KR20220013343A - 안과용 액상 조성물 - Google Patents

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KR20220013343A
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윤재승
박정수
이승희
김현주
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(주) 팬젠
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Abstract

본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 애플리버셉트(aflibercept); 소듐 아세테이트, 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 폴리소르베이트 또는 폴록사머(poloxamer)인 계면활성제를 포함하는 안과용 액상 조성물, 및 애플리버셉트의 안정화용 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명의 안과용 액상 조성물은 교반, 반복 냉·해동, 자외선(UV) 노출 및 고온 보관 시 스트레스에 대해 안정성 부여 효과가 우수한 것을 특징으로 한다.

Description

안과용 액상 조성물{Liquid ophthalmic composition}
본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 애플리버셉트(aflibercept); 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는 안과용 액상 조성물에 관한 것이다.
애플리버셉트(aflibercept)는 무색 또는 연한 황색의 투명한 액상 주사제로서, 혈관 신생 및 혈관 투과성 증가와 관련된 인자 중 하나인 '혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)'에 의한 비정상적인 혈관 신생으로 인한 질환, 예컨대 습성 연령-관련 황반 변성(wet age-related macular degeneration), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema) 및 망막 정맥 폐쇄-황반 부종(macular edema in retinal vein occlusion) 등에 대한 치료제로 알려져 있다.
다른 치료용 단백질 약물과 마찬가지로, 애플리버셉트 또한 최적의 조건이 아닌 경우의 스트레스, 예컨대 저장 및 운송 과정 등에서 물리화학적으로 변성이 일어날 수 있다. 특히 단백질의 농도, 안정화제의 종류 및 농도, pH, 온도, 염의 농도, 외부 충격 및 공기/빛과의 접촉 여부 등에 따라 단백질의 산화나 탈아미드화, 이성질체화 또는 중합 반응이 발생할 수 있고, 이는 단백질 약물의 응집체(aggregate), 단편(fragment) 및 이성질체(isomer) 생성 등으로 이어져 약물의 활성을 감소시킬 수도 있다. 또한, 안과용 액상 조성물의 특성상 단백질 약물 내 응집으로 인한 미립자 형성은 부작용의 원인이 될 수 있는바, 이를 안정화시킬 수 있는 제형의 개발은 무엇보다 중요하다고 할 수 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 애플리버셉트를 포함하는 안과용 액상 조성물의 약학적 처리, 저장 및 운송 등에서 발생할 수 있는 다양한 스트레스에 대해 안정성이 향상된 제형을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 안과용 액상 조성물이 완충액 내 소듐 아세테이트, 히스티딘, 염화 나트륨 또는 소르비톨인 등장화제를 특정 농도로 포함함으로써, 교반, 반복 냉·해동, 자외선(UV) 노출 및 고온 보관 시 스트레스에 대해 안정성 부여 효과가 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
국제공개특허 WO2007/149334는 아플리버셉트; 폴리소르베이트 등의 유기 공용매' 염화나트륨 또는 염화칼륨으로부터 선택된 이온성 등장화제;및 인산나트륨 완충제; 수크로오스 등의 안정화제를 포함하고, pH 5.8 내지 7.0의 안약, 동결건조 제형을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 제제도 고온(40℃) 조건과 같은 가혹 조건에서는 아플리버셉트의 안정성이 현저히 감소된다. 따라서, 이러한 고온 조건을 비롯한 다양한 가혹 조건에서도 향상된 안정성을 제공하는 애플리버셉트 안과용 액상 조성물의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 애플리버셉트를 포함하는 안과용 액상 조성물의 다양한 가혹 조건에 대해 안정성이 향상된 제형을 개발하고자 예의 노력한 결과, 소듐 아세테이트, 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 본 발명의 안과용 액상 조성물이 장기간 가혹 조건에서도 향상된 안정성을 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
WO 2007/149334
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 치료학적으로 유효한 양의 애플리버셉트(aflibercept); 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 안과용 액상 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 예시적 목적은 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 애플리버셉트의 안정화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 예시적 목적은 상기 안과용 액상 조성물을 포함하는 용기를 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 치료학적으로 유효한 양의 애플리버셉트(aflibercept); 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 안과용 액상 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 안과용 액상 조성물은 교반, 반복 냉해동, 자외선(UV) 노출 및 고온 보관 시 스트레스에 대해 안정성 부여 효과가 우수하여 애플리버셉트를 포함하는 공지된 제제와 비교하여 최적의 조건이 아닌 경우의 스트레스, 예컨대 저장 및 운송 과정 등에서 물리화학적으로 발생할 수 있는 변성을 최소화하고 약물의 활성을 안정적으로 유지할 수 있다.
본 발명에서 용어 "애플리버셉트(aflibercept)"는 Regeneron Pharmaceuticals 사에서 개발되어 EYLEA®라는 상표명으로 황반 변성 치료제로 판매되고 있는 안과용 주사제에 포함된 유효성분의 명칭으로, 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 VEGFR1 또는 VEGFR2의 세포외 도메인을 포함하는 융합단백질을 일컫는다.
본 발명에 있어서, 상기 애플리버셉트는 10 내지 100 mg/ml, 구체적으로는 30 내지 80 mg/ml의 농도, 보다 구체적으로는 40 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 "애플리버셉트"는 애플리버셉트 뿐만 아니라 그의 바이오시밀러를 포함한다.
본 발명에서 용어 "바이오시밀러(biosimilar)"는 특허가 만료되어 원특허권자가 아닌 제3자에 의해서 생산이 가능한 생물의약품에 대한 복제약을 의미하며, 다른 말로, 바이오 복제약, 바이오제네릭(biogeneric)이라 부르기도 한다. 즉, 특허받은 생물의약품과 아미노산 서열 정보는 동일하되 동일한 공정으로 제조하지는 않으나 임상실험을 하여 혈액검사 결과 생물학적으로 거의 동일한 효과를 낼 경우 동등성 인증을 받아 바이오시밀러로 인정된다.
