれと等しい、例えば、２２５ｐＭ、２２０ｐＭ、２１０ｐＭ、２０５ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭもしくは１ｐＭ未満またはそれと等しいＫＤで、抗原（例えば、ＩＬ−６）に結合する。ＫＤは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）システムを例えば使用する表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。
Ｋｏｆｆとは、特定の抗体−抗原相互作用または抗体断片−抗原複合体の解離速度定数を指す。解離速度定数は、例えばＢｉａＣｏｒｅ（商標）システムを使用する表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。比較的緩徐なＫｏｆｆは、治療剤の望ましい特色に寄与し得る、例えば、かかる処置を必要とする被験体への阻害剤のより低頻度の投与を可能にする。
特異性
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、標的、例えばＩＬ−６に特異的に結合する。一般に、「特異的結合」は、本明細書で使用する場合、分子が、選択された分子に優先的に結合し、１または複数の他の分子に対してはるかに低い結合親和性を示すことを示す。実施形態では、別の分子に対する結合親和性は、標的に対する結合親和性よりも、１桁、２桁、３桁またはそれを超える桁数だけ低い。
上で議論したように、ＩＬ−６は、遊離ＩＬ−６として、および可溶性ＩＬ−６Ｒαに結合したＩＬ−６として存在し得る。本出願人らは、ＩＬ−６の部位Ｉに結合する阻害剤と比較して、ＩＬ−６アンタゴニストに対する最適な標的として、ＩＬ−６の部位ＩＩを同定した。部位Ｉ阻害剤は、ＩＬ−６Ｒαへの遊離ＩＬ−６の結合を阻害し得る。しかし、かかる阻害剤は、既にあるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によって開始される活性を、この複合体のＫｏｆｆによって限定される置き換えによる場合を除き防止することができない。別の選択肢、ＩＬ−６Ｒαに結合する阻害剤は、飽和濃度で存在しない限り、ＩＬ−６活性を防止するその能力が限定的であり得るので、あまり適切ではない。ＩＬ−６受容体の量は一般に、ＩＬ−６の量と比較して非常に高いので、このアプローチは、受容体に結合することによってＩＬ−６活性を阻害する組成物を望ましくない大量に投与することを必要とし得る。実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニスト（例えば、本明細書に記載される抗体ならびにその断片および誘導体）は、ＩＬ−６がＩＬ−６Ｒに結合している場合であっても、ＩＬ−６の活性を遮断できる。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａの利点は、ＩＬ−６受容体を標的化する阻害剤と比較して、比較的少量の組成物が、治療効果を達成するために投与される必要があり得ることである。抗受容体抗体は、それらのＰＫを顕著に限定する受容体媒介性クリアランスによって迅速に取り除かれ、したがって、より多い用量、より頻繁な投薬またはそれら両方を必要とすることが報告されている。したがって、抗受容体ＩＬ−６抗体および抗部位Ｉ ＩＬ−６抗体の両方は、リガンドの正常な受容体媒介性クリアランス経路を妨害することによってＩＬ−６の組織濃度を顕著に増加させ、それによって、組織中の潜在的に望ましくないレベルのＩＬ−６に被験体を曝露させるという点において、問題を有する。さらに、ＩＬ−６Ｒαを標的化する阻害剤の使用は、阻害が求められる部位および望ましくない部位の両方の近傍での阻害剤の存在、例えば全身処置を必要とし得る。ｇｐ１３０が結合する部位である部位ＩＩに結合するＩＬ−６ａの使用は、遊離ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒに結合しているが、ｇｐ１３０を介したＩＬ−６経路を未だ活性化していないＩＬ−６を介した阻害を可能にする。したがって、理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載されるＩＬ−６アンタゴニストは、両方の形態のＩＬ−６（可溶性および受容体結合型）に結合するように設計され、具体的には、これらのＩＬ−６アンタゴニストは、両方の形態においてアクセス可能である、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合する。本明細書に記載されるＩＬ−６ａを含有する組成物は、ＩＬ−６によるシスシグナル伝達およびトランスシグナル伝達の両方を阻害できる。
一部の場合、本明細書で提供される化合物および方法は、ＩＬ−６関連障害の少なくとも１つの徴候または症状を処置する、例えば、血管形成および／または炎症を阻害するために十分な、有効なＩＬ−６遮断を提供するように設計される。
本明細書に記載される化合物は、例えば硝子体中の、望ましくなく高いレベルのＩＬ−６を特徴とする眼疾患を処置するために有用である（Ｙｕｕｋｉら、Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌ １５巻：２５７頁（２００１年）；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１０巻：１６９０頁、（２００３年）；Ｏｈら、Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３５巻：１１１６頁（２０１０年）；Ｎｏｍａら、Ｅｙｅ ２２巻：４２頁（２００８年）；Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ５１巻：１００頁（２００７年）；Ｋａｕｆｆｍａｎら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５巻：９００頁（１９９４年）；Ｍｉａｏら、Ｍｏｌｅｃ Ｖｉｓ １８巻：５７４頁（２０１２年）を参照のこと）。
一般に、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６シグナル伝達の強力なアンタゴニストである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６に対する高い親和性、例えば、１０ｐＭのＩＬ−６を使用するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＩＬ−６アッセイにおいて、１００ｐＭ未満またはそれと等しいＩＣ５０を有する。ＩＬ−６ａの高い親和性は、ＩＬ−６ａのＫＤ、例えば、１ｎＭ未満もしくはそれと等しい、５００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、４００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、３００ｐＭ未満もしくはそれと等しい、２４０ｐＭ未満もしくはそれと等しい、または２００ｐＭ未満もしくはそれと等しいＫＤに基づいて決定され得る。
増加したＩＬ−６の発現または活性に関連する障害を処置するために有用な生物的ＩＬ−６ａ（例えば、タンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体、その断片または誘導体）を産生するために、典型的には、この生物的ＩＬ−６ａは、高い産生性を有することが望ましい。例えば、適切な産生性は、１ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい（例えば、２ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい、５ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい、または１０ｇ／Ｌ超もしくはそれと等しい）。
ＩＬ−６アンタゴニストを有効に投与するために、この阻害剤は、投与される濃度と適合性の溶解度を有することが必要である。例えば、全長抗体ＩＬ−６ａの場合、溶解度は、２０ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、１０ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、５ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい、または１ｍｇ／ｍｌ超もしくはそれと等しい。
さらに、実行可能な処置であるために、この阻害剤は、送達部位および活性部位の体温における高い安定性、ならびに貯蔵安定性を有さなければならない。実施形態では、この阻害剤は、６０℃超もしくはそれと等しい（例えば、６０℃超もしくはそれと等しい、６２．５℃超もしくはそれと等しい、６５℃超もしくはそれと等しい、７０℃超もしくはそれと等しい、７３℃超もしくはそれと等しい、または７５℃超もしくはそれと等しい）Ｔｍを有する。実施形態では、この阻害剤は、４５℃超もしくはそれと等しい、例えば、５０℃超もしくはそれと等しい、５１℃超もしくはそれと等しい、５５℃超もしくはそれと等しい、または６０℃超もしくはそれと等しいＴｏｎｓｅｔを有する。ＴｍおよびＴｏｎｓｅｔを決定する方法は、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。
所望の特色を有するアンタゴニストは、当該分野で公知の適切な型の分子、例えば、親ＩＬ−６抗体の十分な特色（例えば、所望の結合特性）を一般に保持または維持するＩＬ−６部位ＩＩ標的化抗体の断片および誘導体を含む抗体から、選択され得る。かかるアンタゴニストには、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、Ｆｃ部分を含むように工学的に操作されたＦａｂ断片、および親ＩＬ−６部位ＩＩ標的化抗体とは異なるフレームワークを有するように工学的に操作された全長抗体が含まれる。
一部の態様では、本明細書に開示されるＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合し得る抗体またはその断片と競合または交差競合し得るヒト抗体の抗原結合部位を含む。例えば、抗体またはその断片は、本明細書に開示されるＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成され得、このＶＨおよびＶＬドメインは、本明細書に開示されるＩＬ−６／部位ＩＩ結合性抗体のＣＤＲのセットを含む。
任意の適切な方法は、例えば、ＩＬ−６上の種々の部位を変異させることによって、ＩＬ−６ａが結合するドメインおよび／またはエピトープを決定するために使用され得る。変異がＩＬ−６ａとＩＬ−６リガンドとの結合を防止または減少させる部位は、ＩＬ−６ａへの結合に直接関与するか、または例えばＩＬ−６のコンフォメーションに影響を与えることによって、結合部位に間接的に影響を与えるかのいずれかである。他の方法が、ＩＬ−６ａが結合するアミノ酸を決定するために使用され得る。例えば、ＰＥＰＳＣＡＮベースの酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのペプチド結合スキャンが使用され得る。この型のペプチド結合スキャンでは、抗原に由来する短い重複するペプチドが、結合メンバーへの結合について体系的にスクリーニングされる。これらのペプチドは、ペプチドのアレイを形成するために、支持体表面に共有結合的にカップリングされ得る。ペプチドは、線状または制約されたコンフォメーションであり得る。制約されたコンフォメーションは、ペプチド配列の各末端に末端システイン（ｃｙｓ）残基を有するペプチドを使用して産生され得る。これらのｃｙｓ残基は、ペプチドがループ型コンフォメーションで保持されるように、支持体表面に直接的または間接的に共有結合的にカップリングされ得る。したがって、この方法で使用されるペプチドは、抗原の断片に対応するペプチド配列の各末端に付加されたｃｙｓ残基を有し得る。ｃｙｓ残基がペプチド配列の中央部またはその近傍にさらに位置する二重ループ型ペプチドもまた、使用され得る。これらのｃｙｓ残基は、ペプチドが二重ループ型コンフォメーションを形成するように、支持体表面に直接的または間接的に共有結合的にカップリングされ得、１つのループは、中心ｃｙｓ残基のそれぞれの側にある。ペプチドは、合成により生成され得、したがって、ｃｙｓ残基は、ＩＬ−６部位ＩＩ配列中に天然には存在しないにもかかわらず、所望の位置において工学的に作製され得る。任意選択で、線状および制約されたペプチドは共に、ペプチド結合アッセイでスクリーニングされ得る。ペプチド結合スキャンは、結合メンバーが結合するペプチドのセットを（例えばＥＬＩＳＡを使用して）同定することであって、これらのペプチドは、ＩＬ−６ａの断片に対応するアミノ酸配列を有する（例えば、ＩＬ−６ａの約５、１０または１５連続する残基を含むペプチド）こと、および結合メンバーが結合した残基のフットプリントを決定するためにペプチドを整列させることであって、このフットプリントは、重複するペプチドに共通する残基を含むこと、を含み得る。あるいは、またはさらに、このペプチド結合スキャン法は、少なくとも選択されたシグナル：ノイズ比でＩＬ−６ａが結合するペプチドを同定するために使用され得る。
例えば、部位特異的変異誘発（例えば、本明細書に記載されるとおり）、水素重水素交換、質量分析、ＮＭＲおよびＸ線結晶解析が含まれる、当該分野で公知の他の方法が、抗体が結合する残基を決定するためおよび／またはペプチド結合スキャン結果を確認するために使用され得る。
典型的には、本明細書に記載されるように有用なＩＬ−６ａは、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子、またはそれらの結合性断片である。一般に、この抗体は、モノクローナル抗体である。かかる抗体の起源は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類（ｃａｍｅｌｉｄ）、ウサギ、ヒツジ、ブタまたはウシであり得、当業者に公知の方法に従って生成され得る。
用語「抗体分子」とは、本明細書で使用する場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体分子は、全長抗体またはその断片、例えば、その抗原結合性断片であり得る。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、複数鎖もしくは単鎖、またはインタクトな免疫グロブリンであり得、天然供給源または組換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子のテトラマーであり得る。抗体断片または抗原結合性断片とは、インタクトな抗体の少なくとも一部分、またはその組換えバリアントを指し、抗原結合性ドメイン、例えば、抗原などの標的の認識およびかかる標的への抗体断片の特異的結合を付与するのに十分な、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ならびにヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの、抗体断片から形成される多特異性抗体、ならびに抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合性断片が含まれるがこれらに限定されない。抗原結合性断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ中にも取り込まれ得る（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻：１１２６〜１１３６頁、２００５年を参照のこと）。抗原結合性断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場中へも移植され得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。
例示的なＩＬ−６抗体
一般に、ＩＬ−６ａは、ＩＬ−６（例えば、ヒトＩＬ−６）に、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに特異的に結合し得る抗体の少なくともＣＤＲを含む。本発明のＣＤＲまたはＣＤＲのセットを保有するための構造は、抗体の重鎖もしくは軽鎖配列またはそれらの実質的な部分であり得、ここで、このＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔら、１９８３年（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、および任意のインターネット検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」の下で見出され得るそのアップデートを参照して、決定され得る。
本明細書に開示されるＩＬ−６ａは、典型的には、抗体ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを一般に含む抗体分子である。ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ（ＶＨ ＣＤＲ）のセットを含み、ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ（ＶＬ ＣＤＲ）のセットを含む。かかるＣＤＲの例は、実施例中で本明細書に提供される。抗体分子は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含み得る。これは、あるいは、またはまた、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含み得る。
本明細書に開示されるものなどのＶＨ ＣＤＲ１および／もしくはＶＨ ＣＤＲ２および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３ならびに／または本明細書に開示されるものなどのＶＬ ＣＤＲ１および／もしくはＶＬ ＣＤＲ２および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３を含むＩＬ−６アンタゴニストが、本明細書に開示される。このＩＬ−６ａは、本明細書に記載される抗体、断片または誘導体のうちいずれかの１つまたは複数、例えば、１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み得る。このＩＬ−６ａは、ＶＨ ＣＤＲのセット（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３）を含み得、任意選択で、ＶＬ ＣＤＲのセット（例えば、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３）もまた含み得る。これらのＣＤＲは、本明細書に記載される１または複数の抗体、断片または誘導体に由来し得る。例えば、これらのＶＬ ＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲと同じまたは異なる抗体に由来し得る。
一般に、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対形成して、抗体の抗原結合部位を提供する。例えば、配列番号１、配列番号１３または配列番号２５のＨＣドメインは、配列番号３のＬＣドメインと対形成する。一部の場合には、ＶＨまたはＶＬドメイン単独が、ＩＬ−６ａとして使用され得る。
一態様では、
（ｉ）ＧＹＸ１ＬＸ２ＮＹＬＩＥ（配列番号３０）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＶＸ３ＴＰＧＸ４ＧＴＩＮ（配列番号３１）の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、
（ここで、以下のうちの１つもしくは複数（例えば、１、２、３、または全て）が真である：Ｘ１がＡでない、Ｘ２がＳでない、Ｘ３がＩでない、およびＸ４がＳでない）を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体または抗原結合断片が、本明細書に提供される。ある実施形態では、Ｘ１がＡでない、Ｘ２がＳでない、Ｘ３がＩでない、かつＸ４がＳでない。
ある実施形態では、Ｘ１は、ＶまたはＶの保存的置換である。ある実施形態では、Ｘ２は、ＰまたはＰの保存的置換である。ある実施形態では、Ｘ３は、ＴまたはＴの保存的置換である。ある実施形態では、Ｘ４は、ＧまたはＧの保存的置換である。ある実施形態では、以下のうちの１、２、３、または全てが真である：Ｘ１がＶまたはＶの保存的置換である、Ｘ２がＰまたはＰの保存的置換である、Ｘ３がＴまたはＴの保存的置換である、およびＸ４がＧまたはＧの保存的置換である。ある実施形態では、Ｘ１がＶまたはＶの保存的置換である、Ｘ２がＰまたはＰの保存的置換である、Ｘ３がＴまたはＴの保存的置換である、かつＸ４がＧまたはＧの保存的置換である。
