KR20150033620A - 항-pdgf 압타머 및 vegf 길항제를 포함하는 조성물 - Google Patents

항-pdgf 압타머 및 vegf 길항제를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR20150033620A
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Abstract

본 발명은 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 안과적 질환을 치료 또는 예방하는데 유용하다.

Description

항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물{COMPOSITIONS COMPRISING AN ANTI-PDGF APTAMER AND A VEGF ANTAGONIST}
본원은 미국 가출원 번호 61/654,672 (2012년 6월 1일 출원), 및 미국 가출원 번호 61/778,208 (2013년 3월 12일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
본원과 연관된 서열목록은 페이퍼 카피 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고 이로써 명세서에 참고로 편입되어 있다. 서열목록을 함유하는 텍스프 파일의 명칭은 OPHT_010_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 35 KB이고, 2013년 5월 29일에 만들어 졌고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되어 있다.
본 발명은 항-혈소판 유도된 성장 인자 (항-PDGF) 압타머 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포의 과증식 또는 비정상적인 신생혈관형성을 억제하는 방법, 뿐만 아니라 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 안과적 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제의 확장된 전달을 제공하는 약물 전달 장치 및 조성물에 관한 것이다.
눈의 다양한 장애는 맥락막, 망막 또는 홍채 신생혈관형성, 또는 망막 부종을 특징으로 하거나, 이에 의해 야기되거나, 또는 이를 초래한다. 이들 장애는 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 고혈압 망막증, 중심 장액성 맥락망막병증, 포낭 황반 부종, 코우츠병, 및 안구 또는 부속기 종양, 예컨대 맥락막 혈관종, 망막 색소 상피 암종, 및 안구내 림프종을 포함한다. 노인성 황반 변성(AMD)은 65세가 넘는 미국인 10명 중 대략 1명에게 영향을 미치는 질환이다. AMD 중 한 가지 유형인 "신생혈관 AMD" 및 "삼출성 AMD"로도 알려진 "습성 AMD(wet AMD)"는 AMD 사례의 단지 10%에 불과하지만 노인에서의 황반 변성으로부터 법적시각상실의 사례의 90%를 야기한다. 당뇨병성 망막병증은 10년 이상 동안 당뇨병을 가지고 있는 모든 환자들의 80%까지 영향을 미칠 수 있으며, 성인 시각상실의 세 번째 주된 원인으로서, 미국에서 시각상실의 거의 7%를 차지한다.
혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 성장 인자들의 역할을 포함하는, 안구 신생혈관형성을 수반하거나 야기하는 분자 사건을 이해하는데 진전이 이루어져 왔다. 이들 성장 인자의 활성을 억제하는 치료제들은 AMD 및 당뇨병성 망막병증과 같은 눈의 혈관 장애를 겪고 있는 환자에게 치료적 이점을 제공하는 것으로 나타났으며, 이는 합성 올리고뉴클레오타이드들로 구성된 앱타머를 포함한다. 더욱 최근에, PDGF 또는 VEGF 중 하나를 표적화하는 치료제들의 조합 사용이 연구되고 있다.
PDGF 및 VEGF 모두의 조합 억제는 맥락막, 망막 또는 홍채 신생혈관형성, 또는 망막 부종을 특징으로 하거나, 이에 의해 야기되거나, 이를 야기하는 눈의 다양한 장애를 치료하는데 더 큰 이점을 야기할 수 있다. 각각의 성장 인자에 특이적인 개별적인 제제에 의한 PDGF 및 VEGF 모두의 조합 억제는 두 제제의 동시적인 공동투여에 의해 달성될 수 있다.
불행하게도, 폴리펩타이드 치료제는 물리적 및 화학적 분해에 민감할 수 있다. 폴리펩타이드 치료제의 안정성은 폴리펩타이드 자체, 예를 들면, 그것의 아미노산 서열을 포함하는, 다양한 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 치료제를 포함하는 안정한 약제학적 조성의 개발은 상당한 도전을 제기한다. 상기 도전은 폴리펩타이드 치료제 및 또 다른 치료제, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 치료제를 포함하는 조성물을 개발하는 경우 훨씬 더 큰데, 왜냐하면 그것이 허용가능한 양립가능성을 갖는 2개의 상이한 치료제를 안정화시키는 부형제 및 조건들의 확인을 필요로 하기 때문이다.
항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는, 다수의 치료제를 포함하는 안정한 조성물이 본 기술분야에서 명확히 요구된다.
본 발명은 효과적인 양의 하기를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 항-PDGF 압타머 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) VEGF 길항제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염. 효과적인 양의 (a) 항-PDGF 압타머 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 (b) VEGF 길항제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 "본 발명의 조성물"이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 효과적인 양의 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0에서 달성 또는 유지할 수 있는 완충액; 및 (d) 장성 조절제. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘 또는 약 1 mM 내지 약 20 mM 인산나트륨이고, 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 추가로 포함한다: (e) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 효과적인 양의 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0에서 달성 또는 유지할 수 있는 완충액; 및 (d) 장성 조절제. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산나트륨 또는 약 5 mM 내지 약 200 mM Tris.HCl이고, 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 추가로 포함한다: (e) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 효과적인 양의 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 하기 중 하나 이상: (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0에서 달성 또는 유지할 수 있는 완충액; (d) 장성 조절제; 및 (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산염이고, 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 추가로 포함한다: (f) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 효과적인 양의 하기를 포함한다: (a) 약 3 mg/mL 내지 약 90 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; (b) 약 1.0 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0에서 달성 또는 유지할 수 있는 완충액; 및 (d) 장성 조절제. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 100 mM 인산나트륨 또는 약 1.0 mM 내지 약 10 mM 히스티딘.HCl을 포함하고, 장성 조절제는 약 0.5%(w/v) 내지 약 10%(w/v) 트레할로오스이다.
본 발명은 추가로, 필요한 포유동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 안과적 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
도 1은 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 AEX-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 2는 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 WCX-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 SE-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 5는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 6은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 7은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 8은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 9는 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 10은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 11은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 12는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 13은 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 14는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 15는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 16a 및 16b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 16a는 5% 소르비톨을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 16b는 130 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 17a 및 17b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 17a는 5% 소르비톨을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 라니비주맙의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 17b는 130 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 라니비주맙의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 18은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 19a 및 19b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 19a는 5% 소르비톨을 포함하는 조성물 중 라니비주맙의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 19b는 130 mM NaCl을 포함하는 조성물 중 라니비주맙의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 20은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH에서 다양한 장성 조절제를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 21은 37 ℃에서 보관된 pH 8.0에서 다양한 장성 조절제를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 22는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH에서 다양한 장성 조절제를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 23은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH에서 다양한 장성 조절제를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 24는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 25a 및 25b는 25 ℃ (도 25a) 및 37 ℃ (도 25b) 에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 26a 및 26b는 25 ℃ (도 26a) 및 37 ℃ (도 26b) 에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 27a, 27b, 및 27c는 37 ℃ (도 27a), 25 ℃ (도 27b) 및 4 ℃ (도 27c) 에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물 의 SE-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 28은 4 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 보관된 조성물 F6 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 29는 4 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 보관된 조성물 F6 중 라니비주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 30은 4 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 보관된 조성물 F6 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 31은 4 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 라니비주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 32는 37 ℃에서 2 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 AEX-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 33은 25 ℃에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 WCX-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 34는 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 본 발명의 선택된 조성물의 SE-HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 35는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 36은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 37은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 38은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 39는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 40은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 41은 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 42는 37 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 43은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 44는 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 45는 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 46은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 47은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 48은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 49는 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 50은 25 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 51은 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 52는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 53은 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 54는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 55는 4 ℃에서 보관된 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 56은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 소르비톨-함유 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 57은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 소르비톨-함유 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 58은 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 소르비톨-함유 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 59는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 소르비톨-함유 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 60a 및 60b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 60a는 5% 소르비톨을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 60b는 130 mM NaCl 또는 150 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 61a 및 61b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 61a는 5% 소르비톨을 포함하는 조성물 중 베바시주맙의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 61b는 130 mM NaCl 또는 150 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 베바시주맙의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 62a 및 62b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 62a는 5% 소르비톨을 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 62b는 130 mM NaCl 또는 150 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 63a 및 63b는 37 ℃에서 보관된 다양한 pH를 갖는 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다. 도 63a는 5% 소르비톨을 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여주고, 도 63b는 130 mM NaCl 또는 150 mM NaCl을 다양한 pH에서 경시적으로 포함하는 조성물 중 길항제 A의 퍼센트 순도를 보여준다.
도 64는 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 다양한 농도의 길항제 A를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 65는 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 다양한 농도의 길항제 A를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 66은 37 ℃에서 보관된 다양한 농도의 길항제 A를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 67은 37 ℃에서 8 주 동안 보관된 다양한 농도의 길항제 A를 포함하는 본 발명의 선택된 조성물 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 68은 다양한 보관 온도에서 조성물 F19 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 69는 다양한 보관 온도에서 조성물 F19 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 70은 다양한 보관 온도에서 조성물 F19 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 71은 다양한 보관 온도에서 조성물 F19 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 72는 다양한 보관 상태에서 조성물 F25와과 비교할 때 조성물 F19 중 길항제 A 안정성의 AEX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 73은 다양한 보관 상태에서 조성물 F25와과 비교할 때 조성물 F19 중 길항제 A 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 74는 다양한 보관 상태에서 조성물 F18과 비교할 때 조성물 F19 중 베바시주맙 안정성의 WCX-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 75는 다양한 보관 상태에서 조성물 F18와 비교할 때 조성물 F19 중 베바시주맙 안정성의 SE-HPLC 추세 그래프를 보여준다.
도 76은 다양한 본 발명의 조성물에 의해 VEGF-유도된 TF 발현의 억제를 도시하는 그래프를 보여준다.
도 77은 다양한 본 발명의 조성물에 의해 PDGF-유도된 BTG2 발현의 억제를 도시하는 그래프를 보여준다.
도 78은 길항제 A (패널 A-F)의 구조를 보여주고, 여기서 명칭은 이전의 패널로부터의 계속을 나타낸다.
도 79a 및 79b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F27에 대한 공제된 미세-유동 이미지화 (MFI) 결과를 도시하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 79a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 79b는 10 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 80a 및 80b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F28에 대한 공제된 MFI 결과를 도시하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 80a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 80b는 10 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 81a 및 81b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F29에 대한 공제된 MFI 결과를 도시하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 81a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 81b는 10 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 82a 및 82b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F30에 대한 공제된 MFI 결과를 도시하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 82a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 82b는 10 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 83a 및 83b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F31에 대한 공제된 MFI 결과를 도시하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 83a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 83b 10 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 84a 및 84b는 가변 보관 상태 하에서 조성물 F27 내지 F31에 대한 공제된 MFI 결과를 비교하는 그래프를 보여준다. 그래프는, 5 ℃ 또는 30 ℃에서 바이알 또는 주사기에서 보관될 때, 각각의 열거된 동등 원형 직경 범위에 대해 측정된 입자 수 (입자의 수/mL)를 제공한다. 도 84a는 1 μm 내지 100 μm 동등 원형 직경에 걸쳐 이어진 다양한 범위 내에서 입자 수를 제공하고, 도 84b는 10 μm 내지 75 μm 동등 원형 직경으로 이어진 선택된 범위 내에서 입자 수를 제공한다. 도 84a에서, 30 ℃에서 바이알에서 보관된 조성물 F31에 대해 수득된 <1 μm 내지 <2 μm 동등 원형 직경의 범위 내의 입자 수는 217,404였고, 이것은 그래프의 Y-축에서 묘사된 갓을 초과하고, 이로써 이러한 값은 상응하는 막대 위에 명시되어 있다. 도 84b에서, 30 ℃에서 바이알에서 보관된 조성물 F31에 대해 수득된 <10 μm 내지 <25 μm 동등 원형 직경의 범위 내의 입자수는 3,044였고, 이것은 그래프의 Y-축에서 묘사된 갓을 초과하고, 이로써 이러한 값은 상응하는 막대 위에 명시되어 있다. 상부로부터 하부로의 범례는 각각의 입자 직경 범위에 대한 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대에 해당한다.
도 85는 1.65 nM PDGF-BB로 처리된 NIH 3T3 세포에 의한 상대적 BTG2 유전자 발현 및 길항제 A(F32)의 명시된 농도를 도시하는 그래프를 보여준다.
도 86은 1.65 nM PDGF-BB로 처리된 NIH 3T3 세포에 의한 상대적 BTG2 유전자 발현 및 아플리버셉트 (F33)와 조합한 길항제 A 또는 길항제 A 단독 (F34)의 명시된 농도를 도시하는 그래프를 보여준다.
정의 및 약어
본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어들 및 어구는 본원에 제시된 의미를 가질 것이다.
언급된 수치와 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 상기 언급된 수치 ± 상기 언급된 수치의 최대 10%를 의미한다. 예를 들면, "약 100"은 90 내지 110을 의미한다.
용어 "길항제"는 표적 분자의 활성 또는 생산을 억제하거나, 부분적으로 또는 완전히 억제하는 제제를 지칭한다. 특히, 본원에서 선택적으로 적용될 때 용어 "길항제"는 표적 분자의 유전자 발현의 수준, mRNA 수준, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 감소시킬 수 있는 제제를 의미한다. 길항제의 예시적인 형태는, 예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드(예컨대 사이클릭 펩타이드), 항체 또는 항체 단편, 펩타이드 모방체, 핵산 분자, 안티센스 분자, 리보자임, 앱타머, RNAi 분자, 및 작은 유기 분자를 포함한다. 길항제 억제의 예시적인 비제한적인 기전은 리간드 합성 및 안정성 중 하나 또는 둘의 억압(예를 들면, 리간드 유전자/핵산를 표적화하는 안티센스, 리보자임 또는 RNAi 조성물을 이용하여), 리간드가 그것의 동족 수용체에 결합하는 것을 차단하는 것(예를 들면, 항-리간드 앱타머, 항체, 항-수용체 항체, 또는 가용성, 유인 동족 수용체 또는 그의 단편을 이용하여), 수용체 합성 및 안정성 중 하나 또는 둘의 억압 (예를 들면, 리간드 수용체 유전자/핵산을 표적화하는 안티센스, 리보자임 또는 RNAi 조성물을 이용하여), 수용체가 그것의 동족 반응 인자에 결합하는 것을 차단하는 것(예를 들면, 항-수용체 항체를 이용하여) 및 그것의 동족 리간드에 의한 수용체의 활성화를 차단하는 것(예를 들면, 수용체 티로신 키나제 억제제를 이용하여)을 포함한다. 또한, 길항제는 직접적으로 또는 간접적으로 표적 분자를 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 전체의 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 결합하는 생물학적 활성을 갖는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 그것의 예는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합부의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역, 또는 이의 임의의 일부, 또는 결합 단백질 중 적어도 하나의 일부를 포함할 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함한다.
용어 "항체 단편"은 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬인 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편은 합성적으로 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드일 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함된 결합 단편의 예는: (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편, (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341 544-546), 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코드됨에도 불구하고, 이들은 이들을 VL및 VH 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로서 알려짐, 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242 423-426, 및 Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 5879-5883 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조되게 할 수 있는 합성 링커에 의해, 제조합 방법을 이용하여, 연결될 수 있다. 그러한 단일 사슬 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 본 기술분야에 공지된 종래의 기술을 이용하여 수득되며, 상기 단편들은 전체 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
용어 "앱타머"는 표적에 대해 억제 효과를 갖는 펩타이드 또는 핵산을 지칭한다. 앱타머에 의한 표적의 억제는, 표적의 결합에 의해, 표적을 촉매적으로 변화시킴으로써, 표적을 변형시키거나 표적의 기능적 활성을 변형시키는 방식으로 표적과 반응함으로써, 자살 억제제에서와 같이 표적에 이온결합하거나 공유결합함으로써 또는 표적과 또 다른 분자 사이의 반응을 촉진함으로써 일어날 수 있다. 앱타머는 펩타이드, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 다른 핵산 또는 상이한 유형의 핵산들의 혼합물일 수 있다. 앱타머는 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형된 아미노산, 염기, 당, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 인산염 골격 단위를 포함할 수 있다. 앱타머는 페길화되거나 비페길화될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 사슬들이 링커를 통해 핵산 앱타머의 5' 말단에 연결될 수 있다.
"조성물"은 활성 물질 및 불활성 또는 활성인 담체를 포함할 수 있다. 본 조성물은 시험관내, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도를 위해 유용하다. 특정한 구현예에서, 본 조성물은 멸균이거나, 실질적으로 내독소가 없거나 또는 이용된 복용량 또는 농도에서 수령인에게 비독성이다.
용어 "라벨"은, 비제한적으로, 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 모이어티, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 리간드(예를 들면, 바이오틴 또는 합텐) 등을 포함한다. 형광단 라벨의 예는 플루오레세인, 로다민, 단실, 엄벨리페론, 텍사스 레드, 및 루미놀을 포함한다. 라벨의 다른 예는 NADPH, 알파-베타-갈락토시다아제 및 호스래디쉬 퍼옥시다아제를 포함한다.
용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오타이드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체, 및, 기술되는 구현예에 적용될 수 있는 바와 같이, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 발현된 서열 태그(EST), 염색체, cDNA, mRNA, 및 rRNA를 포함한다. 핵산은 표준 빌딩 블록(아데노신, 시티딘, 구아노신, 티미딘 및 우리딘)에 기초하여 자연 발생 핵산 구조들로부터 구조적으로 벗어나는 핵산의 변형된 형태를 포함한다. 변형은 골격, 당 또는 핵염기에 이뤄질 수 있으며, 자연적으로 발생하거나 인공적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 그의 골격 내에서 변형될 수 있다. 예시적인 변형이 본원에 개시되어 있다. 핵산은 핵산 앱타머 및 스피에겔머(spiegelmer)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 길항제 A는 변형된 형태로 존재한다. 길항제 A의 변형된 형태는 본원에서 기재된 바와 같은 변형된 형태의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이며, 여기서 상기 뉴클레오타이드는 길항제 A 내에 변형되지 않은 형태로 존재한다.
용어들 "RNA 간섭," "RNAi," "miRNA," 및 "siRNA"는 관심 유전자(특히 관심 유전자, 예를 들면, PDGF 또는 VEGF의 메신저 RNA)에 상동인, 하나 이상의 이중-가닥 RNA를 표적 세포 내로 도입함으로써 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 감소되는 임의의 방법을 지칭한다.
용어 "신생혈관형성(neovascularization)"는 비정상 조직에서의 또는 비정상 위치에서의 새로운 혈관 형성을 지칭한다.
용어 "혈관형성(angiogenesis)"은 정상 또는 비정상 조직 또는 위치에서의 새로운 혈관의 형성을 지칭한다.
용어 "안과 질환"은 눈의 질환 및 안구 부속기의 질환을 포함한다.
용어 "안구 신생혈관 장애"는 신생혈관형성을 특징으로 하는 안구 장애를 지칭한다. 특정 암은 안구 신생혈관 장애이다. 일 구현예에서, 안구 신생혈관 장애는 암 이외의 장애이다. 암 이외의 안구 신생혈관 장애의 예는 당뇨병성 망막병증 및 노인성 황반 변성을 포함한다.
용어 "포유동물"은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 소, hog, 양, 말, 개, 및 고양이와 같은 인간 및 비-인간 포유동물을 포함한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되며 그의 가장 넓은 의미에서, 2 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 텝타이도모사체의 화합물을 지칭한다. 상기 서브유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 상기 서브유닛은 다른 결합, 예를 들면, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질의 서열 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 모두, 아미노산 유사체 및 텝타이도모사체를 포함하는, 천연 또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
용어 "PDGF"는 세포 성장 또는 분열을 조절하는 혈소판-유래 성장 인자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PDGF"는 PDGF-B(예를 들면, GenBank Accession No. X02811 및 CAA26579), PDGF-A(GenBank Accession No. X06374 및 CAA29677), PDGF-C(GenBank Accession No. NM 016205 및 NP 057289), PDGF-D, 변이체 1 및 2(GenBank Accession No. NM 025208, NP 079484, NM 033135, NP 149126)를 포함하는 PDGF의 다양한 하위유형, 및 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, 및 PDGF- DD를 포함하는 이의 이량체화된 형태를 포함한다. 혈소판 유래 성장 인자는 2개의 관련된 수용체 티로신 키나제 혈소판-유래 성장 인자 세포 표면 수용체(즉, PDGFR), PDGFR-α(GenBank Accession No. NM 006206 및 NP 006197 참조) 및 PDGFR-β(GenBank Accession No.. NM 002609 및 NP 002600)에의 결합 및 이량체화를 통해 이들의 작용을 하는 A-사슬(PDGF-A) 및 B-사슬(PDGF-B)의 동형- 또는 이형이량체를 포함한다. 또한, PDGF 서열의 경우, 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 PCT 출원 공보 번호 WO2010/127029호(이것은 그 전체가 본원에 편입되어 있음)를 참조한다. 또한, PDGFR 복합체에 대한 2개의 부가적인 프로테아제-활성화된 리간드인 PDGF-C 및 PDGF-D가 확인되어 왔다(Li et al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2: 302-9; Bergsten et al., (2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512-6; and Uutele et al., (2001) Circulation 103: 2242-47). PDGFR의 상이한 리간드 결합 특이성으로 인해, PDGFR-α/α가 PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, 및 PDGF-CC에 결합하고; PDGFR-β/β가 PDGF-BB 및 PDGF-DD에 결합하면 반면, PDGFR-α/β는 PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, 및 PDGF-DD에 결합한다는 것이 알려져 있다(Betsholtz et al., (2001) BioEssavs 23: 494-507). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PDGF"는 또한 반응성 세포 유형 상에서 PDGFR의 결합 및 활성화를 통한 DNA 합성 및 세포분화를 유도하는 성장 인자의 클래스의 멤버들을 지칭한다. PDGF는, 예를 들면: 지시된 세포 이동(화학주성) 및 세포 활성화; 포스포리파제 활성화; 증가된 포스파티딜이노시톨 턴오버 및 프로스타글란딘 대사; 반응성 세포에 의한 콜라겐 및 콜라게나제 합성 모두의 자극; 매트릭스 합성, 사이토카인 생산, 및 지질단백질 흡수를 포함하는 세포 대사 활성의 변이; 간접적으로, PDGF 수용체가 결여된 세포에서 증식성 반응의 유도; 및 강력한 혈관수축 활성에 영향을 미칠 수 있다. 용어 "PDGF"는 "PDGF" 폴리펩타이드, "PDGF" 인코딩 유전자 또는 핵산, 또는 이의 이량체화된 형태를 지칭하는데 사용될 수 있다. 용어 "PDGF-A"는 PDGF의 A 사슬 폴리펩타이드 또는 그것의 상응하는 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭한다. 용어 "PDGF-B"는 PDGF의 B 사슬 폴리펩타이드 또는 그것의 상응하는 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭한다. 용어 "PDGF-C"는 PDGF의 C 사슬 폴리펩타이드 또는 그것의 상응하는 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭한다. 용어 "PDGF-D"는, PDGF의 D 사슬 폴리펩타이드의 변이체 1 및 2를 포함하는, PDGF의 D 사슬 폴리펩타이드 또는 그것의 상응하는 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭한다. 용어 "PDGF-AA"는 2개의 PDGF-A 사슬 폴리펩타이드를 갖는 이량체를 지칭한다. 용어 "PDGF-AB"는 하나의 PDGF-A 사슬 폴리펩타이드 및 하나의 PDGF-B 사슬 폴리펩타이드를 갖는 이량체를 지칭한다. 용어 "PDGF-BB"는 2개의 PDGF-B 사슬 폴리펩타이드를 갖는 이량체를 지칭한다. 용어 "PDGF-CC"는 2개의 PDGF-C 사슬 폴리펩타이드를 갖는 이량체를 지칭한다. 용어 "PDGF-DD"는 2개의 PDGF-D 사슬 폴리펩타이드를 갖는 이량체를 지칭한다.
용어 "VEGF"는 혈관형성 또는 혈관형성 과정을 유도하는 혈관 내피 성장 인자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF"는, 예를 들면, VEGF121, VEGF165 및 VEGF189를 포함하는 VEGF- A/VPF 유전자의 대안적인 스플라이싱에 의해 일어나는 VEGF(혈관 투과성 인자(VPF) 및 VEGF-A로도 알려짐)(Genbank Accession Nos. NM 003376 및 NP 003367)의 다양한 하위유형을 포함한다. 또한, VEGF 서열의 경우 그 전체가 본원에 편입되어 있는 PCT 출원 공보 WO2010/127029호를 참조한다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF"는 동족 VEFG 수용체(즉, VEGFR)를 통해 작용하여 혈관형성 또는 혈관형성 공정을 유도하는, PIGF(태반 성장 인자), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 VEGF-E와 같은 VEGF-관련된 혈관형성 인자를 포함한다. 용어 "VEGF"는 VEGFR-I(FIt-I)(GenBank Accession No. AF063657 및 PCT 출원 공보 WO 2010/127029호의 SID NO:8 참조), VEGFR-2(KDR/Flk-1)(GenBank Accession No.. AF035121 및 AAB88005), 또는 VEGFR-3(FLT-4)과 같은 VEGF 수용체에 결합하는 성장 인자의 클래스의 임의의 멤버를 포함한다. 용어 "VEGF"는 "VEGF" 폴리펩타이드 또는 "VEGF" 인코딩 유전자 또는 핵산을 지칭하는데 사용될 수 있다.
용어 "PDGF 길항제"는 일반적으로 PDGF의 활성 또는 생산을 부분적으로 또는 완전히 감소시키거나 억제하는 제제를 지칭한다. PDGF 길항제는 PDGF-B와 같은 특정 PDGF의 활성 또는 생산을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 억제할 수 있다. 더욱이, "길항제"의 상기 정의와 일치하게, "PDGF 길항제"는 PDGF-연관된 수용체 신호를 감소시키거나 억제하기 위해 PDGF 리간드 또는 그것의 동족 수용체 상에 작용하는 제제를 포함한다. "PDGF 길항제"의 예는 PDGF 핵산을 표적화하는 안티센스 분자, 리보자임 또는 RNAi; 항-PDGF 앱타머, PDGF 자체 또는 그것의 수용체에 대한 항-PDGF 항체, 또는 PDGF가 그의 동족 수용체에 결합하는 것을 막는 가용성 PDGF 수용체 데코이(decoy); 동족 PDGF 수용체(PDGFR) 핵산을 표적화하는 안티센스 분자, 리보자임 또는 RNAi; 동족 PDGFR 수용체에 결합하는 항-PDGFR 앱타머 또는 항-PDGFR 항체; 및 PDGFR 티로신 키나제 억제제를 포함한다.