본 발명에서 용어 "완충액(buffer)"은 약산과 그의 짝염기(conjugate base) 또는 약염기와 그의 짝산(conjugate acid)으로 이루어지며 외부 요인에 의한 pH 변화를 견딜 수 있는 용액을 의미한다. 본 발명에서 완충액은 소듐 아세테이트(sodium acetate) 또는 히스티딘(histidine)을 포함하고, pH 5.3 내지 6.2의 범위, 보다 구체적으로, pH 5.5 내지 5.8을 갖는 완충액일 수 있다.
상기 소듐 아세테이트 또는 히스티딘은 5 내지 20 mM의 농도일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 10 mM의 농도일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당은 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하며, 상기 당은 5 내지 20 %(w/v), 구체적으로는 8 내지 10 %(w/v)의 농도일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머(poloxamer)일 수 있으며, 구체적으로 0.01 내지 0.03 %(w/v)의 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머 188일 수 있다.
또한, 본 발명의 안과용 액상 조성물은 염화 나트륨 또는 소르비톨인 등장화제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 염화 나트륨은 10 내지 50 mM의 농도, 보다 구체적으로는 20 내지 30mM의 농도이고, 상기 소르비톨은 1 내지 10 %(w/v)의 농도일 수 있다.
또한, 조성물의 안정성을 위하여, 염화 나트륨과 같은 염을 포함하지 않을 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 일 실시예에서 확인한 바와 같이, 가속 (accelerated, 25℃), 가혹 (stressed, 40℃) 조건의 SE-HPLC, cIEF, RP-HPLC, Deamidation, Binding assay 등의 결과, pH가 높거나 염이 포함된 제형은 응집체가 증가하고, pI가 낮은 이성질체가 증가하는 반면, pH가 너무 낮은 제형에서는 단편체, 산화체 등이 증가함을 확인하고, 조성물의 pH 5.5 ~ 5.8 범위이면서, NaCl과 같은 염이 포함되지 않은 경우 가장 안정한 조성물로 확인하였다
본 발명의 안과용 액상 조성물은 일 예로, 주사제 조성물로, 유리체 내 주사(intravitreal injection)에 적합한 제형을 갖는 것을 특징으로 하며, 특히 유리체 내 주사에 적당한 프리필드 시린지(pre-filled syringe)에 적용할 수 있다.
상기 안과용 액상 조성물은 애플리버셉트의 처리로 개선/치료될 수 있는 다양한 질환에 대해 특별한 제한없이 의약 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 습성 연령-관련 황반 변성 등의 각종 안과 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 안과용 액상 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 안과용 액상 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양할 수 있으며, 의사는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 애플리버셉트의 안정화용 조성물을 제공한다. 상기 용어 애플리버셉트, 완충액, 당 및 계면활성제의 정의, 종류 및 농도 등에 관한 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 교반, 반복 냉해동, 자외선(UV) 노출, 고온과 같은 가혹 조건, 보관온도에 따른 안정성 효과가 우수한 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어 "안정성"은 약물 내 포함된 단백질이 약학적 처리, 저장 및 운송 등 최적의 조건이 아닌 경우에 발생할 수 있는 다양한 스트레스에 대해 물리적 및/또는 화학적 안정성을 유지하고, 안과용 액상 조성물로서 활성을 유지하기 위한 생물학적 안정성을 그대로 보유하는 것을 의미한다. 단백질 또는 약물의 안정성 측정을 위한 다양한 분석기술은 당업계 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 특정 온도, 가혹 조건, 기간 및 시간 간격으로 측정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명 조성물에 대해 가혹조건인 교반조건, 반복냉해동, UV 조건에서의 안정성 여부를 육안 평가, 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC) 및 FlowCAM 분석법 등을 수행하여 응집체 형성 여부 등을 확인하였고, 다양한 온도(-70℃, 5 ℃, 25 ℃, 40 ℃)에서의 보관 시 안정성을 평가한 결과, 본 발명 조성물은 교반, 반복 냉해동, 자외선(UV) 노출 및 고온 등 가혹조건에 대해 우수한 안정성을 가짐을 확인하였다. 또한, 역상크로마토그래피 (RP-HPLC)를 통한 산화체 생성여부, 탈아미드화 분석을 통한 단백질 분해 여부, 결합 어세이를 통한 애플리버셉트의 결합 활성을 확인한 결과, 우수한 안정성을 가짐을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 안과용 액상 조성물, 또는 상기 안정화용 조성물을 포함하는 용기, 예컨대, 바이알, 앰플, 프리필드시린지(Pre-Filled Syringe) 등을 제공한다. 이러한 용기는 패키징되어 밀봉된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프리필드시린지"는 약물이 직접 충전된 사전 충전형 주사기를 의미하며, 본 발명의 조성물이 미리 충전되어 보관되어 있는 레디-투-유즈(ready-to-use) 형태의 주사기를 말한다. 본 발명의 프리필드시린지는 플라스틱 시린지 또는 유리 시린지일 수 있으며, 본 발명의 조성물이 충진되어 있고, 프리필드시린지 입구에 멸균 니들(주사침)을 장착해 유리체 내 주사로 적용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 안과용 액상 조성물, 또는 상기 안정화용 조성물을 포함하는 용기 및 사용자에게 제공될 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 당업계에 공지된 제공 형태들을 포함한다.
본 발명의 안과용 액상 조성물은 완충액 조성, pH 범위 등 다양하게 조절함으로써, 물리화학적, 생물학적 안정성을 향상시키고, 교반, 반복 냉해동, 자외선(UV) 노출 및 고온과 같은 가혹 조건에서도 응집체 형성을 감소시킬 뿐 아니라, 냉장저장 조건, 가속조건, 고온의 가혹조건 등에서도 안정성 및 활성을 유지시킬 수 있어, 각종 안과질환의 치료에 유용하게 적용될 수 있는 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 안과용 액상 조성물의 교반에 따른 유연물질의 증가를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 안과용 액상 조성물의 반복 냉해동에 따른 유연물질의 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 안과용 액상 조성물의 자외선(UV) 노출에 따른 유연물질의 증가를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 안과용 액상 조성물의 -70 ℃에서의 성상 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 안과용 액상 조성물의 5 ℃에서의 성상 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 안과용 액상 조성물의 -70 ℃에서의 응집체 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 안과용 액상 조성물의 5 ℃에서의 응집체 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 안과용 액상 조성물의 25 ℃에서의 응집체 또는 단편체 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 안과용 액상 조성물의 40 ℃에서의 응집체 또는 단편체 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명에 따른 안과용 액상 조성물의 제조
본 발명에 따른 안과용 액상 조성물은 아래와 같은 성분 및 함량으로 제조하였다.