ある実施形態では、Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択される。ある実施形態では、Ｘ１は、Ｖ、ＩおよびＬから選択される。ある実施形態では、Ｘ２は、Ｐ、Ｇ、およびＡから選択される。ある実施形態では、Ｘ２は、ＰおよびＧから選択される。ある実施形態では、Ｘ３は、ＴおよびＳから選択される。ある実施形態では、Ｘ４は、ＧおよびＰから選択される。
ある実施形態では、以下のうちの１つもしくは複数（例えば、１、２、３、または全て）が真である：Ｘ１がＶである、Ｘ２がＰである、Ｘ３がＴである、およびＸ４がＧである。ある実施形態では、Ｘ１がＶである、Ｘ２がＰである、Ｘ３がＴである、かつＸ４がＧである。
ある実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号２１の配列を含む。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列（以下のうちの１つもしくは複数（例えば、１、２、３、または全て）が真である：Ｘ１がＡである、Ｘ２がＳである、Ｘ３がＩである、およびＸ４がＳである）を含む抗体または抗原結合断片（例えば、それ以外については同一な抗体または抗原結合断片）と比較してヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。
一部の実施形態では、単離された抗体分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号７の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および任意選択で、配列番号９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、単離された抗体もしくはその抗体断片は、ＣＤＲ、例えば、配列番号７、配列番号８または配列番号９のうちの１つ、２つまたは全てのそれぞれにおいて３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる。
一部の実施形態では、単離された抗体分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号１９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および任意選択で、配列番号２１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、単離された抗体もしくはその抗体断片は、ＣＤＲ、例えば、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のうちの１つ、２つまたは全てのそれぞれにおいて３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる。
一部の実施形態では、単離された抗体分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号９または２２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０または２３の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１または２４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、単離された抗体もしくはその抗体断片は、ＣＤＲ、例えば、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のうちの１つ、２つまたは全てのそれぞれにおいて３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる。
ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるか、または配列番号５から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる配列からなる。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５から１〜５アミノ酸だけ異なる。
ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７に同一である少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列からなる。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる。ある実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１７を含む重鎖可変領域配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１７からなる重鎖可変領域配列を含む。
ある実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるか、または配列番号１８から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる配列からなる。ある実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８から１〜５アミノ酸だけ異なる。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、配列番号１５に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１５から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１５から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１５を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂである。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、配列番号１６に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１６から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１６から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１６を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂである。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。ある実施形態では、抗体または抗原結合は、配列番号２６または配列番号２７において提供されるｓｃＦｖ配列を含むかまたはこれからなる。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６または配列番号２７に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６または２７から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６または２７から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６または配列番号２７を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、配列番号１３に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１３から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる重鎖配列を含む。ある実施形態では、重鎖配列は、配列番号１３から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１３を含む重鎖配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１３からなる重鎖配列を含む。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、配列番号１４に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１４から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なる軽鎖配列を含む。ある実施形態では、軽鎖配列は、配列番号１４から２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸だけ異なり、ここで、アミノ酸変化は、いずれのＣＤＲにおけるものでもない。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１４を含む軽鎖配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１４からなる軽鎖配列を含む。
ある実施形態では、抗体分子、例えば、抗体または抗原結合断片は、表１に提供される通りのＥＢＩ−０２９、ＥＢＩ−０３０またはＥＢＩ−０３１の１つもしくは複数の配列を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、図１に示される通りのＥＢＩ−０３０またはＥＢＩ−０３１の１つもしくは複数のドメイン（例えば、重鎖配列のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３および／または軽鎖配列のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、およびＣＫのうちの１つもしくは複数）を含む。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を含む。ある実施形態では、重鎖および軽鎖は、１つもしくは複数のジスルフィド結合によって連結されている。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂである。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖまたはＦｖ断片である。
実施形態では、この抗体分子、例えば、抗体または抗原結合性断片は、ＥＢＩ−０２９の１つもしくは複数の対応する配列、またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４９０５に記載される抗体の配列を含む抗体もしくは抗原結合性断片と比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、トシリズマブと比較して、ヒトＩＬ−６に対する増加した親和性および／または増加した効力を有する。
一部の態様では、このＩＬ−６ａは、以下を含む、抗体分子、その断片または誘導体である：（ｉ）本明細書に記載されるＶＨドメイン（例えば、配列番号１７）と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン配列、または（ｉｉ）ＶＨドメイン配列由来のＶＨ ＣＤＲのセット（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３）。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号１７のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号１７のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３とは１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が合計で異なる、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む。
この抗体分子、その断片または誘導体は、任意選択で以下もまた含み得る：（ｉ）本明細書に記載されるＶＬドメイン、例えば、配列番号１８のＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメイン配列、または（ｉｉ）ＶＬドメイン由来のＶＬ ＣＤＲのセット（例えば、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３）。実施形態では、この抗体分子、その断片または誘導体は、配列番号１８のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む。実施形態では、この抗体分子、断片または誘導体は、配列番号１８のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とは１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸が合計で異なる、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を計算するために使用され得るアルゴリズムには、例えば、デフォルトパラメーターを使用する、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが含まれる。
本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣＫまたはＣＬ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに、そのＣ末端において付加され得る。同様に、ＶＨドメインに基づくＩＬ−６ａは、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびにアイソタイプサブクラスのうちいずれか、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部（例えば、ＣＨ１ドメイン）に、そのＣ末端において付加され得る。実施形態では、この抗体または抗原結合性断片は、ＡＤＣＣ活性が低減または排除されるように工学的に操作される。
一実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載されるＩｇＧ２フレームワーク、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。
ＩｇＧ２抗体は、３つの主要な構造的アイソフォームとして存在し得る：ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（Ｗｙｐｙｃｈ Ｊ．ら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００８年、２８３巻：１６１９４〜１６２０５頁）。この構造的不均一性は、Ｆａｂアームを重鎖ヒンジ領域に連結するジスルフィド結合の異なる立体配置に起因する。ＩｇＧ２−Ａアイソフォームでは、Ｆａｂアームをヒンジ領域に連結するジスルフィド結合は存在しない。ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは、両方のＦａｂアームが、重鎖および軽鎖をヒンジ領域に連結するジスルフィド結合を有する。ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームは、ＩｇＧ２−ＡアイソフォームとＩｇＧ２−Ｂアイソフォームとの間のハイブリッドであり、一方のＦａｂアームだけが、この一方のＦａｂアームの重鎖および軽鎖をヒンジ領域に連結するジスルフィド結合を有する。ジスルフィドシャッフリングとも呼ばれる、異なる構造的アイソフォームのうちの２つまたは全ての間でのＩｇＧ２抗体の変換が、天然に存在する抗体および組換え抗体の両方について、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで天然に発生する。結果として、当該分野におけるＩｇＧ２抗体の製剤は、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームの不均一な混合物を含む。異なるＩｇＧ２アイソフォームは、独自のおよび異なる機能的特性、例えば、安定性、凝集、粘度、Ｆｃ受容体結合または効力における差異を有し得る。ＩｇＧ２抗体製剤中の、複数のアイソフォームの存在、または特定のアイソフォームの増加したレベルは、安定性、凝集または効力に負の影響を与え得る。ジスルフィドシャッフリングをなおも受けることができ、構造的アイソフォームＡ、Ａ／Ｂおよび／またはＢのいずれかで存在するＩｇＧ２抗体の一部の断片、例えば、ジスルフィド結合のシャッフリングに関与する残基（例えば、図１０に示される）を保持する断片が容易に想定され得、例えば、この断片は、少なくとも１つのＩｇＧ２ヒンジ領域を含む。
本発明は、ＩｇＧ２−ＡまたはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームで主に存在することの利点を有する抗体またはその断片を含む製剤を提供する。抗体またはその断片は、ＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは存在しない、または実質的な量の時間にわたってＩｇＧ２−Ｂアイソフォームでは存在せず、そうすることで、所定の時点で組成物または製剤における非常に低レベルのＩｇＧ２−Ｂアイソフォームをもたらす。したがって、本明細書に記載の抗体を含む組成物および製剤は、当該分野で公知の他のＩｇＧ２抗体よりも不均一性が低く、したがって、治療適用での使用により好ましい。
抗体を含む組成物および製剤は、主に、抗体のＩｇＧ２−Ａおよび／またはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の、抗体のＩｇＧ２−ＡまたはＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、合計で、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の、ＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含む。かかる実施形態では、本明細書に記載される抗体を含む組成物は、実質的な量の、抗体のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含まない。例えば、この組成物は、１０％、５％、２％、１％、０．５％または０．１％未満の、抗体のＩｇＧ２−Ｂアイソフォームを含む。
一部の場合には、本発明の抗体は、特定のアロタイプ、例えば、特定の地理的起源を有する集団において優勢であるアロタイプを有する配列を創出するために、当該分野で公知の方法を使用してさらに改変される。一部の場合には、ヒト重鎖定常領域は、この目的のために改変される。
ＩＬ−６ａは、抗体分子、その結合性断片、または抗体フレームワーク内に１もしくは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを有するバリアントであり得る。例えば、抗体（例えば、本明細書に記載される抗体またはその断片もしくは誘導体）の１もしくは複数のＣＤＲまたはＣＤＲのセットが、抗体分子を提供するために、フレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）中に移植され得る。これらのフレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子配列に由来し得る、または起源が非生殖系列であり得る。
ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク残基は、例えば、部位特異的変異誘発を使用して、本明細書で議論および例示されるように、改変され得る。
アミノ酸変化が、当該分野で公知の方法およびパラメーターを使用して、ＩＬ−６の部位ＩＩに標的化された抗体ＩＬ−６ａ（本明細書で「参照ＩＬ−６抗体」と呼ぶ）に由来する１もしくは複数のフレームワーク領域および／または１もしくは複数のＣＤＲにおいて作製され得る。ＩＬ−６の部位ＩＩ（例えば、ヒトＩＬ−６の部位ＩＩ）への結合を保持し、典型的には、参照ＩＬ−６抗体と比較して少なくとも同じ結合または増加した親和性を有する得られたＩＬ−６アンタゴニストもまた、本明細書に含まれる。一部の場合には、安定性などのパラメーターを改善するために、参照ＩＬ−６ａ（例えば、参照抗体）と比較して、誘導されたＩＬ−６ａの結合親和性における減少を生じる変化が、有用なＩＬ−６ａを創出するために導入され得る。一部の実施形態では、例えば、ＦｃＲｎ結合または薬物動態（ＰＫ）パラメーター、例えば、硝子体における半減期または全身半減期（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、肝臓、腎臓、他の組織または体液における）にその言及が関連する一部の場合には、参照抗体は、ＩＬ−６に特異的に結合しない抗体であり得る。