용어 "VEGF 길항제"는 일반적으로 VEGF의 활성 또는 생산을 부분적으로 또는 완전히 감소시키거나 억제하는 제제를 지칭한다. VEGF 길항제는 VEGF165와 같은 특정 VEGF의 활성 또는 생산을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 억제할 수 있다. 더욱이, "길항제"의 상기 정의와 일치하게, "VEGF 길항제"는 VEGF-연관된 수용체 신호를 감소시키거나 억제하기 위해 VEGF 리간드 또는 그것의 동족 수용체 상에 작용하는 제제를 포함한다. "VEGF 길항제"의 예는 VEGF 핵산을 표적화하는 안티센스 분자, 리보자임 또는 RNAi; 항-VEGF 앱타머, VEGF 자체 또는 그것의 수용체에 대한 항-VEGF 항체, 또는 VEGF가 그의 동족 수용체에 결합하는 것을 막는 가용성 VEGF 수용체 데코이(decoy); 동족 VEGF 수용체(VEGFR) 핵산을 표적화하는 안티센스 분자, 리보자임, 또는 RNAi; 동족 VEGFR 수용체에 결합하는 항- VEGFR 앱타머 또는 항-VEGFR 항체; 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF 길항제"는 라니비주맙, 베바시주맙, 및 아플리버셉트를 총괄적으로 지칭하는데 사용된다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 캄포르설포네이트, 파모네이트, 페닐아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 아크릴레이트, 클로로벤조에이트, 딤트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 메틸벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 나프탈렌-2-벤조에이트, 이소부티레이트, 페닐부티레이트, 알파-하이드록시부티레이트, 부틴-l,4-디카복실레이트, 헥신-l,4-디카복실레이트, 카프레이트, 카프릴레이트, 신나메이트, 글리콜레이트, 헵타노에이트, 히푸레이트, 말레이트, 하이드록시말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 프탈레이트, 테라프탈레이트, 프로피올레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 세바케이트, 우베레이트, p-브로모벤젠설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 에틸설포네이트, 2-하이드록시에틸설포네이트, 메틸설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 나프탈렌-l,5-설포네이트, 자일렌설포네이트, 및 타르트레이트 염을 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 또한 카복실산 작용기와 같은 산성 작용기, 및 염기를 갖는 본 발명의 길항제의 염을 지칭한다. 적합한 염기는, 비제한적으로, 나트륨, 칼륨, 및 리튬과 같은 알킬리 금속의 하이드록사이드, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속의 하이드록사이드, 알루미늄 및 아연과 같은 다른 금속의 하이드록사이드, 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대 비치환된 또는 하이드록시-치환된 모노-, 디-, 또는 트리-알킬아민, 디사이클로헥실아민, 트리부틸아민, 피리딘, N-메틸, N-에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-OH-저급 알킬아민), 예컨대 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-tert-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저급 알킬-N-(하이드록실-저급 알킬)-아민, 예컨대 N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민, N-메틸-D-글루카민, 및 아르기닌, 라이신 등과 같은 아미노산을 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 또한 본 발명의 화합물의 수화물을 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 안과적 질환의 치료 또는 예방과 관련하여 사용될 때 용어 "유효량"은 안과적 질환을 치료하거나 예방하는데 유용한 PDGF 길항제 및 VEGF 길항제의 조합된 양을 지칭한다. "유효량"은 투여 방식, 안과적 질환의 특이적 위치, 포유동물의 연령, 체중, 및 일반적인 건강에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물 중 각 길항제의 유효량은, VEGF 길항제의 부재시 PDGF 길항제의 양, 또는 PDGF 길항제의 부재시 VEGF 길항제의 양이 안과적 질환을 치료하거나 예방하는데 비효과적임에도 불구하고, 상기 조성물로 안과적 질환을 치료하거나 예방하는데 유용한 각각의 양이다.
폴리펩타이드 X의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변이된 폴리펩타이드 X의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성(예를 들면, 류신의 이소류신으로의 대체)을 갖는 "보존적" 변화를 가질 수 있다. 더 드물게는, 변이체는 "비보존적" 변화(예를 들면, 글리신의 트립토판으로의 대체)를 가질 수 있다. 유사한 중요하지 않은 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않고 어떤 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나 또는 결실될 수 있는지 결정하는데 있어서 지침은 당해 기술분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR)를 이용하여 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 문맥에서 사용될 때, 용어 "변이체"는 유전자, 이의 코딩 서열, 앱타머, 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열의 것과 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 변이체는 참조 유전자, 코딩 서열, 앱타머 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 치환, 부가 또는 삽입을 포함할 수 있다. 이 정의는 또한, 예를 들면, "대립유전자," "스플라이스," "종," 또는 "다형체" 변이체를 포함한다. 스플라이스 변이체는 참조 분자와 유의미한 동일성을 가질 수 있지만, mRNA 가공 동안 엑손의 대안적인 스플라이싱으로 인해 더 많거나 더 적은 수의 폴리뉴클레오타이드를 가질 것이다. 종 변이체는 종마다 서로 다른 폴리뉴클레오타이드 서열들이다. 다형체 변이체는 주어진 종의 개체 사이에 특정 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변이이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 일반적으로 활성제를 위한 희석제, 비히클, 보존제, 결합제, 또는 안정제로서 사용되는 전형적으로 불활성인 물질을 지칭하며, 비제한적으로, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민 등), 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 알라닌 등), 지방산 및 인지질(예를 들면, 알킬 설포네이트, 카프릴레이트 등), 계면활성제(예를 들면, SDS, 폴리소르베이트, 비이온성 계면활성제 등), 사카라이드(예를 들면, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스 등) 및 폴리올(예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 등)을 포함한다. 또한 그 전체가 참조로 본원에 통합된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(by Joseph P. Remington, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.) 및 약제학적 부형제의 안내서(by Raymond C. Rowe, 5th ed., APhA 공보, Washington, D.C.)]를 참조한다. 어떤 구현예에서, 부형제(들)은 조성물에 대해 유익한 물리적 특성, 예컨대 증가된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 앱타머 또는 소분자 안정성, 증가된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 앱타머 또는 소분자 용해도, 또는 감소된 점도를 부여한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 복수의 활성제를 포함하며, 부형제(들)은 상기 활성제들을 안정화시키는 것을 돕는다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "완충액"은 약제학적 제제의 pH를 안정화시키는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 가리킨다. 적합한 완충액은 당해기술에 널리 알려져 있다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 완충액은 비제한적으로 아세테이트-완충액, 히스티딘-완충액, 시트레이트-완충액, 석시네이트-완충액, 트리스-완충액 및 인산염-완충액을 포함한다. 사용된 완충액과 따로, pH는 본 기술분야에 공지된 산 또는 염기, 예를 들면, 석신산, 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 나트륨 하이드록사이드 및 칼륨 하이드록사이드를 이용하여 약 4.5 내지 약 7.0 또는 대안적으로 약 5.5 내지 약 6.5 또는 대안적으로 약 6.0의 값으로 조정될 수 있다. 적합한 완충액은, 비제한적으로, 히스티딘 완충액, 2-모폴리노에탄설폰산(MES), 카코딜레이트, 포스페이트, 아세테이트, 석시네이트, 및 시트레이트 완충액을 포함한다. 포스페이트 완충액의 부가적인 예는 또한, 비제한적으로, 인산나트륨 완충액 및 인산칼륨 완충액을 포함한다. 인산나트륨 완충액은, 예를 들면, NaH2PO4(1염기성)의 용액을 Na2HPO4(이염기성)의 용액과 조합한 다음 상기 조합된 용액의 pH를 인산 또는 나트륨 하이드록사이드로 조절하여 원하는 pH를 달성함으로써, 제조될 수 있다. 2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-1,3-디올(Tris) 완충액은, 예를 들면, Tris 용액의 pH를 HCl로 조절하여 원하는 pH, 예를 들면, 약 pH 7.0 내지 약 pH 9.0의 범위의 pH를 달성함으로써 제조될 수 있다. L-히스티딘 역시 본 발명에 따른 완충액으로서 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 완충액은, 예를 들면, 보관 동안, 예를 들면, 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 또는 적어도 2년 동안, 실온에서 또는 4℃에서 보관 동안, 원하는 범위 내에 또는 원하는 pH로 또는 그 근처로 본 발명의 조성물의 pH를 달성하거나 유지할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 완충액의 농도는 약 0.01mM 내지 약 1000 mM, 약 0.1mM 내지 약 1000 mM, 약 0.1mM 내지 약 500 mM, 약 0.1 내지 약 200 mM, 약 0.1 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 1000 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 2 mM 내지 약 60 mM, 약 4 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 4 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 25 mM이다.
약제학적으로 허용가능한 "동결보호제"는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 비제한적으로, 예를 들면, 수크로오스, 트레할로오스, 및 글리세롤을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 동결보호제는 동결 또는 동결건조의 효과로부터 조성물, 또는 내부에 하나 이상의 활성 성분의 안정성 보호를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "긴장성 제제" 또는 "장성 조절제"는 조성물의 긴장성을 조절하는데 사용되는 약제학적으로 허용가능한 제제를 가리킨다. 적합한 긴장성 제제는, 비제한적으로, 염화나트륨, 소르비톨, 트레할로오스, 칼륨 클로라이드, 글리세린 및 본원에서 규정된 바와 같은 아미노산의 그룹으로부터의 임의의 성분 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 긴장성 제제는 약 1 mM 내지 약 1000 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 450 mM, 약 20 mM 내지 약 400 mM, 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 125 mM 내지 약 175 mM의 양으로 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 긴장성 제제는 약 5 mM 내지 약 500 mM로 조성물 내에 존재하는 아미노산을 포함한다.
용어 "안정제"는 제조, 보관 및 적용 동안 화학적 또는 물리적 분해로부터 활성 약제학적 성분(들) 또는 제제(들) 또는 조성물을 보호하는, 약제학적 허용가능한 부형제를 가리킨다. 안정제는, 비제한적으로, 당, 아미노산, 폴리올, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 사이클로덱스트린, 예를 들면 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 설포부틸에틸-β-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 예를 들면 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, 알부민, 예를 들면 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 염, 예를 들면 염화나트륨, 마그네슘 클로라이드, 염화칼슘, 및 킬레이터, 예를 들면 EDTA를 포함한다. 안정제는 약 0.1 mM 내지 약 1000 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 10 내지 약 300 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM의 양으로 조성물 내에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 약제학적으로 허용가능한 유기 물질을 지칭하며; 즉, 그것은 반대되는 용해도 경향을 갖는 그룹들, 전형적으로 유용성 탄화수소 사슬 및 수용성 이온성 그룹으로 구성된다. 계면활성제는 표면-활성 모이어티의 전하에 따라, 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 약제학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제를 위해 습윤, 에멀젼화, 가용화, 및 분산제로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 일부 구현예에서, 계면활성제의 양은 중량/용적 퍼센트(w/v %)로 표현되는 백분율로서 기재된다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 계면활성제는, 비제한적으로, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머, Pluronic), 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 그룹을 포함한다. 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20(상표명 Tween 20™으로 판매됨) 및 폴리소르베이트 80(상표명 Tween 80™으로 판매됨)을 포함한다. 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 명칭 Pluronic? F68 또는 폴록사머 188™으로 판매되는 것을 포함한다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 상표명 Brij™으로 판매되는 것을 포함한다. 알킬페놀폴리옥시에틸렌 에테르는 상표명 Triton-X로 판매되는 것을 포함한다. 폴리소르베이트 20(Tween 20™) 및 폴리소르베이트 80(Tween 80™)은 조성물의 총 부피의 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v 또는 약 0.002% w/v 내지 약 0.1% w/v, 또는 대안적으로 약 0.003% w/v 내지 약 0.007% w/v의 농도 범위로 일반적으로 사용된다. 일부 구현예에서, Tween 80™은 약 0.003% w/v, 약 0.004% w/v, 약 0.0045% w/v, 약 0.005% w/v, 약 0.0055% w/v, 약 0.006% w/v 또는 약 0.007% w/v으로 사용된다. 일부 구현예에서, Tween 80™은 약 0.005% w/v로 사용된다. 이 측면에서, "w/v"는 조성물의 총 부피 당 계면활성제의 중량을 의도한다.
"동결건조보호제"는 동결건조 동안 단백질, 핵산 또는 다른 활성 약제학적 성분(들) 또는 제제(들)을 안정화시키는 약제학적으로 허용가능한 물질을 지칭한다. 동결건조보호제의 예는, 비제한적으로, 수크로오스, 트레할로오스 또는 만니톨을 포함한다.
"폴리올"는 다수의 하이드록실 그룹, 또는 당 알코올을 함유하는 알코올을 지칭한다. 당 알코올은 카보닐 그룹(알데하이드 또는 케톤, 환원 당)이 일차 또는 2차 하이드록실 그룹)으로 환원된 탄수화물(그러므로 알코올임)의 수소첨가된 형태이다. 당 알코올은 일반식 H(HCHO)n+1H를 갖는 반면, 당류는 H(HCHO)nHCO를 갖는다.
"항산화제"는 다른 분자의 산화를 늦추거나 방지할 수 있는 분자를 지칭한다. 항산화제는 종종 환원제, 킬레이트제 및 산소 스캐빈져, 예컨대 티올, 아스코르브산 또는 폴리페놀이다. 항산화제의 비제한적인 예는 아스코르브산(AA, E300), 티오설페이트, 메티오닌, 토코페롤(E306), 프로필 갈레이트(PG, E310), 3차 부틸하이드로퀴논(TBHQ), 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA, E320) 및 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT, E321)을 포함한다.
"보존제"는 미생물 성장에 의한 분해 또는 바람직하지 않은 화학적 변화에 의한 분해를 방지하기 위해, 식품, 약제학적 조성물, 페인트, 생물학적 샘플, 목재 등과 같은 제품에 부가되는 천연 또는 합성 화합물이다. 보존 첨가제는 단독으로 사용되거나 다른 보존 방법과 함께 사용될 수 있다. 보존제는 박테리아 및 진균류의 성장을 억제하는 항미생물 보존제, 또는 성분들의 산화를 억제하는 산소 흡수제와 같은 항산화제일 수 있다. 항미생물 보존제의 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 클로로헥시딘, 글리세린, 페놀, 칼륨 소르베이트, 티메로산, 설파이트(이산화황, 나트륨 바이설파이트, 칼륨 수소 설파이트 등) 및 디나트륨 EDTA를 포함한다. 다른 보존제는 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 또는 메틸파라벤과 같은 비경구 단백질 조성물에서 통상적으로 사용되는 것을 포함한다.
본 발명은 적어도 하나의 항-PDGF 압타머 및 적어도 하나의 VEGF 길항제를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 관련된 제조 방법 및 그의 용도를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 효과적인 양의 하기를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 항-PDGF 압타머 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) VEGF 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염. 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제의 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 90%는, 본 조성물이 보관된 약 2.0 ℃ 내지 약 8.0 ℃의 온도에서 적어도 약 12 주 동 보관될 때 화학적으로 안정하다.
본 발명의 다양한 조성물 및 방법의 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태이다. 본 발명의 다양한 조성물 및 방법의 특정한 구현예에서, VEGF 길항제는 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 아플리버셉트, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 필요한 포유동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 안과적 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 조성물은 안과적 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 투여된다. 다양한 구현예에서, 안과적 질환은 노인성 황반 변성, 결절 맥락막 맥관병증, 맥락막 신생혈관형성과 연관된 병태, 고혈압 망막증, 당뇨 망막병증, 겸형 세포 망막증, 주변 망막 신생혈관형성과 연관된 병태, 미숙아 망막증, 정맥 폐쇄성 질환, 동맥 폐쇄성 질환, 중심 장액성 맥락망막병증, 포낭 황반 부종, 망막 모세혈관확장증, 동맥 대혈관류, 망막 혈관종증, 방사선-유도된 망막증, 홍채 조홍, 또는 종양이다. 특정한 구현예에서, 안과적 질환은 노인성 황반 변성이고, 노인성 황반 변성은 습성 노인성 황반 변성 또는 건성 노인성 황반 변성이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 약물-전달 장치에서 존재한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 안구내로 투여된다. 특이한 구현예에서, 안구내 투여는 유리체내 투여 또는 전방 투여이다. 다른 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
PDGF 압타머 및 VEGF 길항제
본 발명은 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 (또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이고, VEGF 길항제는 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 아플리버셉트 (또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다. 본 발명은 추가로, 효과적인 양의 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다.
항-PDGF 압타머
어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는, 비제한적으로, PDGF-특이적 및 PDGF-VEGF-특이적 압타머 둘 모두를 포함하는, 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있는 US 특허 번호 8,039,443에서 기재된 것을 포함한다.
항-PDGF 압타머의 예는 올리고뉴클레오타이드 서열이 하기 서열 중의 하나를 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나 이루어진 압타머를 포함한다:
ARC126: 5'-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [서열번호:1])-HEG-(5'-dC-dG-T- dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [서열번호:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]- 3' [서열번호:3])-3', 여기서 "HEG" = 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, "m"는 2'-메톡시 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "f"는 2' 플루오로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "d"는 데옥시뉴클레오타이드를 나타내고, "[3T]"는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고;
ARC127: 5'-[40K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [서열번호:1])-HEG- (5'-dC-dG-T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [서열번호:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC- fU-mG-[3T]-3' [서열번호:3])-3', 여기서 "HEG" = 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, "m"는 2'-메톡시 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "f"는 2' 플루오로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "d"는 데옥시뉴클레오타이드를 나타내고, "[3T]"는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고;
ARC240: 5'-[20K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [서열번호:1])-HEG-(5'-dC-dG- T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [서열번호:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG- [3T]-3' [서열번호:3])-3', 여기서 "HEG" = 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, "m"는 2'-메톡시 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "f"는 2' 플루오로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "d"는 데옥시뉴클레오타이드를 나타내고, "[3T]"는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고;
ARC308: 5'-[30K PEG]-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [서열번호:1])-HEG-(5'-dC-dG- T-dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3 [서열번호:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG- [3T]-3' [서열번호:3])-3', 여기서 "HEG" = 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, "m"는 2'-메톡시 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "f"는 2' 플루오로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내고, "d"는 데옥시뉴클레오타이드를 나타내고, "[3T]"는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고;
데옥시ARC126: 5'-dCdAdGdGdCdTdAdCdGdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T]-3' (서열번호:75), 여기서 "d"는 비변형된 데옥시뉴클레오타이드를 나타내고 "[3T]"는 리보오스 당 상의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고; 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 2 5' 말단을 가지며 따라서 3' 하이드록실 말단 상에서 작용하는 뉴클레아제에 대해 내성이 있고;
ARC124: 5'-CACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTG[3T]-3' (서열번호:6), 여기서 "[3T]"는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미한다.
다가 압타머에 결합하는 PDGF-VEGF의 예는 include PDGF-B-VEGF 압타머 키메라 TK.131.12. 및 TK.131.12.B를 포함하고, 이것은 PDGF-B 및 VEGF의 동시 표적화를 허용한다. 이들 압타머 키메라는 PCT 특허 출원 공보 번호 WO2006/050498 및 WO2004/094614에서 기재되어 있다.
TK.131.012.A의 서열은 하기이다: 5'-CdAdGdGdCdTdAdCdGmAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmUdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG[3T]-3' (서열번호:4), 여기서 "m"는 2'-OMe 뉴클레오타이드를 나타내고, "d" 및 "[3T]"는 상기에서 규정된 바와 같고;
그리고 TK.131.012.B의 서열은 하기이다: 5'-CdAdGdGdCdTdAdCdGmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAdCdGdTdAdGdAdGdCdAdTdCdAdGdAdAdAdTdGdAdTdCdCdTdG-[3T] (서열번호:5) 여기서 "m", "d" 및 "[3T]"는 상기에서 규정된 바와 같다.
특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 PDGF에 결합한다. 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 PDGF-A 또는 PDGF-B에 결합한다. 항-PDGF 압타머의 예는 31-35 길이의 뉴클레오타이드 (미국 특허 번호 8,039,443의 서열번호:1 내지 서열번호:3, 서열번호:4 내지 서열번호:30, 서열번호:31 내지 서열번호:68, 서열번호:69, 및 서열번호:70 내지 서열번호:74)의 일련의 핵산 압타머를 포함하고, 이것은 시험관 내에서 PDGF-B 단백질에 특이적으로 결합하고 생체내 및 세포 기반 검정에서 PDGF-BB의 활성을 기능적으로 차단하는. 특정한 구현예에서, 항-PDGF-B 압타머는 모 분자 ARC126, 5'-(5'-NH2-dC-dA-dG-dG-dC-fU-dA-fC-mG-3' [서열번호:1])-HEG-(5'-dC-dG-T- dA-mG-dA-mG-dC-dA-fU-fC-mA-3' [서열번호:2])-HEG-(5'-T-dG-dA-T-fC-fC-fU-mG-[3T]- 3' [서열번호:3])-3'로부터 유도되고, 이것은 잔기를 함유하는 7 개의 개별적인 2'F를 함유하고, 여기서 HEG = 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, 및 [3T]는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미한다. 잔기를 함유하는 2'F는 혈청 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 차단하여 압타머의 시험관내 혈청 및 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 강력한 시험관내 결합 및 항-증식성 활성을 보유하고 자연 발생 2'데옥시 또는 2'OMe 치환된 뉴클레오타이드를 함유하는 완전한 2'F-없는 압타머. 또한, 특정한 구현예에서, 이들 압타머는 시험관내 안정성 검정에서 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 통해 측정되는 바와 같이 실질적인 혈청 안정성을 보유한다.
어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 길항제 A 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 길항제 A의 화학명은 하기이다: [(모노메톡시 20K 폴리에틸렌 글리콜 카바모일-N2-) (모노메톡시 20K 폴리에틸렌 글리콜 카바모일-N6-)]-라이신-아미도-6-헥산딜릴-(1-5')- 2'-데옥시시티딜릴 -(3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5')-2'-데옥시구아닐릴-(3'-5')- 2'-데옥시구아닐릴-(3'-5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로우리딜릴- (3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시- 2'-메톡시구아닐릴-(3'-l)-PO3-헥사(에틸옥시)-(18-5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시구아닐릴-(3'-5')- 티미딜릴-(3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5') -2'-데옥시-2'-메톡시구아닐릴-(3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-메톡시구아닐릴-(3'-5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로우리딜릴-(3'-5')-2'- 데옥시-2'-플루오로시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-메톡시아데닐릴-(3'-l)- PO3-헥사(에틸옥시)-(18-5')-티미딜릴-(3'-5')-2'-데옥시구아닐릴-(3'-5')-2'-데옥시아데닐릴-(3'-5')-티미딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로시티딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-플루오로우리딜릴-(3'-5')-2'-데옥시-2'-메톡시구아닐릴-(3'-3')-티미딘.
길항제 A의 구조는 도 78A-F에서 보여지고, 그 전체가 본원에 편입된 PCT 출원 공보 번호 WO 2010/127029의 도 7에서 또한 기재되어 있다.
길항제 A의 서열은 하기이다:
5'-[mPEG2 40kD]-[HN-(CH2)6O] CAGGCUfACfGm (서열번호:1) [PO3(CH2CH2O)6] CGTAGmAGmCAUfCfAm (서열번호:2) [PO3(CH2CH2O)6] TGATCfCfUfGm[3T] (서열번호:3) -3', 여기서 [3T]는 리보오스 당의 3' 위치에서 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 부착된 역전된 티미딘 뉴클레오타이드를 의미하고, [mPEG2 40 kD]는 2 개의 20 kD 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머 사슬, 일 구현예에서, 카바메이트 연결을 통해 라이신 잔기의 2 개의 아미노 그룹에 공유결합된 2 개의 약 20 kD PEG 폴리머 사슬을 나타낸다. 이러한 모이어티는 결국 아래에서 기재된 아미노 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드와 연결된다.
[HN-(CH2)6O]는 아마이드 결합을 통해 PEG 폴리머에 공유결합된 이작용성 α-하이드록시-ω-아미노 링커를 나타낸다. 링커는 포스포디에스테르 연결에 의해 길항제 A의 5'-말단에서 올리고뉴클레오타이드에 부착된다.
[PO3(CH2CH2O)6]는 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오타이드의 분절을 연결하는 헥사에틸렌 글리콜 (HEX) 모이어티를 나타낸다. 길항제 A는 링커와 각 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 연결을 통해 제 9 및 제 10 뉴클레오타이드 및 제 21 및 제 22 뉴클레오타이드를 함께 연결하는 2 개의 HEX 연결을 갖는다.
C, A, G, 및 T는 시토신, 아데노신, 구아노신, 및 티미딘 핵산, 각각의2'-데옥시 유도체에 대한 단일 글자 코드를 나타낸다. 길항제 A는 4 개의 2'-데옥시리보시토신, 6 개의 2'-데옥시리보아데노신, 4 개의 2'-데옥시리보구아노신, 및 4 개의 2'-데옥시리보티미딘을 갖는다.
Gm 및 Am은 구아노신 및 아데노신, 각각의 2'-메톡시 치환된 형태를 나타낸다. 길항제 A는 4 개의 2'-메톡시구아노신 및 하나의 2'-메톡시아데노신을 갖는다. Cf 및 Uf는 시토신 및 우리딘, 각각의 2'-플루오로 치환된 형태를 나타낸다. 길항제 A는 4 개의 2'-플루오로시토신 및 3 개의 2'-플루오로우리딘을 갖는다.