제제 완충액 (10 mM) pH 당 활성성분 (mg/mL) 계면활성제
1 소듐 아세테이트 5.3 10% 트레할로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
2 소듐 아세테이트 5.3 10% 수크로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
3 소듐 아세테이트 5.5 10% 트레할로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
4 소듐 아세테이트 5.5 10% 수크로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
5 소듐 아세테이트 5.8 8% 트레할로스25 mM Nacl 애플리버셉트 40 0.01% PS20
6 소듐 아세테이트 5.8 8% 수크로스25 mM Nacl 애플리버셉트 40 0.01% PS20
7 히스티딘 5.8 10% 트레할로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
8 히스티딘 5.8 10% 수크로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
9 히스티딘 6.0 10% 트레할로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
10 히스티딘 6.0 10% 수크로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
11 히스티딘 6.2 10% 트레할로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
12 히스티딘 6.2 10% 수크로스 애플리버셉트 40 0.01% PS20
13 (대조군) 40 mg/mL 애플리버셉트, 10 mM 소듐 포스페이트, 5% 수크로스, 40 mM NaCl, 0.03% PS20, pH 6.2
실시예 2: 본 발명에 따른 안과용 액상 조성물의 가속/가혹 조건에서의 안정성 평가
실시예 1에서 제조한 각 조성물 제제를 유리바이알 또는 프리필드시린지(PFS)에 넣고, 다음과 같은 다양한 조건에서 안정성 평가를 진행하였다.
가속 안정성 평가는 냉동(-70 ℃), 냉장(5 ℃), 가속(accelerated, 25 ℃) 및 가혹(stressed, 40 ℃) 조건의 보관 온도에서 각각의 조성물 제제를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 또한, 각 조성물 제제는 의약품의 가공 및 선적과 관련된 다른 급성 가혹조건(acute stress)에 대해서도 안정성을 평가하였다. 이러한 가혹 조건으로는 교반(shear stress), 반복 냉해동 및 자외선(UV) 노출을 포함한다. 아래 표 2는 가속/가혹 안정성 평가에 사용된 각 조건을 요약한 것이다.
가속/가혹 조건 시점
온도 -70℃, 5℃ 0주, 4주, 8주, 3개월, 6개월, 12개월
25℃, 40℃ 0주, 4주, 8주, 3개월, 6개월,
교반 1,000 RPM에서 Vortexing 4시간
반복 냉-해동 -70℃에서 상온 5회 연속 사이클
광과민성 UV 노출 8 watt-hours/m2의 UVA
실시예 3. 급성 가혹 조건(Acute stress)에서의 안정성 평가
3-1. 교반(agitation)조건 에서의 안정성 평가
실시예 1에서 제조한 모든 제제에 대해 bench-top vortexer를 사용하여 상온에서 1,000 rpm으로 4시간 동안 일정한 교반에 노출시켰다. 대조군 샘플은 동일한 세트의 제형을 교반없이 상온에서 4시간 동안 인큐베이션하였으며, 이후 각각의 교반된 제제 및 대조군 제제에 대해 성상 및 가시적 입자 형성 유무를 관찰하였다. 성상 확인을 위해, 흑백배경에 대한 백색광원(13W 형광튜브)을 이용하여 육안 평가를 수행하였고, 모든 시점에서 디지털 사진을 결과물로 획득하였다. 그 결과, 실시예 1의 1번 내지 12번의 모든 제제에서 교반에 따른 성상의 변화가 없음을 확인하였다.
또한, Hewlett Packard Agilent 1100 Series를 이용해 수행한SE-HPLC 분석(조건: 컬럼; TSK-GEL G3000SWXL, 7.8 X 30 (ID mm X L cm)(Tosoh, Cat. # 08541), 이동상: 200mM KPi, 250 mM KCl,pH 6.2, 유속: 0.5 ml/min, 파장: 280 nm)으로 응집체 및 단편체의 변화를 확인한 결과, 도 1과 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 모든 제제가 교반 조건에서 유연물질의 증가가 관찰되지 않음을 확인하였다.
제제 처리조건 응집체2 (%) 응집체1 (%) 주피크(%)
실험대조 (-70 ℃) 0.1 1.9 98.0
1 정치 0.1 1.8 98.1
교반 0.1 1.8 98.1
2 정치 0.1 1.7 98.2
교반 0.1 1.7 98.2
3 정치 0.1 2.1 97.8
교반 0.1 2.1 97.8
4 정치 0.1 2.0 97.9
교반 0.1 2.0 97.9
5 정치 0.1 2.4 97.5
교반 0.1 2.4 97.5
6 정치 0.1 2.4 97.5
교반 0.1 2.4 97.5
7 정치 0.1 2.3 97.6
교반 0.1 2.3 97.6
8 정치 0.1 2.3 97.6
교반 0.1 2.3 97.6
9 정치 0.1 2.3 97.6
교반 0.1 2.3 97.6
10 정치 0.1 2.3 97.6
교반 0.1 2.3 97.6
11 정치 0.1 2.5 97.4
교반 0.1 2.5 97.4
12 정치 0.1 2.5 97.4
교반 0.1 2.5 97.4
13 정치 0.1 3.2 96.7
교반 0.1 3.2 96.7
또한, FlowCAMTM 입자 이미징 시스템(Benchtop B3 Series, Fluid Imaging Technologies)을 이용해 FlowCAM 분석을 수행하여 미립자 (subvisible particle)를 측정하였으며, 분석 결과, 실시예 1의 모든 제제에서 미립자는 대체로 낮은 수치로 나타나, 교반에 따른 미립자의 증가가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통하여 실시예 1의 안과용 액상 조성물은 교반 가혹 조건에서 안정성이 있음을 확인하였다.