ＩＬ−６ａポリペプチドのアミノ酸配列における変化は、１もしくは複数のアミノ酸残基（複数可）を天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸で置換すること、１もしくは複数のアミノ酸残基を天然に存在しないもしくは非標準的な形態に改変すること、または１もしくは複数の天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸を配列中に挿入することを含み得る。本発明の配列における変更の数および位置の例は、本明細書の別の箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸には、それらの標準的な一文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅと特定される２０種の「標準的な」Ｌ−アミノ酸が含まれる。非標準的なアミノ酸は、ポリペプチド骨格中に取り込まれ得る、または既存のアミノ酸残基の改変から生じ得る、任意の他の残基が含まれる。非標準的なアミノ酸は、天然に存在するものまたは天然に存在しないものであり得る。いくつかの天然に存在する非標準的なアミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジンおよびＮ−アセチルセリンが、当該分野で公知である。それらのＮ−アルファ位置において誘導体化されるアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端にのみ位置する。このアミノ酸は、典型的には、Ｌ−アミノ酸である。一部の場合には、このアミノ酸はＤ−アミノ酸である。したがって、変更は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に改変すること、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置き換えることを含み得る。メチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態のアミノ酸もまた公知であり、本発明におけるアミノ酸は、かかる改変に供され得る。
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバー中のアミノ酸配列は、本明細書で議論される非天然のまたは非標準的なアミノ酸を含み得る。非標準的なアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）は、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、分子の合成において、またはアミノ酸の合成後改変もしくは置き換えによって、アミノ酸配列中に取り込まれ得る。一部の場合には、Ｄ−アミノ酸が、ＩＬ−６ａのＰＫを増加させるために使用される。
本発明のＣＤＲ由来配列を保有する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、可変ドメイン全体内に変異を生成するために、１つまたは複数の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ核酸配列のランダム変異誘発を使用して生成され得る。例えば、エラープローンＰＣＲが使用され得る（Ｃｈａｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１巻：７５５〜７６８頁（２００６年））。一部の実施形態では、１個または２個のアミノ酸置換が、可変ドメイン全体、またはＣＤＲのセット内で作製される。当該分野で公知の他の方法、例えば、部位特異的変異誘発が、典型的には１つまたは複数のＣＤＲにおいて変異を生成するために使用され得る。
抗体ＩＬ−６ａを産生するための１つの方法は、１個または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入することによって、本明細書に開示されるものなどのＶＨドメインを変更することである。変更されたＶＨドメインは、本明細書に記載されるようにかつ当該分野で公知の方法を使用しても変更され得るＶＬドメイン（例えば、本明細書に開示されるＶＬドメイン）と組み合わされ得る。かかる変更された分子は、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合するそれらの能力について、および任意選択で他の所望の特性、例えば、参照分子と比較して増加した親和性について、試験される。一部の場合には、バリアントＶＨまたはＶＬドメインは、１、２、３、４または５つのかかる変更（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸置換）を有し得る。
実施形態では、本発明のＩＬ−６ａは、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合し、抗原結合部位を含む、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに結合できる、抗体の断片である。本発明の抗体断片は、一般に、参照（親）抗体分子、例えば、配列番号１３および配列番号１４を含む抗体分子から出発して取得される。抗体断片は、組換えＤＮＡ、酵素的切断（例えば、ペプシンまたはパパインを使用する）、抗体の化学的切断（例えば、ジスルフィド架橋の化学的還元）などの、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。抗体の抗原結合部位を含む抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄおよびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）などの分子が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を含む、１つまたは複数の抗体の抗原結合部位を含む種々の他の抗体分子が、工学的に作製され得る。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法の例は、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３巻：１１２６〜１１３６頁に記載されている。結合性断片の非限定的な例は、ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）ドメインから構成されるＦａｂ断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片；ＶＨまたはＶＬドメインから構成されるｄＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域；２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片；ＶＨドメインとＶＬドメインとが、これら２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結される、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二特異性単鎖Ｆｖダイマー（例えば、ＷＯ１９９３／０１１１６１に開示されるとおり）、ならびに遺伝子融合を使用して構築された多価または多特異性断片であるダイアボディ（例えば、ＷＯ９４／１３８０４に開示されるとおり）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するジスルフィド架橋の取込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに繋がれたｓｃＦｖを含むミニボディもまた、ＩＬ−６ａとして使用され得る。ＩＬ−６ａとして使用され得る抗体の他の断片および誘導体には、抗体ヒンジ領域由来の１個または複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個のアミノ酸残基の付加によってＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨ、が含まれる。
一部の場合には、抗体断片であるＩＬ−６ａは、半減期または取込みを増加させるためのＰＥＧ化など、望ましい特性を改善または導入するために、化学的に改変されている。
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の、小さいモノマー性の抗原結合性断片（抗体重鎖または軽鎖の可変領域）である。ＶＨ ｄＡｂは、ラクダ類（例えば、ラクダおよびラマ）中に天然に存在し、ラクダ類を標的抗原で免疫化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることによって産生され得る。本発明のＩＬ−６ａは、実質的に本明細書に示されるようなＶＨもしくはＶＬドメイン、または実質的に本明細書に示されるようなＣＤＲのセットを含むＶＨもしくはＶＬドメインを含むｄＡｂであり得る。
本発明の抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子中で組み合わされた、二特異性抗体を含む。Ｉｌ−６ａは、当該分野で公知の方法を使用して調製された、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製された、二特異性抗体の一部として取り込まれ得る。かかる分子は、上で議論した型の二特異性抗体断片であり得る。二特異性抗体を生成するための方法の１つの非限定的な例は、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインが使用され得、短い可撓性ペプチドを介して直接連結され得る、ＢｉＴＥ（商標）テクノロジーである。これは、２つの抗体を、短い単一のポリペプチド鎖上で組み合わせる。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインだけを使用して、Ｆｃ領域なしに構築され得、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低減させる。二特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして、さもなければ二特異性ｓｃＦｖとして、構築され得る。さらに、２つの二特異性抗体が、四価抗体を形成するために、当該分野で公知の慣用的な方法を使用して、連結され得る。
二特異性抗体全体とは対照的に、二特異性ダイアボディは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構築および発現され得ることに一部起因して、有用である。適切な結合特異性のダイアボディ（および多くの他のポリペプチド、例えば抗体断片）は、ライブラリーからファージディスプレイ（ＷＯ１９９４／１３８０４）を使用して容易に選択され得る。ダイアボディの一方のアームが、例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに対する特異性を伴って一定に保たれる場合、他方のアームが変動されるライブラリーが作製され得、適切な特異性の抗体が選択される。
二特異性抗体全体は、ＷＯ１９９６／２７０１１、ＷＯ１９９８／５０４３１およびＷＯ２００６／０２８９３６に記載されるような、代替的な工学的作製方法によって作製され得る。
一部の場合には、本発明のＩＬ−６ａは、例えば、以下にさらに議論するように、非抗体タンパク質足場中に１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを取り込むことによって、非抗体分子内に抗原結合部位を含む。一部の場合には、これらのＣＤＲは、非抗体足場中に取り込まれる。ＩＬ−６部位ＩＩ結合部位は、非抗体タンパク質足場、例えば、フィブロネクチンもしくはチトクロムＢ上のＣＤＲの配置によって、またはＩＬ−６部位ＩＩに対する結合特異性を付与するためにタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化もしくは変異させることによって、提供され得る。タンパク質中の新規結合部位を工学的に作製するための足場は、当該分野で公知である。例えば、抗体模倣物のためのタンパク質足場は、少なくとも１つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣物）を記載する、ＷＯ２０００３４７８４に開示されている。１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲのセットを移植する適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。この足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質足場の利点は、かかる足場が、少なくとも一部の抗体分子よりも小さいおよび／または製造がより容易である足場分子中に抗原結合部位を提供できることである。結合メンバーの小さいサイズは、有用な生理学的特性、例えば、細胞に進入し、組織中に深く貫通し、もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力を付与し得る。安定な骨格および１つまたは複数の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ループ（単数または複数）のアミノ酸配列は、標的抗原に結合する抗原結合部位を創出するために、特異的にまたはランダムに変異される。かかるタンパク質には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを使用する）、リポカリンならびにガンマ−クリスタリン（ｇａｍｍａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）および他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。他のアプローチの例には、サイクロチドに基づく合成マイクロボディ−−分子内ジスルフィド結合を有する小さいタンパク質、ミクロタンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ−Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）が含まれる。かかるタンパク質には、小さい工学的に操作されたタンパク質ドメイン、例えば、イムノドメイン（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｏｍａｉｎ）（例えば、米国特許出願公開第２００３／０８２６３０号および米国特許出願公開第２００３／１５７５６１を参照のこと）などもまた含まれる。イムノドメインは、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
ＩＬ−６ａは、例えば、抗原に結合する能力に加えて、別の機能的特徴を分子に付与するために、さらなるアミノ酸を含み得る。
一部の場合には、ＩＬ−６ａは、検出可能な標識を保有する、あるいは（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）毒素または標的化部分もしくは酵素にコンジュゲート化される。例えば、ＩＬ−６ａは、抗原結合部位が抗原に結合し、したがって、触媒部位をＩＬ−６またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に標的化するように、触媒部位（例えば、酵素ドメイン中）ならびに抗原結合部位（例えば、ＩＬ−６の部位ＩＩに対する結合部位）を含み得る。この触媒部位は、一部の場合には、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはＩＬ−６ａ／ＩＬ−６複合体と会合する他の分子の切断によって、ＩＬ−６の生物学的機能をさらに阻害し得る。
一部の態様では、本発明は、ＩＬ−６ａの生物学的作用機能を変更、例えば、増加、減少または排除するように、参照抗体と比較して改変された抗体ＩＬ−６ａを含む。一例では、Ｆｃ領域が改変されているか、または未改変の親と比較して改変されたＩＬ−６ａの薬物動態を変更させるために、親Ｆｃドメインが、改変されたＦｃドメインで置き換えられる。一部の実施形態では、このＩＬ−６ａは、ＩｇＧ２フレームワークを有するように工学的に操作される。他の実施形態では、このＩＬ−６ａは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２フレームワーク中にあり、親または他の参照ＩＬ−６ａと比較して、ｐＨ６．０においてＩＬ−６ａの結合親和性を増加させるが、ｐＨ７．０においては結合親和性を実質的に変更させない、改変されたＦｃを有する。実施形態では、Ｆｃドメインが改変され、このＩＬ−６ａは、親または他の参照ＩＬ−６ａと比較して、低減された全身蓄積、減少した半減期および／または増加した全身クリアランスを有する。
一部の実施形態では、抗体ＩＬ−６ａは、補体結合および補体依存的細胞傷害を増加させるために改変される。他の態様では、この抗体ＩＬ−６ａは、参照抗体と比較して、抗体がエフェクター細胞を活性化する能力および抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を増加させるために改変される。一部の場合には、本明細書に開示される抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を増強するため、かつ補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を増強するために、改変され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために改変される。他の実施形態では、これらの抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために改変される。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、エフェクター細胞を活性化し抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するその能力を低減させるため、かつ補体に結合し補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するその能力を低減させるために、改変され得る。
製剤
本明細書に記載の製剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、０．１〜８０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ；１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ；２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；３０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；４０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；５０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；６０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；１０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；２０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；４０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；５０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；６０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；１０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；２０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；３０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；４０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ；または５０ｍｇ／ｌ〜６０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に存在するＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６抗体もしくはその断片を含む。例えば、製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌまたは５５ｍｇ／ｍｌのＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載のＩＬ−６抗体または断片を含む。
ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載のＩＬ−６抗体もしくはその断片は、他の薬学的に有効な賦形剤とともに製剤化される。一実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載のＩＬ−６抗体もしくはその断片は、以下：緩衝剤、界面活性剤、および張度剤（例えば、糖および／または塩）とともに製剤化される。一実施形態では、製剤は、ＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載される通りのＩＬ−６抗体もしくはその断片、および１つもしくは複数の緩衝液（例えば、緩衝剤）のうちの１つもしくは複数を含む。一実施形態では、製剤は、１つもしくは複数の界面活性剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、１つもしくは複数の張度剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、２つもしくはそれより多くの張度剤、例えば、塩および糖を含む。一実施形態では、製剤は、１つもしくは複数のキレート剤、１つもしくは複数の保存剤、１つもしくは複数の抗酸化剤、および／または１つもしくは複数のアミノ酸をさらに含む。一実施形態では、製剤は、１つもしくは複数の追加の治療剤、例えば、第２の治療剤をさらに含む。例示的な賦形剤および追加の治療剤は、本明細書にさらに記載される。
緩衝液
被験体への投与に適切な異なる緩衝液が、当該分野で公知である。一般に、適切な緩衝液は、目的のポリペプチド、例えば、ＩＬ−６ａ、例えば、ＩＬ−６アンタゴニストまたはその断片が、種々のｐＨ、濃度、温度で、および種々の時間にわたって種々の緩衝液に曝露される、安定性研究を実施することによって選択される。緩衝液は、例えば、目的のポリペプチド、例えば、ＩＬ−６ａ、例えば、ＩＬ−６抗体またはその断片を緩衝液中に配置し、試料を上昇した温度に供し（加速安定性試験）、次いで、例えば、弱カチオン交換クロマトグラフィーによる脱アミド化または逆相クロマトグラフィーによる酸化をモニタリングすることによって、物理的安定性（目視検査による沈殿）または化学的安定性について試験することによって、選択され得る。さらなるアッセイには、Ａ２８０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｐＨおよび質量オスモル濃度のモニタリングが含まれ得る。最良の物理的安定性および化学的安定性を提供する緩衝液が選択される。実施形態では、この緩衝液は、所望のｐＨに近い液体組成物を提供し、また、増強された抗体安定性、ならびに凝集、酸化および断片化に対する耐性を提供する。
緩衝剤の例には、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、酢酸、リン酸塩、リン酸、アスコルビン酸塩、酒石酸（ｔａｒｔａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、マレイン酸、グリシン、乳酸塩、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、炭酸水素塩および炭酸、コハク酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸、グルコン酸塩、エデト酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、イミダゾール、トリス（トリシン）、リン酸塩、およびそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、この緩衝剤は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｎｅ）、リン酸塩およびトリス（トリシン）からなる群より選択される。
一部の実施形態では、緩衝剤は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１８ｍＭ〜約２２ｍＭの量で存在する。一部の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭの量で存在する。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の緩衝剤の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の緩衝剤、例えば、ヒスチジン緩衝剤を含む。例として、一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−１０％の緩衝剤を含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−２０％の緩衝剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−３０％の緩衝剤をさらに含む。
一実施形態では、この緩衝剤はヒスチジンであり、ここでヒスチジンは、Ｌ−ヒスチジンもしくはＤ−ヒスチジンのいずれか、溶媒和形態のヒスチジン、水和形態の（例えば、一水和物）ヒスチジンまたは無水形態のヒスチジンあるいはそれらの混合物を含み得る。一実施形態では、この緩衝剤は、ヒスチジン塩酸塩（ＨＣｌ）である。一実施形態では、このヒスチジン緩衝液は、約 の濃度で存在する。
界面活性剤
別の態様では、本明細書で提供される製剤は、１つまたは複数の界面活性剤を含む。理論に束縛されることは望まないが、界面活性剤の使用は、例えば、容器への分子の付着を低減させ、特に撹拌の条件下でのタンパク質の凝集を低減させるために、有用であり得る。適切な界面活性剤およびかかる界面活性剤の濃度は、界面活性剤が撹拌研究において凝集を防止するかどうかを試験することによって決定され得る。かかる研究を実施する方法は、当該分野で公知である。例えば、界面活性剤が撹拌ストレスからの沈殿を防止するために必要かどうかを決定することができる。かかる実験では、典型的には、撹拌および分析を使用してスクリーニングが実施される。かかる研究に使用される濃度の例は、０．０１％ｗ／ｖ、０．０２％ｗ／ｖ、０．０６％ｗ／ｖおよび０．１％ｗ／ｖの界面活性剤、例えば、ポロクサマー１８８である。実施形態では、凝集および／または沈殿は、分光光度法（Ａ２８０）、目視検査、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、光遮蔽（例えば、ＨＩＡＣデバイスを使用する）またはＭｉｃｒｏ−Ｆｌｏｗ Ｉｍａｇｉｎｇ（商標）（ＭＦＩ、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）による分析を使用して評価される。界面活性剤は、一般に、最少量の沈殿、例えば、目に見える沈殿がないこと、または注射中の粒子状物質についてのガイドライン（例えば、ＵＳＰ＜７８８＞を参照のこと）もしくは眼科溶液中の粒子状物質についてのガイドライン（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞を参照のこと）を満たす粒子計数と関連する製剤における使用のために選択される。
開示された製剤における使用に適切な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、およびそれらの混合物）、ポロクサマー（例えば、ポロクサマーＰ１８８）、トリトン（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ４０５）、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｅｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、オクチルグリコシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｃｔｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル（ｍｙｈｓｔｙｌ）−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノールアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル（ｐａｌｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピル−ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｃｏｃｏｙｌ−ｔａｕｒａｔｅ）、オレイルメチルタウリン二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｅｙｌ−ｔａｕｒａｔｅ）、ジヒドロキシプロピルＰＥＧ ５リノールアンモニウムクロリド（ｌｉｎｏｌｅａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、チロキサポール、オクトキシノール４０およびステアリン酸ポリオキシル４０ならびにそれらの混合物が含まれ得るがこれらに限定されない。一実施形態では、この界面活性剤は、ポリソルベート２０（本明細書でＴｗｅｅｎ ２０とも呼ぶ）、ポリソルベート８０（本明細書でＴｗｅｅｎ ８０とも呼ぶ）およびポロクサマーＰ１８８からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、製剤は、約０．００１％〜約１０％、約０．００５％〜約５％、約０．０１％〜約１％、約０．０５％〜約０．５％、約０．０５％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．８％、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０２％〜約０．０８％、約０．０２％〜約０．０５％または約０．０２％〜約０．０５％ｗ／ｖの範囲の濃度で界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはＴｗｅｅｎ２０）を含む。一実施形態では、製剤は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％または約１％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の界面活性剤の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の界面活性剤を含む。例として、一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．００３％の界面活性剤を含む。一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．００６％の界面活性剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は、０．０３％＋／−０．０１％の界面活性剤をさらに含む。
ある実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）またはポロクサマー１８８である。そのような実施形態では、ポリソルベート２０、ポリソルベート−８０またはポロクサマー１８８は、約０．０１％〜約０．２％、約０．０１％〜約０．１％、０．０１％〜約０．０５％、０．０１％〜約０．０３％、０．０２％〜約０．８％、０．０２％〜約０．０５％、０．０２％〜約０．０４％ｗ／ｖの範囲の濃度で製剤に存在する。一実施形態では、ポリソルベート２０、ポリソルベート−８０またはポロクサマー１８８は、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％または０．０５％ｗ／ｖ、例えば、０．０３％ｗ／ｖの濃度で製剤に存在する。本明細書に記載の任意の製剤では、ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、およびポロクサマー１８８は、互換的である。
張度剤
別の態様では、本明細書に記載される製剤は、１種または複数の張度剤を含む。例えば、本明細書に記載される製剤は、２種の張度剤を含有し得る。張度剤とは、製剤が被験体の身体組織または器官の細胞と生理学的に適合性であるように、製剤の浸透圧をそれと等張まで調整できる賦形剤を指す。実施形態では、張度剤は、ポリオール、例えば、糖（例えば、サッカライド）、炭水化物、塩、またはそれらの混合物であり得る。いずれの理論にも拘束されないが、かかる薬剤は、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片の安定性に寄与し得る。
一実施形態では、この張度剤はポリオールである。ポリオールとは、本明細書で使用する場合、複数のヒドロキシル基を有する賦形剤を指し、これには、糖（還元および非還元糖、糖アルコールならびに糖酸）が含まれる。一実施形態では、このポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０〜約４００ｋＤの範囲内）の分子量を有する。適切なポリオールには、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、グリセロール、ラクチトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イノシトール、またはそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。実施形態では、適切な糖および炭水化物には、モノサッカライド、ジサッカライドおよびポリサッカライド、またはそれらの混合物が含まれる。適切な糖（例えば、サッカライド）または炭水化物には、フルクトース、グルコース、マンノース、スクロース、ソルボース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、水溶性グルカン、およびそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
ある実施形態では、製剤は、約０．１％〜約２０％、約１％〜約１０％、約１％〜約８％、約１％〜約５％、約２％〜約１０％、約２％〜約８％、約２％〜約５％、約３％〜約１０％、約３〜約８％、約３％〜約５％の範囲の濃度で本明細書に記載される通りのポリオール、糖または炭水化物を含む。ある実施形態では、製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の濃度でポリオール、糖または炭水化物を含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載のポリオールの濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度のポリオールを含む。例として、一実施形態では、製剤は、４％＋／−０．４％のポリオールを含む。一実施形態では、製剤は、４％＋／−０．８％のソルビトールをさらに含む。一実施形態では、製剤は、４％＋／−１．２％のポリオールをさらに含む。
一実施形態では、製剤は、張度剤を含み、張度剤は、ソルビトールまたはトレハロースから選択される。一実施形態では、製剤はソルビトールを含む。一実施形態では、製剤におけるソルビトールの濃度は、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約２％〜約５％または約４％である。
ある特定の実施形態では、この張度剤は塩である。いずれの理論に束縛されることも望まないが、塩、例えば塩化ナトリウムを含めることもまた、脱アミド化からタンパク質を保護することによって、抗体安定性を改善し得る。適切な塩には、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムが含まれるがこれらに限定されない。
ある実施形態では、製剤は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭまたは約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲の濃度で塩を含む。一実施形態では、製剤は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭまたは１５０ｍＭ、例えば、２０ｍＭの濃度で塩を含む。一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の塩の濃度より少なくとも１０％低い濃度〜少なくとも１０％高い濃度の塩を含む。例として、一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−１０％の塩を含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−２０％の塩をさらに含む。一実施形態では、製剤は、２０ｍＭ＋／−３０％の塩をさらに含む。
一実施形態では、製剤は塩を含み、ここで、塩は塩化ナトリウムである。一実施形態では、製剤は、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭまたは約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で塩化ナトリウムを含む。
ある特定の実施形態では、この製剤は、２種の張度剤、例えば、ポリオール（糖）および塩を含む。一実施形態では、この製剤は、ソルビトールおよび塩化ナトリウムを含む。
ある特定の実施形態では、この本明細書で提供される製剤は、眼と等張である（例えば、約２７０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有する）。一部の実施形態では、この製剤は、約２５０〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、３５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、２００〜３７５ｍＯｓｍ／ｋｇまたは３５０〜３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有する。実施形態では、この製剤は、２７０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有する。
他の賦形剤
本発明で特徴付ける製剤は、他の薬学的に許容される賦形剤もまた含有し得る。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ７ｔｈ Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；Ｋｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， ３ｒｄ ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＭｃＮａｌｌｙ ａｎｄ Ｈａｓｔｅｄｔ（ｅｄｓ．），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（ＩＳＢＮ：０８４９３７９４９０）（２００７）を参照のこと。添加され得る賦形剤のなかでは、キレート剤、アミノ酸、防腐剤（例えば、保存剤）、浸透増強剤、生体接着剤、安定剤、抗酸化剤および粘性剤である。
この製剤は、１種または複数の浸透増強剤および／または生体接着剤を含み得る。浸透増強剤および生体接着剤には、例えば、キトサン、サイトカラシンＢ、アミノ化ゼラチン、ポリ−ε−カプロラクトン（ｃａｐｒｏｌｅｃｔｏｎｅ）（ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４１Ｐ）；ポリ（ブチルシアノアクリレート）；ポリ−Ｌ−アルギニン；シクロデキストリン；ジェラン；ポリ（アクリル酸）；ヒアルロン酸；ムチン；アルギネート；カルボフィル（ｃａｒｂｏｐｈｉｌ）およびポロクサマー（例えば、Ｎａｇａｒｗａｌら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１３６巻：２〜１３頁（２００９年）；Ｄｉｎｇ、ＰＳＴＴ １巻：３２８〜３５頁（１９９８年）；およびＳａｈｏｏら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、１３巻：１４４〜５１頁（２００８年）を参照のこと）が含まれ得る。他の賦形剤が安定剤として有用であり得、これには、例えば、グリセリン、塩化カリウム、リン酸カリウム、プロピレングリコール、酢酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、四ホウ酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム（リン酸ナトリウム一塩基性および二塩基性を含む）；塩化亜鉛、フェノール、ベンゾエート、ヒマシ油およびエチレンオキシドの誘導体、ならびにＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれ得る。