3'-말단을 제외하고, 올리고뉴클레오타이드에서의 포스포디에스테르 연결은 표준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 포스포디에스테르 연결을 갖는 리보오스 고리의 5'- 및 3'-산소를 연결한다. 3'-말단 티미딘 및 끝에서 두 번째 Gm사이의 포스포디에스테르 연결은 그들의 각각 3'-산소를 연결하며, 이는 3', 3'-캡으로서 지칭된다.
길항제 A는 전체 분자(핵산, 아미노 링커 및 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함함)에 대해 분자량 약 40,000 내지 약 60,000 달톤, 일 구현예에서 40,000 내지 60,000 달톤의 분자량을 가지며, 용액에서 무색 내지 옅은 황색일 수 있다. 어떤 구현예에서, 길항제 A는 완충액로서 일염기성 인산나트륨 일수화물 및 이염기성 인산나트륨 헵타히드레이트 및 긴장성 조정제로서 염화나트륨의 용액 내에 존재할 수 있다. 길항제 A는 친수성 폴리머이다. 육안 검사에 의해 평가된 바와 같이, 길항제 A 나트륨 염은 적어도 약 50 mg(올리고뉴클레오타이드 중량에 기초하여)/mL 용액까지 물에서 그리고 인산염-완충된 염수(PBS)에서 가용성이다.
일 구현예에서, 길항제 A는 올리고뉴클레오타이드 부분 및 아미노 링커를 생산한 후, 실시예 5 및 본원에 그 전체가 참고로 통합된 PCT 출원 공보 번호 WO 2010/127029에 기재된 바와 같은 페길화 시약에 공유결합되는 반복적인 화학적 합성 절차를 이용하여 제조된다.
길항제 A는 충분히 염기성인 작용기를 가질 수 있고, 이는 임의의 많은 무기 및 유기산과 반응하여 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 산 부가염은 당해분야에 공지되어 있는 약제학적으로-허용가능한 산으로부터 형성된다. 그러한 염은 본원에 기재된 것 및 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) and The Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use, P H Stahl and C G Wermuth (ED s), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002]에 열거된 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-PDGF 앱타머는, 길항제 A와 같은 앱타머, 또는 본원에서 기재된 또 하나의 앱타머의 변형된 형태이며, 이는 본원에서 기재된 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 길항제 A와 관련하여 구체적으로 논의되었음에도 불구하고, 본원에 기재된 임의의 변형은 본원에 기재된 임의의 다른 항-PDGF 앱타머의 변형된 형태로 존재할 수 있는 것으로 이해되며, 이들 각각은 본 발명에 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면 길항제 A의 변형된 형태는, 상기 앱타머와 동일한 뉴클레오타이드 서열 및 핵산을 포함하거나 이로 구성되지만, 상기 앱타머와 비교하여 하나 이상의 상이한 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 사슬을 포함하거나, 또는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 사슬을 앱타머의 핵산부에 결합시키는 하나 이상의 상이한 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A의 변형된 형태는, 피리미딘 염기 내에 5-X 또는 2'-Y 치환 및 퓨린 염기 내에 8-X 또는 2'-Y 치환을 포함하는, 상기 앱타머와 비교하여 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 표적과의 앱타머 결합 상호작용을 타협하지 않으면서 뉴클레아제에 대한 안정화를 위해 2'-플루오로 및 2'-O-Me와 같은 2'-변형이 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Lin et al., Nucleic Acids Res., 22, 5229- 5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry, 34, 11363-1137 (1995); Lin et al., Nucleic Acids Res., 22, 5229-5234 (1994); Kubik et al., J. Immunol., 159(1), 259-267 (1997); Pagratis et al., Nat. Biotechnol., 1, 68-73 (1997); and Wilson et al., Curr Opin Chem Biol, 10(6), 607-614 (2006)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 화학적 치환은 당 위치에서의 화학적 치환, 염기 위치에서의 화학적 치환, 또는 포스페이트 위치에서의 화학적 치환일 수 있다.
앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A 내에 존재할 수 있는 변형은, 비제한적으로, 앱타머 염기에 또는 전체로서 앱타머에, 추가의 전하, 분극성, 소수성, 수소 결합, 정전 상호작용, 또는 유동성을 도입하는 다른 화학적 그룹을 제공하는 것을 포함한다. 그와 같은 변형은, 비제한적으로, 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 고리외 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-아이오도-우라실의 치환; 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화, 아이소베이스 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 드문 염기 짝짓기 등을 포함한다. 변형은 또한 당 모이어티를 이용한 캡핑 또는 변형과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A의 변형된 형태는 피리미딘 잔기의 당 모이어티 상에서 변형된 2'-플루오로(2'-F)인 RNA 분자이다. 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면 길항제 A의 변형된 형태, 뿐만 아니라 본 발명에 따라 사용될 수 있는 안정된 앱타머 내에 존재할 수 있는 변형의 예는, 그 전체가 참고로 본원에 통합된 미국 특허 제8,039,443호에 기재되어 있다. 어떤 구현예에서, 항-PDGF 앱타머는 비제한적으로 미국 특허 제8,039,443호에 기재된 것을 포함하는, 항-PDGF-B 앱타머이다.
일부 구현예에서, 앱타머의 안정성은 상기 변형의 도입에 의해서 증가될 수 있을 뿐만 아니라 RNA의 인산염 골격을 따라 변형 및 치환에 의해서 증가될 수 있으며, 이는 또한 길항제 A의 변형된 형태 내에 존재할 수 있다. 또한, 다양한 변형은 핵염기 자체 상에서 이뤄질 수 있으며, 이는 모두 분해를 억제하고 원하는 뉴클레오타이드 상호작용을 증가시키거나 원하지 않는 뉴클레오타이드 상호작용을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일단 앱타머의 서열이 알려지면, 변형 또는 치환은 하기 기재된 합성 절차 또는 당해분야의 숙련가에게 공지된 절차에 의해 이뤄질 수 있다. 임의의 상기 변형은 길항제 A의 변형된 형태 내에 존재할 수 있다.
앱타머의 변형된 형태, 예를 들면 길항제 A의 변형된 형태 내에 존재하는 다른 변형들은 리보핵산(즉, A, C, G 및 U) 및 데옥시리보핵산(즉, A, C, G 및 T) 내에 존재하는 표준 염기, 당류 또는 포스페이트 골격 화학 구조의 변이인 변형된 염기(또는 변형된 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오타이드)의 혼입을 포함한다. 예를 들면: Gm(2'-메톡시구아닐산), Am(2'-메톡시아데닐산), Cf(2'-플루오로시티딜산), Uf(2'-플루오로우리딜산), Ar(리보아데닐산)이 이 범위에 포함된다. 길항제 A의 변형된 형태는 5-메틸시토신, 4-아세틸시토신, 3-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-티오시토신, 5-할로시토신(예를 들면, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 및 5-아이오도시토신), 5-프로피닐 시토신, 6-아조시토신, 5-트리플루오로메틸시토신, N4, N4-에타노시토신, 펜옥사진 시티딘, 페노티아진 시티딘, 카바졸 시티딘 또는 피리도인돌 시티딘을 포함하는 시토신 또는 임의의 시토신 -관련된 염기를 포함할 수 있다. 길항제 A의 변형된 형태는 6-메틸구아닌, 1-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2-프로필구아닌, 6-프로필구아닌, 8-할로구아닌(예를 들면, 8-플루오로구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 및 8-아이오도구아닌), 8-아미노구아닌, 8-설프하이드릴구아닌, 8-티오알킬구아닌, 8-하이드록실구아닌, 7-메틸구아닌, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌 또는 3-데아자구아닌을 포함하는 구아닌 또는 임의의 구아닌-관련된 염기를 포함할 수 있다. 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A의 변형된 형태는, 6-메틸아데닌, N6-이소펜테닐아데닌, N6-메틸아데닌, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 8-할로아데닌(예를 들면, 8-플루오로아데닌, 8-브로모아데닌, 8-클로로아데닌, 및 8-아이오도아데닌), 8-아미노아데닌, 8-설프하이드릴아데닌, 8-티오알킬아데닌, 8-하이드록실아데닌, 7-메틸아데닌, 2-할로아데닌(예를 들면, 2-플루오로아데닌, 2-브로모아데닌, 2-클로로아데닌, 및 2-아이오도아데닌), 2-아미노아데닌, 8-아자아데닌, 7-데아자아데닌 또는 3-데아자아데닌을 포함하는 아데닌 또는 임의의 아데닌 -관련된 염기를 포함할 수 있다. 5-할로우라실(예를 들면, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실), 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 1-메틸슈도우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 5'-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-프로피닐 우라실, 6-아조우라실, 또는 4-티오우라실을 포함하는 우라실 또는 임의의 우라실-관련된 염기가 또한 포함된다.
앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A의 변형된 형태 내에 존재할 수 있는, 당해 기술분야에 알려진 다른 변형된 염기의 예는, 비제한적으로, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록실메틸) 우리딘, 2'-메톡시시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, b-D-갈락토실퀘우오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1 -메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, b-D-만노실퀘우오신, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-b-D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-b-D-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시 아세트산, 와이부톡소신, 슈도우리딘, 퀘우오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-b-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘을 포함한다.
본 기술분야에 공지된 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 당 골격 변이체의 예는, 비제한적으로, F, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2, CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, OCH2OCH2N(CH3)2, O(Cl -10 알킬), O(C2-10 알케닐), O(C2 -10 알키닐), S(Cl -10 알킬), S(C2 -10 알케닐), S(C2 -10 알키닐), NH(C1 -10 알킬), NH(C2 -10 알케닐), NH(C2 -10 알키닐), 및 O-알킬-O-알킬과 같은 2'-리보실 치환기를 갖는 것을 포함한다. 바람직한 2' 리보실 치환기는 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH=CH2), 2'-아미노 (2'-NH2),및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-치환기는 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치에 존재할 수 있다. 이들은 길항제 A의 변형된 형태 내에 존재할 수 있다.
변형의 예는 피리미딘의 퓨린 치환; 우리딘의 2'-데옥시 디하이드로우리딘 치환; 시티딘의 2'-데옥시-5-메틸 시티딘 치환; 퓨린의 2-아미노 퓨린 치환; 포스포디에스테르의 포스포로티오에이트 치환; 포스포디에스테르의 포스포로디티오에이트 치환; 2'-OH 뉴클레오타이드의 데옥시뉴클레오타이드 치환; 2'-OH 또는 데옥시뉴클레오타이드의 2'-OMe 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 뉴클레오타이드 또는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오타이드 치환; PEG 또는 PAG 폴리머의 부가; 큰 입체 분자의 부가; 3' 캡의 부가; 또는 뉴클레아제 분해를 차단하는 것으로 알려진 임의의 다른 변형을 포함한다. 예를 들면, 그 전체가 참고로 통합된 미국 특허 공보 제20090075342호를 참조한다.
앱타머의 변형된 형태, 예를 들면 길항제 A의 변형된 형태는, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있으며, 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체이다. 앱타머의 변형된 형태, 예를 들면, 길항제 A의 변형된 형태는, 예를 들면 PDGF에 결합하는 올리고머의 기능에 영향을 미치지 않는 위치에 있는 뉴클레오타이드 유사체를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 항-PDGF 앱타머는 친지질성 화합물(예를 들면, 콜레스테롤)과 같은 하나 이상의 비-생리적 활성 그룹과 연결되거나; 하나 이상의 비-면역원성 고분자량 화합물(예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜)과 연결되거나; 또는 친지질성 성분(예를 들면, 리포좀)을 포함하는 복합체에 부착되거나 그 안에 캡슐화될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 연결된 앱타머는 앱타머를 세포내 표적으로 전달하기 위해 세포에 의해 앱타머의 세포성 흡수를 향상시킨다. 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 미국 특허 제6,011,020호는 하나 이상의 친지질성 화합물 또는 비-면역원성, 고분자량 화합물과 연결된 앱타머를 제조하는 방법을 기술한다.
본원에 기재된 항-PDGF 앱타머는 미국 특허 제6,011,020호에 기재된 바와 같은 진단 또는 치료 복합체에서, 링커를 통해 하나 이상의 비-생리적으로 활성 그룹, 예컨대 친지질성 또는 비-면역원성, 고분자량 화합물에 부착될 수 있다. 진단 또는 치료 복합체 내에서, 링커를 통해 친지질성 화합물, 예컨대 디아실 글리세롤 또는 디알킬 글리세롤에 부착된 앱타머는 미국 특허 제5,859,228호에 기재되어 있다. 글리세롤 지질과 같은 친지질성 화합물에, 또는 폴리알킬렌 글리콜과 같은 비-면역원성, 고분자량 화합물에 링커를 통해 부착된 앱타머는, 미국 특허 제6,051,698호에 추가 기재되어 있다. 비-면역원성, 고분자량 화합물에 또는 친지질성 화합물에 링커를 통해 부착된 앱타머는 또한 "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes"라는 명칭의, 1997년 10월 17일에 출원된 PCT/US97/18944에 추가 기술되어 있다. 본원에 기술된 특허 및 특허 출원 각각은 그 전체가 참고로 본원에 명시적으로 통합되어 있다.
하나 이상의 앱타머, 예를 들면 길항제 A는 링커를 통해 비-면역원성, 고분자량 화합물 또는 친지질성 화합물에 부착될 수 있다. 비-면역원성, 고분자량 화합물은 전형적으로 면역원성 반응을 생성하지 않는, 약 100 Da 내지 1,000,000 Da, 약 1000 Da 내지 500,000 Da, 또는 약 1000 Da 내지 200,000 Da의 분자량을 갖는 선형 또는 분지형 화합물일 수 있다. 일 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜일 수 있다. 일 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜을 포함한다. 일 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 복수의 폴리알킬렌 글리콜을 포함한다. 일 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 2개의 폴리알킬렌 글리콜을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG는 약 10 내지 약 80 kDa의 분자량 또는 약 20 내지 약 45 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 PEG는 약 10 내지 약 80 kDa의 조합된 분자량 또는 약 20 내지 약 45 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 2개의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하고, 이들 각각은 약 20 kDa의 분자량을 갖는다.
앱타머, 예를 들면 길항제 A는 링커를 통해 하나 이상의 친지질성 화합물에부착될 수 있다. 친지질성 화합물은 주로 친지질성 성분에 기반한 화합물을 포함하는, 지질 또는 낮은 유전 상수를 갖는 다른 물질 또는 상과 회합하거나 이들로 분배되는 경향을 갖는 화합물이다. 친지질성 화합물은 지질(또는 낮은 유전 상수를 갖는 다른 물질 또는 상들)과 회합하는 경향을 갖는 화합물을 함유하는 지질 및 비-지질을 포함한다. 콜레스테롤, 인지질, 및 디알킬 글리세롤, 디아실 글리세롤, 및 글리세롤 아마이드 지질과 같은 글리세롤 지질이 친지질성 화합물의 추가 예이다. 일 구현예에서, 친지질성 화합물은 글리세롤 지질이다.
비-면역원성, 고분자량 화합물 또는 친지질성 화합물은, 예컨대 뉴클레오타이드 염기 상의 고리외 아미노 그룹, 피리미딘 뉴클레오타이드의 5-위치, 퓨린 뉴클레오타이드의 8-위치, 뉴클레오타이드 포스페이트의 하이드록실 그룹, 또는 앱타머의 5' 또는 3' 말단에 있는 하이드록실 그룹 또는 다른 그룹에 링커를 통해 공유 결합될 수 있다. 친지질성 화합물이 글리세롤 지질이거나, 비-면역원성, 고분자량 화합물이 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜인 일부 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 이의 인산염 그룹의 5' 또는 3' 하이드록실에 링커를 통해 결합될 수 있다. 일 구현예에서, 친지질성 화합물 또는 비-면역원성, 고분자량 화합물은 앱타머의 5' 인산염 그룹에 링커를 통해 결합된다. 앱타머에의 비-면역원성, 고분자량 화합물 또는 친지질성 화합물의 부착은 직접적으로 수행되거나 상기 앱타머 및 친지질성 화합물 또는 비-면역원성, 고분자량 화합물 사이에 삽입되는 하나 이상의 링커를 이용하여 수행될 수 있다. 부착이 직접적으로 수행되는 경우, 일부 구현예에서, 링커가 존재하지 않는다.
링커는 공유 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 2 이상의 분자 독립체를 연결하는 분자 독립체이며, 이는 하나 이상의 분자 독립체의 작용성 특성을 보존하는 방식으로 분자 독립체의 공간 분리를 허용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 비-면역원성, 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜이고 구조 R(O(CH2)x)nO-를 가지며, 여기서 R은 독립적으로 H 또는 CH3이고, x=2-5이며, n은 폴리알킬렌 글리콜의 MW/(16+14x)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜의 분자량은 약 10-80 kDa이다. 또 하나의 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜의 분자량은 약 20-45 kDa이다. 또 하나의 구현예에서, x=2 및 n=9X102이다. 동일한 앱타머에 링커를 통해 부착된 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜이 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 복수의 폴리알킬렌 글리콜이 링커를 통해 동일한 앱타머에 부착된다. 또 하나의 구현예에서, 2개의 폴리알킬렌 글리콜이 링커를 통해 동일한 앱타머에 부착된다. 또 하나의 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜은 약 40 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일 구현예에서, 항-PDGF 앱타머는 링커를 통해 폴리알킬렌 글리콜 또는 PEG와 같은 비-면역원성, 고분자량 화합물에, 또는 복수의 비-면역원성, 고분자량 화합물에 부착된다. 이 구현예에서, 상기 연결된 PDGF 앱타머의 약력학적 특성은 항-PDGF 앱타머 단독 대비 개선된다. 폴리알킬렌 글리콜 또는 PEG는 링커를 통해 PDGF 앱타머 상의 다양한 위치에 공유 결합될 수 있다. 폴리알킬렌 글리콜 또는 PEG가 사용되는 구현예에서, 항-PDGF 앱타머는 링커를 통해 포스포디에스테르 연결을 통한 5' 하이드록실 그룹을 통해 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 앱타머가 폴리알킬렌 글리콜 또는 PEG과 같은 단일 비-면역원성, 고분자량 화합물, 또는 글리세롤 지질과 같은 친지질성 화합물과 회합될 수 있다. 상기 앱타머들은 모두 하나의 표적에 대한 것이거나 상이한 표적에 대한 것일 수 있다. 화합물이 하나를 초과하는 항-PDGF 앱타머를 포함하는 구현예에서, 표적, PDGF와의 다수의 결합 상호작용으로 인해 결합능이 증가할 수 있다. 또 추가의 구현예에서, 복수의 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜, PEG, 및 글리세롤 지질 분자들은 서로에게, 동일한 링커에, 또는 복수의 링커에 부착될 수 있다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 앱타머는 각각 폴리알킬렌 글리콜, PEG, 또는 글리세롤 지질과 회합될 수 있다. 이는 각 앱타머의 그의 표적에 대한 결합능 증가를 야기할 수 있다. 또한, PDGF에 대한 앱타머 또는 폴리알킬렌 글리콜, PEG, 또는 글리세롤 지질과 연관된 상이한 표적 및 PDGF에 대한 앱타머가 존재하는 구현예에서, 약물은 또한 폴리알킬렌 글리콜, PEG, 또는 글리세롤 지질과 회합, 예를 들면, 공유 결합될 수 있다. 따라서 상기 화합물은 임의로, 하나 이상 추가적인 링커와 함께, 링커로서 작용하는 폴리알킬렌 글리콜, PEG, 또는 글리세롤 지질을 이용하여, 약물의 표적화된 전달을 제공할 것이다.
특정한 구현예에서, 앱타머는 5' 말단에서의 5'-5' 역전된 뉴클레오타이드 캡 구조 및/또는 3' 말단에서의 3'-3' 역전된 뉴클레오타이드 캡 구조로 5'-캡핑된 및/또는 3'-캡핑될 수 있다. 어떤 구현예에서, 길항제 A(또는 길항제 A의 변형된 형태)는 5' 또는 3' 말단-캡핑된다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 캡은 역전된 티미딘이다.
VEGF 길항제
본 발명의 조성물에서 유용한 VEGF 길항제는, 비제한적으로, 라니비주맙, 베바시주맙, 아플리버셉트, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
어떤 구현예에서, VEGF 길항제는 항체, 또는 그의 단편이고, 이들은 인간화된 또는 인간 항-VEGF 항체일 수 있는 인간 VEGF에 결합한다. 특정한 구현예에서, 항-VEGF 항체 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYG X4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (서열번호:76), 여기서 X1은 T 또는 D이고; X2는 N 또는 H이고; X3은 Y 또는 H이고; X4는 S 또는 T이다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL (서열번호:77). 이들 중쇄 가변 도메인 서열은 하기 경쇄 가변 도메인 서열 또는 다른 경쇄 가변 도메인 서열과 조합될 수 있고, 단, 그렇게 생산된 항체는 인간 VEGF에 결합한다.
어떤 구현예에서, 항-VEGF 항체 경쇄 가변 도메인은 하기 아미노산 서열: CDRLl (SASQDISNYLN [서열번호:78]), CDRL2 (FTSSLHS [서열번호:79]) 및 CDRL3 (QQYSTVPWT [서열번호:80]) 을 갖는 초가변 영역을 포함한다. 특정한 구현예에서, 3 개의 경쇄 초가변 영역은, 예를 들면, 하기 식: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4으로 나타낸 인접 서열로서 인간 프레임워크 영역에서 제공된다. 일 구현예에서, 항-VEGF 항체 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열을 포함한다: DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (서열번호:81), 여기서 X1은 M 또는 L이다. 특정한 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (서열번호:82). 이들 경쇄 가변 도메인 서열은 상기-확인된 중쇄 가변 도메인 서열 또는 다른 중쇄 가변 도메인 서열과 조합될 수 있고, 단, 그렇게 생산된 항체는 인간 VEGF에 결합하는 능력을 보유한다.
하나의 특별한 구현예에서, VEGF 길항제는 항체 베바시주맙 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 이들은 하기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 각각을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL (서열번호:77); 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (서열번호:82). 베바시주맙은 Avastin? (Genentech, S. San Francisco, CA) 하에서 시판되고 또한 US 특허 번호 6,054,297에서 기재되었다.
어떤 구현예에서, VEGF 길항제는 모 항-VEGF 항체의 변이체 (상기 모 항체는 임의로 인간화된 또는 인간 항-VEGF 항체임)이고, 여기서 상기 변이체는 인간 VEGF에 결합하고 모 항-VEGF 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 초가변 영역에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 구현예에서, 변이체는 항-VEGF 항체의 1 이상의 초가변 영역(들)에서 1 이상 치환(들)을 갖는다. 더욱 특정한 구현예에서, 치환(들)은 모 항체의 중쇄 가변 도메인에 존재한다. 예를 들면, 아미노산 치환(들)은 중쇄 가변 도메인의 CDRH1 또는 CDRH3에서 있을 수 있거나, 이들 초가변 영역 둘 모두에서의 치환일 수 있다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 "친화성 성숙된" 변이체는 산출된 모 항-VEGF 항체보다 더 강하게 인간 VEGF에 결합하고, 즉, 유의미하게 모 항- VEGF 항체 미만인 Kd 값을 갖는다. 어떤 구현예에서, 변이체는 모 항-VEGF 항체보다 적어도 약 10 배 미만, 적어도 약 20 배 미만, 또는 적어도 약 50 배 미만인 시험관내 내피 세포의 VEGF-유도된 증식을 억제하기 위해 ED50 값을 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 아미노산 서열: GYDFTHYGMN (서열번호:83)을 포함하는 CDRH1 및 아미노산 서열: YPYYYGTSHWYFDV (서열번호:84)을 포함하는 CDRH3을 갖는다. 이들 초가변 영역 및 CDRH2는 인간 프레임워크 영역에서 제공될 수 있고, 예를 들면, 이로써 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 낳는다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL (서열번호:77). 그와 같은 중쇄 가변 도메인 서열은 하기 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 도메인을 포함하는 경쇄 가변 도메인과 임의로 조합된다: DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (서열번호:82).
일 구현예에서, VEGF 길항제는 항체 단편 라니비주맙 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 이들은 하기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 각각을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL (서열번호:77); 및 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (서열번호:82). 라니비주맙은 상표명 Lucentis? 하에서 시판되고, 여기서, 그것은 유리체내 투여를 위해 제형되고 (Genentech, S. San Francisco, CA), 또한 US 특허 번호 7,060,269에서 기재되어 있다.
또 하나의 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF-Trap™ 예컨대 아플리버셉트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다 (참고 Do 등 (2009) Br J Ophthalmol. 93: 144-9, 이것은 그 전체가 참고로 편입되어 있음). 아플리버셉트는 명칭 VEGF-Trap-Eye™으로 또한 공지되어 있고 상표명 Eylea™(Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, NY) 하에서 시판되고 있다. 특정한 구현예에서, VEGF-Trap™은 2 개의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 이량체 융합 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 융합 폴리펩타이드는 제 1 VEGF 수용체 인간 Flt1의 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 2 및 제 2 VEGF 수용체 인간 Flk1 ot 인간 Flt4의 Ig 도메인 3으로 구성된 VEGF 수용체 성분을 포함한다. 아플리버셉트는 VEGF 수용체 1 도메인 2 및 VEGF 수용체 2 도메인 3에 융합된 IgG의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질이고, 이 단백질은 VEGF-A 및 태반 성장 인자 (PlGF) 둘 모두에 결합한다. 아플리버셉트는 97 킬로달톤 (kDa)의 단백질 분자량을 갖는 이량체 당단백질이고 총 분자량의 추가의 15%를 구성하는 당화를 함유하고, 이로써 총 분자량이 115 kDa이 된다. 아플리버셉트을 포함하는 설명적인 VEGF-Traps, 및 그것을 생산하는 방법은 US 특허 번호 7,306,799, 7,531,173, 7,608,261, 7,070,959, 7,374,757, 및 7,374,758에서 기재되어 있다. 특정한 구현예에서, VEGF-Trap™은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 폴리펩타이드이다: MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호:85).