3-2. 반복 냉해동 조건에서의 안정성 평가
반복 냉해동에 대한 안정성을 평가하기 위해, 실시예 1의 모든 제제에 대해 -70 ℃에서 30분 이상 동안 동결시키고 상온에서 30분 이상 해동하는 연속 5 회 반복 수행하였다.
완전한 동결과 해동을 육안으로 확인한 결과, 모든 제형에서 반복 냉해동에 따른 성상의 변화가 없음을 확인하였다.
또한, SE-HPLC 분석(Hewlett Packard Agilent 1100 Series, 컬럼; TSK-GEL G3000SWXL, 7.8 X 30 (ID mm X L cm)(Tosoh, Cat. # 08541), 이동상: 200mM KPi, 250 mM KCl,pH 6.2, 유속: 0.5 ml/min, 파장: 280 nm)을 사용하여 냉해동 전후 각 제형의 물리적 분해(physical degradation) 여부를 관찰하였다. 분석의 정확도를 모니터링하고 제제 간 비교를 제공하기 위해, 대조군의 주입과 함께 각 제형의 크로마토그래피 프로파일을 확인하였다. 시간에 따른 피크 백분율로 응집체 및 단편의 생성을 확인함으로써 각 제형의 안정성을 비교분석하였다.
응집체 및 단편체의 변화를 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 모든 제제에서 반복 냉해동에 따른 유연물질의 증가가 없음을 확인하였다.
또한, FlowCAM 분석(Benchtop B3 Series, Fluid Imaging Technologies)을 수행하여 반복 냉해동 전후 각 제제의 미립자 (subsivisible particle)의 정도를 모니터링하였고, 반복 냉해동에 따른 미립자 변화를 확인함으로써 각 제제의 안정성을 평가한 결과, 실시예 1의 모든 제제에서 미립자 유의적인 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 분석결과를 통하여 실시예 1의 안과용 액상 조성물은 반복 냉해동 조건에서 안정성이 있음을 확인하였다.
3-3. 자외선 조건에서의 안정성 평가
모든 제제의 자외선 노출에 따른 화학적/물리적 안정성을 평가하기 위해, 각각의 제제를 25℃ 광안정성 챔버 내에서 총 8 Wh/m2의 UVA 광에 노출시켰다. 자외선의 노출 여부를 제외하고 동일한 세트의 제형을 비-UV 노출 대조군(UV-control)으로 제조하고, UV 광 노출없이 동일한 시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 이후 모든 제형의 성상 및 가시적인 입자의 유무를 평가하였다. 그 결과, 실시예 1의 모든 제제에서 자외선 노출에 따른 성상의 변화는 없는 것으로 확인하였다.
또한, SE-HPLC 분석(Hewlett Packard Agilent 1100 Series, 컬럼; TSK-GEL G3000SWXL, 7.8 X 30 (ID mm X L cm)(Tosoh, Cat. # 08541), 이동상: 200mM KPi, 250 mM KCl,pH 6.2, 유속: 0.5 ml/min, 파장: 280 nm)을 사용하여 자외선 노출 전후 각 제제의 물리적 분해(physical degradation) 여부를 관찰하였다. 분석의 정확도를 모니터링하고 제제 간 비교를 하기 위해, 대조군의 주입과 함께 각 제형의 크로마토그래피 프로파일을 확인하였다. UV노출에 따른 피크 백분율로 응집체 및 단편의 생성을 확인함으로써 각 제제의 안정성을 비교분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 모든 제제에서 자외선 노출 후 유연물질의 증가가 미비하여 안정함을 확인하였다.
또한, 각 제제에 대해 cIEF 분석을 수행(Maurice cIEF; Maurice-OBM, 2AHGG-Maurice, Protein Sample, 1500V에서 1.0 분, 3000V에서 6 분; 노출: A280 nm에서 0.005 초; 샘플 로드: 55 초; 카트리지 온도: 상온; 샘플 온도: 10 ℃)하여 자외선 노출 동안 전하-기반(charge-based)의 화학적인 변형을 모니터링하였다.
분석의 정확도를 모니터링하고 제제 간 비교를 제공하기 위해, 대조군의 주입과 함께 제제를 분석하였고, 각 제제의 프로파일을 확인하였다. UV노출에 따른 피크 백분율로 이성질체의 변화를 확인함으로써 각 제제의 안정성을 비교분석하였다. 그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 모든 제제에서 이성질체의 특별한 변화가 나타나지 않아, 실시예 1의 안과용 액상 조성물은 자외선 노출에 대해 안정성이 있음을 확인하였다.