この製剤は、１種または複数のキレート剤を含み得る。キレート剤は、本発明の組成物中の、還元酸素種の形成を低下させ、酸性種（例えば、脱アミド化）形成を低減させ、抗体凝集を低減させ、および／または抗体断片化を低減させ得、および／または抗体酸化を低減させ得る。かかるキレート剤は、キレート剤の保護なしの抗体と比較して、製剤化された抗体の分解を低減させまたは防止し得る。
適切なキレート剤には、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、デフェロキサミン（ＤＥＦ）、クエン酸、ナイアシンアミドおよびデスオキシコレートならびにそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。さらに好ましくは、このキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸５（ＤＴＰＡ）、ニトリロトリ酢酸（ｎｉｔｈｌｏｔｈａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル、Ｎ，Ｎ，１ＳＴ，ＩＳＴ−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン（ビシン（ｂｉｃｉｎｅ））およびＮ−（トリスヒドロキシメチルメチル（ｔｈｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ））１０グリシン（トリシン）、グリシルグリシン、デソキシコール酸ナトリウム、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；ジエチレントリアミン；トリエチレンテトラミン（トリエン）、エチレンジアミンテトラアセトＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ、カルシウムＥＤＴＡシュウ酸、マレート、クエン酸、クエン酸一水和物、およびクエン酸三ナトリウム二水和物、８−ヒドロキシキノレート、アミノ酸、ヒスチジン、システイン、メチオニン、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。さらに好ましくは、このキレート剤は、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、およびエデト酸カリウムを含むＥＤＴＡの塩からなる群より選択され；デフェロキサミン（ＤＥＦ）の適切な塩は、メシル酸デフェロキサミン（ＤＦＭ）、またはその混合物である。本発明において使用されるキレート剤は、可能な場合、化合物の遊離酸形態もしくは遊離塩基形態または塩形態として、また、化合物または対応する塩の無水形態、溶媒和形態または水和形態としても、存在し得る。
この製剤は、１種または複数のアミノ酸を含み得る。適切なアミノ酸には、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはメチオニンが含まれるがこれらに限定されない。このアミノ酸は、典型的には、タンパク質の安定性および／または溶解度を増強するために選択される。かかるアミノ酸を同定する方法は、当該分野で公知である。一部の実施形態では、製剤はアルギニンを含有する。
この製剤は、１種または複数の粘性剤を含み得る。粘性剤は、一般に、そうでなければ瞬きまたは結膜嚢を介したドレナージによって迅速に取り除かれる眼科処置の滞留時間を増加させるために、眼科製剤中に含められる。
適切な粘性剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム（本明細書でカルボキシメチルセルロースまたはＣＭＣとも呼ぶ）を含むメチルセルロース；エチルセルロースを含むヒドロキシセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース）；カルボマー、例えば、９３４Ｐ、９７１Ｐおよび９７４Ｐ；ポリビニルアルコール；キサンタンガム；グアーガム；ジェランガム；ならびにグリセリンが含まれるがこれらに限定されない。
この製剤は、１種または複数の抗酸化剤を含み得る。適切な抗酸化剤には、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼおよび白金が含まれるがこれらに限定されない。
この製剤は、例えば、使用の間の微生物および真菌の夾雑を予防するために、１種もしくは複数の防腐剤を含み得、ならびに／または例えば、タンパク質を可溶化するために、１種もしくは複数の洗剤もしくは界面活性剤を含み得る。適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンセトニウム（ｂｅｎｚａｌｔｈｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンジルアルコール、クロロブタノール、臭化ベンゾドデシニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、フェノキシエタノール、フェノール、ｍ−クレゾール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸およびポリクオタニウム−１が含まれるがこれらに限定されず、０．００１％ｗ／ｖ〜１．０％ｗ／ｖの濃度で含まれ得る。典型的には、本明細書に記載される治療的タンパク質を含有する製剤は、無菌であるがなおも防腐剤を含まない。
この製剤は、滑沢剤または湿潤剤として作用する他の化合物もまた含み得る。これらには、粘性剤、例えば、モノマー性ポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール；ポリマー性ポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、セルロースファミリーの種々のポリマー：ヒドロキシプロピルメチルセルロース（「ＨＰＭＣ」）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（「ＨＰＣ」）、デキストラン、例えば、デキストラン７０；水溶性タンパク質、例えば、ゼラチン；ならびにビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドンおよびカルボマー、例えば、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１；カルボマー９４０、カルボマー９７４Ｐが含まれる。なおさらなる例には、ポリサッカライド、例えば、ヒアルロン酸およびその塩、ならびにコンドロイチン硫酸およびその塩、ならびにアクリル酸ポリマーが含まれる。ある特定の実施形態では、この製剤は、１ｃＰ〜４００ｃＰの間の粘性を有する。
ｐＨ
別の態様では、本明細書において提供される製剤は、約５．０〜約７．５、約５．５〜約７．５、約６．０〜約７．５、約６．５〜約７．５、約５．０〜約７．０、約５．５〜約７．０、約６．０〜約７．０または約６．２〜約６．８のｐＨを有する。ある実施形態では、本明細書において提供される製剤は、７．５未満、７．０未満、６．９未満、６．８未満、６．６未満、６．５未満、６．４未満、６．３未満、６．２未満または６．０未満のｐＨを有する。ある実施形態では、本明細書において提供される製剤は、約６．５または６．５のｐＨを有する。
本明細書に記載される組成物または製剤のｐＨレベルは、当該分野で公知の方法のいずれかによって、製剤化プロセスの間に調整され得る。一実施形態では、高度に濃縮された酸、例えば、塩化水素（ＨＣｌ）または高度に濃縮された塩基、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が、所望のｐＨが達成されるまで添加される。
安定性
当該分野で公知のように、タンパク質、例えば抗体は、小分子よりも、撹拌および温度に対して感受性が高い。撹拌ストレスは、沈殿をもたらし得、熱ストレスは、沈殿および化学的分解をもたらし得る。さらに、送達デバイス中への化合物の負荷の間に、熱ストレスへの曝露が存在し得る。出願人らは、撹拌ストレスおよび熱に曝露された場合に優れた安定性を首尾よく提供する製剤を達成した。
実施形態では、本明細書に記載される製剤は、安定である。実施形態では、この製剤は、本明細書に記載される条件（例えば、特定の温度における貯蔵、または撹拌ストレス）下で安定性を示す。実施形態では、安定性は、本明細書に記載される１つもしくは複数の方法（例えば、視覚的外観、分光光度法（Ａ２８０）による含量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元；サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ ＨＰＬＣ）もしくはＳＥ−ＵＰＬＣ；逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）；弱アニオン交換ＨＰＬＣ（ＷＡＥＸ−ＨＰＬＣ）；効力；光遮蔽粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される光遮蔽粒子計数試験）；または顕微鏡粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される顕微鏡粒子計数試験）に基づく）および／または当該分野で公知の方法を使用して評価される。
安定性は、視覚的外観に基づいて評価され得る。実施形態では、製剤は、目に見える微粒子物を本質的に含まない透明〜僅かにオパール色の無色溶液である場合、安定である。
ある実施形態では、製剤は、約２５℃〜約４０℃、例えば、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃または約４０℃で、少なくとも２日；３日；５日；１週間；１０日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１６週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４５週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、またはより長くの期間にわたって安定である。
ある実施形態では、製剤は、約２℃〜約８℃の温度、例えば、約４℃、約５℃、約６℃、２℃〜８℃、４℃、５℃または６℃での貯蔵の間長期間にわたって安定である。例えば、製剤は、少なくとも２週間；４週間；６週間；２ヶ月；３ヶ月；６ヶ月、１年、２年、３年または４年の期間、そのような貯蔵温度で安定である。
製剤の安定性は、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２または１８ヶ月にわたる、例えば、２〜８℃での貯蔵後、または周囲条件下、例えば、室温（ＲＴ）、例えば、約２５℃での、例えば、少なくとも２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月または１８ヶ月にわたる貯蔵後に評価され得る。ある実施形態では、製剤は、２〜８℃での少なくとも８ヶ月にわたる貯蔵後に安定である。ある実施形態では、製剤は、少なくとも５ヶ月にわたる室温への曝露後に安定である。一部のそのような実施形態では、製剤は、例えば、少なくとも５ヶ月にわたる、ＢＦＳ容器内での貯蔵後に安定である。
安定性は、例えば、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の方法および基準に基づいて評価され得る。例えば、安定性は、物理的純度（例えば、凝集の欠如、例えば、本明細書でサイズ排除、ＳＥ ＨＰＬＣまたはＳＥＣ ＨＰＬＣとも呼ばれるサイズ排除ＨＰＬＣを使用して評価される）、化学的純度（例えば、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣおよび／またはＳＤＳ ＰＡＧＥ（例えば、還元または非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を使用して評価される）、および／または微粒子物のレベル（例えば、視覚的に、またはＨＩＡＣ液体粒子計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用する粒子計数によって評価される）に基づいて評価され得る。
実施形態では、安定性は、例えば、ＵＳＰ＜７８９＞（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に示されるような、眼科溶液中の粒子状物質についてのガイドラインの順守に基づいて実証される。
実施形態では、この製剤は、例えば、光遮蔽粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される光遮蔽粒子計数試験）を使用して評価されるように、１０μｍ以上の粒子については５０粒子／ｍｌ未満もしくはそれと等しい、および／または２５μｍ以上の粒子については５粒子／ｍｌ未満もしくはそれと等しい粒子を有する。
実施形態では、この製剤は、例えば、顕微鏡粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される顕微鏡粒子計数試験）を使用して評価されるように、１０μｍ以上の粒子については５０粒子／ｍｌ未満もしくはそれと等しい、２５μｍ以上の粒子については５粒子／ｍｌ未満もしくはそれと等しい、および／または５０μｍ以上の粒子については２粒子／ｍｌ未満もしくはそれと等しい粒子を有する。
ある実施形態では、安定性は、例えば、ＵＳＰ＜７８９＞（Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）に示されるような、注射中の粒子状物質についてのガイドラインの順守に基づいて実証される。
ある実施形態では、製剤は、例えば、光遮蔽粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される光遮蔽粒子計数試験）を使用して評価されるように、１０μｍ以上の粒子については容器（１００ｍｌまたはそれ未満の容積の容器について）あたり６０００未満もしくはそれと等しい粒子、および／または２５μｍ以上の粒子については容器（１００ｍｌまたはそれ未満の容積の容器について）あたり６００未満もしくはそれと等しい粒子を有する。
ある実施形態では、製剤は、例えば、顕微鏡粒子計数試験（例えば、ＵＳＰ＜７８９＞に記載される顕微鏡粒子計数試験）を使用して評価されるように、１０μｍ以上の粒子については５ｍｌあたり３０００未満もしくはそれと等しい粒子、および／または２５μｍ以上の粒子については５ｍｌあたり３００未満もしくはそれと等しい粒子を有する。
実施形態では、製剤中のタンパク質は、例えば、例えば室温（ＲＴ）で１〜８時間にわたって、例えばＲＴで４時間にわたってタンパク質溶液をボルテックスした後の凝集の欠如によって実証されるように、撹拌ストレスから保護される（製剤が、凝集形態に対して、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％または＞９９％のモノマー形態のタンパク質を含有する場合、凝集の欠如が実証され得る）。凝集は、例えば、本明細書に記載される方法または当該分野で公知の方法を使用して評価され得る。例えば、凝集は、超遠心、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、動的光散乱および／または濁度測定を使用して評価され得る。
一部の態様では、安定性は、当該分野で公知の物理的または化学的方法によってアッセイされる。例えば、物理的純度または凝集の欠如は、サイズ排除ＨＰＬＣ、または製剤中のモノマー性ポリペプチドの相対量を決定する他の方法を使用して決定され得る。典型的には、許容される安定性を有する製剤は、タンパク質の凝集形態に対して、＞９０％の、モノマー形態の治療的タンパク質（例えば、ＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片）を含有する。実施形態では、この製剤は、タンパク質の凝集形態に対して、＞９０％（例えば、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％または＞９９％）の、モノマー形態の治療的タンパク質（例えば、ＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片）を含有する。
化学的純度は、例えば、弱カチオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣを使用して決定され得る。典型的には、許容される安定性を有する製剤は、例えば、弱カチオン交換ＨＰＬＣを使用して評価されるように、化学的に改変された形態の分子に対して、＞８０％の未変性分子を含有する。実施形態では、この製剤は、化学的に改変された形態（例えば、酸化またはアセチル化された形態）の分子に対して、＞８０％（例えば、＞８５％、＞８７％、＞９０％または＞９５％）の未変性分子を含有する。
微粒子物は、視覚的に同定され得る。実施形態では、この製剤は、視覚的に同定され得る微粒子物を本質的に含まない製剤である。
生物製剤による処置は、それらが比較的短い保存有効期間を有し得る、または貯蔵、輸送および患者使用に対する障害、ならびに生物製剤の十分な供給を保証することに対する障害となり得る特別な貯蔵条件を必要とし得るので、投与するには問題であり得る。本明細書で提供されるある特定の製剤の利点は、これらの製剤が驚くべきことに、冷蔵の条件下だけでなく、室温（例えば、２５℃）およびそれより上（例えば、４０℃）に従う温度でも安定である点である。したがって、サイトカインタンパク質またはポリペプチド製剤（例えば、異種サイトカインタンパク質またはポリペプチド製剤）、例えば、本明細書に記載される製剤は、一部の実施形態では、少なくとも３日、５日、１週間、１０日間、２週間、３週間、６週間、８週間、１６週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４５週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、１２ヶ月またはそれよりも長い期間にわたってＲＴ（例えば、２５℃）で安定な液体形態で提供される。実施形態では、１ヶ月は、例えば、その月の最初から第２の月の最初まで、日付単位で決定される。
別の態様では、製剤は、約２５℃〜約４０℃、例えば、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃または約４０℃で、少なくとも２日；３日；５日；１週間；１０日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１６週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４５週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月またはそれよりも長い期間にわたって安定である。
投与
形態
本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、種々の形態で製剤化される。これらには、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば、ナノ粒子およびリポソームを含む、液体溶液（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）、分散物または懸濁物が含まれる。この形態は、一般に、意図した投与の様式および治療適用に依存する。本明細書に記載される薬剤のための組成物は、典型的には、注射可能な溶液もしくは注入可能な溶液の形態であり、または外用送達、例えば、外用眼性送達のために製剤化される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。医薬組成物はまた、投与のための規制および業界標準に合致することを確実にするために、試験され得る。この組成物は、高い薬物（例えば、生物製剤）濃度に適切な溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソームまたは他の秩序立った構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、上に列挙した成分のうちの１つまたはそれらの組合せと共に、適切な溶媒中に必要とされる量で、本明細書に記載される薬剤を取り込み、その後必要に応じて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、本明細書に記載される薬剤を、基本分散媒および上に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の例示的な方法には、あらかじめ無菌濾過されたその溶液から本明細書に記載される薬剤と任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライが含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって操作され得る。かかる薬剤は、低用量製剤において特に有用であり得る。実施形態では、この製剤は、≦１ｍｇ／ｍｌの治療的タンパク質（例えば、ＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片）を含み、ゼラチンがこの製剤中に含まれる。