조성물
본 발명은 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 안과적 질환을 치료 또는 예방하는데 유용한 것을 포함하는, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제에 대한, 또는 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 둘 모두에 대한 안정성을 제공한다. 어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 부정적으로 VEGF 길항제의 활성에 영향을 주지 않는다. 어떤 구현예에서, VEGF 길항제는 부정적으로 항-PDGF 압타머의 활성에 영향을 주지 않는다. 어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 VEGF 길항제의 활성을 향상시킨다. 어떤 구현예에서, VEGF 길항제는 항-PDGF 압타머의 활성을 향상시킨다. 어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 통계적 유의도 내에서 부정적으로 VEGF 길항제의 활성에 영향을 주지 않는다. 어떤 구현예에서, VEGF 길항제는 통계적 유의도 내에서 부정적으로 항-PDGF 압타머의 활성에 영향을 주지 않는다. 어떤 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 통계적 유의도 내에서 VEGF 길항제의 활성을 향상시킨다. 다른 구현예에서, VEGF 길항제는 통계적 유의도 내에서 항-PDGF 압타머의 활성을 향상시킨다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 하나 이상의 항-PDGF 압타머는 압타머 길항제 A 또는 그의 변형된 형태이다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 하나 이상의 VEGF 길항제는 라니비주맙, 베바시주맙, 및 아플리버셉트 중 하나 이상이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (i) 길항제 A (또는 그의 변형된 형태) 및 라니비주맙; (ii) 길항제 A (또는 그의 변형된 형태) 및 베바시주맙; 또는 (iii) 길항제 A (또는 그의 변형된 형태) 및 아플리버셉트. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제의 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제의 적어도 약 90%는, 본 조성물이 약 2.0 ℃ 내지 약 8.0 ℃의 온도에서 적어도 약 12 주 동안 보관될 때 화학적으로 안정하다.
본 발명의 조성물에 존재하는 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제의 상대적 농도는 이들 길항제의 강도 및 특이성, 및 그의 결합 표적의 유형 및 농도를 기반으로 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제는 조성물에서 실질적 동등 농도로 존재한다. 또 하나의 구현예에서, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제는 다른 것보다 실질적으로 초과인 농도로 존재하고, 예를 들면, 조성물 중 항-PDGF 압타머:VEGF 길항제 농도의 비는 약 1.5:1, 약 2:1, 약 2.5:1, 약 3:1, 약 4:1, 또는 약 5:1이거나, 또는 조성물 중 VEGF 길항제:항-PDGF 압타머 농도의 비는 약 1.5:1, 약 2:1, 약 2.5:1, 약 3:1, 약 4:1, 또는 약 5:1이다. 어떤 구현예에서, 조성물 중 항-PDGF 압타머:VEGF 길항제 농도의 비는 약 1:1 내지 약 5:1, 약 1.5:1 내지 약 5:1, 또는 약 2.0:1 내지 약 5:1의 범위이고; 다른 구현예에서, 조성물 중 VEGF 길항제:항-PDGF 압타머 농도의 비는 약 1:1 내지 약 5:1, 약 1.5:1 내지 약 5:1, 또는 약 2.0:1 내지 약 5:1의 범위이다. 달리 지적되지 않으면, 압타머의 농도는 단쇄 폴리에틸렌 글리콜을 임의로 포함할 수 있는 압타머의 핵산부의 분자량을 오로지 기준으로 한다. 핵산부가 단쇄 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 경우, 핵산부의 분자량은 모든 단쇄 폴리에틸렌 글리콜 잔기의 분자량을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 각각은 하기의 농도로 본 발명의 조성물에서 존재한다: 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 1 내지 약 150 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL. 일부 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 하기의 농도로 본 발명의 조성물에서 존재한다: 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 1 내지 약 150 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL. 일부 구현예에서, VEGF 길항제는 하기의 농도로 본 발명의 조성물에서 존재한다: 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 1 내지 약 150 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL. 일부 구현예에서, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 각각은 하기의 농도로 존재한다: 적어도 약 0.1 mg/mL, 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 2 mg/mL, 적어도 약 3 mg/mL, 적어도 약 4 mg/mL, 적어도 약 5 mg/mL, 적어도 약 6 mg/mL, 적어도 약 7 mg/mL, 적어도 약 8 mg/mL, 적어도 약 9 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 15 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 적어도 약 80 mg/mL, 적어도 약 90 mg/mL, 적어도 약 100 mg/mL, 적어도 약 120 mg/mL, 적어도 약 150 mg/mL 또는 적어도 약 200 mg/mL. 일부 구현예에서, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제 중 적어도 하나는 하기의 농도로 존재한다: 적어도 약 0.1 mg/mL, 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 2 mg/mL, 적어도 약 3 mg/mL, 적어도 약 4 mg/mL, 적어도 약 5 mg/mL, 적어도 약 6 mg/mL, 적어도 약 7 mg/mL, 적어도 약 8 mg/mL, 적어도 약 9 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 15 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 적어도 약 80 mg/mL, 적어도 약 90 mg/mL, 적어도 약 100 mg/mL, 적어도 약 120 mg/mL, 적어도 약 150 mg/mL 또는 적어도 약 200 mg/mL.
본 발명의 조성물은 또한, may 1 이상 부형제, 완충액 (즉, 완충액), 동결보호제, 긴장 조절제 (즉, 장성 조절제), 액체, 안정제, 계면활성제 (예를 들면, 비이온성 계면활성제), 동결건조보호제, 항산화제, 아미노산, pH-조정제 또는 보존제, 예컨대 본원에서 기재된 임의의 것들을 포함할 수 있다. 적당한 완충액은, 비제한적으로, 1염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 및 나트륨 아세테이트를 포함한다. 어떤 구현예에서, 완충액은 조성물의 pH를 원하는 pH로 또는 원하는 pH 범위 내로 조정할 수 있고/거나 조성물의 pH를 원하는 pH에서 또는 원하는 pH 범위 내에 달성 또는 유지할 수 있다. 적당한 비이온성 계면활성제는, 비제한적으로, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 예컨대 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 적당한 보존제는, 비제한적으로, 벤질 알코올을 포함한다. 적당한 긴장 조절제는, 비제한적으로 염화나트륨, 만니톨, 및 소르비톨을 포함한다. 적당한 동결건조보호제는, 비제한적으로, 수크로오스, 트레할로오스, 및 만니톨을 포함한다. 적당한 아미노산, 비제한적으로 글리신 및 히스티딘을 포함한다. 적당한 pH-조정제 (또는 원하는 pH 또는 pH 범위를 달성 또는 유지할 수 있는 제제)는, 비제한적으로, 염산, 아세트산, 및 나트륨 하이드록사이드. 일 구현예에서, pH-조정제 또는 제제 (또는 원하는 pH 또는 pH 범위를 달성 또는 유지할 수 있는 제제(들))은 약 3 내지 약 8, 약 4.0 내지 약 8.0, 약 4 내지 약 7, 약 5 내지 약 6, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 8, 또는 약 7 내지 약 7.5의 pH를 갖는 조성물을 제공하는데 효과적으로 양으로 존재한다. 조성물용 적당한 부형제는 또한 미국 특허 No 7,365,166에서 기재된 것을 포함하고, 이들의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (1) 항-PDGF 압타머; (2) VEGF 길항제; (3) 완충액; 임의로, (4) 장성 조절제; 및, 임의로, (5) 계면활성제. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (1) 항-PDGF 압타머; (2) VEGF 길항제; (3) 장성 조절제; 임의로, (4) 완충액; 및, 임의로, (5) 계면활성제. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (1) 항-PDGF 압타머; (2) VEGF 길항제; (3) 완충액; (4) 장성 조절제; 및, 임의로, (5) 계면활성제. 그와 같은 조성물의 특이한 구현예에서, 완충액은 아세테이트, 인산염, Tris 또는 히스티딘 완충액, 또는 그의 혼합물이고; 장성 조절제는 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨, 또는 트레할로오스, 또는 그의 혼합물이고; the 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 다양한 구현예에서, 항-PDGF 압타머는 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 농도로 본 발명의 조성물에서 존재하고; VEGF 길항제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 농도로 존재하고; 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재하고; 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM (염화나트륨), 약 1% 내지 약 10%(w/v) (소르비톨), 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) (트레할로오스)의 농도로 존재하고; 계면활성제는, 존재할 때, 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도 또는 약 0.001% 내지 약 0.05%의 농도로 존재한다.
본 발명의 조성물은, 하나의 유용한 측면에서, 비경구로(예를 들면, 근육내, 복강내, 정맥내, 안구내, 유리체내, 안구뒤, 결막하, 건주하 또는 피하 주사 또는 임플란트에 의해) 또는 전신으로 투여된다. 비경구 또는 전신 투여용 조성물은 멸균한 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 또는 유화액을 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들면, 물, 완충수, 염수 등이 사용될 수 있다. 다른 적합한 비히클의 예는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 하이드로겔, 수소첨가된 나프탈렌, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 그와 같은 조성물은 또한, 보존제, 습윤제, 완충제, 유화제, 또는 분산제와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 활성 성분의 방출을 제어하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물은 주사에 적합한 수용액의 형태이다. 일 구현예에서, 본 조성물은 항-PDGF 앱타머, VEGF 길항제, 완충액, pH-조정제(또는 원하는 pH 또는 pH 범위를 달성하거나 유지할 수 있는 제제), 및 주사용 물을 포함한다.
일부 예에서, 본 발명의 조성물은 또한, 예를 들면, 패치에 의해 또는 신생혈관 장애에 민감하거나 이에 의해 영향을 받은 상피 또는 눈과 같은 영역에 직접 적용함으로써, 또는 전리요법에 의해 국소로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 눈 안으로 유리체내 주사에 의해 뿐만 아니라 결막하 및 건주하 주사에 의해 안구내로 투여될 수 있다. 다른 투여 경로는 경공막, 안구뒤, 복강내, 근육내, 및 정맥내를 포함한다. 대안적으로, 조성물은 약물 전달 장치 또는 안구내 임플란트를 이용하여 투여될 수 있다. 안과 사용에 유용한 조성물은, 본원에 기술된 것을 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 약제학적 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제를 포함한다. 이들 부형제는, 예를 들면, 완충액, 불활성 희석제 또는 충전제(예를 들면, 수크로오스 및 소르비톨), 윤활제, 활제, 및 항접착제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소첨가된 식물성 오일, 또는 탈크)일 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물에 존재하는 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제 중 하나 이상에 대해 물리적 또는 화학적 안정성을 부여한다. 이들 구현예에서, 본 발명의 조성물은 물리적으로 또는 화학적으로 안정한 조성물이다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 조성물 내에 존재하는 항-PDGF 앱타머(들) 또는 VEGF 길항제(들)을 보관 동안 물리적으로 또는 화학적으로 안정하게 할 수 있다. 육안 검사, SDS-PAGE, IEF, (고압력) 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC), RFFIT, 카파/람다 ELISA를 포함하는, 첨부된 실시예에 기재된 것, 및 문헌[Reubsaet et al. (1998) J. Pharm. Biomed. Anal. 17(6-7): 955-78 and Wang (1999) Int. J. Pharm. 185(2): 129-88]에서 검토된 것에서 검토된 것을 포함하는, 항-PDGF 앱타머(들) 및 VEGF 길항제(들)의 안정성을 평가하는데 유용한 다양한 분석적 기술이 본 기술분야에서 이용가능하다. 첨부된 예에 기술된 방법들은 SE-HPLC, AEX-HPLC, 및 WCX-HPLC를 포함한다.
본 발명의 조성물에서 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제의 물리적 안정성은, 비제한적으로, 앱타머 또는 길항제의 물리적 온전성 상태를 측정하거나, 그것이 색상 또는 투명도의 육안 조사시에 응집, 침전 또는 변성의 어떤 신호를 나타내는지 여부를 결정하거나, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 시차주사열량계(DSC)를 수행함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 미세-유동 분석은, 예를 들면, 실시예 4에 기재된 바와 같은 조성물에서 육안으로 보이지 않는 입자의 존재 및 크기를 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제의 화학적 안정성은, 비제한적으로, 앱타머 또는 길항제의 화학적 온전성 상태를 측정하거나, 그것이 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형의 어떠한 신호를 나타내는지 여부를 결정함으로써 결정될 수 있다. 화학적 온전성은 앱타머 또는 길항제의 화학적으로 변이된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변이는, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE, HPLC를 갖는 크기 배제 크로마토그래피(LMW 및 HMW 종의 존재를 결정하기 위해) 또는 매트릭스-지원된 레이저 탈착 이온화/비과시간 질량 분광분석법(MALDI/TOF MS)을 이용하여 평가될 수 있는 크기 변형(예를 들면, 클리핑)을 포함할 수 있다. 그러한 측정을 하기 위한 적합한 시스템, 예를 들면, HPLC 시스템(Waters, Milford, Mass.) 및 양이온 교환-HPLC(변이체 및 모니터 표면 전하를 검출하는 CEX-HPLC)가 당해 기술에 공지되어 있다. 또한, 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제의 안정성을 측정하는데 유용한 첨부한 예에 기술된 방법들이 사용될 수 있다. 이들은 SE-HPLC, WCX-HPLC, 및 AEX-HPLC를 포함한다. 화학적 변이의 다른 유형은, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있는 전하 변이(예를 들면, 탈아미드화의 결과로서 발생함)를 포함한다. 산화는 본원에 개시된 방법 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있는 또 하나의 화학적 변형이다.
특정한 구현예에서, 만약 조성물에 존재하는 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제 중 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 색상 또는 투명도의 육안 검사시, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정된 바와 같이, 응집, 침전 또는 변성의 신호를 나타내지 않으면, 본 발명의 조성물은 물리적으로 안정하다. 특정한 구현예에서, 조성물에 존재하는 두 항-PDGF 앱타머(들) 및 VEGF 길항제(들) 중 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 색상 또는 투명도의 시각적 시험시, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정된 바와 같이, 응집, 침전 또는 변성의 신호를 나타내지 않으면, 조성물은 물리적으로 안정하다.
어떤 구현예에서, 물리적 안정성은 미세-유동 이미지화에 의해 측정될 수 있고, 여기서 검출된 더 큰 수의 입자 또는 더 큰 크기의 입자는 일반적으로 감소된 물리적 안정성과 관련된다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 그것의 입자가 예를 들면, 실시예 4에서 기재된 바와 같이 미세-유동 이미지화에 의해 측정되는 바대로 카운트되면, 물리적으로 안정하고, 예를 들면, 약 500,000 미만, 약 100,000 미만, 또는 약 50,000 미만 총 입자/mL이고, 여기서 입자는 동등 원형 직경을 0 μm 내지 약 100 μm의 범위, 또는 또 하나의 구현예에서, 0 μm 내지 약 25 μm의 범위로 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 입자가 미세-유동 이미지화에 의해 측정되는 바대로 카운트되면, 물리적으로 안정한 것으로 간주되고, 예를 들면, 약 100,000 미만, 약 50,000 미만, 약 20,000 미만, 약 10,000 미만, 약 5,000 미만, 약 2,500 미만, 약 1,000 미만, 또는 약 500 미만 입자/mL이고, 여기서 입자는 have 동등 원형 직경을 약 1 μm 내지 약 2 μm의 범위, 또는 또 하나의 구현예에서, 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위로 갖는다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물에 존재하는 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 신규 화학적 독립체의 형성을 유발하는 분해 또는 변형을 보여주지 않을 때, 화학적으로 안정하다.
특정한 구현예에서, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제는, 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 신규 화학적 독립체의 형성을 유발하지 않는 분해 또는 변형을 보여주지 않을 때, 화학적으로 안정하고. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물에 존재하는 항-PDGF 압타머(들) 및 VEGF 길항제(들) 둘 모두의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형을 보여주지 않을 때 화학적으로 안정하다. 어떤 구현예에서, 분해 또는 변형은 예를 들면, 화학적 결합 절단에 의해 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 것이다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 하기일 때 화학적으로 안정하다: 조성물 중 항-PDGF 압타머 또는 VEGF 길항제의 하나 이상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형을 보여주기 않을 때, 약 실온에서 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 적어도 14 일, 적어도 20 일, 적어도 30 일, 적어도 2 주, 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 16 주, 또는 적어도 24 주, 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 4 개월, 적어도 6 개월, 또는 적어도 약 1 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 2 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 3 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 4 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 5 년 동안; 또는 대안적으로 약 2.0 ℃ 내지 약 8.0 ℃의 온도에서 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 적어도 14 일, 적어도 20 일, 적어도 30 일, 적어도 30 일, 적어도 2 주, 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 16 주, 적어도 24 주, 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 4 개월, 적어도 6 개월, 또는 적어도 약 1 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 2 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 3 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 4 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 5 년 동안; 또는 대안적으로 약 5.0 ℃의 온도에서 적어도 2 주, 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 16 주, 적어도 24 주, 적어도 약 1 년, 또는 적어도 약 2 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 3 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 4 년 동안, 또는 대안적으로 적어도 약 5 년 동안 보관될 때. 특정한 구현예에서, 본 조성물은, 조성물에 존재하는 항-PDGF 압타머(들) 및 VEGF 길항제(들)이 화학적으로 안정할 때, 물리적으로 또는 화학적으로 안정하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 40 ℃에서 최대 또는 적어도 1 주, 최대 또는 적어도 2 주, 또는 최대 또는 적어도 1 개월 동안 안정한, 즉, 물리적으로 또는 화학적으로 안정하다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 약 -20 ℃에서 최대 또는 적어도 1 년, 또는 대안적으로 최대 또는 적어도 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 약 -80 ℃에서 최대 또는 적어도 1 년, 대안적으로 최대 또는 적어도 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년 동안 안정하다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 그의 입자가 예를 들면, 실시예 4에서 기재된 바와 같이미세-유동 이미지화에 의해 측정된 바대로 카운트되면 물리적으로 또는 화학적으로 안정하고, 예를 들면, 약 500,000 미만, 약 100,000 미만, 또는 약 50,000 미만의 총 입자/mL이고, 여기서 입자는 동등 원형 직경을 0 μm 내지 약 100 μm의 범위, 또는 또 하나의 구현예에서, 0 μm 내지 약 25 μm의 범위로 가지며; 또는 약 100,000 미만, 약 50,000 미만, 약 20,000 미만, 약 10,000 미만, 약 5,000 미만, 약 2,500 미만, 약 1,000 미만, 또는 약 500 미만 입자/mL이고, 여기서 입자는 약 5 ℃ 또는 약 30 ℃에서 약 4 시간 동안 보관된 후, 동등 원형 직경을 1 μm 내지 2 μm의 범위, 또는 또 하나의 구현예에서, 1 μm 내지 5 μm의 범위로 갖는다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 문헌[(788) Particulate Matter in Injections, Revised Bulletin, Official Ocotber 1, 2011, The United States Pharmacopeial Conventon]에 기술된 광 차폐 입자 계수시험에 의해 측정된 바와 같이, 입자가 > 약 10 μm의 직경을 갖는 경우 만약 보관 후 검출된 평균 입자수가 약 50 입자/mL을 초과하지 않으면 그리고 입자가 > 25 μm의 직경을 갖는 경우 5 입자/mL를 초과하지 않으면, 본 발명의 조성물은 물리적으로 또는 화학적으로 안정한 것으로 간주된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 이 시험은 입자의 크기 및 크기에 따른 입자의 수의 자동 결정을 가능하게 하는 광 차폐의 원리에 기초한 적합한 장치를 이용하여 수행된다. 상기 장치는 10 μm 내지 25 μm의 공지된 크기의 구형 입자의 분산을 이용하여 보정된다. 이들 표준 입자는 입자가 없는 물에서 분산된다. 분산 동안 입자의 응집을 피하기 위해 주의가 요구된다. 상기 시험은, 예를 들면, 층류 캐비닛에서, 외부 미립자 물질에 대한 노출을 제한하는 조건 하에서 수행된다. 막 필터를 제외하고, 사용된 유리그릇 및 여과 장비는 따뜻한 세제 용액으로 조심스레 세정하고 모든 미량의 세제를 제거하기 위해 충분한 양의 물로 세정한다. 사용 바로 전, 장비는 위부터 아래까지, 바깥 및 다음으로 안쪽을 입자가 없는 물로 세정한다. 특히, 제조물의 분획을 측정이 수행될 용기로 옮길 때, 측정될 샘플 내로 기포가 들어가지 않도록 주의한다. 환경이 시험에 적합한지, 유리그릇이 적절하게 세정되었는지, 그리고 사용될 물이 입자가 없는지를 확인하기 위해, 입자가 없는 물의 각각 5 mL의 5개의 샘플에서 미립자 물질을 즉시 하기와 같이 결정한다. 10 μm 이상의 입자의 수가 조합된 25 mL에 대해 25를 초과하는 경우, 시험을 위해 취한 예방조치가 충분하지 않다. 이후, 환경, 유리그릇, 및 물이 적합할 때까지 상기 준비 단계를 반복한다.
일단 환경, 유리그릇, 및 물이 시험에 적합하면, 시험 샘플에 대해 시험을 수행한다. 샘플의 용기를 20회 연속적으로 서서히 뒤집음으로써 샘플 내용물을 혼합한다. 필요한 경우, 용기의 밀봉 마개를 조심스럽게 제거한다. 상기 용기의 외부면을 입자가 없는 물을 분사하여 세정하고, 용기의 밀봉 마개를 제거하여 내용물의 어떤 오염을 피한다. 용기를 2분간 방치시키거나 초음파분해하는 것과 같은 적절한 수단에 의해 기포를 제거한다.
25 mL 이상의 부피의 거대 부피 샘플의 경우, 단일 단위를 시험한다. 25 mL 미만의 부피의 작은 부피 샘플의 경우, 10개 이상의 단위들의 내용물을 세정된 용기에서 합하여 25 mL 정도의 부피를 얻고, 적합한 수의 바이알의 내용물들을 혼합하고 생성된 혼합물을 입자가 없는 물 또는 입자가 없는 물이 적당하지 않을 때 적절한 입자가 없는 용매로 25 mL로 희석함으로써 시험액을 제조할 수 있다. 25 mL 이상의 부피를 갖는 작은 부피 비경구제는 개별적으로 시험될 수 있다. 분말은 입자가 없는 물 또는 입자가 없는 물이 적당하지 않을 때 적절한 입자가 없는 용매를 이용하여 재구성된다. 시험 샘플의 수는 통계적으로 유의미한 평가를 제공하기 위해 충분해야 한다. 거대 부피 샘플의 경우 또는 25 mL 이상의 용적을 갖는 작은 부피 샘플의 경우, 적절한 샘플링 계획을 이용하여 10개 미만의 단위들을 시험할 수 있다.
각각 5 mL 정도의 4개의 부분들을 각 샘플로부터 제거하고, 10 μm 또는 25 μm 이상의 입자 수를 계수한다. 첫 번째 부분에 대해 얻어진 결과는 무시하고, 조사될 제제에 대한 평균 입자수를 계산한다.
100 mL를 초과하는 공칭 부피를 갖는 용기 내의 샘플의 경우, 본원에 기재된 시험 1.A의 기준이 고려되어야 한다.
100 mL 이하의 공칭 부피를 갖는 용기 내의 샘플의 경우, 본원에 기재된 시험 1.B의 기준이 고려되어야 한다.
만약 평균 입자의 수가 시험 한계를 초과하면, 샘플은 현미경적 입자수 시험을 이용하여 시험되어야 한다.
시험 1.A. 입자가 10 μm 이상의 직경을 갖는 경우 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 mL 당 25를 초과하지 않으면, 또는 입자가 25 μm 이상의 직경을 갖는 경우 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 mL 당 3을 초과하지 않으면, 샘플은 시험 한계를 따른다.
시험 1.B. 입자가 10 μm 이상의 직경을 갖는 경우 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 용기 당 6000을 초과하지 않으면, 또는 입자가 25 μm 이상의 직경을 갖는 경우 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 mL 당 6000을 초과하지 않으면, 샘플은 시험 한계를 따른다.
특정한 구현예에서, 문헌[(788) Particulate Matter in Injections, Revised Bulletin, Official Ocotber 1, 2011, The United States Pharmacopeial Conventon]에 기술된 현미경 방법 입자 계수시험에 의해 측정된 바와 같이, 입자가 > 약 10 μm의 직경을 갖는 경우 만약 보관 후 검출된 평균 입자수가 약 50 입자/mL을 초과하지 않으면 그리고 입자가 > 25 μm의 직경을 갖는 경우 5 입자/mL를 초과하지 않으면, 그리고 입자가 > 50 μm의 직경을 갖는 경우 2 입자/mL을 초과하지 않으면, 조성물은 물리적으로 또는 화학적으로 안정한 것으로 간주된다.
현미경 입자 계수시험은 적합한 양안 현미경, 미립자 물질을 보유하기 위한 필터 어셈블리, 및 조사를 위한 막 필터를 이용하여 수행된다. 현미경은 100 ± 10 배율로 조정되며, 대물 마이크로미터로 보정된 안구 마이크로미터, 막 필터의 전체 여과 영역을 잡고 통과할 수 있는 기계대, 및 경사 조명 외에 에피스코프 조명을 제공하는 2개의 적당한 조명장치가 구비된다. 안구 마이크로미터는 원형 직경 계수선이며, 십자선에 의해 100 배율에서 10 μm 및 25 μm 직경의 사분면의 투명하고 검정색의 참조 원으로 분할된 거대 원으로 구성되어 있다. 그것은 국내 또는 국제 표준 협회에 의해 보증된 단계 마이크로미터를 이용하여 보정된다. ±2% 이내의 계수선의 선형 등급의 상대적 오차가 허용될 수 있다. 큰 원은 눈금판 시야(GFOV)로 명명된다. 2개의 조명장치가 사용된다. 하나는 현미경 내부에 있는 에피스코프 명시 조명장치이고, 다른 하나는 10° 내지 20°의 각도에서 반사된 경사 조명을 생성하기 위해 조정될 수 있는 외부의, 초점을 맞출 수 있는 보조 조명장치이다. 미립자 물질을 보유하기 위한 필터 어셈블리는 유리 또는 다른 적합한 물질로 구성된 필터 홀더로 이루어지며, 진공 공급원 및 적합한 막 필터가 구비된다. 막 필터는 적당한 크기이며, 검정 또는 진회색이고, 격자가 없거나 격자가 있으며, 1.0 μm 미만의 공칭 기공 크기이다.