제제 처리조건 Area (%)
Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Peak5 Peak6 Peak7 Peak8 Peak9 Peak10
실험대조 (-70 ℃) 16.8 6.9 15.5 16.7 12.1 6.4 7.9 11.1 5.7 1.0
1 UV 비노출 16.6 8.9 11.4 20.2 10.5 6.2 8.1 10.9 6.0 1.2
UV노출 16.5 6.8 16.2 19.4 10.9 6.2 7.9 10.6 5.1 0.3
2 UV 비노출 16.7 9.3 11.8 17.2 12.2 6.2 8.8 11.0 5.6 1.1
UV노출 16.8 6.7 14.6 17.3 13.0 7.0 7.2 10.8 5.8 0.9
3 UV 비노출 17.8 7.9 13.1 16.0 13.1 5.1 9.0 11.3 5.6 1.1
UV노출 16.8 7.3 16.1 15.7 11.1 6.6 7.7 11.5 6.0 1.2
4 UV 비노출 16.6 8.2 12.4 20.1 10.4 6.3 8.1 11.1 5.6 1.2
UV노출 16.9 6.9 15.2 16.7 12.1 6.0 8.6 11.0 5.6 0.9
5 UV 비노출 16.5 11.1 10.8 18.5 10.8 6.4 8.3 11.2 5.3 0.9
UV노출 16.9 8.5 16.1 14.9 12.0 6.6 7.8 10.8 5.4 1.1
6 UV 비노출 17.1 7.9 14.3 16.3 12.7 6.3 7.7 11.2 5.5 1.0
UV노출 16.4 9.5 11.0 18.5 12.6 6.3 8.0 10.8 5.8 1.1
7 UV 비노출 16.9 7.7 13.3 19.1 11.1 6.7 7.0 11.5 5.5 1.4
UV노출 17.7 6.9 15.5 16.8 12.0 7.6 6.3 10.6 5.4 1.1
8 UV 비노출 16.1 7.9 15.6 16.8 12.0 5.9 8.8 11.2 5.1 0.8
UV노출 16.9 7.3 14.7 17.2 12.9 7.3 7.1 10.6 5.3 0.7
9 UV 비노출 16.5 8.2 13.6 19.4 10.3 6.2 8.2 11.3 5.5 1.0
UV노출 17.2 7.8 13.8 18.0 12.6 6.5 7.1 10.7 5.4 1.0
10 UV 비노출 16.3 9.5 12.3 20.2 9.9 6.0 8.3 11.2 5.5 1.0
UV노출 17.2 6.7 16.0 19.4 10.1 6.7 7.2 10.8 5.1 0.8
11 UV 비노출 16.7 8.5 14.0 19.5 10.4 7.0 7.1 11.3 5.1 0.5
UV노출 17.2 7.7 15.3 16.9 12.5 6.6 7.1 10.8 5.1 0.8
12 UV 비노출 16.5 9.0 12.6 19.3 10.8 6.3 7.7 11.6 5.3 1.0
UV노출 17.3 9.1 13.3 18.2 12.4 5.4 8.3 10.4 5.0 0.6
13 UV 비노출 17.1 7.2 14.2 18.9 10.7 6.3 8.0 10.7 5.8 1.1
UV노출 16.8 6.1 17.2 18.0 10.0 6.4 8.6 10.5 5.6 0.8
실시예 4: 보관 온도 조건에 따른 안정성 평가
모든 제제를 각각 -70 ℃, 5 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃의 온도에서 인큐베이션한 후, 특정 시점(time point)에서 각 제제에 대해 안정성 평가 분석을 수행하였다.
4-1. 육안 평가
특정 시점에서 각 온도별 보관 장소로부터 모든 제제의 시료를 꺼내 육안으로 성상 및 가시적인 입자의 유무를 확인함으로써 안정성 평가를 수행하였다. 각 제제에 대해 흑백 배경 및 백색 광원(13W 형광 튜브) 하에서 육안 검사를 수행하였고, 각 시점에서 모든 제제의 디지털 사진을 촬영하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 각각 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 모든 제제는 -70 ℃ 및 5 ℃ 각각의 냉동, 냉장 온도 조건 하에서 12개월까지 성상 변화가 없었고, 25 ℃(가속조건)에서 6개월 동안, 40 ℃(가혹조건)에서 8주 동안 성상 변화가 나타나지 않았다.
4-2. 농도 측정
각각의 온도에서 보관하였던 제제들의 농도를 분석하고, 8주 동안의 농도 변화 추세 및 제제의 안정성을 확인하였다. 애플리버셉트의 농도 측정은 Implen Nanophotometer N50 Touch를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하고 (A280), 흡광계수 (extinction coefficient : 1.15 M-1 cm-1)로 나누어 분석하였다.
그 결과, 실시예 1의 모든 제제는 표 5에 나타낸 바와 같이 -70 ℃ 및 5 ℃ 각각의 온도 조건 하에서 12개월까지 농도는 안정하였고, 25 ℃(가속조건)에서 6개월 동안, 40 ℃(가혹조건)에서도 8주 동안 단백질 농도는 안정하였다.
제제 보관조건 별 단백질 농도 (mg/mL)
0개월 -70℃, 12개월 5℃, 12개월 25℃, 6개월 40℃, 8주
1 40.4 39.7 39.3 40.4 40.2
2 40.2 41.9 39.0 40.4 39.9
3 39.2 39.2 38.7 40.1 38.4
4 39.3 40.2 39.3 39.8 38.8
5 39.3 39.7 38.1 38.9 38.8
6 40.2 41.6 40.1 39.4 39.8
7 40.3 40.2 39.8 39.8 40.0
8 39.1 39.7 40.2 39.3 38.8
9 39.4 41.6 41.6 39.5 39.2
10 38.9 39.0 41.3 38.9 38.5
11 39.8 36.5 39.3 38.6 39.0
12 39.3 40.1 39.9 39.6 39.4
13 40.0 40.4 40.1 40.1 40.4
4-3. 삼투압몰농도(Osmolality)
모든 제제 제조후에 삼투압몰농도를 측정하였다. 삼투압몰농도는 Model 2020 Freezing Point Osmometer (Advanced Instruments)를 이용하여 T=0 시점에서만 측정하였다. 그 결과, 모든 제제는 대체로 345 내지 382 mOsm/kg의 삼투압몰 농도를 가지는 것으로 측정되어, 안과 조성물로 이용되는데 문제가 없음을 확인하였다.
4-4. pH
각각의 온도에서 보관하였던 제형들의 pH를 측정하여 대조군 제제와 비교분석하여 안정성을 평가하였다. pH는 SympHony® pH Meter (VWR Scientific, catalog # SB70P)를 이용해 측정하였다. 각 제제의 온도를 조정하지 않고 상온에 맞추어 pH를 측정하였고, pH 미터는 교정 기울기(calibration slope)가 95% 이상임을 확인하고 사용하였다.
그 결과, 실시예 1의 모든 제제는 표 6에 나타낸 바와 같이 -70 ℃ 및 5 ℃ 각각의 온도 조건 하에서 12개월까지 pH는 안정하였고, 25 ℃(가속조건)에서 6개월 동안 안정한 pH를 나타내었으며, 40 ℃(가혹조건)에서도 pH는 8주 동안 안정하였다.