ある特定の実施形態では、製剤は、担体を用いて調製される。かかる実施形態では、この製剤は、例えば、制御放出製剤として送達され得、移植片またはマイクロカプセル化された送達系によって送達され得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。
眼科パックは、眼科製剤と眼との延長された接触を与えるために使用され得る。外科用綿撒糸は、製剤で飽和され、次いで、上結膜円蓋（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｆｏｒｎｉｘ）または下結膜円蓋（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｆｏｒｎｉｘ）中に挿入される。この製剤は、イオン導入によっても投与され得る。この手順は、電極を有するアイカップ中で、角膜と溶液とを接触させて維持する。薬物の拡散は、電位差によってもたらされる。使用されてきたイオン導入系には、Ｏｃｕｐｈｏｒ（登録商標）１（Ｉｏｍｅｄ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）；Ｅｙｅｇａｔｅ（登録商標）ＩＩ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ１（ＥｙｅＧａｔｅ Ｐｈａｒｍａ、ＵＳＡ）；およびＶｉｓｕｌｅｘ（登録商標）１（Ａｃｉｏｎｔ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）が含まれる。ＡｍｏおよびＵｒｔｔｉ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、１３巻：１４３頁（２００８年）を参照のこと。
持続性の眼性送達のための別の戦略は、ゲル化剤（ｇｅｌｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の使用である。これらの材料は、点眼剤または眼内注射として、液体形態で送達され得る。点眼後、ポリマーは相変化を受け、延長された期間にわたって薬物を放出する半固体または固体のマトリクスを形成する。この相転移は、温度、イオン濃度またはｐＨにおける変化によって誘導され得る。
外用眼性使用のために、ゲル形成性溶液、例えば、Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ジェランガムからの精製アニオン性ヘテロポリサッカライド）を含有するＴｉｍｏｐｔｉｃ（登録商標）−ＸＥ１（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）；ポリ（アクリル酸）を含有するＰｉｌｏｇｅｌ（登録商標）１（Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）点眼剤；およびＡｚａｓｉｔｅ（登録商標）１（Ｉｎｓｉｔｅ Ｖｉｓｉｏｎ、ＵＳＡ）が、臨床試験されている。これらの材料は、従来の点眼剤と比較して薬物保持を増強し、眼中への増加した薬物吸収および低減された投薬頻度をもたらす。ＡｍｏおよびＵｒｔｔｉ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、１３巻：１３５〜１４３頁（２００８年）を参照のこと。
本発明で特徴付ける製剤は、注射、例えば、硝子体内、眼周囲または結膜下注射によって送達され得る。この製剤は、結膜の下に注射されて、単純拡散による強膜を経て眼中への通過を促進し得る。この製剤は、毛様体、脈絡膜および網膜に薬剤を送達するために、眼のより後側の部分において結膜および基礎をなすテノン嚢の下にも注射され得る。この製剤は、眼球後注射によっても投与され得る。
一般に、本明細書に記載される製剤は、任意の適切な方法、例えば、ボーラスとしての静脈内投与によって、または筋内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、滑液包内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）、くも膜下、脊髄内、硬膜外注射、胸骨内の注射および注入による、一定期間にわたる持続的注入によって、被験体に投与され得る。投与の他の適切な様式には、外用（例えば、真皮または粘膜）または吸入（例えば、鼻腔内または肺内）経路が含まれる。ある特定の適用のために、投与の経路は、静脈内注射もしくは注入、皮下注射、または筋内注射のうちの１つである。眼への投与のために、一部の実施形態では、特徴付けられる製剤のための投与の様式は、例えば、液滴の形態での眼への外用投与である。この製剤を含有し得るおよび／またはこの製剤の投与に使用され得るデバイスの例には、単純な点眼器、計量機能ありまたはなしのスクイーズボトル、および成形同時充填（ｂｌｏｗ／ｆｉｌｌ／ｓｅａｌ）（ＢＦＳ）デバイス、例えば、Ｃａｔａｌｅｎｔ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）が製造するもの、例えば先端密封テクノロジー、銀／オリゴダイナミックテクノロジー、無菌フィルター、圧潰式一次容器などを使用する多回使用デバイスが含まれる。
容器についてのさらなる考慮事項は、ひとたび充填されると許容される保存有効期間を提供すること、例えば、許容可能に低いレベルの蒸発が存在すること、および／または製剤が、放出アッセイ仕様、例えば、本明細書に記載される仕様に合致することである。実施形態では、この容器は、例えば５℃で、少なくとも２年間、例えば、少なくとも３年間、少なくとも４年間または少なくとも５年間の保存有効期間を提供するのに適切である。実施形態では、この容器は、５℃で少なくとも３年間の保存有効期間を提供するのに適切である。実施形態では、この容器は、ＲＴで少なくとも２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、１０ヶ月間または１２ヶ月間の保存有効期間を提供するのに適切である。実施形態では、この容器は、ＲＴで少なくとも５ヶ月間の保存有効期間を提供するのに適切である。種々の適切な容器材料が当該分野で公知であり、例えば、ある特定のプラスチック、例えば、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）またはポリプロピレンである。
この製剤は、容器中に単回使用適用のために調製され得るか、または多回使用容器での使用のために調製され得る。
本明細書で特徴付ける製剤は、例えば、後眼部と関連する障害を処置するために、硝子体内送達され得る。硝子体内投与の方法は当該分野で公知であり、これには、例えば、眼内注射、移植可能なデバイスが含まれる。
実施形態では、この製剤は、移植可能なデバイスを使用して硝子体内投与される。実施形態では、この製剤は、熱安定剤、例えば、ソルビトールを含む。実施形態では、このソルビトールは、≧５％ｗ／ｖの濃度で存在する。
移植可能なデバイスは、例えば、非生分解性デバイス、例えば、ポリビニルアルコール−エチレン酢酸ビニルポリマーおよびポリスルホンキャピラリーファイバー、生分解性デバイス、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ポリカプロラクトンならびにポリ酸無水物であり得る。デバイスは、ナノ粒子、リポソームまたはミクロスフェアなどの形態で送達され得る。
投薬
本発明で特徴付ける製剤は、固定用量として、体重により決定される用量（例えば、ｍｇ／ｋｇ）として、または年齢により決定される用量として投与され得る。本明細書に記載される製剤は、例えば、１日４回；１日３回；１日２回；１日１回；１日おき；３日、４日もしくは５日おき；週に１回；２週間毎；３週間毎；４週間毎；５週間毎；月に１回；２ヶ月毎；３ヶ月毎；４ヶ月毎；６ヶ月毎；または必要に応じて（自由裁量）、投与され得る。
医薬組成物は、「治療有効量」の本明細書に記載される薬剤を含み得る。薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答、例えば、少なくとも１つの障害パラメーター（例えば、徴候）の好転、または障害の少なくとも１つの症状の好転を惹起する化合物の能力、（および任意選択で、投与されている任意のさらなる薬剤の効果）などの因子に従って変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が組成物の任意の毒性効果または有害効果を凌ぐ量である。一部の実施形態では、「治療有効量」は、個体の集団において決定され、その量は、罹患した集団の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％において、サイトカイン関連障害、例えば、ＩＬ−６関連障害の少なくとも１つの症状または指標を好転させるのに有効である。製剤は、典型的には、治療有効量で投与される。一部の場合には、治療有効製剤は、ビヒクル製剤である。一部の場合には、治療有効製剤は、治療的タンパク質を含む。
医薬組成物は、本明細書に記載され当該分野で公知の医療用デバイス、例えば、移植片、注入ポンプ、皮下針および針なし皮下注射デバイスを使用して投与され得る。デバイスは、例えば、医薬組成物を貯蔵するための１つまたは複数のハウジングを含み得、単位用量のＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片、および任意選択で第２の治療剤を送達するために構成され得る。これらの用量は、固定用量、即ち、処置される被験体のために単位投薬量として適合された物理的に個別の単位であり得る；各単位は、医薬担体と関連して、および任意選択で別の薬剤、例えば、一般用製品または処方された製品として入手可能な薬剤と関連して、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量のＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片を含有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される障害、例えば、ＩＬ−６関連障害を処置するために、この製剤は、その障害の少なくとも１つの徴候または症状における持続性の改善を誘導するのに十分な量かつ十分な時間にわたって、障害を有する被験体に投与される。改善は、被験体が、延長された期間にわたって、例えば、１〜４週間離れた少なくとも２つの時点で改善を示す場合に、「持続性」とみなされる。改善の程度は、徴候または症状に基づいて決定され得、生活の質の質問票などの、被験体に施される質問票もまた使用できる。
改善は、被験体が、選択された徴候および／または症状についてベースラインを超える改善を示すまで、製剤の用量を反復投与することによって誘導され得る。慢性状態を処置する場合、改善の量は、少なくとも１ヶ月またはそれよりも長い期間、例えば、１、２もしくは３ヶ月間またはそれよりも長い期間にわたって、あるいは無期限に、反復投与によって評価され得る。急性状態を処置する場合、この薬剤は、１〜６週間の期間にわたって、またはさらには単回用量として投与され得る。
初回のまたは間欠性の処置後の障害の程度は、１つまたは複数の徴候または症状に従って改善されるように見える場合があるが、処置は、同じレベルでまたは低減された用量もしくは頻度で、無期限に継続され得る。処置はまた、例えば、徴候または症状の改善または消失の際には中断され得る。処置は、低減または中断された後、症状が再出現したときには再開され得る。
処置
本発明のＩＬ−６ａで処置され得る疾患には、ＩＬ−６発現、例えば、上昇したＩＬ−６発現がその疾患状態と関連しているまたはその疾患状態への必要条件としてである疾患が含まれる。かかる疾患には、ＩＬ−６によって駆動される血管形成および炎症が疾患病理に寄与する疾患が含まれる。これには、ＩＬ−６が正常レベルと比較して上昇している疾患、例えば、ＩＬ−６が眼の硝子体において上昇している疾患（例えば、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症およびブドウ膜炎など）または眼の組織において上昇している疾患が含まれる。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４９０５に記載されるように、多くのＩＬ−６関連疾患、例えばＤＭＥの基礎をなす病理的プロセスを再現するマウスおよびラットの脈絡膜血管新生モデルにおいてＩＬ−６抗体の投与によってＩＬ−６経路を遮断することは、抗ＶＥＧＦ陽性対照と類似のレベルまでの血管新生の低減を生じることが、以前に示されている。これらのｉｎ ｖｉｖｏの結果は、ＩＬ−６の局所的阻害が、ＩＬ−６発現と関連する眼性疾患、および血管の漏出が関与する眼性疾患、例えば黄斑浮腫を処置するために有用であり得ることを実証している。
ＩＬ−６関連疾患の例には、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（ウエット型（滲出型）ＡＭＤもしくはドライ型（萎縮型）ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）または近視性脈絡膜血管新生が含まれるがこれらに限定されない特定の眼疾患が含まれる。処置され得る他の眼性障害には、角膜移植、角膜上皮剥離または眼に対する他のかかる物理的傷害などの外傷によって引き起こされる障害が含まれる。処置され得る他の眼性障害には、眼性がん、例えば、眼および眼の近傍、例えば、眼窩または眼瞼を冒すがんが含まれる。したがって、本発明は、ＩＬ−６関連疾患を有する被験体を、本明細書に記載されるＩＬ−６ａで処置することを含む。
本明細書で使用する場合、用語「処置する」とは、障害、例えば、本明細書に記載される障害と関連する状態、症状もしくはパラメーターを改善するのに有効な、または統計的に有意な程度もしくは当業者にとって検出可能な程度のいずれかまで、障害の発症もしくは進行を予防するのに有効な量、様式（ｍａｎｎｅｒ）および／または様式（ｍｏｄｅ）での、被験体、例えば患者への、本明細書に記載される薬剤の投与を指す。この処置は、障害、障害の症状または障害に向かう素因を、治癒させる（ｃｕｒｅ）、治癒させる（ｈｅａｌ）、緩和させる、救済する、変更させる、治療する、好転させる、軽減させる、改善するまたはそれに影響を与えることであり得る。有効な量、様式（ｍａｎｎｅｒ）または様式（ｍｏｄｅ）は、被験体に依存して変動し得、被験体に合わせて調整され得る。例示的な被験体には、ヒト、霊長類および他の非ヒト哺乳動物が含まれる。本発明で特徴付ける製剤はまた、障害またはその症状もしくは徴候の発生の危険性を低減させるために、予防的に与えられ得る。
一部の実施形態では、このＩＬ−６関連疾患は炎症性疾患である。一部の実施形態では、この疾患は緑内障である。
一部の実施形態では、この疾患は眼痛、例えば、眼の疾患または障害に関連する疼痛である。
一部の実施形態では、被験体の処置は、その被験体がＩＬ−６関連疾患を有するかどうか、および任意選択で、その被験体が他の非ＩＬ−６阻害処置、例えば、ステロイドまたは抗ＶＥＧＦ剤に対して抵抗性であるかどうかを決定することもまた含む。
本明細書に記載される製剤は、かかるＩＬ−６関連疾患を有するかまたはかかるＩＬ−６関連疾患の危険性がある被験体に投与され得る。このＩＬ−６関連疾患または障害は、以下に記載されるような炎症性障害であり得る。本明細書に記載される製剤は、かかるＩＬ−６媒介性炎症性障害を有するかまたはかかるＩＬ−６媒介性炎症性障害の危険性がある被験体に投与され得る。
本発明で特徴付ける製剤は、眼性障害、例えば、眼に直接または眼の領域に局所的に、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片を投与することが所望される眼性障害における使用に特に適している。
ドライアイ障害を有する被験体は、眼の炎症を示し得、チクチク（ｓｃｒａｔｃｈｙ）、刺痛（ｓｔｉｎｇｙ）、痒み、ヒリヒリ感または圧力がかかった感覚、刺激、疼痛および発赤を経験し得る。ドライアイ障害は、過剰な流涙および不十分な涙産生と関連し得る。本発明で特徴付ける製剤は、１つまたは複数のかかる症状の発症または悪化を好転させるためまたは予防するために、かかる被験体に投与され得る。本発明で特徴付ける製剤は、被験体における疼痛、例えば、眼性疼痛、例えば、神経炎症に起因する疼痛を和らげるためにも使用され得る。
本明細書に記載される実施形態は、ＩＬ−６関連障害、例えば、ドライアイ障害を有する動物を処置する方法を含む。ドライアイは、例えばイヌでは重篤な障害であり得る。イヌにおけるドライアイと関連する障害の非限定的な例には、先天性障害、感染症（例えば、イヌジステンパーウイルス）、薬物誘導（例えば、サルファ抗生物質による）、および第３の眼瞼の涙腺の脱出（「チェリーアイ」）が含まれる。ドライアイ障害はまた、ある特定のイヌ品種、例えば、コッカースパニエル、シーズー、ラサアプソー、ブルドッグ、シュナウツァーおよびウェストハイランドホワイトテリアにおいて一般に見られる。処置され得る動物の他の非限定的な例には、ネコおよびウマが含まれる。
本発明の製剤は、眼を冒すアレルギー反応を有する被験体、例えば、重症アレルギー性（アトピー性）眼疾患、例えば、アレルギー性結膜炎などを経験している被験体に投与され得る。例えば、この製剤は、外用投与され得る。例えば、Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓら、（１９９９） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ， ４０（１２）： ３０４１−６も参照のこと。
本発明で特徴付ける製剤は、糖尿病性網膜症を有するかまたは糖尿病性網膜症の危険性がある被験体に投与され得る。例えば、Ｄｅｍｉｒｃａｎら、（２００６） Ｅｙｅ ２０：１３６６−１３６９およびＤｏｇａｎａｙら、（２００６） Ｅｙｅ， １６：１６３−１７０を参照のこと。
ブドウ膜炎。ブドウ膜炎には、急性および慢性形態が含まれ、虹彩、毛様体および脈絡膜のうちの１つまたは複数の炎症が含まれる。慢性形態は、全身性自己免疫疾患、例えば、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、ライター症候群および炎症性腸疾患と関連し得る。前部ブドウ膜炎では、炎症は、主に虹彩にある（虹彩炎とも）。前部ブドウ膜炎は、全身性自己免疫疾患を有する被験体を冒し得るが、全身性自己免疫疾患を有さない被験体もまた冒し得る。中間部ブドウ膜炎には、前部硝子体、末梢網膜および毛様体の炎症が関与し、前部または脈絡網膜の炎症はほとんど伴わない場合が多い。毛様体扁平部炎（ｐａｎ ｐｌａｎｉｔｉｓ）は、虹彩と脈絡膜との間の毛様体扁平部の炎症から生じる。後部ブドウ膜炎には、ブドウ膜および主に脈絡膜が関与し、これは脈絡膜炎とも呼ばれる。後部ブドウ膜炎は、全身性感染症または自己免疫性疾患と関連し得る。これは、数ヶ月間、さらには数年間にわたって持続し得る。本発明で特徴付ける製剤は、上述の形態のブドウ膜炎のいずれかを処置するために、被験体に投与され得る。例えば、Ｔｓａｉら、（２００９） Ｍｏｌ Ｖｉｓ １５：１５４２−１５５２およびＴｒｉｔｔｉｂａｃｈら、（２００８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５（２２）： １４７８−８８も参照のこと。
一部の実施形態では、本発明で特徴付ける製剤は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、例えば、ウエット型（滲出型）ＡＭＤもしくはドライ型（萎縮型）ＡＭＤを有するかまたはかかるＡＭＤの危険性がある被験体を処置するために使用される。これらの製剤は、眼に外用適用され得、（例えば、硝子体内）注射され得、または全身的に提供され得る。例えば、Ｏｌｓｏｎら、（２００９） Ｏｃｕｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｌａｍｍ １７（３）：１９５−２００を参照のこと。