상기 시험은, 예를 들면, 층류 캐비닛에서, 외부 미립자 물질에 대한 노출을 제한하는 조건 하에서 수행된다. 막 필터를 제외하고, 사용된 유리그릇 및 여과 어셈블리를 따뜻한 세제 용액으로 조심스레 세정하고 모든 미량의 세제를 제거하기 위해 충분한 양의 물로 세정한다. 사용 바로 전, 막 필터와 장비의 양쪽 면을 위부터 아래까지, 바깥 및 다음으로 안쪽을 입자가 없는 물로 세정한다.
환경이 시험에 적합한지, 유리그릇과 막 필터가 적절하게 세정되었는지, 그리고 사용될 물이 입자가 없는지를 확인하기 위해, 하기 시험을 수행한다: 입자가 없는 물의 50-mL 부피 중 미립자 물질을 즉시 하기와 같이 결정한다. 만약 10 μm 이상의 크기의 20개를 초과하는 입자들이 여과 영역 내에 존재하거나, 만약 25 μm 이상의 크기의 5개를 초과하는 입자들이 여과 영역 내에 존재하면, 시험을 위해 취한 예방조치가 충분하지 않다. 이후, 환경, 유리그릇, 막 필터, 및 물이 적합할 때까지 상기 준비 단계를 반복한다.
샘플의 용기를 20회 연속적으로 서서히 뒤집음으로써 샘플 내용물을 혼합한다. 필요한 경우, 용기의 밀봉 마개를 조심스럽게 제거한다. 상기 용기의 외부면을 입자가 없는 물을 분사하여 세정하고, 용기의 밀봉 마개를 제거하여 내용물의 어떤 오염을 피한다.
거대 부피 샘플의 경우, 단일 단위를 시험한다. 25 mL 미만의 부피의 작은 부피 샘플의 경우, 10개 이상의 샘플 용기의 내용물을 세정된 용기에서 합하고, 적합한 수의 바이알의 내용물들을 혼합하고 입자가 없는 물 또는 입자가 없는 물이 적당하지 않을 때 적절한 입자가 없는 용매로 25 mL로 희석함으로써 시험액을 제조할 수 있다. 25 mL 이상의 부피를 갖는 작은 부피 샘플들은 개별적으로 시험될 수 있다. 비경구용 분말은 입자가 없는 물 또는 입자가 없는 물이 적당하지 않을 때 적절한 입자가 없는 용매를 이용하여 재구성된다. 시험 샘플의 수는 통계적으로 유의미한 평가를 제공하기 위해 충분해야 한다. 거대 부피 샘플의 경우 또는 25 mL 이상의 용적을 갖는 작은 부피 샘플의 경우, 적절한 샘플링 계획을 이용하여 10개 미만의 단위들을 시험할 수 있다.
막 필터가 설치된 필터 홀더의 내부는 입자가 없는 물 몇 mL로 습윤된다. 용액 집단 또는 단일 샘플 용기의 총 부피를 여과 깔때기로 옮기고, 진공을 적용한다. 필요하면, 전체 용적이 여과될 때까지, 샘플의 일부를 단계적으로 첨가한다. 샘플의 마지막 첨가 후, 필터 홀더의 내벽을 입자가 없는 물을 분사하여 세정한다. 막 필터의 표면에 액체가 없을 때까지 진공을 유지시킨다. 막 필터를 페트리 디쉬에 넣고, 커버를 약간 열어 막 필터를 공기건조시킨다. 막 필터가 건조된 후, 페트리 디쉬를 현미경의 단에 놓고, 조명장치로부터 반사된 빛 하에 전체 막 필터를 스캐닝하고, 10 μm 이상의 입자의 수 및 25 μm 이상의 입자의 수를 계수한다. 대안적으로, 부분 막 필터 계수 및 계산에 의한 총 필터 계수의 결정이 수행될 수 있ㄷ다. 조사될 제제에 대한 평균 입자의 수가 결정된다.
원형 직경 계수선을 이용한 입자 크기산정 과정은 계수선 상에서 10 μm 및 25 μm 참조 원과 비교하여 입자의 상응하는 직경을 추정함으로써 수행된다. 그렇게 함으로써 입자는 시야의 계수선 내에 있는 이들의 초기 위치로부터 움직이지 않으며 비교용 참조 원 상에 겹쳐지지 않는다. 투명한 계수선 참조 원의 내부 직경은 희고 투명한 입자의 크기를 산정하는데 사용되는 반면, 어두운 입자는 검정 불투명한 계수선 참조 원의 외직경을 이용하여 크기가 산정된다.
막 필터 상에 얼룩 또는 변색의 외관을 갖는 비결정성, 반액체, 또는 형태적으로 또렷하지 않은 물질은 크기가 산정되지 않거나 계수되지 않는데, 왜냐하면 이들 물질은 표면 부조(Surface relief)를 거의 또는 전혀 나타내지 않고 젤라틴성 또는 필름-유사 외관을 나타내지 않기 때문이다. 그러한 경우에, 계산의 해석은 광 차폐 입자수 시험에 의해 용액의 샘플을 시험함으로써 도움을 받을 수 있다.
100 mL를 초과하는 공칭 부피를 갖는 용기 내의 샘플의 경우, 시험 2.A의 기준을 적용한다.
100 mL 이하의 공칭 부피를 갖는 용기 내의 샘플의 경우, 시험 2.B의 기준을 적용한다.
시험 2.A. 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 mL 당 12를 초과하지 않고, 입자가 10 μm 이상의 직경을 가지면, 또는 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 mL 당 2를 초과하지 않고 입자가 25 μm 이상의 직경을 가지면, 샘플은 시험 한계를 따른다.
시험 2.B. 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 용기 당 3000을 초과하지 않고, 입자가 10 μm 이상의 직경을 가지면, 또는 만약 시험된 샘플 용기 내에 존재하는 평균 입자의 수가 용기 당 300을 초과하지 않고 입자가 25 μm 이상의 직경을 가지면, 샘플은 시험 한계를 따른다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 형태이다.
길항제 A 및 라니비주맙 을 포함하는 조성물
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙을 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 (그것의 -R 그룹의 질량 미만의 길항제 A의 질량/ 조성물의 용적) 대 라니비주맙의 농도 (조성물의 질량/용적)의 비는 25.0 미만, 10.0 미만, 9.0 미만, 8.0 미만, 7.0 미만, 6.0 미만, 5.0 미만, 4.0 미만, 3.0 미만, 2.0 미만 또는 1.0 미만이다. 특정한 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 (그것의 -R 그룹의 질량 미만의 길항제 A의 질량/ 조성물의 용적) 대 라니비주맙의 농도 (조성물의 질량/용적)의 비는 25.0 이하, 또는 10.0 이하, 또는 9.0 이하, 또는 8.0 이하, 또는 7.0 이하, 또는 6.0 이하, 또는 5.0 이하, 또는 4.0 이하, 또는 3.0 이하, 또는 2.0 이하 또는 1.0 이하이다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 (그것의 -R 그룹의 질량 미만의 길항제 A의 질량/ 조성물의 용적) 대 라니비주맙의 농도 (조성물의 질량/용적)의 비는 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 5, 약 3 약 4, 또는 약 5의 범위이다.
길항제 A-R 그룹은 도 78a에서 묘사되어 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙을 포함하고, 본 조성물은 특정한 pH에서 활성제 둘 모두에 대해 안정하고 비경구 투여에 적당하다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 라니비주맙의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 라니비주맙은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 라니비주맙의 활성을 향상시킨다. 어떤 구현예에서, 라니비주맙은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성을 향상시킨다. 길항제 A 및 VEGF 길항제의 활성을 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있고 예를 들면, 실시예 3 및 6에서 기재된 바와 같이 PDGF의 발현 또는 VEGF 조절된 유전자 발현 각각에 대한 길항제 A 또는 VEGF 길항제의 효과를 측정하는 것을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 조성물은 장성 조절제, 계면활성제, 및 특정한 pH를 달성 또는 유지하는데 적당하거나 비경구 투여에 적당한 완충액 중 하나 이상을 포함한다. 적절한 완충액은 본원에서 기재된 것들 뿐만 아니라 당해기술에서 공지된 다른 것들, 예컨대, 굳 완충액, 예를 들면, MES를 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 100 mg/mL 이하, 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 24 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 라니비주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 또는 약 12 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 라니비주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 또는 약 12 mg/mL이고, 본 조성물 중 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 100 mg/mL 미만, 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 라니비주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 또는 약 12 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 라니비주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 24 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 3 mg/mL이고, 라니비주맙의 농도는 약 5 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 6 mg/mL이고, 라니비주맙의 농도는 약 10 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 15 mg/mL이고, 라니비주맙의 농도는 약 5 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 24 mg/mL이고, 라니비주맙의 농도는 약 8 mg/mL이다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙을 포함하는 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 소르비톨 또는 염화나트륨, 또는 그의 혼합물인 장성 조절제을 포함한다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제는 소르비톨이고, 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 6.0 또는 약 7.0이다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제는 염화나트륨, 및 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 8.0, 약 7.0, 또는 약 6.0이다. 어떤 구현예에서, 장성 조절제는 약 1% 내지 약 10 %(w/v), 또는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 약 4%(w/v), 약 5%(w/v), 약 6%(w/v), 약 7%(w/v), 약 8%(w/v), 약 9%(w/v), 또는 약 10%(w/v)의 소르비톨이다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 200 mM, 약 75 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM 약 140 mM 또는 약 150 mM 농도의 염화나트륨이다. 일 구현예에서, 장성 조절제는 약 130 mM 농도의 염화나트륨이다. 다른 구현예에서, 장성 조절제는 약 75 mM 또는 약 120 mM 농도의 염화나트륨이다. 장성 조절제 농도에 대해, "mM"는 조성물 리터 당 밀리몰의 장성 조절제을 의미한다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙 을 포함하는 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 조성물의 pH를 원하는 범위 내로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 히스티딘 (예를 들면, L-히스티딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염) 또는 인산염을 완충액, 예를 들면, 인산칼륨의 인산나트륨 (또는 둘 모두 히스티딘 및 인산염)로서 포함한다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 100 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 10 mM의 농도로 존재한다. 특정한 구현예에서, 완충된 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0이다. 일 구현예에서, 완충된 조성물은 has 약 5.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 2 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 10 mM 농도의 히스티딘을 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 하나의 특별한 구현예에서, 완충액은 약 10 mM 농도의 히스티딘을 포함하고 히스티딘-완충된 조성물의 pH는 약 6.0이다. 완충액 농도에 대해, "mM"는 조성물의 리터 당 밀리몰의 완충액 (예를 들면, 히스티딘)를 의미한다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙 을 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 완충액은 인산염을, 단독으로 또는 히스티딘과 조합하여 포함한다. 인산염 완충액은 may be, 예를 들면, 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액일 수 있다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 2 mM 내지 약 200 mM, 약 2 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 25 mM, 또는 약 50 mM 농도의 인산염을 포함한다. 특정한 구현예에서, 완충된 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 6.0, 약 7.0, 또는 약 8.0이다. 일 구현예에서, 완충액은 인산염을 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 6.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM, 약 8 mM, 약 10 mM, 약 25 mM, 또는 약 50 mM 농도의 인산염을 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 하나의 특별한 구현예에서, 완충액은 약 10 mM 농도의 인산염을 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 6.2의 pH를 갖는다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙 을 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 계면활성제를 포함한다. 특정한 구현예에서, 계면활성제는 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.002%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.005%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 또는 약 0.02%(w/v) 농도의 폴리소르베이트 20이다.
일 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 라니비주맙, 히스티딘, 및 NaCl을 포함한다. 본 조성물은 폴리소르베이트를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 버젼 및 라니비주맙을 포함하고; 길항제 A (또는 그의 변형된 형태)의 농도 대 라니비주맙의 농도의 비는 2 미만이고; 조성물은 추가로, 약 10 mM 내지 약 200 mM 농도의 염화나트륨, 약 1 mM 내지 약 100 mM 농도의 히스티딘, 및 약 0.005% 내지 약 0.05% 농도의 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.0이다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 라니비주맙, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염. 다른 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다: (c) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl. 추가 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 임의로 폴리소르베이트인 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제. 특정 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0이다. 추가 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 10 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 130 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 1.0 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 5.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염. 다른 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다: (c) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl. 추가 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 임의로 폴리소르베이트인 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제. 특정 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 5.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5이다. 추가 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 15 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 5 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 75 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5 또는 약 pH 6.0이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 약 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 20. 추가 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 24 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 8 mg/mL 라니비주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 2 mM L-히스티딘; 및 (d) 약 120 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5 또는 약 pH 6.0이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 약 0.002%(w/v) 폴리소르베이트 20.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염; (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 라니비주맙; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액; 및 (d) 장성 조절제. 특정한 구현예에서, 완충액은, 존재하는 경우, 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘 또는 약 1 mM 내지 약 20 mM 인산나트륨이고; 장성 조절제는, 존재하는 경우, 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스이다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘이고; 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl이고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0이다.
본 발명의 임의의 조성물은 또한, may 계면활성제, 예를 들면, 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 예는 표 1, 표 3 또는 표 8에서 기재된 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 표 1에 기재된 조성물을 포함하지만 폴리소르베이트는 없다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 농도로, 라니비주맙를 약 5 mg/mL의 농도로, 히스티딘을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM이 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 약 5 mg/mL 라니비주맙, 약 10 mM 인산나트륨, 약 5%(w/v) 소르비톨, 및 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 약 5 mg/mL 라니비주맙, 약 10 mM 인산나트륨, 약 130 mM NaCl, 및 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 약 5 mg/mL 라니비주맙, 약 5 mM 인산나트륨, 약 5 mM 히스티딘 HCl, 약 75 mM NaCl, 약 5%(w/v) 트레할로오스, 및 약 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.5이다.
어떤 구현예에서 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 3 mg/mL 내지 약 90 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태; (b) 약 1.0 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 라니비주맙; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액 조성물; 및 (d) 장성 조절제. 특정한 구현예에서, 완충액은, 존재하는 경우, 약 1 mM 내지 약 100 mM 인산나트륨 또는 약 1.0 mM 내지 약 10 mM 히스티딘.HCl을 포함하고; 장성 조절제는, 존재하는 경우, 약 0.5%(w/v) 내지 약 10%(w/v) 트레할로오스이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 15 mg/mL의 농도로, 라니비주맙을 약 5 mg/mL의 농도로, 히스티딘을 약 5 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 75 mM의 농도로 폴리소르베이트 20을 약 0.005%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.5이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 24 mg/mL의 농도로, 라니비주맙을 약 8 mg/mL의 농도로, 히스티딘을 약 2 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 120 mM의 농도로 폴리소르베이트 20을 약 0.002%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.5이다.
특정한 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙을 포함하는 조성물은 적어도 8 주 또는 적어도 12 주 동안 25 ℃에서 또는 적어도 12 주 또는 적어도 16 주 또는 적어도 24 주 동안 4 ℃에서 화학적으로 안정하다. 특정한 구현예에서, 각각의 길항제 A 및 라니비주맙의 적어도 80%는 이들 조건 중 적어도 하나 하에서 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형의 징후를 보여주지 않는다.
길항제 A 및 베바시주맙을 포함하는 조성물
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 길항제 A (또는 그의 변형된 형태)의 농도 (그것의 -R 그룹의 질량 미만의 길항제 A의 질량/ 조성물의 용적) 대 베바시주맙의 농도 (조성물의 질량/용적)의 비는 25.0 미만, 10.0 미만, 9.0 미만, 8.0 미만, 7.0 미만, 6.0 미만, 5.0 미만, 4.0 미만, 3.0 미만, 2.0 미만, 1.0, 또는 0.5 미만이다.
길항제 A-R 그룹은 도 78a에서 묘사되어 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하고, 본 조성물은 특정한 pH에서 활성제 둘 모두에서 안정하거나 비경구 투여에 적당하다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 베바시주맙의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 베바시주맙은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 베바시주맙의 활성을 향상시킨다. 어떤 구현예에서, 베바시주맙은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성을 향상시킨다. 길항제 A 및 VEGF 길항제의 활성을 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있고 예를 들면, 실시예 3 및 6에서 기재된 바와 같이 PDGF의 발현 또는 VEGF 조절된 유전자 발현 각각에 대한 길항제 A 또는 VEGF 길항제의 효과를 측정하는 것을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 조성물은 1 이상 장성 조절제, 계면활성제, 및 특정한 pH를 달성 또는 유지하는데 적당하거나 비경구 투여에 적당한 완충액을 포함한다. 적절한 완충액은 본원에서 기재된 것들 뿐만 아니라 당해기술에서 공지된 다른 것들, 예컨대, 굳 완충액, 예를 들면, MES를 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 조성물 중 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 베바시주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1.0 내지 약 25 mg/mL, 약 1.0 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 12.5 mg/mL, 약 25 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 베바시주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1.0 내지 약 25 mg/mL, 약 1.0 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 12.5 mg/mL, 약 25 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다.
어떤 구현예에서, 베바시주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1.0 내지 약 25 mg/mL, 약 1.0 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 12.5 mg/mL, 약 25 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 베바시주맙의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1.0 내지 약 25 mg/mL, 약 1.0 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 12.5 mg/mL, 약 25 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 3 mg/mL이고 베바시주맙의 농도는 약 12.5 mg/mL. 또 하나의 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 6 mg/mL, 및 베바시주맙의 농도는 약 25 mg/mL 또는 약 50 mg/mL이다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙 을 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 소르비톨, 염화나트륨 및 트레할로오스로부터 선택된 장성 조절제을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 조성물은 소르비톨 및 염화나트륨 둘 모두, 염화나트륨 및 트레할로오스 둘 모두, 또는 둘 모두 소르비톨 및 트레할로오스를 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물은 소르비톨을 포함하고, 조성물의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 특정한 구현예에서, 본 조성물은 염화나트륨을 포함하고, 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 트레할로오스를 포함하고, 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 약 1% 내지 약 10 %(w/v), 또는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 약 4%(w/v), 약 5%(w/v), 약 6%(w/v), 약 7%(w/v), 약 8%(w/v), 약 9%(w/v), 또는 약 10%(w/v)의 소르비톨을 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물은 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 200 mM, 약 75 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM 약 140 mM 또는 약 150 mM의 농도로 포함한다. 일 구현예에서, 본 조성물은 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 약 1% 내지 약 10 %(w/v), 또는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 약 4%(w/v), 약 5%(w/v), 약 6%(w/v), 약 7%(w/v), 약 8%(w/v), 약 9%(w/v), 또는 약 10%(w/v)의 트레할로오스를 포함한다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 조성물의 pH를 원하는 범위 내로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 아세테이트, 인산염, 및 Tris 중 하나 이상을 완충액으로서 포함한다. 어떤 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 포함한다. 인산염 완충액은 may be, 예를 들면, 인산나트륨 완충액 또는 인산칼륨 완충액일 수 있다. 특정한 구현예에서, 완충된 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 6.0, 약 7.0, 또는 약 8.0이다. 일 구현예에서, 완충액은 인산염을 포함하고, 완충된 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.0이다. 어떤 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 하나의 특별한 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 50 mM의 농도로 포함하고, 완충된 조성물은 약 6.0의 pH를 갖는다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 계면활성제를 포함한다. 특정한 구현예에서, 계면활성제는 약 0.005%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 또는 약 0.02%(w/v)의 농도의 폴리소르베이트 20이다.
일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하는 조성물은 길항제 A, 베바시주맙, 염화나트륨, 및 인산염을 포함한다. 본 조성물은 폴리소르베이트를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서: 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하고; 길항제 A (또는 그의 변형된 형태)의 농도 대 베바시주맙의 농도의 비는 1.5 미만, 1.2 미만 또는 1 미만이고; 본 조성물은 추가로, 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 인산염을 약 5 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 및 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)을 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.0이다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 베바시주맙, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; 및 (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 베바시주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염. 다른 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다: (c) 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산염 완충액; 및 (d) 약 10 mM NaCl 내지 약 200 mM NaCl. 다른 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 베바시주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산염 완충액, (예를 들면, 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산나트륨); 및 (d) 약 10 mM NaCl 내지 약 200 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0이다. 베바시주맙을 포함하는 조성물의 특정한 구현예에서, 본 조성물은 하기를 추가로 포함한다: (e) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제, which is 임의로 폴리소르베이트. 특정 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 50 mM 인산염 완충액; 및 (d) 약 130 mM NaCl, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0이다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 하기를 추가로 포함한다: (e) 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태; (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 베바시주맙; 및 하기 중 하나 또는 둘 모두: (c) pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액 조성물; 및 (d) 장성 조절제. 특정한 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산나트륨 또는 약 5 mM 내지 약 200 mM Tris.HCl이고; 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스이다. 어떤 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 200 mM 인산나트륨이고; 긴장 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl이고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 계면활성제, 예를 들면, 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 조성물의 예는 표 3에서 기재된 조성물, 뿐만 아니라 계면활성제가 없는 이들 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 농도로, 베바시주맙을 약 12.5 mg/mL의 농도로, 인산나트륨을 약 50 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙, 약 50 mM 인산나트륨, 약 5%(w/v) 소르비톨, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙, 약 50 mM 인산나트륨, 약 5%(w/v) 소르비톨, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙, 약 50 mM 인산나트륨, 약 150 mM NaCl, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙, 약 50 mM Tris.HCl, 약 130 mM NaCl, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 8.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 15 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙, 약 30 mM 인산나트륨, 약 75 mM NaCl, 약 3%(w/v) 트레할로오스, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.3이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 3 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태, 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 약 30 mM 인산나트륨, 약 75 mM NaCl, 약 3%(w/v) 트레할로오스, 및 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.3이다.
특정한 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 포함하는 조성물은 적어도 4 주 또는 적어도 8 주 동안 25 ℃에서 또는 적어도 12 주 또는 적어도 24 주 동안 4 ℃에서 화학적으로 안정하다. 특정한 구현예에서, 각각의 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙의 적어도 70%는 이들 조건 하에서 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형의 징후를 보여주지 않는다.
길항제 A 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물
어떤 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에 존재하는 길항제 A의 농도 (그것의 -R 그룹 질량 미만의 길항제 A의 질량 / 조성물의 용적) 대 아플리버셉트의 농도 (조성물의 질량/용적)의 비는 25.0 미만, 10.0 미만, 9.0 미만, 8.0 미만, 7.0 미만, 6.0 미만, 5.0 미만, 4.0 미만, 3.0 미만, 2.0 미만, 1.0 미만, 0.5 미만, 또는 0.25 미만이다.
길항제 A-R 그룹은 도 78a에서 묘사되어 있다.
특정한 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하고, 본 조성물은 특정한 pH에서 활성제 둘 모두에 대해 안정하고 비경구 투여에 적당하다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 아플리버셉트의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 아플리버셉트는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태는 아플리버셉트의 활성을 향상시킨다. 어떤 구현예에서, 아플리버셉트는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 활성을 향상시킨다. 길항제 A 및 VEGF 길항제의 활성을 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있고 , 예를 들면, 실시예 3 및 6에 기재된 바와 같이 PDGF의 발현 또는 VEGF 조절된 유전자 발현 각각에 대한 길항제 A 또는 VEGF 길항제의 효과를 측정하는 것을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 조성물은 1 이상의 장성 조절제, 계면활성제, 및 특정한 pH를 달성 또는 유지를 적당하거나 비경구 투여에 적당한 완충제를 포함한다. 적절한 완충액은 본원에서 기재된 것들 뿐만 아니라 당해기술에서 공지된 다른 것들, 예컨대, 굳(Good) 완충액, 예를 들면, MES을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 조성물 중 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이다. 어떤 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 아플리버셉트의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 아플리버셉트의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 50 mg/mL 미만, 약 40 mg/mL 미만, 약 30 mg/mL 미만, 약 25 mg/mL 미만, 약 20 mg/mL 미만, 약 15 mg/mL 미만, 약 10 mg/mL 미만, 또는 약 5 mg/mL 미만이다.
어떤 구현예에서, 아플리버셉트의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 0.3 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.3 내지 약 25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.3 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이다.
어떤 구현예에서, 아플리버셉트의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/ mL 내지 약 5 mg/mL이고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 1 mg/ mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A의 농도는 약 3 mg/mL이고, 아플리버셉트의 농도는 약 20 mg/mL이다. 일 구현예에서, 길항제 A의 농도는 약 6 mg/mL이고, 아플리버셉트의 농도는 약 40 mg/mL이다. 또 하나의 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도는 약 12 mg/mL이고, 아플리버셉트의 농도는 약 80 mg/mL이다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 소르비톨 및 염화나트륨으로부터 선택된 하나 이상의 장성 조절제(들)을 포함한다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제는 소르비톨을 포함하고, 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제 염화나트륨을 포함하고, 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 어떤 구현예에서, 장성 조절제는 약 1% 내지 약 10 %(w/v), 또는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 약 4%(w/v), 약 5%(w/v), 약 6%(w/v), 약 7%(w/v), 약 8%(w/v), 약 9%(w/v), 또는 약 10%(w/v)의 소르비톨을 포함한다. 특정한 구현예에서, 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 200 mM, 약 75 mM 내지 약 200 mM, 약 25 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM 약 140 mM 또는 약 150 Mm의 농도의 염화나트륨이다. 일 구현예에서, 장성 조절제는 약 40 mM 농도의 염화나트륨이다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, pH를 원하는 범위 내에서 달성 또는 유지할 수 있는 완충액을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 아세테이트, 인산염, 히스티딘 및 Tris 로부터 선택된 하나 이상의 완충액(들)을 포함한다. 어떤 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 25 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 포함한다. 어떤 구현예에서, 인산염 완충액은 인산나트륨 또는 인산칼륨. 특정한 구현예에서, 완충된 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 6.0, 약 7.0, 또는 약 8.0이다. 일 구현예에서, 완충액은 인산염을 포함하고, 완충된 조성물은 약 6.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 어떤 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 25 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 포함하고, 완충된 조성물은 has 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 하나의 특별한 구현예에서, 완충액은 인산염을 약 10 mM의 농도로 포함하고, 완충된 조성물은 약 6.2의 pH를 갖는다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 수크로오스를 포함한다. 특정한 구현예에서, 수크로오스는 약 0%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 또는 약 5%(w/v)의 농도로 조성물에서 존재한다.