제제 보관조건 별 pH
0개월 -70℃, 12개월 5℃, 12개월 25℃, 6개월 40℃, 8주
1 5.34 5.32 5.32 5.25 5.33
2 5.38 5.36 5.34 5.25 5.31
3 5.45 5.49 5.45 5.41 5.46
4 5.46 5.45 5.44 5.39 5.55
5 5.74 5.76 5.77 5.71 5.81
6 5.75 5.78 5.78 5.70 5.83
7 5.79 5.81 5.82 5.74 5.82
8 5.81 5.83 5.85 5.72 5.86
9 5.96 6.00 6.00 5.97 5.99
10 6.04 6.02 6.01 5.94 5.98
11 6.13 6.18 6.18 6.13 6.15
12 6.14 6.20 6.20 6.12 6.16
13 6.08 6.14 6.16 6.09 6.08
4-5. SE-HPLC 분석
SE-HPLC 분석(Hewlett Packard Agilent 1100 Series, 컬럼; TSK-GEL G3000SWXL, 7.8 X 30 (ID mm X L cm)(Tosoh, Cat. # 08541), 이동상: 200mM KPi, 250 mM KCl,pH 6.2, 유속: 0.5 ml/min, 파장: 280 nm)을 통해, 특정 온도에서 보관하는 동안 각 제형의 물리적 분해(physical degradation) 여부를 관찰하였다. 분석의 정확도를 모니터링하고 제제 간 비교를 제공하기 위해, 대조군의 주입과 함께 각 제형의 크로마토그래피 프로파일을 확인하였다. 각 온도 별 시간에 따른 피크 백분율로 응집체 및 단편의 생성을 확인함으로써 각 제제의 안정성을 비교분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, -70 ℃(냉동조건)에서는 실시예 1의 모든 제제에서 12개월간 응집체 또는 단편체의 증감이 나타나지 않고 상태가 유지되었다. 5 ℃(냉장조건)에서는, 도 7에 나타낸 바와 같이, 12개월 동안 NaCl이 첨가된 실시예 1의 5번 및 6번 제제의 경우 다른 제제에 비해 응집체 증가율이 가장 높은 것으로 나타나, 염(NaCl)이 포함되지 않는 제형이 더 안정한 것을 확인하였다.
25 ℃(가속조건)에서는, 도 8 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 6개월 동안, 냉장조건과 마찬가지로 NaCl이 첨가된 5번 및 6번 제제에서 응집체 증가율이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, pH가 낮은 제제(1번 및 2번)일수록 3개월 경과 후 단편체의 증가율이 높은 것으로 확인되었고, pH가 높은 제제(11번 및 12번)일수록 응집체의 증가율이 높은 것으로 확인되었다.
제제 가속 조건 (25℃, 6개월), 응집체 및 단편체 변화
조건 응집체2(%) 응집체1(%) 주피크(%) 단편체(%)
1 0개월 0.1 1.9 98.0 -
25°C, 6개월 0.1 2.5 96.5 0.9
2 0개월 0.1 1.8 98.1 -
25°C, 6개월 0.1 2.5 96.6 0.8
3 0개월 0.1 2.2 97.7 -
25°C, 6개월 0.1 2.7 96.4 0.8
4 0개월 0.1 2.1 97.9 -
25°C, 6개월 0.1 2.7 96.6 0.7
5 0개월 0.1 2.4 97.5 -
25°C, 6개월 0.4 4.2 94.8 0.6
6 0개월 0.1 2.4 97.5 -
25°C, 6개월 0.5 4.6 94.3 0.6
7 0개월 0.1 2.4 97.5 -
25°C, 6개월 0.2 3.3 95.9 0.6
8 0개월 0.1 2.4 97.6 -
25°C, 6개월 0.2 3.3 95.9 0.6
9 0개월 0.1 2.4 97.6 -
25°C, 6개월 0.2 3.3 95.9 0.6
10 0개월 0.1 2.3 97.6 -
25°C, 6개월 0.2 3.3 96.0 0.6
11 0개월 0.1 2.6 97.3 -
25°C, 6개월 0.4 3.9 95.2 0.6
12 0개월 0.1 2.6 97.3 -
25°C, 6개월 0.4 4.0 95.1 0.5
13 0개월 0.1 3.3 96.5 -
25°C, 6개월 1.0 6.8 91.7 0.5
40 ℃(가혹조건)에서는, 도 9 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 25 ℃에 비해 분해 속도는 빠르나, 대체적으로 유사한 경향이 나타났다.
제제 가혹 조건 (40℃, 8주), 응집체 및 단편체 변화
조건 응집체2(%) 응집체1(%) 주피크(%) 단편체(%)
1 0개월 0.1 1.9 98.0 -
40°C, 8주 0.4 4.7 94.4 0.5
2 0개월 0.1 1.8 98.1 -
40°C, 8주 0.4 5.0 94.0 0.5
3 0개월 0.1 2.2 97.7 -
40°C, 8주 0.6 5.6 93.3 0.5
4 0개월 0.1 2.1 97.9 -
40°C, 8주 0.6 5.8 93.0 0.5
5 0개월 0.1 2.4 97.5 -
40°C, 8주 3.8 11.9 83.8 0.5
6 0개월 0.1 2.4 97.5 -
40°C, 8주 2.3 9.0 88.3 0.4
7 0개월 0.1 2.4 97.5 -
40°C, 8주 1.0 6.2 92.4 0.4
8 0개월 0.1 2.4 97.6 -
40°C, 8주 1.0 6.3 92.2 0.4
9 0개월 0.1 2.4 97.6 -
40°C, 8주 1.5 7.0 91.1 0.4
10 0개월 0.1 2.3 97.6 -
40°C, 8주 1.8 7.5 90.3 0.5
11 0개월 0.1 2.6 97.3 -
40°C, 8주 2.7 8.4 88.5 0.4
12 0개월 0.1 2.6 97.3 -
40°C, 8주 3.1 9.1 87.4 0.5
13 0개월 0.1 3.3 96.5 -
40°C, 8주 8.1 14.9 76.6 0.4
상기 분석결과를 통하여, pH 6.2 이상일 경우 응집체의 생성률이 높고, 반대로 pH 5.3 이하일 경우 단편체의 생성률이 증가하므로, 적절한 pH 조건(pH 5.5 내지 pH 6.0) 하에서, 염(NaCl)이 포함되지 않은 제형이 현저히 안정하다는 것을 확인하였다.