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）には、低減された視力および潜在的には失明を引き起こす、網膜血管の閉塞および漏出が関与する。ＤＭＥに対する標準的な処置は、ステロイドまたは抗ＶＥＧＦ抗体の局所的投与を含む。しかし、多くの患者は、これらの治療に対して不応性である。糖尿病性黄斑浮腫の病因には、血管形成、炎症および酸化ストレスの構成要素が関与する。ＩＬ−６は、低酸素症および高血糖症によって誘導され、血管炎症、血管透過性および病理的血管形成を増加させ得る。ＩＬ−６は、ＶＥＧＦ発現を直接誘導し得、動物モデルにおいて脈絡膜血管新生を促進し得る。ＤＭＥ患者では、眼のＩＬ−６レベルは、黄斑の厚さおよび疾患重症度と正に相関する。ＩＬ−６レベルは、報告によれば、抗ＶＥＧＦ治療に失敗する患者では上昇するが、抗ＶＥＧＦ応答性患者では減少する。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａの投与は、抗ＶＥＧＦ治療剤と組み合わせた、または抗ＶＥＧＦ治療に応答しない患者のためを含む抗ＶＥＧＦ処置の代替法として、糖尿病患者の処置のために有用である。ＩＬ−６ａによる黄斑浮腫の処置はまた、病理を阻害するためにいずれかの機構を完全に阻害する必要性を除去し、したがって、各サイトカインの所望の生理学的役割の一部を防止することによって、安全性を改善し得る。したがって、ＶＥＧＦ阻害と組み合わせた局所的ＩＬ−６ａ処置は、用量頻度を減少させ得、処置の有害作用を低減させ得る。
ＤＭＥでは、硝子体ＩＬ−６レベルと、疾患重症度およびＶＥＧＦ不応性被験体の両方との間に、正の相関が存在する。したがって、本明細書に記載されるＩＬ−６ａは、ステロイド治療、抗ＶＥＧＦ治療またはそれら両方に対して不応性であるＤＭＥ被験体を処置するために使用され得る。所与の治療、例えば、ステロイド治療もしくは抗ＶＥＧＦ治療またはそれら両方に対して不応性である被験体は、選択された症状の改善、低減または好転を示さない。一部の場合には、ＩＬ−６ａ、例えば、本明細書に記載されるＩＬ−６抗体またはその断片は、例えばＤＭＥを処置するために、抗ＶＥＧＦ治療またはステロイド治療と組み合わせて使用される。したがって、一実施形態では、本明細書で提供される製剤は、抗ＶＥＧＦ剤またはステロイドを含む。
本明細書に記載される製剤は、眼性疾患を処置するために、任意の様式によって投与され得る。この薬剤は、非経口様式によって送達され得る。あるいはまたはさらに、この製剤は、眼に直接または眼の近傍に送達され得る。例えば、この製剤は、外用、眼内、例えば硝子体内注射によって硝子体内、または結膜下で投与され得る。
例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６抗体またはその断片を含む、本明細書に記載の製剤は、障害、例えば、がん、例えば、眼性がん（眼におけるがんまたは眼の近傍におけるがん）、前立腺がん、白血病、多発性骨髄腫、炎症性疾患（例えば、慢性炎症性増殖性疾患）および自己免疫性疾患、例えば、関節リウマチ、キャッスルマン病（巨大または血管濾胞性リンパ節過形成（ｇｉａｎｔ ｏｒ ａｎｇｉｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、リンパ様過誤腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈａｍａｒｔｏｍａ）、血管濾胞性リンパ節過形成（ａｎｇｉｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ））、若年性特発性関節炎（多関節型若年性特発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および全身型若年性特発性関節炎が含まれる）、スチル病（若年性特発性関節炎および成人発症スチル病を包含する）、成人発症スチル病、アミロイドＡアミロイドーシス、リウマチ性多発筋痛、圧痕浮腫を伴う寛解型血清反応陰性対称滑膜炎（ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｐｉｔｔｉｎｇ ｅｄｅｍａ）、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、ベーチェット病（眼の症状発現の処置を含む）、アテローム動脈硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎（炎症性ミオパチー）、再発性多発軟骨炎、後天性血友病Ａ、多発性硬化症、炎症による貧血、およびクローン病を処置するためにも使用され得る。
ＩＬ−６アンタゴニストは、特定の神経性疾患の処置にも有用である。したがって、一部の場合には、本明細書に記載の製剤は、抑うつおよびアルツハイマー病を処置するために使用することができる。
本明細書に記載されるような製剤で処置され得る他の疾患には、全身性硬化症、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、移植片対宿主病およびＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）が含まれるがこれらに限定されない。
均等物
全ての技術的特色は、かかる特色の全ての可能な組合せで個々に組み合わされ得る。
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなしに、他の具体的な形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての観点において、本明細書に記載される発明に対する限定ではなく例示とみなされるべきである。
本明細書に記載される全ての参考文献の全内容は、その全体が本明細書に援用される。
以下の非限定的な実施例は、本明細書に記載される発明の実施形態をさらに説明する。
（実施例１）
ｋＤによる製剤研究
各製剤中の抗体のｋＤを評価することによって初回スクリーニングを実施して、ＩＬ−６抗体ＥＢＩ−０３１のための有望な賦形剤および製剤を同定した。拡散相互作用パラメーターｋＤを、自由溶液（ｆｒｅｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のナノ粒子の拡散係数を測定するＷｙａｔｔ ＤｙａｎＰｒｏプレートリーダーを使用して決定した。濃ＥＢＩ−０３１を、製剤緩衝液中に段階希釈して、所望の濃度を達成した。ＥＢＩ−０３１モノマーについての拡散係数を、複数回の反復を使用して測定した。平均拡散係数を、ＥＢＩ−０３１濃度に対してプロットした。拡散係数ｋＤを、グラフの傾きをｙ値によって除算することによって得た。
試験した製剤は、クエン酸、ヒスチジンまたはリン酸から選択される２０ｍＭの緩衝液、および以下のうちの１つを含有した：５％のスクロース、５％のトレハロース、５％のソルビトールまたは１５０ｍＭのＮａＣｌ。クエン酸緩衝液を含有する試験した製剤は、６．０または６．５のｐＨを有し、ヒスチジンまたはリン酸緩衝液を含有する製剤は、６．０、６．５または７．０のｐＨを有した。以下に示す表２は、ｋＤ製剤スクリーニングからの結果をまとめる。
このスクリーニングからの結果に基づくと、溶解度は、ｐＨ６．５において良好であったが、ｐＨ６．０またはｐＨ７．０ではそれほど良好ではなく、最良のｐＨが６．５であることを示唆している。結果の要約を表２に示す。このスクリーニングは、塩化ナトリウムなどの塩が、全ての製剤にとって良好であったこともまた示した。
（実施例２）
異なる緩衝液および賦形剤の動的光散乱（ＤＬＳ）スクリーニング
加速安定性研究を実施して、ＥＢＩ−０３１について異なる緩衝液および賦形剤をスクリーニングした。試験した製剤は、１ｍｇ／ｍｌのＥＢＩ−０３１、２０ｍＭの緩衝液、および試験した賦形剤（例えば、張度剤またはアミノ酸）を含有した。使用した緩衝液は、ｐＨ７．５のトリス緩衝液、ｐＨ６．５もしくはｐＨ７．５のリン酸緩衝液、ｐＨ６．５のヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液またはｐＨ５．５の酢酸緩衝液から選択した。試験した賦形剤は、５％のソルビトール、１０％のスクロース、５％のトレハロース、５％のキシリトール、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．２Ｍのアルギニン、または０．２Ｍのグリシンから選択した。試験した具体的な製剤を以下の表３に示す。試料を３８℃でインキュベートし、安定性を１週間後および６週間後に評価した。
動的光散乱（ＤＬＳ）は、溶液中のタンパク質分子による凝集物形成の尺度として利用される。試料は、Ｗｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ中に配置され、この装置は、ブラウン運動に基づいて拡散係数（Ｄｔ）を測定する。流体力学半径（Ｒｈ）は、拡散係数と反比例し、増加した流体力学半径は凝集を示す。ＤＬＳスクリーニングについての結果を以下の表３にまとめる。
（実施例３）
０日目および７日目における産物純度製剤研究
種々の賦形剤を、ＥＢＩ−０３１抗体を含有する異なる製剤において試験した。異なる製剤を、試料回収、産物純度および外観について、０日目および７日目に試験した。試験した製剤は、２０ｍＭの基礎緩衝液を含有し、この緩衝液は、酢酸（ｐＨ５．５）、クエン酸（ｐＨ６．０またはｐＨ６．５）、ヒスチジン（ｐＨ６．５）、リン酸（ｐＨ６．５、ｐＨ７．０またはｐＨ７．５）およびトリシン（ｐＨ８．５）；２０ｍＭおよび１５０ｍＭのいずれかの塩化ナトリウム；ならびに以下の賦形剤のうちの１つであった：１０％のスクロース、５％のソルビトール、０．１％のポリソルベート−２０、０．１％のポリソルベート−８０、０．１％のポロクサマーＰ１８８および０．２Ｍのアルギニン。
試験した製剤は、９６ウェル微小透析プレート中で調製した。微小透析プレートウェルを、ストック緩衝液（２０ｍＭの緩衝液）および２×最終濃度の賦形剤溶液（例えば、９００μｌの２×緩衝液＋９００μＬの２×賦形剤溶液）で満たした。プレートを、プレートシェーカー上で混合して、試料添加前の混合を確実にした。タンパク質試料を適切なウェルに添加した。プレート上の製剤の組織を表４に示す。試料を、プレートシェーカー上で室温で２時間透析した。試料ウェルインサートを、新たな溶液中での一晩の透析のために、第２の緩衝液／賦形剤プレートに移した。
一晩の透析後、各試料を回収し、透明３００μＬガラスバイアル中に移した。全ての試料は、透明で無色であった。各透析カセットから回収された容積は、ある特定の緩衝液条件（特に、１０％スクロース緩衝液中）では変動した。
次いで、各試料の濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した；しかし、おそらくは高い粘性／高いタンパク質濃度に起因して、測定値は可変であった。次いで、各試料のアリコートを、サイズ排除−ＵＰＬＣ（ＳＥ−ＵＰＬＣ）移動相緩衝液中で、およそ０．９９４ｍｇ／ｍＬ（出発濃度に基づく）まで１００倍希釈し、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計で分析した。回収の結果を表４に示す。
増加したタンパク質濃度が、回収容積における低減に最も可能性が高く起因して、１０％のスクロースを含有する全ての条件で観察された。ＳＥ−ＵＰＬＣによって得られたクロマトグラムのクロマトグラムオーバーレイによる分析によって、試料間で実質的な差異は存在しなかった。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計を使用して決定したタンパク質濃度とＳＥ−ＵＰＬＣピーク面積から予測したタンパク質濃度との比較は、表５に示すように、良好に一致した。
主要ＩｇＧピーク純度をＳＥ−ＵＰＬＣによって決定した。ｐＨに関して主要ＩｇＧピーク純度を分析した場合、主要ＩｇＧピークは、基礎緩衝液のｐＨが増加するにつれて、僅かに低減するようであった（図２Ａ）。これらの結果は、ＥＢＩ−０３１が、より低いｐＨでより安定なままであること、例えば、ｐＨ８．５からｐＨ５．５に向かうほど安定なままであることを示している。各賦形剤に関して主要ＩｇＧピーク純度を分析した場合、賦形剤アルギニンは、産物純度に対して正の影響を有した（図２Ｂ）。この効果は、高い塩濃度および低い塩濃度の両方で観察された。他の賦形剤は、産物の安定性に対してより長期の影響を有し得る。
４０℃での７日間のインキュベーション後、試料を、外観、回収、ＵＶ含量（ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計決定による）、ＳＥ−ＵＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥについて分析した。外観による分析は、ほとんどの試料が透明で無色に見えたことを示した。おおよその容積は、１５μｌと１００μｌとの間で変動し、ほとんどの試料は、予測された値（２５〜４０μｌ）（ほとんどの試料について適切な容積回収、×１００希釈での分析を可能にする）に近い容積で回収され、いくつかの試料は、さらなる分析のためには粘性がありすぎた。
７日目の時点での試料の濃度を、ＳＥＣ移動相Ａによる１００倍希釈で分析した（ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計）。１００倍希釈後の予測されたタンパク質濃度＝０．９９４ｍｇ／ｍＬ。ほとんどの試料は、評価の結果として、出発濃度よりも僅かに高い含量値を生じた。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計分析の結果を表６に示す。
ＳＥ−ＵＰＬＣ分析もまた、７日目に実施した。ＳＥ−ＵＰＬＣクロマトグラムを、緩衝液に従ってオーバーレイして、試料の純度に対する異なる塩濃度および賦形剤の影響を評価した。ＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を図３Ａ〜３Ｅにまとめる。このデータは、ｐＨの増加と共に、減少した主要ピーク百分率および増加したＨＭＷピークに向かう傾向もまた示している。純度はまた、低いｐＨでは合理的に一貫している（図４）。ヒスチジン緩衝液は、全ての賦形剤にとって最適な緩衝液であることが示された。ソルビトールもまた、ｐＨ６．５のヒスチジン緩衝液を用いた製剤における、次善の賦形剤であることが示された（図５）。
図６は、ヒスチジン緩衝液を含有する試料についての、異なる塩濃度および賦形剤に関する主要ピーク純度（％）を示すグラフである。ｘ軸上の数１〜１２は、表６に列挙される列１〜１２中に存在する塩濃度および賦形剤を示す。
（実施例４）
撹拌研究
撹拌研究を実施して、ＥＢＩ−０３１を含有する製剤についての最適な洗剤条件を同定した。第１の研究では、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびポロクサマー１８８を比較した（０．１％で）。第２の研究では、異なる濃度のポリソルベート２０およびポリソルベート８０を比較した（０．１％および０．０３％）。
第１の研究では、０．１％のポリソルベート−２０、０．１％のポリソルベート−８０または０．１％のポロクサマー１８８と共に、ｐＨ６．５の、２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）中５０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＢＩ−０３１。研究の開始時および終了時に、バイアルの目視検査を実施した。研究の開始時に、全ての試料は、目視検査で透明に見えた。試料を４時間ボルテックスした。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計およびＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、撹拌誘導される凝集が、洗剤によって有効に防止されたことが示された。第１の撹拌研究の結果を図７にまとめる。ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって、ポリソルベートは、緩衝液条件における低い産物濃度で、ポロクサマーよりも僅かに良好なようであった。これらの結果は、全ての洗剤が、ＳＥ−ＵＰＬＣを使用して評価した場合、撹拌誘導される凝集からの保護を提供するようであることを実証している。洗剤の非存在は、より低い産物濃度でかなりの凝集をもたらした。
第２の研究では、Ａ）洗剤なし、Ｂ）０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、Ｃ）０．１％のＴｗｅｅｎ−８０、Ｄ）０．０３％のＴｗｅｅｎ−２０、またはＥ）０．０３％のＴｗｅｅｎ−８０と共に、ｐＨ６．５の、２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール中５０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＢＩ−０３１を含有する試料を調製した。研究の開始時および終了時に、バイアルの目視検査を実施した。研究の開始時に、全ての試料は、目視検査で透明に見えた。対照は、２〜８℃の非撹拌試料（２００μｌの試料）であった。試料（８００μｌ）を、４００ｒｐｍで２〜８℃でＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒによって撹拌し、次いで、アリコートを、ＳＥ−ＵＰＬＣを使用する分析のために１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＳＥ−ＵＰＬＣおよび質量オスモル濃度のための材料の取り出し後の残りの試料（５００μｌ）を、１０００ｒｐｍで２〜８℃で４時間にわたってＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒによって再撹拌し、次いで、アリコートを、ＳＥ−ＵＰＬＣによる分析のために１ｍｇ／ｍｌに希釈した。残りの試料を、１０００ｒｐｍで２５℃で３時間にわたってＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒによって再撹拌し、次いで、アリコートを、ＳＥ−ＵＰＬＣによる分析のために１ｍｇ／ｍｌに希釈した。残りの試料を、１０００ｒｐｍで２５℃で一晩Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒによって再撹拌した。
第２の撹拌研究におけるＳＥ−ＵＰＬＣ分析からの結果を図８Ａ〜８Ｃにまとめる。結果は、総ピーク面積（図９Ａ）、ＩｇＧ主要ピーク純度（図９Ｂ）、高分子量種（図９Ｃ）および低分子量種（図９Ｄ）の分析によってグラフ形式で示す。濃度分析もまた、Ｓｏｌｏ ＶＰＥ（表７Ｂ）およびＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計分析（表７Ｃ）からの結果を、ＳＥ−ＵＰＬＣ総ピーク面積から推定した含量と比較することによって、試料に対して実施した。ＳＥ−ＵＰＬＣ総ピーク面積から推定した含量を、平均参照標準と比較し、希釈計数を乗算して、表７Ａに示される含量値（ｍｇ／ｍｌ）を得た。ＳＥ−ＵＰＬＣからの結果とＵＶ含量決定からの結果との相関は、３２０ｎｍでも６００ｎｍでも実質的な光散乱がないこと、およびその産物含量の実質的な喪失がないことを示し、したがって、これは、最小限の凝集を暗示している。合わせると、第２の撹拌研究からのこれらの結果は、産物抗体が、含量、主要ピーク純度またはＨＭＷ種に対する最小限の変化を伴って、良好な安定性を実証したことを示した。洗剤の使用は、試験した条件では有害ではなかった。０．０３％濃度および０．１％濃度におけるＴｗｅｅｎ−２０およびＴｗｅｅｎ−８０の両方が、製剤中に含めるために等しく適切であるようであった。
（実施例５）
例示的な製剤の調製
ＧＭＰ製造
ＧＭＰ製造の間に、最終製剤緩衝液Ｒ（２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール、０．０３％のＴｗｅｅｎ−２０）が、最終０．２μｍフィルターを洗い流すために調製される。これを実施するために、９Ｌの緩衝液Ｒが作製され、１Ｌの緩衝液Ｑが添加される（詳細については表８を参照のこと）。ＧＭＰ製造において使用される材料は表９に詳述する。
−緩衝液Ｑおよび緩衝液ＲについてのｐＨは、水酸化ナトリウム２５％溶液を用いて調整される。
−表３の緩衝液の室温での保存有効期間は３日間である。
−緩衝液Ｑ：１．７ｍＬ／Ｌの水酸化ナトリウム（２５％）を必要とする。逆滴定は許容されない。最終緩衝液密度＝１．０１３２ｋｇ／Ｌ。質量オスモル濃度の仕様＝３００〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ。
−緩衝液Ｒ：１．７ｍＬ／Ｌの水酸化ナトリウム（２５％）を必要とする。逆滴定は許容されない。最終緩衝液密度＝１．０１１６０ｋｇ／Ｌ。質量オスモル濃度の仕様＝３００〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ。
−緩衝液Ｕ：この緩衝液は、９部の緩衝液Ｒを１部の緩衝液Ｑに混合することによって作製する。特定された容積の緩衝液Ｒが作製され、次いで、必要な容積の緩衝液Ｑが添加される。