길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물의 어떤 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 계면활성제를 포함한다. 특정한 구현예에서, 계면활성제는 약 0.005%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v), 약 0.03%(w/v), 또는 약 0.02%(w/v) 농도의 폴리소르베이트 20이다.
일 구현예에서, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 아플리버셉트, 염화나트륨, 및 인산염을 포함한다. 조성물은 추가로, may 폴리소르베이트 또는 수크로오스 (또는 둘 모두)을 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 포함하고; 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 대 아플리버셉트의 농도의 비는는 1 미만이고; 본 조성물은 추가로, 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 인산염을 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로, 수크로오스를 약 0%(w/v) 내지 약 10%(w/v) 의 농도로, 및 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)을 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다.
어떤 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; 및 (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염. 특정한 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 하기 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다: (c) 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산염 완충액 (예를 들면, 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산나트륨); 및 (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl. 추가 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산염 완충액; (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl; 및 (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0이다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (f) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 폴리소르베이트. 하나의 특별한 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 6 mg/mL 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (b) 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염; (c) 약 10 mM 인산염 완충액; (d) 약 40 mM NaCl; 및 (e) 약 5%(w/v) 수크로오스, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.2이다. 추가 구현예에서, 본 조성물은 추가로 하기를 포함한다: (f) 약 0.03%(w/v) 폴리소르베이트 20.
어떤 구현예에서 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태; (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트; 및 하기 중 1 이상: (c) pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충액 조성물; (d) 장성 조절제; 및 (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스. 특정한 구현예에서, 완충액은, 존재하는 경우, 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산염이고, 장성 조절제는, 존재하는 경우, 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl이다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A, 또는 그의 변형된 형태; (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트; (c) 약 5 mM 내지 약 50 mM 인산염; (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl; (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스; 및 (f) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0이다.
본 발명의 조성물은 또한 include 계면활성제가 없는 본원에서 기재된 임의의 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 농도로, 아플리버셉트를 약 40 mg/mL의 농도로, 인산염을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 40 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.03%(w/v) 의 농도로 포함하고, 본 조성물은 pH 약 6.2를 갖는다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 농도로, 아플리버셉트를 약 20 mg/mL의 농도로, 인산염을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 40 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.03%(w/v) 의 농도로 포함하고, 본 조성물은 pH 약 6.2를 갖는다.
특정한 구현예에서, 길항제 A 및 아플리버셉트를 포함하는 조성물은 적어도 4 주 또는 적어도 8 주 동안 25 ℃에서 또는 적어도 12 주 또는 적어도 24 주 동안 4 ℃에서 화학적으로 안정하다. 특정한 구현예에서, 길항제 둘 모두의 적어도 70%는 이들 조건 하에서 신규 화학적 독립체의 형성을 야기하는 분해 또는 변형의 징후를 보여주지 않는다.
본 발명의 조성물의 제조 방법
본원에서 기재된 것들을 포함하는 본 발명의 조성물은, 길항제 (예를 들면, 하나 이상의 항-PDGF 압타머 및 하나 이상의 VEGF 길항제) 및 효과적인 양의 완충액, 예를 들면, 히스티딘, 인산염, 아세테이트 또는 Tris 완충액을 혼합하고, 임의로 수득한 혼합물의 pH를 약 5.5 내지 약 8.0의 pH 및 본원에서 기재된 것 사이의 변화로 조정하는 것을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나 이루어진 방법으로 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 및 효과적인 양의 긴장 조절제를 혼합하는 것을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나 이루어진다. 특정한 측면에서, 긴장 조절제는 염화나트륨 또는 소르비톨.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 및 효과적인 양의 계면활성제를 혼합하는 것을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나 이루어진다. 특히 측면, 계면활성제는 폴리소르베이트, 예를 들면, Tween 20 또는 Tween 80이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제 및 효과적인 양의 안정제, 동결보호제, 또는 동결건조보호제를 혼합하는 것을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나 이루어진다. 안정제는 적어도 하나의 당, 아미노산, 폴리올, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 알부민 또는 염일 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 조성물은 본원에서 기재된 다양한 조성물에서 및 본원에서 기재된 농도의 범위로 존재하는 다양한 부형제 및 항-PDGF 압타머 및 VEGF 길항제를 혼합하여 제조되고, 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 베바시주맙, 라니비주맙, 또는 아플리버셉트와 함께 포함하는 상기 기재된 각각의 특이적 조성물을 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 최종 농도로, 베바시주맙을 약 12.5 mg/mL의 최종 농도로, 인산염을 약 50 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 최종 농도로, 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 최종 농도로. 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 최종 농도로, 베바시주맙을 약 25 mg/mL의 최종 농도로, 인산염을 약 50 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 최종 농도로, 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 최종 농도로. 어떤 구현예에서, 조성물의 pH는 조정된 내지 약 6.0이다.
또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 최종 농도로, 라니비주맙을 약 5 mg/mL의 최종 농도로, 히스티딘을 약 10 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 최종 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 최종 농도로. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 최종 농도로, 라니비주맙을 약 10 mg/mL의 최종 농도로, 히스티딘을 약 10 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 최종 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 최종 농도로. 어떤 구현예에서, 조성물의 pH는 조정된 내지 약 6.0이다.
또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 최종 농도로, 아플리버셉트를 약 40 mg/mL의 최종 농도로, 인산염을 약 10 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 40 mM의 최종 농도로, 수크로오스를 약 5%(w/v)의 최종 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.03%(w/v)의 최종 농도로. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 하기를 혼합하여 제조된다: 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 최종 농도로, 아플리버셉트를 약 20 mg/mL의 최종 농도로, 인산염을 약 10 mM의 최종 농도로, 염화나트륨을 약 40 mM의 최종 농도로, 수크로오스를 약 5%(w/v)의 최종 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.03%(w/v)의 최종 농도로. 어떤 구현예에서, 조성물의 pH는 약 6.2로 조정된다.
어떤 구현예에서, 본 조성물은 유리 바이알 또는 주사기에서 혼합되거나 유리 생존가능 또는 주사기에서 혼합한 후 보관된다.
안과 질환을 치료 또는 예방하는 방법
본 발명의 조성물은 다양한 안과적 질환을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 안과적 질환은 신생혈관 장애이다. 다른 구현예에서, 안과적 질환은 망막 부종을 야기한다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 설명적인 안과적 질환은 본원에서 기재되어 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 필요한 포유동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 안과적 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에서 존재하는 항-PDGF 압타머는 길항제 A 또는 그의 변형된 형태이다. 특정한 구현예에서, 본 조성물에서 존재하는 VEGF 길항제는 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 아플리버셉트이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 존재하는 치료제는 효과적인 양의 하기를 포함한다: (i) 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙; (ii) 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙; 또는 (iii) 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 라니비주맙, 히스티딘, 및 염화나트륨. 본 조성물은 폴리소르베이트를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 라니비주맙을 2 미만의 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 대 베바시주맙의 농도의 비로, 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 히스티딘을 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로, 및 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)을 약 0.005% 내지 약 0.05% 또는 0.001% 내지 약 0.05%의 농도에서 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 농도로, 라니비주맙을 약 5 mg/mL의 농도로, 히스티딘을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다. 추가 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 농도로, 라니비주맙을 약 10 mg/mL의 농도로, 히스티딘을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태, 베바시주맙, 염화나트륨, 인산염, 및 폴리소르베이트를 포함한다. 본 조성물은 폴리소르베이트를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 베바시주맙을 1 미만의 길항제 A 또는 그의 변형된 형태의 농도 대 베바시주맙의 농도의 비로, 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 인산염을 약 5 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 및 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)을 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 7.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 3 mg/mL의 농도로, 베바시주맙을 약 12.5 mg/mL의 농도로, 인산염을 약 50 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 농도로, 베바시주맙을 약 25 mg/mL의 농도로, 인산염을 약 50 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 130 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.02%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트, 염화나트륨, 및 인산염을 포함한다. 본 조성물은 추가로, 폴리소르베이트 또는 수크로오스 (또는 둘 모두)를 포함할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태 및 아플리버셉트를 1 미만의 길항제 A의 농도 대 아플리버셉트의 농도의 비로, 염화나트륨을 약 10 mM 내지 약 200 mM의 농도로, 인산염을 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로, 수크로오스를 약 0%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 농도로, 및 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)을 약 0.005% 내지 약 0.05%의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 6.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 길항제 A 또는 그의 변형된 형태를 약 6 mg/mL의 농도로, 아플리버셉트를 약 40 mg/mL의 농도로, 인산염을 약 10 mM의 농도로, 염화나트륨을 약 40 mM의 농도로 및 폴리소르베이트 20을 약 0.03%(w/v)의 농도로 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 6.2의 pH를 갖는다.
안과적 질환
어떤 구현예에서, 안과적 질환은 노인성 황반 변성이다. 노인성 황반 변성의 예는 비신생혈관("건성"으로도 공지됨) 및 신생혈관("습성"으로도 공지됨) 황반 변성이다. 일 구현예에서, 건성 노인성 황반 변성은 결정강의 형성과 연관된다. 일부 구현예에서, 건성 황반 변성을 치료하거나 예방하는 것은 망막 색소 상피의 비정상을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다. 망막 색소 상피의 이상의 예는 지리학상 위축증, 비-지리학상 위축증, 초점 저색소침착, 및 초점 과색소침착을 포함한다. 일부 구현예에서, 습성 노인성 황반 변성을 치료하거나 예방하는 것은 맥락막 신생혈관형성 또는 색소 상피 탈착을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 안과적 질환은 결절 맥락막 맥관병증이다. 결절 맥락막 맥관병증은 동맥류 벌쥐(aneurysmal bulge) 또는 표면상의 돌출(outward projection)로 끝나는 외부혈관의 내부 맥락막 혈관 네트워크로부터의 병변을 특징으로 한다(Ciardella et al (2004) Surv Ophthalmol 49 25-37).
어떤 구현예에서, 안과적 질환은 맥락막 신생혈관형성과 연관된 병태이다. 맥락막 신생혈관형성과 연관된 병태의 예는 퇴행성, 염증성, 외상성 또는 특발성 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 맥락막 신생혈관형성과 연관된 퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 유전변성 장애를 치료하거나 예방하는 것을 포함한다. 유전변성 장애의 예는 난황상 황반 이영양증, 황반 안저 및 시신경 두부 결정강을 포함한다. 맥락막 신생혈관형성과 연관된 퇴행성 병태의 예는 근시 퇴화 또는 혈관양선조를 포함한다. 다른 구현예에서, 맥락막 신생혈관형성과 연관된 염증성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 안구 히스토플라마증 증후군, 다중초점 맥락막염, 사행상 맥락막염, 톡소플라스마증, 톡소카라증, 풍진, 포크트-고야나기-하라다 증후군, 베체트 증후군 또는 교감성 안염을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 맥락막 신생혈관형성과 연관된 외상성 장애를 치료하거나 예방하는 것은 강렬한 광응고에 의해 야기된 맥락막 파열 또는 외상성 병태를 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 안과적 질환은 고혈압 망막증 또는 겸상 적혈구 망막증이다.
일 구현예에서, 안과적 질환은 당뇨병성 망막병증이다. 당뇨병성 망막병증은 비증식성 또는 증식성 당뇨병성 망막병증일 수 있다. 비증식성 당뇨병성 망막병증의 예는 황반 부종 및 황반 허혈을 포함한다.
특정한 구현예에서, 안과적 질환은 주변 망막 신생혈관형성과 연관된 병태이다. 주변 망막 신생혈관형성과 연관된 병태의 예는 허혈성 혈관 질환, 가능한 허혈을 갖는 염증성 질환, 색소 실조증, 색소성 망막염, 망막층간분리 또는 만성 망막 탈착을 포함한다. 허혈성 혈관 질환의 예는 증식성 당뇨병성 망막병증, 분지 망막 정맥 폐색, 분지 망막 세동맥 폐색, 경동맥 해면 정맥동루, 겸상세포생성 이상혈색소증, 비-겸상세포생성 이상혈색소증, IRVAN 증후군(특발성 망막 혈관염, 동맥류, 및 신경망막염을 특징으로 하는 망막 맥관염 장애), 망막 색전, 미숙아 망막증, 가족성 삼출성 초자체망막병증, 과다점성 증후군, 대동맥활 증후군 또는 이일즈 병을 포함한다. 겸상세포생성 이상혈색소증의 예는 SS 이상혈색소증 및 SC 이상혈색소증을 포함한다. 비-겸상세포생성 이상혈색소증의 예는 AC 이상혈색소증 및 AS 이상혈색소증을 포함한다. 과다점성 증후군의 예는 백혈병, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 적혈구증가증 또는 골수증식성 장애를 포함한다.
일부 구현예에서, 가능한 허혈을 갖는 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 것은 전신 질환과 연관된 망막 혈관염, 감염원과 연관된 망막 혈관염, 포도막염 또는 버드샷 망막증을 치료하거나 예방하는 것을 포함한다. 전신 질환의 예는 전신 홍반성 낭창, 베체트 질환, 염증성 장질환, 유육종증, 다발성 경화증, 베게너 육아종증 및 다발동맥염 결절성을 포함한다. 감염원의 예는 매독, 결핵, 라임병 또는 고양이 발톱 질환에 대한 원인 인자인 세균제, 헤르페스바이러스와 같은 바이러스, 또는 톡소카라 카니스 또는 톡소플라스마 곤디이와 같은 기생충을 포함한다. 포도막염의 예는 평면부염 또는 후치스 포도막염 증후군을 포함한다.
어떤 구현예에서, 안과적 질환은 미숙아 망막증이다. 미숙아 망막증은 망막을 발전시키는 것을 지지하는 혈관상에서의 혈관의 비정상 성장으로부터 야기될 수 있다(Pollan C (2009) Neonatal Netw. 28:93-101).
다른 구현예에서, 안과적 질환은 정맥 폐쇄성 질환 또는 동맥 폐쇄성 질환이다. 정맥 폐쇄성 질환의 예는 분지 망막 정맥 폐색 및 중심 망막 정맥 폐색을 포함한다. 분지 망막 정맥 폐색은 혈액의 망막을 빼내는 순환의 일부의 봉쇄일 수 있다. 봉쇄는 모세혈관에서의 백업 압력을 야기할 수 있으며, 이는 혈액의 유체 및 다른 구성요소의 출혈 및 또한 누출을 야기할 수 있다. 동맥 폐쇄성 질환의 예는 분지 망막 동맥 폐색, 중심 망막 동맥 폐색 또는 안구 허혈성 증후군을 포함한다. 분지 망막 동맥 폐색(BRAO)은 망막에의 동맥 공급의 분지 중 하나가 폐색될 때 일어날 수 있다.
특정한 구현예에서, 안과적 질환은 중심 장액성 맥락망막병증(CSC)이다. 일 구현예에서, CSC는 중심 황반에서 유체의 누출을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 안과적 질환은 포낭 황반 부종(CME)이다. 어떤 구현예에서, CME는 중심 망막 또는 황반에 영향을 미친다. 또 하나의 구현예에서, CME는 백내장 수술 후 발생한다.
다른 구현예에서, 안과적 질환은 망막 모세혈관확장증이다. 일 구현예에서, 망막 모세혈관확장증은 망막 혈관의 팽창 및 비틀림 및 다중 동맥류의 형성을 특징으로 한다. 특발성 JXT, 레버 좁쌀 동맥류, 및 코우츠병이 망막 모세혈관확장증의 3가지 유형이다.
일 구현예에서, 안과적 질환은 동맥 대혈관류이다.
일 구현예에서, 안과적 질환은 망막 혈관종증이다. 일 구현예에서, 망막 혈관종증은 안구 혈관들이 다중 혈관종을 형성할 때 발생한다.
일 구현예에서, 안과적 질환은 방사선-유도된 망막증(RIRP)이다. 일 구현예에서, RIRP는 황반 부종 및 비증식성 및 증식성 망막증과 같은 증상을 나타낼 수 있다.
어떤 구현예에서, 안과적 질환은 홍채 조홍이다. 일 구현예에서, 홍채 조홍은 신생혈관 녹내장의 형성을 야기한다. 또 하나의 구현예에서, 홍채 조홍은 당뇨병성 망막병증, 중심 망막 정맥 폐색, 안구 허혈성 증후군, 또는 만성 망막 탈착에 의해 야기된다.
어떤 구현예에서, 안과적 질환은 종양이다. 종양의 예는 눈꺼풀 종양, 결막 종양, 맥락막 종양, 홍채 종양, 시신경 종양, 망막 종양, 침윤성 안구내 종양 또는 궤도 종양을 포함한다. 눈꺼풀 종양의 예는 기저 세포 암종, 편평상피 암종, 피지 암종, 악성 흑색종, 모세혈관 혈관종, 땀샘낭종, 모반 또는 지루성 각화증을 포함한다. 결막 종양의 예는 결막 카포시 육종, 편평상피 암종, 결막의 상피내 신조직형성, 안구상 유피낭종, 결막의 림프종, 흑색종, 검열반, 또는 익상편을 포함한다. 맥락막 종양의 예는 맥락막 모반, 맥락막 혈관종, 전이성 맥락막 종양, 맥락막 골종, 맥락막 흑색종, 모양체 흑색종 또는 오타 모반을 포함한다. 홍채 종양의 예는 전측 포도막 전이, 홍채 낭종, 홍채 멜라닌세포종, 홍채 흑색종, 또는 홍채의 진주 낭종을 포함한다. 시신경 종양의 예는 시신경 멜라닌세포종, 시신경 덮개 수막종, 시신경에 영향을 미치는 맥락막 흑색종, 또는 시신경병증을 갖는 유두주위 전이를 포함한다. 망막 종양의 예는 망막 색소 상피(RPE) 비대, RPE 샘종, RPE 암종, 망막모세포종, RPE의 과오종, 또는 폰 히펠 혈관종을 포함한다. 침윤성 안구내 종양의 예는 만성 림프구성 백혈병, 침윤성 맥락막병증, 또는 안구내 림프종을 포함한다. 궤도 종양의 예는 눈물샘의 선양 낭성 암종, 궤도의 해면상 혈관종, 궤도의 림프관종, 안와 점액종, 궤도 의사종양, 궤도 횡문근육종, 소아기의 눈주위 혈관종, 또는 경화 궤도 의사종양을 포함한다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 또 하나의 요법과 함께 투여될 수 있으며 집, 의사의 사무실, 클리닉, 병원의 외래환자부, 또는 병원에서 제공될 수 있다. 투여의 지속시간은 치료되거나 예방될 안과적 질환의 유형, 포유동물의 연령 및 상태, 포유동물의 질환의 단계 및 유형, 및 포유동물이 치료에 반응하는 방법에 따라 좌우될 수 있다. 특정한 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 추가로, 안과적 질환으로 발전할 더 큰 위험성이 있는 포유동물(예를 들면, 당뇨 환자)은 증상의 개시를 억제하거나 지연시키는 치료를 받을 수 있다. 일 구현예에서, 본 방법 또는 조성물은, 치료제가 단독으로 사용될 때 이용되는 용량과 비교하여, 조성물에 존재하는 항-PDGF 앱타머(들) 및 VEGF 길항제(들) 중 하나 이상의 상대적으로 더 낮은 용량의 투여를 허용한다.
본 발명의 조성물의 투여는 안과적 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제의 양을 야기하는 임의의 적합한 수단에 의할 수 있다. 일 구현예에서, 본 조성물은 안과적 질환을 치료하거나 예방하는데 효과적인 양으로 투여된다.
투여된 조성물의 복용량은 병태의 중증도, 병태가 치료되거나 예방될지 여부, 치료될 사람의 연령, 체중, 및 건강을 포함하는 몇 가지 인자에 좌우될 수 있다. 추가로, 특정한 환자에 대한 게놈약학(치료제의 약력학적, 약동학적 또는 효능 프로파일에 대한 유전자형의 효과) 정보가 사용된 복용량에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 정확한 개별적인 복용량은 조성물 내에 존재하는 치료제의 특이적 조합, 투여 시간, 투여의 경로, 조성물의 특성, 배출 속도, 치료될 특정한 안과적 질환, 장애의 중증도, 및 장애의 해부적 위치를 포함하는, 다양한 인자에 따라 어느 정도 조정될 수 있다. 단일 복용량을 생산하기 위해 담체 물질과 혼합된 각각의 길항제의 양은 치료될 포유동물 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
비경구 주사에 의한 조성물의 투여를 위해, 각각의 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제의 복용량은 전형적으로 1일당 0.1 mg 내지 250 mg, 1일당 1 mg 내지 20 mg, 또는 1일당 3 mg 내지 5 mg이다. 주사는 매일 최대 4회 제공될 수 있다. 일반적으로, 비경구로 투여될 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제의 복용량은 전형적으로 1일당 0.1 mg 내지 1500 mg, 또는 1일당 0.5 mg 내지 10 mg, 또는 1일당 0.5 mg 내지 5 mg이다. 1일당 적어도 최대 3000 mg의 복용량이 투여될 수 있다.
예를 들면 유리체내로, 인간에게 안과적으로 투여될 때, 본 발명의 조성물 내에 존재하는 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제 각각의 복용량은 투여 당 눈 당 전형적으로 0.003 mg 내지 5.0 mg, 또는 투여 당 눈 당 0.03 mg 내지 3.0 mg, 또는 투여 당 눈 당 0.1 mg 내지 1.0 mg이다. 일 구현예에서, 본 조성물에서 하나 이상의 항-PDGF 앱타머의 복용량은 눈 당 0.03 mg, 0.3 mg, 1.5 mg 또는 3.0 mg이다. 또 하나의 구현예에서, 본 조성물에서 VEGF 길항제의 복용량은 눈 당 약 0.5 mg이다. 상기 복용량은 눈 당 투여된 0.01 mL 내지 0.2 mL, 또는 눈 당 투여된 0.03 mL 내지 0.15 mL, 또는 눈 당 투여된 0.05 mL 내지 0.10 mL의 범위일 수 있다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 항-PDGF 앱타머 길항제 A는 최대 100 μL까지 주사 용적으로 최대 30 mg/ml에서 유리체내로 전달된다.
본 발명의 조성물의 투여는 매일 1 내지 4회 또는 1개월 당 1 내지 4회 또는 1년 당 1 내지 6회 또는 2, 3, 4 또는 5년마다 1회일 수 있다. 투여는 1일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년의 지속시간 동안일 수 있으며, 심지어 환자의 인생 동안일 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 3개월 동안 1개월에 1회 수행된다. 만성, 장기간 투여는 많은 사례에서 명시될 것이다. 복용량은 단회 용량으로서 투여되거나 다중 용량으로 분할될 수 있다. 일반적으로, 원하는 복용량은, 몇 개월 또는 몇 년 이상의 더 긴 기간의 투여가 필요할 수도 있음에도 불구하고, 장기적인 기간, 보통 적어도 몇 주 또는 몇 개월 이상 동안 설정 간격으로 투여되어야 한다.
기존의 안과적 질환을 치료하는 것 외에, 조성물은 이들 장애의 개시를 예방하거나 늦추기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 예방적 적용에서, 본 조성물은 특정한 안과적 질환에 민감하거나 또는 상기 질환의 위험성에 있는 포유동물에게 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 전형적으로 주사가능 약제학적 조성물의 형태로, 이의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다. 상기 투여는 주사에 의해, 예를 들면 안구내 주사에 의해, 또는 약물 전달 장치를 이용하여 이뤄질 수 있다. 비경구, 전신, 또는 경피 투여는 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
조성물은 제어 방출 조성물을 이용하여, 투여시 실질적으로 즉시 또는 투여 후 임의의 예정된 기간에 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제를 방출하도록 제형화될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 지속 방출 형태로 제공될 수 있다. 즉각적인 또는 지속 방출 조성물의 사용은 치료될 병태의 특성에 좌우된다. 예를 들면, 만약 병태가 급성 장애로 이루어지면, 연장된 방출 조성물보다 즉시 방출 형태를 이용한 치료가 사용될 수 있다. 어떤 예방 치료 또는 장기 치료의 경우, 지속 방출된 조성물이 또한 사용될 수 있다.
치료제의 방출 속도가 분해 또는 대사 속도보다 빠른 제어 방출을 달성하기 위해 많은 전략이 추구될 수 있다. 예를 들면, 제어 방출은, 예를 들면, 적절한 제어 방출 조성물 및 코팅을 포함하는, 조성물 파라미터 및 성분들의 적절한 선택에 의해 얻어질 수 있다. 예들은 오일 용액, 현탁액, 유화액, 마이크로캡슐, 마이크로구형체, 나노입자, 패치, 및 리포좀을 포함한다. 디포 제형은 또한, 예를 들면, 원위치에서 형성되는 마이크로입자, 이식물, 또는 고체 볼러스의 형태로 사용될 수 있다. 디포 제형은 약물 방출의 속도를 제어하고 약물 방출 동안 또는 약물 방출 후 재흡수하는 생분해성 폴리머 부형제를 포함할 수 있다. 생분해성 폴리머의 하나의 클래스는 락타이드/글리콜라이드 폴리머이다. 이들 재흡수가능한 폴리머는 생체적합성이며, 가수분해에 의해 처음에 락트산 및 글리콜산에 재흡수되고, 결국 이산화탄소 및 물에 재흡수되는 것으로 여겨진다.