4-6. cIEF 분석
각 제제에 대해 Protein Simple Maurice를 이용하여 cIEF 분석(Maurice cIEF; Maurice-OBM, 2AHGG-Maurice, Protein Sample, 1500V에서 1.0 분, 3000V에서 6 분; 노출: A280 nm에서 0.005 초; 샘플 로드: 55 초; 카트리지 온도: 상온; 샘플 온도: 10 ℃)을 수행함으로써 특정 온도에서 보관하는 동안 전하-기반(charge-based)의 화학적인 변형을 모니터링하였다. 분석의 정확도를 모니터링하고 제제 간 비교를 제공하기 위해, 대조군의 주입과 함께 제형을 분석하였고, 각 제제의 프로파일을 확인하였다. 각 온도 별 시간에 따른 피크 백분율로 이성질체의 변화를 확인함으로써 각 제제의 안정성을 비교분석하였다.
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, 40 ℃(가혹조건)에서는 대부분의 제제에서 상대적 산성 피크(peak 1~4)는 증가하고, 상대적 중성 피크(peak 5~6) 및 상대적 염기성 피크(peak 7~10)는 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 pH가 높은 제제(9번 내지 12번 제제, pH 6.0 내지 pH 6.2)는 그보다 pH가 낮은 제제에 비해 고온40 ℃에서 산성 피크(acidic peak)가 증가하는 양상을 나타내었으며, NaCl이 포함된 제제(5번 및 6번 제형)가 포함되지 않은 제제보다 상대적 산성 피크의 비율이 높게 나타나는 것으로 확인되었다.
이러한 결과를 통해, pH 6.0 미만, 그리고 염을 포함하지 않은 제제가 다른 조건 대비 더 안정하다는 것을 확인하였으며, 상기 실시예 4-5의 SE-HPLC 분석결과와 종합하여 볼 때, pH 5.5 내지 pH 5.8이며 염이 포함되지 않은 제제가 현저히 우수한 안정성을 지님을 확인하였다.
제제 처리조건 가혹 조건 (40℃, 8주), 이설징체 변화, Area (%)
Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Peak5 Peak6 Peak7 Peak8 Peak9 Peak10
1 0개월 16.6 6.5 15.5 17.2 13.5 8.1 5.7 11.0 5.4 0.6
40°C, 8주 17.3 7.4 20.0 15.4 10.6 5.7 7.9 9.4 5.5 0.9
2 0개월 16.2 7.2 16.7 14.8 13.4 7.2 6.8 10.8 5.8 1.1
40°C, 8주 16.8 10.5 18.7 15.0 10.1 6.5 7.3 9.0 5.2 0.8
3 0개월 15.6 6.4 13.5 19.0 13.6 7.9 5.9 11.1 5.9 1.0
40°C, 8주 18.6 10.2 17.3 14.9 12.0 6.1 6.5 9.0 4.7 0.7
4 0개월 16.9 6.3 16.4 16.6 13.2 6.7 7.0 10.7 5.4 0.8
40°C, 8주 18.1 11.2 19.0 14.7 9.9 6.3 6.6 8.7 4.8 0.8
5 0개월 16.7 6.3 14.3 18.5 12.9 7.4 6.4 11.2 5.2 1.1
40°C, 8주 19.3 13.2 16.7 16.1 9.8 5.7 6.6 7.7 4.3 0.8
6 0개월 16.1 6.8 14.2 18.1 12.6 7.3 6.9 11.0 5.6 1.4
40°C, 8주 18.6 8.5 22.2 14.0 10.1 7.2 5.3 8.6 4.6 0.9
7 0개월 16.5 8.2 14.0 18.3 12.8 6.8 7.2 10.8 4.8 0.4
40°C, 8주 19.5 9.1 19.4 16.0 9.8 6.8 5.7 8.4 4.3 1.0
8 0개월 16.0 7.5 17.1 18.6 10.5 7.3 6.9 10.6 5.1 0.5
40°C, 8주 20.5 8.6 21.5 12.5 11.3 6.6 6.2 8.0 4.2 0.7
9 0개월 16.9 7.1 17.2 16.2 12.9 7.3 6.9 10.7 4.4 0.2
40°C, 8주 20.9 9.8 21.6 12.5 10.9 6.6 5.6 7.7 3.8 0.7
10 0개월 17.6 6.3 15.7 20.5 10.7 6.2 7.7 10.6 4.5 0.2
40°C, 8주 21.9 12.6 18.4 14.9 9.4 6.0 5.4 7.1 3.7 0.7
11 0개월 16.5 6.3 14.6 18.3 12.4 7.8 6.3 11.3 5.3 1.1
40°C, 8주 23.4 13.3 21.0 12.6 8.9 5.6 4.6 6.9 3.1 0.6
12 0개월 17.4 5.6 15.1 18.0 13.0 6.6 7.4 10.6 5.5 1.0
40°C, 8주 22.9 16.0 18.7 12.2 9.9 5.6 4.7 6.3 3.1 0.7
13 0개월 16.5 6.4 15.2 17.5 13.3 7.4 6.8 10.5 5.5 0.9
40°C, 8주 23.2 13.8 17.3 17.7 8.8 5.2 4.4 5.5 3.5 0.7
4-7. FlowCAM 분석
FlowCAMTM 입자 이미징 시스템(Benchtop B3 Series, Fluid Imaging Technologies)을 이용해 FlowCAM 분석을 수행함으로써 특정 온도에서 보관하는 동안 각 제제의 미립자 (subsivisible particle)의 정도를 모니터링하였다. 각 온도 별 시간에 따른 미립자 변화를 확인함으로써 각 제제의 안정성을 평가하였다. 그 결과, 실시예 1의 모든 제제에서 낮은 수의 미립자가 검출되었으며, 온도별 시간에 따른 미립자 수 증감은 나타나지 않았다.