毒性学研究材料についての希釈の詳細。
出発材料は７０．３ｇ／Ｌであった。この材料を、緩衝液Ｒ（２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール）を用いて、５５．５ｇ／Ｌの標的まで希釈した。次いで、この産物を、１部の緩衝液Ｑ（２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール、０．３％のＴｗｅｅｎ−２０）に対して９部の産物で希釈して、５０．６ｇ／Ｌの最終ＥＢＩ−０３１濃度および０．０３％の最終Ｔｗｅｅｎ−２０濃度を達成した。
５０．６ｇ／Ｌ試料の一部分を、１部の緩衝液Ｕ（２０ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭの塩化ナトリウム、４％のソルビトール、０．０３％のＴｗｅｅｎ−２０）に対して１部の産物で希釈して、２５．３ｇ／Ｌの最終濃度を達成した。
２５．３ｇ／Ｌ材料の一部分を、４部の緩衝液Ｕに対して１部の産物でさらに希釈して、５．１ｇ／Ｌの最終濃度を達成した。全ての濃度を、Ａ３２０補正を用いたＡ２８０によって決定した。
（実施例６）
ＩｇＧ２ ＩＬ−６抗体の構造的アイソフォームの特徴付け
ＥＢＩ−０３１はＩｇＧ２抗体である（配列は表１において提供される）。以前に議論したように、ＩｇＧ２抗体は、３つの異なる構造的アイソフォーム、ＩｇＧ２−Ａ、ＩｇＧ２−ＢおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームで存在する（図１０）。この実施例では、ＥＢＩ−０３１試料中の構造的アイソフォームおよび異なる試料供給源からおよび還元剤の存在下でのその分布を同定するための実験を実施した。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、ＥＢＩ−０３１の種々の構造的アイソフォームを分解した。ＩｇＧ２ジスルフィド媒介性構造的アイソフォームを分解するために以前に使用された増強分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法（Ｄｉｌｌｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２００６年、１１２０巻：１１２〜１２０頁を参照のこと）を、ＥＢＩ−０３１を分解するために最適化した。
およそ３０μｇを含むＥＢＩ−０３１試料を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、５．０μｍ、３００Å）上にロードした。カラム温度を７５℃に設定した。移動相Ａは、０．１％ＴＦＡを含む水であり、移動相Ｂは、５５％ＩＰＡ、４０％ＡＣＮ、４．９％水および０．１％ＴＦＡであった。流量は０．５ｍＬ／分であった。このカラムを、９０％移動相Ａおよび１０％移動相Ｂで２分間最初に平衡化し、その後、１０％Ｂから２５％Ｂまでの２分間のステップ勾配が続いた。溶出を、２１分間にわたる２５〜３２％Ｂの線形勾配で達成した。ＵＶ吸光度を、２１４ｎｍおよび／または２８０ｎｍにおいてモニタリングした。
この分解がジスルフィドに関連するかどうかを決定するために、試料を、室温で２分間５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭシステインで処理し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ法で分析した（図１１）。強力な還元剤であるＤＴＴによる処理は、ＩｇＧ２抗体の還元を引き起こし、初期ピーク（ピーク０およびピーク１）への溶出を生じる（図１１、中央のパネル）。ＤＴＴと比較してより穏やかな還元剤であるシステインによる処理もまた、ＤＴＴ処理試料において見られた程度までではなかったものの、アイソフォーム分布を初期ピーク（ピーク０およびピーク１）に向けてシフトさせる（図１１、下のパネル）。
このデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣ法が、異なるジスルフィド接続性を有する構造的アイソフォームを分解したことを実証している。異なるジスルフィド結合構造を、非還元ペプチドマッピングおよび質量分析的分析によって確認した：初期に溶出するピーク（ピーク１）は、ＩｇＧ２−Ａ／Ｂアイソフォームを含み、後に溶出するピーク（ピーク２）は、ＩｇＧ２−Ａアイソフォームを含む。重要なことに、ＥＢＩ−０３１試料では、ＩｇＧ２−ＢアイソフォームＢ（ピーク０）は検出されなかった（図１１、上のパネル）。
異なるＥＢＩ−０３１試料におけるアイソフォームの不均一性
上記ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を使用して、異なるＥＢＩ−０３１発現細胞株から収集したＥＢＩ−０３１試料を分析して、産生された抗体のアイソフォーム分布を比較した。ＥＢＩ−０３１試料を、クローン性細胞株の２００Ｌスケールの培養物、親細胞株からの１０Ｌスケールの培養物、および細胞の安定にトランスフェクトされたプールから収集した。ＥＢＩ−０３１を、クローン性および親ＥＢＩ−０３１発現細胞株から、３ステップクロマトグラフィー法を使用して精製した。ＥＢＩ−０３１を、プロテインＡ精製を使用して、細胞の安定にトランスフェクトされたプールから精製した。これらの試料を、上記方法によって分析した。
図１２に示される結果は、３つ全てのＥＢＩ−０３１試料が、アイソフォームＩｇＧ２−ＡおよびＩｇＧ２−Ａ／Ｂを含有したが、実質的な量のＩｇＧ２−Ｂは含有しなかったことを示している。このデータは、産生が、クローン性ＥＢＩ−０３１発現細胞株からであれ、親ＥＢＩ−０３１発現細胞株からであれ、ＥＢＩ−０３１を安定に発現する不均一な細胞集団からであれ、このＥＢＩ−０３１ ＩｇＧ２抗体が、他のＩｇＧ２抗体よりも不均一ではない混合物として産生されることを実証している。図１３は、クローン性ＥＢＩ−０３１発現細胞株、例えば、図１２の上のパネルの２００Ｌスケールの培養物由来のＥＢＩ−０３１試料からのアイソフォームの分布を示す。曲線下面積もまた測定し、アイソフォーム間の分布を図の下の表に示す。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (65)

  1. １〜１００ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体またはその断片；
    １０〜５０ｍＭのヒスチジン；
    ０．０１％〜０．１％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；
    １〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム；および
    １〜１０％のソルビトール
    を含む医薬製剤であって、前記製剤のｐＨが５．５と７．５との間である、医薬製剤。
  2. ５〜５０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む、請求項１に記載の製剤。
  3. ５ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む、請求項２または３に記載の製剤。
  4. ５０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む、請求項２または３に記載の製剤。
  5. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号１９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む、請求項１から４のいずれかに記載の製剤。
  6. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号２２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２３の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の製剤。
  7. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    （ｉ）配列番号２８または２９を含む定常領域配列、または
    （ｉｉ）配列番号２８に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である定常領域配列
    を含む、請求項１から６のいずれかに記載の製剤。
  8. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    （ｉ）配列番号１７を含む重鎖可変領域配列、または
    （ｉｉ）配列番号１７に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖可変領域配列
    を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
  9. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    （ｉ）配列番号１３を含む重鎖配列、または
    （ｉｉ）配列番号１３に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である重鎖配列
    を含む、請求項１から８のいずれかに記載の製剤。
  10. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    （ｉ）配列番号１８を含む軽鎖可変領域配列、または
    （ｉｉ）配列番号１８に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖可変領域配列
    をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の製剤。
  11. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    ｉ）配列番号１４を含む軽鎖配列、または
    ｉｉ）配列番号１４に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一である軽鎖配列
    を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の製剤。
  12. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の製剤。
  13. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号１３を含む重鎖配列および配列番号１４を含む軽鎖配列を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の製剤。
  14. １０〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の製剤。
  15. ２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の製剤。
  16. ０．０１％〜０．０５％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の製剤。
  17. ０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の製剤。
  18. １０〜５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の製剤。
  19. １０〜３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１から１８のいずれかに記載の製剤。
  20. ２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１から１９のいずれかに記載の製剤。
  21. ２〜６％のソルビトールを含む、請求項１から２０のいずれかに記載の製剤。
  22. ４％のソルビトールを含む、請求項１から２１のいずれかに記載の製剤。
  23. ６．０と７．０との間のｐＨである、請求項１から２２のいずれかに記載の製剤。
  24. ６．２と６．８との間のｐＨである、請求項１から２３のいずれかに記載の製剤。
  25. 約ｐＨ６．５である、請求項１から２４のいずれかに記載の製剤。
  26. ５〜５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片；
    ２０ｍＭのヒスチジン；
    ０．０３％のポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）またはポロクサマー１８８；
    ２０ｍＭの塩化ナトリウム；および
    ４％のソルビトール
    を含む医薬製剤であって、前記製剤のｐＨが６．５である、医薬製剤。
  27. ５ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む、請求項２６に記載の製剤。
  28. ５０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６抗体またはその断片を含む、請求項２６に記載の製剤。
  29. 前記抗ＩＬ−６抗体またはその断片が、
    ｉ）配列番号１９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；ならびに
    ｉｉ）配列番号２２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２３の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号２４の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、請求項２６から２８のいずれかに記載の製剤。
  30. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２６から２９のいずれかに記載の製剤。
  31. 前記ＩＬ−６抗体またはその断片が、配列番号１３を含む重鎖配列および配列番号１４を含む軽鎖配列を含む、請求項２６から３０のいずれかに記載の製剤。
  32. 前記抗ＩＬ−６抗体がＩｇＧ２抗体である、請求項１から３１のいずれかに記載の製剤。
  33. 前記ＩＬ−６抗体が全長抗体である、請求項１から３２のいずれかに記載の製剤。
  34. 前記製剤中に存在する前記抗体の少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％または９９％が、合わせて、アイソフォームＡまたはＡ／Ｂである、請求項１から３３のいずれかに記載の製剤。
  35. 前記製剤中に存在する前記抗体の少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％が、アイソフォームＡである、請求項１から３４のいずれかに記載の製剤。
  36. 前記製剤中に存在する前記抗体の１％未満、例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％が、アイソフォームＢである、請求項１から３５のいずれかに記載の製剤。
  37. アイソフォームＢにある前記抗体を実質的に含まない、例えば、５％、４％、３％、２％または１％未満しか含まない、請求項１から３６のいずれかに記載の製剤。
  38. アイソフォームＡ、Ａ／Ｂおよび／またはＢで存在する抗体の百分率が、ＨＰＬＣ、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ、または例えば非還元条件下でのペプチドマッピングとその後の質量分析的分析とによって決定される、請求項３４から３７のいずれかに記載の製剤。
  39. キレート剤、保存剤または抗酸化剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１から３８のいずれかに記載の製剤。
  40. 第２の治療剤をさらに含む、請求項１から３９のいずれかに記載の製剤。
  41. 眼への投与に適切である、請求項１から４０のいずれかに記載の製剤。
  42. 硝子体内、眼内または結膜下投与に適切である、請求項１から４１のいずれかに記載の製剤。
  43. 少なくとも１または２年間にわたって−６５℃またはそれ未満の温度で安定である、請求項１から４２のいずれかに記載の製剤。
  44. 少なくとも６ヶ月間にわたって２℃〜８℃の間の温度で安定である、請求項１から４２のいずれかに記載の製剤。
  45. ＩＬ−６関連疾患を有する被験体を処置するための、請求項１から４４のいずれかに記載の製剤の使用。
  46. 前記ＩＬ−６関連疾患が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（例えば、ウエット型ＡＭＤもしくはドライ型ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、近視性脈絡膜血管新生、眼性がん、角膜移植、角膜上皮剥離または眼に対する物理的傷害からなる群から選択される、請求項４５に記載の製剤の使用。
  47. 前記ＩＬ−６関連疾患が糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、請求項４５または４６に記載の使用。
  48. 前記製剤が、前記被験体の眼に投与される、請求項４６から４７のいずれかに記載の使用。
  49. 前記製剤が、硝子体内投与される、請求項４６から４８のいずれかに記載の使用。
  50. 請求項１から４４のいずれかに記載の製剤を含む容器またはデバイス。
  51. 前記製剤の容積が、少なくとも０．１、０．５、１、２または５ｍｌである、請求項５０に記載の容器。
  52. 多用量容器である、請求項５０または５１に記載の容器。
  53. 請求項１から４４のいずれか一項に記載の製剤を含む薬物送達デバイス。
  54. 請求項１から４４のいずれか一項に記載の製剤を含む容器またはデバイス、および任意選択で、使用のための指示を含む、キット。
  55. ＩＬ−６関連疾患、例えば、上昇したＩＬ−６発現と関連する疾患を有する被験体を処置する方法であって、請求項１から４４のいずれかに記載の医薬製剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
  56. 前記製剤が眼に投与される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記製剤が、例えば、硝子体内注射によって硝子体内投与される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＩＬ−６関連疾患が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、ドライアイ（例えば、ドライアイ疾患またはドライアイ症候群）、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（例えば、ウエット型ＡＭＤもしくはドライ型ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、近視性脈絡膜血管新生、眼性がん、角膜移植、角膜上皮剥離または眼に対する物理的傷害からなる群から選択される、請求項５５〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. 前記ＩＬ−６関連疾患が糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、請求項５５から５８のいずれかに記載の方法。
  60. 第２の治療剤を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項５５から５９のいずれかに記載の方法。
  61. 前記第２の治療剤が、抗ＶＥＧＦ剤、ステロイド、例えばコルチコステロイド、または抗ＰＤＧＦ剤である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記被験体が、抗ＶＥＧＦ剤、ステロイドまたは抗ＰＤＧＦ剤で以前に処置されている、請求項５５から５１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記被験体が、抗ＶＥＧＦ剤、ステロイドまたは抗ＰＤＧＦ剤による処置に応答しなかった、請求項５２に記載の方法。
  64. 前記被験体が哺乳動物である、請求項５５から６３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記被験体がヒトである、請求項５５から６４のいずれかに記載の方法。
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