본 발명의 조성물은 또한 임플란트와 같은 약물 전달 장치를 이용하여 전달될 수 있다. 그와 같은 이식물은 생분해성이거나 생체적합성일 수 있거나, 또는 비-생분해성일 수 있다. 이식물은 항-PDGF 앱타머 또는 VEGF 길항제에 대해 투과성일 수 있고 또는 생물침식에 의해 제제를 전달할 수 있다. 안과 약물 전달 장치는 눈의 챔버, 예컨대 전방 또는 후방 내로 삽입될 수 있거나 또는 공막, 맥락막 공강, 또는 유리체의 외부의 무혈관화된 영역 내에 또는 상에 이식될 수 있다. 일 구현예에서, 이식물은 원하는 치료 부위, 예를 들면, 안구내 공간 및 눈의 황반으로 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제의 경공막 확산을 허용하기 위해, 공막 상에서와 같이 무혈관 영역 위에 배치될 수 있다. 더욱이, 경공막 확산 부위는 황반에 가까운 부위와 같이, 신생혈관형성 부위에 가까울 수 있다. 적당한 약물 전달 장치는, 예를 들면, 이들 각각이 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는, 미국 공보 제2008/0286334호; 제 2008/0145406 호; 제 2007/0184089 호; 제 2006/0233860 호; 제 2005/0244500 호; 제 2005/0244471호; 및 제 2005/0244462 호, 및 미국 특허 제6,808,719 호 및 제5,322,691 호에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 이식물은 생분해성 폴리머 매트릭스 내에 분산된 본 발명의 조성물을 포함한다. 상기 매트릭스는 PLGA(폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체), 에스테르-말단 캡핑된 폴리머, 산 말단-캡핑된 폴리머, 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 이식물은 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제, 계면활성제, 및 친지질성 화합물을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 친지질성 화합물은 이식재의 약 80-99중량의 양으로 존재할 수 있다. 적합한 친지질성 화합물은, 비제한적으로, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 디에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 모노리놀레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 모노팔미테이트, 글리세릴 모노라우레이트, 글리세릴 디라우레이트, 글리세릴 모노미리스테이트, 글리세릴 디미리스테이트, 글리세릴 모노팔미테이트, 글리세릴 디팔미테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 디올레이트, 글리세릴 모노리놀레이트, 글리세릴 디리놀레이트, 글리세릴 모노아라키데이트, 글리세릴 디아라키데이트, 글리세릴 모노베헤네이트, 글리세릴 디베헤네이트, 및 그의 혼합물을 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 상기 이식물은 중공 슬리브 내에 보관된 본 발명의 조성물을 포함한다. 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물은 슬리브를 눈 안으로 삽입하고, 상기 슬리브로부터 이식물을 눈 안으로 방출시키고, 그 다음 눈으로부터 슬리브를 제거함으로써 눈에 전달된다. 이 전달 장치의 예는 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 미국 공보 제2005/0244462호에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 상기 이식물은 눈 안으로 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제의 조절된 지속 방출을 위해 적응된 가요성 안구 삽입 장치이다. 일 구현예에서, 상기 장치는 항-PDGF 앱타머 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 함유하는 막대 또는 튜브의 형태의 폴리머 물질의 신장된 몸체를 포함하고, 적어도 2개의 고착 돌출부는 상기 몸체로부터 방사상으로 밖으로 연장된다. 상기 장치는 적어도 8 mm의 길이를 가질 수 있고 돌출부을 포함하는 그것의 몸체부의 직경은 1.9 mm를 초과하지 않는다. 지속 방출 기전은, 예를 들면, 확산에 의해 또는 삼투 또는 생물침식에 의할 수 있다. 상기 삽입 장치는 뇌궁 해부학에 의해 눈의 움직임과 무관하도록 눈의 상부 또는 하부 뇌궁 내로 삽입될 수 있다. 상기 돌출부는, 예컨대, 갈비, 스크류 가닥, 옴폭 들어간 곳 또는 혹, 끝이 잘린 콘-형상화된 분절 또는 와인딩 장식용 수술 분절과 같은 다양한 형태일 수 있다. 추가 구현예에서, 몸체를 위한 폴리머 물질은 액체 환경에서 팽윤하는 것으로서 선택된다. 따라서 더 작은 초기 크기의 장치가 이용될 수 있다. 상기 삽입 장치는 상부 또는 하부 뇌궁 내로 삽입시, 제자리에 잘 유지되고 장기적인 사용 기간 동안 수령인에 의해 인지되지 않도록 시야 밖에 유지되기 위한 크기 및 배열일 수 있다. 상기 장치는 7 내지 14일 또는 더 긴 기간 동안 상부 또는 하부 뇌궁에 유지될 수 있다. 이 장치의 예가 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 미국 특허 제5,322,691호에 기재되어 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 또한 외식편, 예를 들면, 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있는 문헌[Pontes de Carvalho, R.A. et al ., Invest Ophthalmol Vis Sci . 2006, 47(1):4532-9]에 기재된 것과 같은 공막외 외식편과 같은 약물-전달 장치를 이용하여 전달될 수 있다. 그러한 외식편은 생분해성이거나 생체적합성일 수 있으며, 또는 비-생분해성일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 또한 보충가능한 안구내 디포와 같은 약물-전달 장치를 이용하여 전달될 수 있다.
복용은 일반적으로 치료될 병태의 중증도 및 반응성에 좌우되며, 치료 코스는 며칠 내지 몇 개월까지 지속되거나 치유가 달성되거나 질환 상태의 축소가 달성될 때까지 지속된다. 최적의 복용 계획은 몸에서 또는 국재화된 부위에서 약물 축적의 측정으로부터 또는 환자의 반응에 기초하여 계산될 수 있다. 숙련가는 복용량, 복용 방법론, 및 반복률을 최적화할 수 있다. 최적의 복용량은 항-PDGF 작용제 및 VEGF 길항제의 효능에 따라 달라질 수 있고, 또한 시험관내 및 생체내 동물 연구에서 EC50에 기초하여 추정될 수 있다.
실시예
실시예 1
길항제 A 및 라니비주맙을 포함하는 조성물의 안정성
다양한 조성물에서, Genentech(S. San Francisco, CA)사로부터 Lucentis?로서 시판되는, 길항제 A 및 라니비주맙의 조성물 안정성을 조건 범위 하에서 조사하였다. 다양한 pH(5.0-8.0) 및 장성 조절제(염화나트륨, 소르비톨, 및 트레할로오스)을 사용하여 다양한 보관 조건(4℃, 25℃, 및 37℃)에서 그리고 물리적 스트레스(진탕) 하에서 조성물 안정성을 최적화하였다. 길항제 A 및 라니비주맙의 조성물 안정성은 육안 관찰, pH 측정, 및 다양한 HPLC 방법(음이온 교환 [AEX-HPLC], 약한 양이온 교환 [WCX-HPLC], 및 크기 배제 [SE-HPLC])에 의해 규명하였다.
연구 16주 내내, 조성물 중에, pH 6.0의 10 mM L-히스티딘, 130 mM NaCl, 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20 중에 3 mg/mL의 길항제 A 및 5 mg/mL의 라니비주맙을 포함하는 조사된 조성물(F6)이 가장 안정하였고 길항제 A 및 라니비주맙의 분해에 대해 가장 큰 보호를 제공하였음이 결정되었다. 수행된 실험의 보다 상세한 설명이 본원에 제공되어 있다.
조성물 파라미터
하기 조성물 파라미터를 조사하였다:
(1) pH: 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 8.0
(2) 완충액: 아세테이트, 인산염, 히스티딘 및 2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-1,3-디올 ("Tris")
(3) 장성 조절제: 염화나트륨, 소르비톨, 및 트레할로오스
(4) 계면활성제: 폴리소르베이트 20 [0.01% 및 0.005%(% w/v)]
하기 파라미터를 고정시켰다:
(1) 충진 용적은 Ophthotech 사에 의해 제공된 변형된 3 cc 바이알에서 300 μL였다 (Mglas AG, Munnerstadt, Germany로부터 얻음)
(2) 라니비주맙의 농도는 5 mg/mL였다
(3) 길항제 A의 농도는 3 mg/mL로 고정되었다
하기 표 1은 본 연구에서 사용된 조성물 매트릭스를 요약한다.
표 1. 조성물 매트릭스
조성물 완충액 pH 장성 조절제 [ Ant . A] ( mg / mL ) [ ran .]
( mg / mL ) 		폴리소르베이트 20 (% w/v)
F1 10 mM 인산나트륨 7.3 150 mM NaCl 3 0 0%
F2 10 mM 나트륨 아세테이트 5.0 5%(w/v) 소르비톨 3 5 0.01%
F3 10 mM 나트륨 아세테이트 5.0 130 mM NaCl 3 5 0.01%
F4 10 mM 히스티딘.HCl 5.5 10%(w/v) 트레할로오스 0 5 0.01%
F5 10 mM 히스티딘.HCl 6.0 5%(w/v) 소르비톨 3 5 0.01%
F6 10 mM 히스티딘.HCl 6.0 130 mM NaCl 3 5 0.01%
F7 10 mM 인산나트륨 7.0 5%(w/v) 소르비톨 3 5 0.01%
F8 10 mM 인산나트륨 7.0 130 mM NaCl 3 5 0.01%
F9 10 mM Tris.HCl 8.0 5%(w/v) 소르비톨 3 5 0.01%
F10 10 mM Tris.HCl 8.0 130 mM NaCl 3 5 0.01%
F11 5 mM 인산나트륨 + 5 mM 히스티딘 6.5 75 mM NaCl
+ 5%(w/v) 트레할로오스		 3 5 0.005%
"Ant. A"는 길항제 A이고; "ran."은 라니비주맙이다.
샘플 제조
조성물에서 길항제 A의 3 mg/mL 농도를 얻기 위해, 길항제 A 스톡 용액을 10 mM 인산염, 150 mM NaCl, 및 pH 7.3 중에서 6 mg/mL로 제조하였다. 수득한 스톡 용액을 상업적 Lucentis?(10 mg/mL)의 희석된 형태와 1:1 혼합하여, 3 mg/mL 길항제 A 및 5 mg/mL 라니비주맙(F11)의 최종 농도를 야기하였다. 상기 조성물을 10 kDa 분자량 컷오프 투석 카세트에 넣고 표 1에 열거된 다양한 조성물 완충액에 대해 ~1,000,000-배 투석하였다(조성물 번호 F2-F3, F5-F10).
조성물 연구
(어떤 조성물은 초기에 분해되어 모든 시점에 시험되지 않았음에도 불구하고) 조성물을 하기 조건 하에서 시험하였다:
표 2. 시험 조건
조건 시점
4 ℃ 0, 2, 4, 8, 12, 및 16 주
25 ℃ 2, 4, 8, 및 12 주
37 ℃ 2, 4, 8, 및 12 주
진탕 4 시간
분석 방법
다양한 조성물에서 스트레스 하에 산출된 임의의 분해 생성물의 농도를 측정하기 위해, 하기 안정성-표시 검정을 사용하였다:
(1) SE - HPLC (길항제 A 및 라니비주맙 의 분석)
· 이동상: 50 mM 인산염 완충액, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: Tosoh TSKgel G3000SWXL 7.8 mm x 300 mm, 5 μm 입자
· 칼럼 온도: 주위
· 유속: 1.0 mL/분
· 파장: 신호, 280 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 5 μL
· 샘플 제조: 희석 없음
· 길항제 A 및 라니비주맙 둘 모두에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트를 기초하여 보고된 퍼센트 순도.
(2) WCX - HPLC (라니비주맙 의 분석)
· 이동상 A: 10 mM 인산염 완충액, pH 7.0
· 이동상 B: 10 mM 인산염 완충액, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: Dionex ProPac WCX-10, 4 x 250 mm
· 칼럼 온도: 주위
· 유속: 1.0 mL/분
· 파장: 신호, 214 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 5 μL
· 샘플 제조: 희석 없음
· 길항제 A 및 라니비주맙 둘 모두에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트를 기초하여 보고된 퍼센트 순도.
(3) AEX - HPLC (길항제 A의 분석)
· 이동상 A: 10 mM 인산염 완충액, pH 7.0
· 이동상 B: 10 mM 인산염 완충액, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: Dionex DNA Pac PA-100, 4 x 250 mm
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 1.2 mL/min
· 파장: 신호, 258 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 5 μL
· 샘플 제조: 희석 없음
· 길항제 A 및 라니비주맙 둘 모두에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트를 기초하여 보고된 퍼센트 순도.
(4) pH
· VWR symphony SB70P
(5) 시각적 관찰
· 소니 사이버샷 DSC-H9 디지털 스틸 카메라 (8.1 메가픽셀)로부터 사진 촬영됨
(6) 몰삼투압
· Advanced Instruments, Inc. The Advanced Osmometer Model 3D3
안정성 개요
다양한 길항제 A 및 라니비주맙 조성물에 대한 진탕(4시간) 및 다양한 보관 온도(4℃, 25℃, 및 37℃)의 효과를 분석하였다. 연구 내내, 시험된 모든 조성물은 모든 보관 및 스트레스 조건 내내, 그의 표적 pH 값, 즉, 적정된 초기 pH를 유지할 수 있었다.
안정성 지표 분석
조성물 F2는 2주 후 37℃에서 보관 동안 가시적임 침전을 나타내었다(데이터 도시되지 않음). 침전의 정량적 측정을 위한 다른 분석은 수행하지 않았다.
보관 동안 길항제 A의 분해를 AEX-HPLC에 의해 효과적으로 분석하였다(도 1). 샘플이 증가된 온도에서 배양될 때 전-피크 및 후-피크의 형성이 관찰되었다(도 1). 조성물 F2에서, 길항제 A의 AEX-HPLC 순도는 37℃에서 8주 동안 보관 동안 거의 20%까지 감소하였다.
WCX-HPLC는 보관 동안 라니비주맙의 분해를 규명하는데 효과적이었다(도 2). 라니비주맙이 증가된 온도에서 배양될 때 전-피크 및 후-피크 모두의 형성이 관찰되었다(도 2).
SE-HPLC 검정은 라니비주맙의 가용성 응집 또는 단편화를 규명하는데 유용하였다(도 3). 길항제 A는, 그것의 응집된 형태의 분해능이 Tosoh TSKgel G3000SWXL 칼럼의 능력을 넘을 수 있음에도 불구하고, SE-HPLC에 의한 유의미한 변화를 나타내지 않았다. 라니비주맙은 37℃에서 보관 동안 조성물 F3 및 조성물 F5에서 응집 또는 단편화를 겪었다(도 3).
안정성에 대한 진탕의 효과
표 1에 열거된 모든 조성물은 4시간의 교반을 겪었고, 교반되지 않은 대조군 조성물의 세트는 실온에서 방치되었다. 임의의 분석 방법 상에서 대조군 및 진탕된 샘플 사이에 차이가 나타나지 않았다(데이터 도시되지 않음).
안정성에 대한 보관 온도의 효과
37℃ 보관은 조사된 다양한 조성물에서 길항제 A 및 라니비주맙 모두의 현저하지만 다양한 수준의 분해를 생산하였다. 2주에, 조성물 F2는 침전을 나타내었다(데이터 도시되지 않음). 다른 모든 조성물들은 8주 내내, 그리고 몇몇 조성물(조성물 F1, F4, F6, F8, 및 F11)의 경우 12주까지 맑은 상태를 유지하였다.
37℃에서 2주 후, 조성물 F2에서의 길항제 A 순도는 AEX-HPLC에 기초하여 거의 20% 감소하였다. 조성물 F3 및 F5 또한 동일한 보관 조건 하에 4주 후 증가된 길항제 A 분해를 나타내었다(도 4). 8주에, 조성물 F8은 F6 및 F7보다 길항제 A에 대해 더 큰 보호를 제공하였다. 12주에, F8은 길항제 A의 더 높은 순도를 계속 나타내었다(도 4).
WCX-HPLC가 2주에 순도의 거의 20% 손실을 검출한 바와 같이, 조성물 F2는 또한 라니비주맙의 분해를 막을 수 없었다(도 5). 4주에, 많은 조성물(F3, F5, F7, F8, F9, 및 F10)은 F6과 비교하여 라니비주맙의 유의미한 분해를 나타내었다(도 5). 조성물 F6은 최대 12주 동안 라니비주맙의 가장 좋은 순도를 유지하였다(도 5).
라니비주맙의 원상태 형태에 대한 단일 피크를 나타낸, 4℃에서 2, 8, 및 12주의 결과에 기초하여, 모든 조성물은 SE-HPLC에 의해 최대 4주간 길항제 A 및 라니비주맙의 유사한 순도 프로파일을 나타내었다(도 14 및 도 15). 37℃에서의 12주 보관을 포함하는, 모든 보관 조건에서 길항제 A에 대해 유의미한 변화가 관찰되지 않았다(도 6). 그러나, 라니비주맙은 25℃ 및 37℃에서 보관 동안 응집을 겪었다. 동일한 보관 상태 하에 상업적 Lucentis?(F4)의 희석된 형태를 이용하여 유의미한 응집이 관찰되었다(도 7).
모든 조성물은 37℃보다 25℃에서 보관 동안 더 나은 시각적 안정성을 나타내었다. 8주 동안, 모든 조성물은 맑은 상태를 유지하였다. 2개의 조성물(F6 및 F8)은 추가의 12주 시점에서 맑은 상태를 유지하였다.
25℃에서 처음 4주 동안, 모든 조성물은 AEX-HPLC에 의해 규명된 바와 같이 대등한 길항제 A 순도를 유지하였다(도 8). 조성물 F2는 8주에 길항제 A 분해에서의 유의미한 증가를 겪었다(도 8). 또한, 조성물 F3 및 F5는 동일한 기간 동안 상당한 순도 감소를 나타내었다(도 8). 조성물 F6, F7, 및 F8은 최대 12주 동안 길항제 A의 순도를 유지할 수 있었다(도 8).
라니비주맙의 WCX-HPLC 분석은 조성물 사이에 순도 프로파일에서의 미묘하지만 독특한 변화를 나타내었다. 25℃에서 2주 보관 후, 조성물 F2는 라니비주맙의 상당한 분해를 생성하였다(도 9). pH 8.0 조성물(F9 및 F10)이 라니비주맙의 상당한 순도 감소를 나타내었을 때, 남아있는 조성물들은 8주까지 라니비주맙의 대등한 순도를 유지하였다(도 9). 조성물 F6은 WCX-HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같이 25℃에서 라니비주맙의 분해를 막을 수 있었다(도 9).
그것의 고유한 가변성 외에, SE-HPLC 검정은 25℃에서 보관 동안 길항제 A 프로파일의 유의미한 변화를 나타내지 않았다(도 10). 일반적으로, 모든 조성물은 8주간, 그리고 조성물 F6 및 F8의 경우 12주간 길항체 A의 응집 또는 단편화를 막는 것으로 나타났다(도 10). 조성물 F8 및 F6은 25℃에서 12주간 우수한 라니비주맙 순도를 유지하였다(도 11).
길항제 A 및 라니비주맙은 4℃에서 대부분의 조성물에서 안정한 상태를 유지하였다. 모든 조성물은 육안 검사에 의해 맑은 상태를 유지하였다. 더욱이, 상당한 양의 라니비주맙의 가용성 응집물을 생성한 F2, F3, 및 F5를 제외하고(도 15), 대부분의 조성물은 모든 HPLC 방법에 의한 개시 물질과 대등한 순도를 유지하였다(도 12-15).
안정성에 대한 조성물 특성/성분의 효과
pH 및 상이한 조성물 성분이 길항제 A 및 라니비주맙의 안정성에 미치는 효과를 결정하기 위해, 길항제 A 및 라니비주맙을 다양한 pH 수준(5.0 - 8.0)에서 그리고 상이한 장성 조절제(염화나트륨 및 소르비톨)을 이용하여 공제형화하였다. 본 섹션은 다양한 온도에서 보관할 때 길항제 A 및 라니비주맙 중 하나 또는 둘 모두의 안정성에 대한 pH 및 조성물 성분의 효과를 기술한다.
안정성에 대한 pH 의 효과
길항제 A 및 라니비주맙의 안정성에 대한 pH의 효과는 소르비톨-함유 및 NaCl 함유 조성물에서 37℃에서 보관에 의해 가장 잘 구분되었다(도 16). AEX-HPLC에 기초하여, 길항제 A의 분해는 pH와 역 상관관계가 있었고, pH 5.0에서 가장 크게 분해되었다(도 16). pH 변화는 소르비톨-함유 조성물에서 라니비주맙의 순도 프로파일에 대해 덜 유의미한 변화를 야기하였다. WCX-HPLC에 기초하여, pH 5.0에서 제형화는 37℃에서 4주 후 라니비주맙의 더 빠른 분해를 낳았지만, 37℃에서 8주 후 pH 6.0 조성물에 대해 유사한 분해를 낳았다(도 17). 라니비주맙은 NaCl-함유 조성물 중에서 pH 6.0에서 적게 분해된 반면, pH 7.0은 소르비톨-함유 조성물 중에서 가장 좋았다. 길항제 A(도 18) 및 라니비주맙(도 19)의 평가를 위해 SE-HPLC를 이용시, 라니비주맙의 응집 속도는 pH 7.0의 조성물에서 가장 느린 반면, 길항제 A 분해에 대해 변화는 관찰되지 않았다.
안정성에 대한 장성 조절제의 효과
길항제 A 및 라니비주맙의 안정성에 대한 장성 조절제의 효과는 37℃ 보관 결과를 비교함으로써 구분되었다. AEX-HPLC에 의해 규명된 바와 같이, 길항제 A는 8주간 pH 5.0-7.0에서 소르비톨 조성물보다 NaCl 조성물에서 더 안정한 상태를 유지하였다(도 20). pH 8.0에서, 4주간 염화나트륨 또는 소르비톨을 함유하는 조성물 사이에는 구별할 수 있는 차이가 없었다(도 21). WCX-HPLC에 의해 규명된 바와 같이, 라니비주맙 조성물의 경우, 염화나트륨 조성물은 시험된 pH 범위(pH 5.0-8.0)에서 소르비톨 조성물보다 우수하였다(도 22). 라니비주맙을 안정화시키는 염화나트륨 조성물의 우수한 성능은 또한 SE-HPLC에 의해 밝혀졌다(도 23). 두 장성 조절제을 갖는 조성물의 경우, 가용성 응집의 수준은 pH 7.0에서 가장 낮았고 pH 5.0에서 가장 높았다(도 23).
길항제 A 및 Lucentis ?의 1:1 혼합물의 안정성
연구의 또 하나의 측면은 길항제 A 및 상업적 Lucentis?의 혼합 효과를 규명하는 것을 포함하였다. 이를 달성하기 위해, 길항제 A를 10 mM 인산나트륨 및 150 mM NaCl, pH 7.3의 조성물에서 30 mg/mL의 그것의 원래 농도로부터 6 mg/mL로 희석한 다음, 얻어진 조성물을 같은 부피(1:1)의 상업적인 Lucentis?(10 mg/mL)와 조합하였다. 37℃에서 보관함으로써 상기 1:1 혼합물(F11)의 안정성을 조사하였고, 유사한 농도 및 보관 온도에서 F1 및 F4 단독과 비교하였다.
길항제 A의 경우, SE-HPLC 분석은 1:1 혼합물, F11에서의 길항제 A의 안정성이 37℃에서 12주 동안 F1 단독과 비슷하다는 것을 보여주었다(도 24). 길항제 A가 37℃에서 보관 동안 조기 시점에 1:1 혼합물에서 더 빠른 분해를 겪었다는 것이 AEX-HPLC에 의해 나타났음에도 불구하고, 두 F1 및 1:1 혼합물(F11)은 12주에 대등한 순도를 나타내었다(도 25). 샘플들이 25℃에서 보관될 때 AEX-HPLC 순도 프로파일에서 차이가 관찰되지 않았다(도 25).
라니비주맙은 비슷한 보관 조건에서 길항제 A보다 1:1 혼합물에서 더 안정성 사안을 접하였다. F11 내 라니비주맙은 37℃에서 4주 보관까지 F4에서 라니비주맙에 대해 대등한 WCX-HPLC 프로파일을 유지하였고, 그 후 라니비주맙은 혼합물(F11)에서 더 빠른 분해를 겪었다(도 26). 그러나, 라니비주맙은, 샘플이 25℃에서 보관될 때 혼합물에서 상당히 안정한 상태를 유지하였다(도 26). 25℃에서 혼합물 및 F4 사이에 라니비주맙의 WCX-HPLC 순도 프로파일에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. SE-HPLC는 F4와 비교하여 37℃에서 8주 보관 후 1:1 혼합물에서 응집된 라니비주맙의 현저한 증가를 나타내었다(도 27a). 혼합물에서의 응집은 25℃에서 보관할 때 실질적으로 더 낮았고, 4℃에서 관찰되지 않았다(도 27b-c).
조성물 F6의 안정성
길항제 A의 AEX-HPLC 분석은 F6 조성물이 25℃에서 12주까지, 그리고 4℃에서 적어도 16주(시험된 최근 시점)까지 길항제 A의 순도를 유지하였음을 보여주었다(도 28). 37℃에서, 길항제 A 분해가 2주 빨리 관찰되었다(도 28). F6을 이용한 제형화는, WCX-HPLC에 의한 유의미한 순도 감소가 8주에 생성되기 전에 최대 4주간 라니비주맙이 37℃에서 분해되는 것을 막는 것을 도왔다(도 29). 그러나, 라니비주맙은, WCX-HPLC에 의한 임의의 실질적인 순도 감소 없이, 25℃에서 적어도 12주, 및 4℃에서 적어도 16주 동안 조성물 F6에서 안정하였다(도 29).
SE-HPLC 결과는 모든 보관 조건에서 16주 동안 길항제 A가 안정한 상태를 유지한다는 것을 보여주었다(도 30). 라니비주맙의 경우, F6 조성물에서 37℃에서 12주 동안 배양될 때 유의미한 응집이 관찰되지 않았다(도 31). F6 조성물은 두 온도에서 8주 동안 대등한 순도와 함께, 4℃ 또는 25℃에서 보관될 때 더 잘 수행하였다. 25℃에서 그리고 37℃에서 라니비주맙의 응집은 F4보다 F6 조성물에서 더 빨랐다.
이들 범위 연구로부터, 조성물 F6은 평균적으로, 본 연구에 사용된 모든 보관 온도 및 분석 방법에 대해 최적의 안정성을 나타내었다.