4-8. RP-HPLC 분석
실시예 1에서의 제제 중에서, 2번, 4번, 8번, 13번 제제를 대상으로, 5℃(냉장,장기보관조건), 25℃(가속조건), 40℃(가혹조건)에서 6개월동안 보관하면서, 각 시점별로 RP-HPLC 분석(Waters, Acquity UPLC H-class system, 컬럼; ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column, 2.1 X 100 (ID mm X L cm) (Waters, Cat. # 186004496), 이동상 A: 0.1% TFA, 이동상 B: 0.08% TFA in ACN, 유속: 0.5 ml/min, 파장: 214 nm)을 이용하여, 활성(역가)에 영향을 줄 수 있는 산화체(oxidated form) 생성 여부 및 변화를 확인하였다. 표 10에서 나타난 바와 같이, 5℃에서는 6개월동안 모든 제제에서 산화체 생성이 거의 없는 것으로 나타났고, 25℃에서는 산화체가 다소 생성되는데, pH가 낮을 수록 미세한 수준으로 산화체 생성이 정도에 차이를 보이고, 40℃ 조건에서는 pH가 낮은 경우 산화체 생성이 확연히 증가함을 확인되었다.
제제 0개월 보관조건 (6개월, 5℃) 가속조건 (6개월, 25℃) 가혹조건 (6개월, 40℃)
주피크% 산화체% 주피크% 산화체% 주피크% 산화체% 주피크% 산화체%
2 100.00 0 99.98 0.02 99.94 0.06 98.90 1.10
4 100.00 0 99.98 0.02 99.96 0.04 99.17 0.83
8 100.00 0 99.98 0.02 99.98 0.02 99.34 0.66
13 100.00 0 99.92 0.08 99.97 0.03 99.60 0.40
4-9. 탈아미드화(Deamination) 분석
실시예 1에서의 제제 중에서, 2번, 4번, 8번, 13번 제제를 대상으로, 5℃(냉장,장기보관조건), 25℃(가속조건), 40℃(가혹조건)에서 6개월동안 보관하면서, 탈아미드화 분석을 수행하여 단백질 분해여부를 평가하였다. 분석 시 전처리는 ISOQUANT® Isoaspartate Detection Kit (Promega, MA1010)를 사용하였으며, 시료 준비 후 HPLC 분석(Waters, HPLC e2695, 컬럼; SynergiTM Hydro-RP, 4.6 x 150 (ID mm X L cm) (Phenomenex, Cat. # 00F-4375-E0), 이동상: 50 mM Kpi, pH 6.20, 유속: 1.0 ml/min, 파장: 260 nm)그 결과는 표 11에 나타난 바와 같이, 5℃에서는 모든 제제가 유사하고, 25℃에서는 모든 제제에서 유사한 증가율을 나타내며, 40℃에서는 모든 제제에서 유사한 증가율을 보이고 13번에 비해서는 증가율이 낮음을 확인하였다.
제제 탈아미드화 (mol/mol of Aflibercept)
0개월 보관조건 (6개월, 5℃) 가속조건 (6개월, 25℃) 가혹조건 (6개월, 40℃)
2 0.32 0.32 0.79 3.49
4 0.31 0.32 0.70 3.44
8 0.30 0.41 0.71 3.47
13 0.33 0.43 0.91 4.12
4-10. 결합 어세이 (Binding assay)
실시예 1에서의 제제 중에서, 2번, 4번, 8번, 13번 제제를 대상으로, 5℃(냉장,장기보관조건), 25℃(가속조건), 40℃(가혹조건)에서 6개월동안 보관하면서, 결합 어세이 (ELISA method, 코팅 단백질: VEGF165 protein, 애플리버셉트 농도 범위: 0.04~500 ng/mL, 표준품: 대조약 (Eylea®))을 통해 애플리버셉트가 타겟 단백질인 VEGF에 결합하는 정도를 활성으로써 확인하였다. 활성이 감소하면 표준품 대비 EC50의 비율(%)이 높아진다. 그 결과는, 표 12에 나타난 바와 같이, 5℃에서는 모든 제제의 활성이 80~125%의 범위로 측정되었고, 25 ℃와 40℃에서는 모든 제제에서 EC50의 비율이 증가하며, pH 낮을수록 활성이 가장 감소하는 경향을 확인하였다.
제제 표준품 대비 EC 50 의 비율 (%)
0개월 보관조건 (6개월, 5℃) 가속조건 (6개월, 25℃) 가혹조건 (6개월, 40℃)
2 101 91 167 181
4 106 102 111 152
8 115 98 96 137
13 102 98 106 138
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 치료학적으로 유효한 양의 애플리버셉트(aflibercept); 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 안과용 액상 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소듐 아세테이트 또는 히스티딘은 5 내지 20 mM의 농도인 것인, 안과용 액상 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 5.3 내지 6.2의 범위를 갖는 것인, 안과용 액상 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 5.5 내지 5.8의 범위를 갖는 것인, 안과용 액상 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 당은 5 내지 20 %(w/v)의 농도인 것인, 안과용 액상 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 0.01 내지 0.03 %(w/v)의 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 것인, 안과용 액상 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 염화 나트륨을 포함하지 않는, 안과용 액상 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 유리체 내 주사(intravitreal injection)에 적합한 것을 특징으로 하는, 안과용 액상 조성물.
  9. 소듐 아세테이트 또는 히스티딘을 포함하는 완충액; 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 당; 및 계면활성제를 포함하는, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 소듐 아세테이트 또는 히스티딘은 5 내지 20 mM의 농도인 것인, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 5.3 내지 6.2의 범위를 갖는 것인, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 당은 5 내지 20 %(w/v)의 농도인 것인, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 계면활성제는 0.01 내지 0.03 %(w/v)의 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 것인, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 염화 나트륨을 포함하지 않는, 애플리버셉트(aflibercept)의 안정화용 조성물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물이 포함된 용기.
  16. 제15항에 있어서, 상기 용기는 바이알 또는 프리필드 시린지인 것인, 용기.
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