실시예 2
길항제 A 및 베바시주맙을 포함하는 조성물의 안정성
Genentech 사(S. San Francisco, CA)로부터의 아바스틴?로서 시판되는, 항-VEGF 모노클로날 항체(mAb) 베바시주맙을 포함하는 조성물에서의 길항제 A의 안정성을, 조건 범위 하에 조사하였다. 다양한 pH(4.0-8.0) 및 장성 조절제(염화나트륨, 소르비톨, 및 트레할로오스)을 사용하여, 다양한 온도(4℃, 25℃, 및 37℃)에서 그리고 물리적 스트레스(진탕)에 대해 보관될 때 조성물 길항제 A 및 베바시주맙의 안정성을 최적화하였다. 길항제 A 및 베바시주맙의 안정성을 시각적 관찰, pH 측정, 및 다양한 HPLC 방법(음이온 교환 [AEX-HPLC], 약 양이온 교환 [WCX-HPLC], 및 크기 배제 [SE-HPLC])에 의해 규명하였다.
길항제 A는 두 가지가 시험된 임의의 조성물에서 조합될 때, 인식될 수 있는 안정성 사안 없이 베바시주맙과 양립가능하였다. 24주 안정성 연구 결과에 기초하여, 최적의 안정성은 조성물 F19에서 관찰되었다. F19 조성물에서, 길항제 A 및 베바시주맙 모두 4℃에서 24주 내내, 및 25℃에서 적어도 4주까지 안정한 상태를 유지하였다.
조성물 파라미터
하기 조성물 파라미터를 조사하였다:
(1) pH: 4.0, 5.0, 6.0, 6.2, 6.3, 7.0, 7.3, 8.0
(2) 완충액: 아세테이트, 인산염, 및 Tris
(3) 장성 조절제: 염화나트륨, 소르비톨, 및 트레할로오스
(4) 계면활성제: 폴리소르베이트 20
(5) 길항제 A 농도: 30 mg/mL, 15 mg/mL, 및 3 mg/mL
하기 파라미터를 고정시켰다:
(1) 충진 용적은 Ophthotech 사에 의해 제공된 변형된 3 cc 바이알에서 300 μL였다(Mglas AG, Munnerstadt, Germany로부터 얻음).
(2) 베바시주맙의 농도는 12.5 mg/mL였다.
하기 표 3은 본 연구에 사용된 조성물 매트릭스를 요약한다.
표 3. 길항제 A: 베바시주맙 조성물에 대한 조성물 매트릭스
조성물 완충액 pH 장성 조절제 길항제 A 농도 ( mg / mL , 올리고 wt .) 베바시주맙 농도 ( mg / mL ) 계면활성제
F12 10 mM 인산염 7.3 150 mM 염화나트륨 30 0.0 0%
F13 50 mM 아세테이트 4 5%(w/v) 소르비톨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F14 50 mM 아세테이트 4 130 mM 염화나트륨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F15 50 mM 아세테이트 5 5%(w/v) 소르비톨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F16 50 mM 아세테이트 5 130 mM 염화나트륨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F17 50 mM 인산염 6 5%(w/v) 소르비톨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F18 50 mM 인산염 6.2 6%(w/v) 트레할로오스 0 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F19 50 mM 인산염 6 130 mM 염화나트륨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F20 50 mM 인산염 7 5%(w/v) 소르비톨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F21 50 mM 인산염 7 130 mM 염화나트륨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F22 50 mM Tris 8 5%(w/v) 소르비톨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F23 50 mM Tris 8 130 mM 염화나트륨 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F24 30 mM 인산염 6.3 75 mM 염화나트륨 + 3%(w/v) 트레할로오스 15 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
F25 10 mM 인산염 7.3 150 mM 염화나트륨 3 0.0 0%
F26 30 mM 인산염 6.3 75 mM 염화나트륨 + 3%(w/v) 트레할로오스 3 12.5 0.02% 폴리소르베이트 20
샘플 제조
길항제 A 스톡 용액을 10 mM 인산염, 150 mM NaCl, 및 pH 7.3 중에서 6 mg/mL으로 제조하였다. 수득한 스톡 용액을 상업적 아바스틴?(25 mg/mL)과 혼합하여, 3 mg/mL 길항제 A 및 12.5 mg/mL 베바시주맙의 최종 농도를 야기하였다(조성물 F26). 상기 조성물을 10 kDa 분자량 컷오프 투석 카세트에 넣고 표 3에 열거된 다양한 조성물 완충액에 대해 ~1,000,000-배 투석하였다(조성물 번호 F13-F17, F19-F23). 예외는 하기를 포함한다:
· 조성물 F12는 추가의 희석 또는 투석이 필요하지 않았다.
· 조성물 F18을 제공하기 위해 상업적 아바스틴?은 6%(w/v) 트레할로오스 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20를 함유하는 50 mM 인산염 완충액(pH 6.2)을 이용하여 1:1 희석되었다.
· 조성물 F24는 조성물 F12와 상업적 아바스틴?을 1:1로 혼합함으로써 제조되었다.
· 조성물 F25는 150 mM NaCl을 함유하는 10 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 조성물 F12를 10배 희석하여 생성되었다.
스트레스 연구
표 3의 조성물을 하기 스트레스 조건 하에서 시험하였다:
표 4. 스트레스 조건
스트레스 조건 시점
보관 4 ℃ 0, 2, 4, 8, 12, 및 24 주
25 ℃ 2, 4, 8, 12, 및 24 주
37 ℃ 2, 4, 8, 및 12 주
진탕 4 시간
분석 방법
스트레스 하에 생성된 분해 생성물을 분석하기 위해, 하기 안정성-표기 분석을 개발하고 본 연구에 사용하였다.
(1) SE - HPLC (길항제 A 및 베바시주맙의 분석)
· 이동상: 50 mM 인산염 완충액, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: TOSOH TSKgel G3000SWXL
· 칼럼 온도: 주위
· 유속: 1.0 mL/min
· 파장: 신호, 214 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 1 μL
· 샘플 제조:
- 30 mg/mL 앱타머 샘플의 경우 밀리-Q 물에서 10배 희석
- 다른 샘플의 경우 희석하지 않음
· 퍼센트 순도는 둘 모두 길항제 A 및 베바시주맙에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트에 기초하여 보고됨
(2) WCX - HPLC ( 베바시주맙의 분석)
· 이동상 A: 10 mM 인산염 완충액, pH 7.0
· 이동상 B: 10 mM 인산염 완충액, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: Dionex ProPac WCX-10, 4 x 250 mm
· 칼럼 온도: 주위
· 유속: 1.0 mL/min
· 파장: 신호, 214 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 10 μL
· 샘플 제조: 밀리-Q 물에서 10배 희석
· 퍼센트 순도는 베바시주맙에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트에 기초하여 보고됨
(3) AEX - HPLC (길항제 A의 분석)
· 이동상 A: 10 mM 인산염 완충액, pH 7.0
· 이동상 B: 10 mM 인산염 완충액, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0
· 칼럼: Dionex DNA Pac PA-100, 4 x 250 mm
· 칼럼 온도: 40℃
· 유속: 1.2 mL/min
· 파장: 신호, 258 nm; 참조, 360 nm
· 주사 용적: 5 μL
· 샘플 제조:
- 3.0 mg/mL 앱타머 샘플의 경우 밀리-Q 물에서 10배 희석
- 15 mg/mL 앱타머 샘플의 경우 밀리-Q 물에서 50배 희석
- 30 mg/mL 앱타머 샘플의 경우 밀리-Q 물에서 100배 희석
· 퍼센트 순도는 길항제 A 에 대해 확인된 주요 피크들의 통합된 면적 퍼센트에 기초하여 보고됨
(4) pH
· VWR symphony SB70P
(5) 시각적 관찰
· 소니 사이버샷 DSC-H9 디지털 스틸 카메라(8.1 Mega pixels)로부터 사진 촬영됨.
(6) 몰삼투압 (제로 시점에서)
· Advanced Instruments, Inc. Advanced Osmometer Model 3D3
안정성 개요
본 섹션은 길항제 A 및 베바시주맙에 대한 다양한 온도(4℃, 25℃, 및 37℃)에서 진탕(4시간) 및 보관의 효과를 기술한다. 연구 내내, 각각의 조성물은 모든 물리적 스트레스 내내 표적화된 pH 값을 유지할 수 있다.
안정성 지표 분석
시각적 관찰에 의해, 조성물 F15, F16, 및 F24가 37℃에서 2주 보관 동안 침전을 생성하였다는 점에 유의하였다(데이터 도시되지 않음). 연구에 이용가능한 부피 제한으로 인해, 침전의 정량적 측정을 위한 다른 분석은 수행하지 않았다.
보관 동안 길항제 A의 안정성을 AEX-HPLC에 의해 효과적으로 분석하였다. 어떤 조성물 내의 길항제 A가 37℃의 증가된 온도에서 배양될 때 전-피크 및 후 피크의 형성이 관찰되었다. 예를 들면, 조성물 F14에서, 길항제 A의 AEX-HPLC 순도는 37℃에서 2주간 보관 동안 거의 50%까지 감소하였다(도 32).
WCX-HPLC는 또한 베바시주맙의 안정성을 규명하는데 효과적이었다. 어떤 조성물 내의 베바시주맙이 25℃의 온도에서 배양될 때 전-피크 및 후 피크의 형성이 관찰되었다. 예를 들면, 조성물 F22에서, 베바시주맙 순도는 25℃에서 8주 보관 동안 거의 30%까지 감소하였다(도 33).
SE-HPLC는 베바시주맙의 가용성 응집 또는 단편화를 규명하는데 유용한 것으로 입증되었다. 길항제 A는, 그것의 응집된 형태의 분해능이 안정성의 분석 민감도로 인해 TSKgel G3000SWXL 칼럼의 능력을 넘어설 수 있음에도 불구하고, SE-HPLC에 의한 유의미한 변화를 나타내지 않았다. 베바시주맙의 분해는 37℃에서 8주의 보관 후 조성물 F15에서 나타났다(도 34).
안정성에 대한 진탕의 효과
길항제 A 및 베바시주맙 중 하나 또는 둘 모두에 대한 진탕의 효과를 평가하였다. 표 3에 열거된 조성물을 인하우스 진탕기로 4시간 동안 진탕시킨 반면, 조성물의 대조군 세트는 실온에서 진탕하지 않은 채로 두었다. 진탕된 샘플 및 대조군 사이에 시각적 관찰, pH, AEX-HPLC, 및 WCX-HPLC의 차이가 관찰되지 않았다(데이터 도시되지 않음). 그러나, 길항제 A 및 베바시주맙 모두의 응집 또는 단편화를 평가하는 SE-HPLC는 F23 및 F24 샘플에서 진탕된 대조군 샘플 사이에 약간의 변화를 나타내었다(표 5 및 표 6). 4시간의 진탕 후, 더 가용성인 응집물(전-길항제 A 피크 및 전-베바시주맙 피크)이 F23 샘플 및 30 mg/mL 길항제 A 및 25 mg/mL 아바스틴?의 직접적인 1:1 혼합물(F24)에서 관찰되었다. 이것은 염화나트륨을 이용하여 pH 8.0에서 제형화하는 것, 또는 고농도의 길항제 A를 베바시주맙과 공제형화하는 것이 전단 응력 동안 가용성 응집물 또는 단편을 형성하는 길항제 A 또는 베바시주맙을 야기한다는 것을 제시한다. SE-HPLC에 의해 결정된 바와 같이, 다른 조성물은 길항제 A 및 베바시주맙의 온정성을 유지하는 것으로 보였다. 이들 결과는 상기 언급된 조건들 하에 있는 것을 제외하고, 공제형된 길항제 A 또는 베바시주맙의 분명한 분해가 진탕에 의해 유도되지 않았음을 제시한다.
표 5. 진탕 전 샘플에 대한 SE - HPLC 결과
길항제 A 베바시주맙
농축 ( mg / mL ) 면적 (%) 면적 (%)
조성물 Ant . A bev . 전- Ant . A 피크 Ant . A 피크 전- bev . 피크 bev . 피크 후- bev . 피크
F12 30.0 0.0 0.3 99.7 NA NA NA
F13 3.0 12.5 4.6 95.4 4.6 89.3 6.1
F14 3.0 12.5 6.2 93.8 4.0 89.6 6.4
F15 3.0 12.5 5.6 94.4 3.9 90.1 6.0
F16 3.0 12.5 4.2 95.8 4.5 89.4 6.1
F17 3.0 12.5 3.6 96.4 4.0 90.7 5.3
F18 0.0 12.5 NA NA 4.7 90.1 5.3
F19 3.0 12.5 2.5 97.5 4.4 91.1 4.5
F20 3.0 12.5 2.4 97.6 9.5 86.1 4.4
F21 3.0 12.5 2.6 97.4 13.5 82.0 4.5
F22 3.0 12.5 3.0 97.0 13.8 81.6 4.6
F23 3.0 12.5 3.1 96.9 16.7 78.0 5.2
F24 15.0 12.5 2.3 97.7 16.8 76.1 7.0
F25 3.0 0.0 0.7 99.3 NA NA NA
F26 3.0 12.5 1.7 98.3 7.2 88.0 4.8
"Ant. A"는 길항제 A이고; "bev."는 베바시주맙이고; "NA"는 해당 없음을 의미한다.
표 6. 4시간 진탕 후 샘플에 대한 SE - HPLC 결과
길항제 A 베바시주맙
농축 ( mg / mL ) 면적 (%) 면적 (%)
조성물 Ant . A bev . 전- Ant . A 피크 Ant . A 피크 전- bev . 피크 bev . 피크 후- bev . 피크
F12 30.0 0.0 0.3 99.7 NA NA NA
F13 3.0 12.5 5.4 94.6 4.0 90.0 6.0
F14 3.0 12.5 6.0 94.0 3.9 90.1 6.0
F15 3.0 12.5 3.4 96.6 3.2 91.6 5.1
F16 3.0 12.5 3.4 96.6 4.0 89.9 6.2
F17 3.0 12.5 2.4 97.6 4.2 90.5 5.4
F18 0.0 12.5 NA NA 4.1 90.8 5.2
F19 3.0 12.5 1.7 98.3 3.9 91.7 4.4
F20 3.0 12.5 2.7 97.3 9.2 86.2 4.7
F21 3.0 12.5 4.4 95.6 13.3 82.2 4.5
F22 3.0 12.5 4.8 95.2 13.4 82.0 4.6
F23 3.0 12.5 7.1 92.9 16.0 78.7 5.3
F24 15.0 12.5 5.4 94.6 20.7 74.6 4.7
F25 3.0 0.0 1.1 98.9 NA NA NA
F26 3.0 12.5 2.3 97.7 7.3 88.4 4.3
"Ant. A"는 길항제 A이고; "bev."는 베바시주맙이고; "NA"는 해당 없음을 의미한다.
안정성에 대한 보관 온도의 효과
길항제 A 및 베바시주맙 중 하나 또는 둘 모두의 안정성에 대한 온도의 효과를 연구하기 위해, 24주 연구 동안, 표 3에 열거된 조성물을 4℃, 25℃, 및 37℃ 안정성 챔버에 두었다. 길항제 A 및 베바시주맙 모두는, 크로마토그래피 분석에 기초하여, 보관 온도가 증가함에 따라 더 큰 분해를 나타내었다.
37℃에서의 보관은 길항제 A 및 베바시주맙의 유의미하게 증가된 분해 수준을 유도하였다. 2주에, 길항제 A 또는 베바시주맙의 침전이 F15, F16, 및 F24에서 관찰되었다(데이터 도시되지 않음). 4주에, F14는 또한 길항제 A 또는 베바시주맙의 불용성 응집을 나타내기 시작하였다(데이터 도시되지 않음). 다른 모든 조성물은 12주 내내 맑은 상태를 유지하였다.
AEX-HPLC는 pH 4.0 및 5.0에서 조성물 샘플(F13, F14, F15, 및 F16)에서 유의미한 길항제 A 분해를 나타낸 반면, F17에서 공제형화된 샘플은 더 나은 안정성을 나타내었다(도 35). 길항제 A는, 12주에 길항제 A 순도 감소가 관찰되었던 F20 및 F26을 제외하면, 37℃에서 12주 보관 내내 pH 6.0-7.0에서 대등한 순도를 유지하였다(도 36).
37℃에서 2주의 보관 후, WCX-HPLC는 pH 4.0 조성물(F13 및 F14)에서 베바시주맙 순도에서 유의미한 감소를 밝혀내었는데, 이는 온전한 베바시주맙이 적게 또는 거의 남아있지 않다는 것을 보여준다(도 37). 가속화된 분해가 F19를 제외한 모든 다른 조성물에서 37℃에서 12주 보관 동안 관찰되었으며, 이는 다른 조성물보다 더 느린 분해를 일관되게 밝혀내었다(도 38).
SE-HPLC는 스트레스받은 샘플에서 가용성 응집물의 형성을 밝혀내었다. 길항제 A의 경우, 37℃에서 2주의 보관은 pH 4.0-5.0의 조성물이 더 빠르게 가용성 응집물을 형성하게 하였다(도 39). F17에서 제형화된 길항제 A는 또한 더 낮은 속도로 가용성 응집을 나타내었다(도 39). 4주에, 대부분의 항체 조성물은, 높은 길항제 A 순도를 유지할 수 있었던 F19 및 2가지 1:1 혼합물(F24 및 F26)을 제외하면, 더 낮은 길항제 A 순도를 나타내었다(도 40). 이 추세는 F26은 약간 감소된 길항제 A 순도를 나타내었을 때 12주까지 유지되었고, 이는 F19를 안정성에 대해 길항제 A를 위한 선택 조성물로서 두었다. 베바시주맙의 경우, pH 6.0 이외에서 제형화하는 것은 mAb 순도의 유의미한 감소를 야기하였다(도 41). 이 추세는 37℃에서 12주 보관 내내 계속되었고, 이는 F19를 가장 큰 안정성을 갖는 베바시주맙을 제공하는 조성물로서 두었다(도 42).
일부 조성물은 25℃에서 보관 동안 더 나은 안정성을 제공하였다. 모든 조성물은 8주에 침전이 관찰된 F14를 제외하면, 25℃에서 24주 후 맑은 상태를 유지하였다(데이터 도시되지 않음).
AEX-HPLC에 기초하여, pH 4.0에서 길항제 A를 제형화하는 것(F13 및 F14)은 단지 2주의 보관 후 앱타머의 분해를 야기하였다(도 43). F15는 25℃의 4주 보관시 분해를 나타내었으나, F16은 8주까지 개선된 안정성을 나타내었다(도 43). pH 6.0-8.0에서 길항제 A를 제형화하는 것은 25℃에서 8주 보관 내내, 그리고 조성물 F19, F20, F21, 및 F23을 이용하여 4℃에서 적어도 24주까지 대등한 안정성을 유지하였다 (도 44).
WCX-HPLC는 pH가 길항제 A와 비교하여 베바시주맙의 안정성에 반대 효과를 미친다는 것을 보여주었다. 25℃에서 2주 후, pH 8.0 샘플은 베바시주맙의 실질적인 분해를 나타내었다(도 45 및 도 46). 25℃에서 4주까지, pH 4.0 및 pH 7.0 조성물은 베바시주맙 분해의 징후를 나타내기 시작하였다(도 45 및 도 46). pH 5.0-6.0의 조성물은 25℃에서 12주까지 베바시주맙의 대등한 안정성을 제공하였고, 그 시간에 모든 선두 후보들은 가속화된 분해의 징후를 나타내었다. 그러나, pH 6.0에서 F19 조성물은 25℃에서 12 내지 24주의 보관으로부터 베바시주맙의 가속화된 분해를 추가적으로 겪지 않았다(도 45 및 도 46).
AEX-HPLC 및 WCX-HPLC에서 관찰된 유사한 분해 추세가 SE-HPLC에 의해 관찰되었다. pH 4.0에서 제형화된 길항제 A는 25℃에서 보관될 때 길항제 A 순도를 유지할 수 없었다(도 47). 8주에, pH 5.0에서 제형화된 길항제 A는 유의미한 응집 또는 단편화를 겪었다(도 47). 6.0-8.0의 pH 범위에서 길항제 A를 제형화하는 것은 25℃ 보관의 적어도 24주까지 내내 대등한 순도를 제공하였다(도 21). 베바시주맙의 순도는 조성물의 pH 및 조성물에서 길항제 A의 농도에 좌우되었다. 25℃에서 4주 보관 후, pH 4.0 및 pH 8.0에서 제형화하는 것은 베바시주맙의 순도의 가속화된 감소를 야기하였다(도 49 및 도 50). 동일한 시간 및 보관 조건 하에, 15 mg/mL로 공제형화된 길항제 A는 베바시주맙의 순도에 부정적으로 영향을 미치는 것으로 보였다(도 49). pH 5.0-7.0의 조성물은 8주 동안 25℃에서 더 나은 안정성을 제공하였다(도 49 및 도 50). 추가 시점은 선두 조성물(pH 6.0 및 7.0)이 대등한 순도를 유지할 수 있었음을 밝혀내었다(도 50).
4℃에서의 보관은 본 연구 동안 대부분의 조성물에 대해 최상의 안정성을 제공하였다. 시각적 관찰은 조성물 F19, F20, F21, 및 F23에 대해 최대 적어도 24주 동안 4℃ 보관 동안 불용성 응집을 나타내지 않았다.
길항제 A의 경우, 모든 조성물은 8주의 보관 후, 및 조성물 F19, F20, F21, 및 F23를 이용하여 4℃에서 24주 내내, AEX-HPLCdp 의해 대등한 순도를 유지하였다(도 51). 그러나, WCX-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, pH 8.0에서 베바시주맙을 제형화하는 것은 4℃에서 8주 후 상당한 분해 증가를 야기하였고, 이 추세는 24주 내내 진행되었다(도 52).
SE-HPLC는 몇 가지 조성물에서 길항제 A의 단편화 또는 베바시주맙의 응집을 밝혀내었다. 길항제 A의 경우, 대부분의 조성물은 4℃에서 8주까지 그의 순도를 유지한 반면, pH 4.0-5.0의 조성물은 순도의 유의미한 손실을 나타내었다(도 53). 조성물 F19, F20, F21 및 F23은 12주까지의 4℃ 보관시 대등한 길항제 A 순도를 유지하였지만, 12 및 24주 후, F23에서 길항제 A의 순도는 실질적으로 감소한 반면, 다른 3개의 선택된 조성물은 유사하게 상승된 상태를 유지하였다(도 54). pH 8.0에서 제형화하는 것은 초기 투석 동안 베바시주맙의 가용성 응집물의 형성을 야기하였으나, 4℃에서의 보관은 다른 조성물과 유사하게, 적어도 8주간 베바시주맙의 순도를 유지하였다(도 55). 한 가지 예외는, 15 mg/mL에서의 길항제 A의 농도가 보관 8주 동안 베바시주맙의 순도에 영향을 미쳤던, 조성물 F24였다(도 55).
안정성에 대한 조성물 특성/성분의 효과
안정성에 대한 이들 인자의 효과를 결정하기 위해, 길항제 A 및 베바시주맙을 다양한 pH에서 그리고 상이한 장성 조절제을 이용하여 공제형화하였다. 본 섹션은 길항제 A 및 베바시주맙 중 하나 또는 둘 모두의 안정성에 대한 조성물의 효과를 기술한다.
안정성에 대한 pH 의 효과
37℃에서 보관함으로써 길항제 A 및 베바시주맙의 안정성에 대한 pH의 효과를 구분하였다. AEX-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, 길항제 A는 가속화된 분해가 일어났던 pH 4.0-6.0 소르비톨-함유 조성물 F13, F15, 및 F17과 달리, pH 7.0 및 pH 8.0 소르비톨-함유 조성물 F20 및 F22에서 37℃에서 안정하였다(도 56). 베바시주맙의 경우, WCX-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, pH 5.0-6.0 이외의 소르비톨-함유 조성물(F13, F20, 및 F22)은 37℃에서 베바시주맙의 가속화된 분해를 나타내었다(도 57). AEX-HPLC 결과와 유사하게도, SE-HPLC는 소르비톨-함유 조성물 F13 및 F15(pH 4.0 - 5.0) 내의 길항제 A가 37℃에서 단편화 또는 응집을 겪었음을 밝혀내었다(도 58). 그러나, pH 5.0-6.0의 범위 이외의 소르비톨-함유 조성물에 대하여 WCX-HPLC에 의해 관찰된 분해에도 불구하고, SE-HPLC는 37℃에서 보관될 때 pH 5.0-8.0의 소르비톨-함유 조성물에서 더 느린 응집 또는 단편화를 겪었음을 밝혀내었다(도 59). 37℃에서 보관된 pH 4.0 소르비톨-함유 조성물 F13의 SE-HPLC는 베바시주맙의 실질적인 분해를 나타내었다. pH 6.0에서 제형화하는 것(F17)은 소르비톨-함유 조성물에 대해 분석된 다른 pH 수준보다 더 나은 베바시주맙의 순도를 유지하는 것으로 보였다(도 58 및 도 59).
안정성에 대한 장성 조절제의 효과
37℃에서 보관함으로써 길항제 A 및 베바시주맙의 안정성에 대한 장성 조절제의 효과를 구분하였다. 소르비톨 또는 염화나트륨의 이점은 조성물의 pH에 좌우되었다.
pH 5.0 및 6.0에서, AEX-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, 길항제 A는 8주 연구 내내 소르비톨 조성물(F15 및 F17)에서 분해를 겪었다(도 60). 그러나, 장성 조절제로서 염화나트륨을 갖는 이들 pH 수준에서의 조성물(F16 및 F19)은 상기 분해를 겪지 않았다(도 60). 염화나트륨을 함유하는 pH 4.0 조성물(F14)은 4주의 가속화된 스트레스 후 안정성이 감소되었음을 입증하였고, 이는 소르비톨이 pH 4.0에서 우수한 장성 조절제임을 야기하였다(도 60). pH 7.0 및 pH 8.0에서, 장성 조절제로서 염화나트륨 또는 소르비톨을 갖는 조성물(F20, F21, F22, 및 F23)은 대등한 안정성을 유지하였다. WCX-HPLC에 의한 베바시주맙의 분석은 pH 6.0-7.0으로부터 염화나트륨으로 제형화하는 것이 소르비톨 대비 안정성을 개선하였다는 것을 밝혀내었다(도 61). 그러나, 소르비톨이 37℃에서 4주 보관 동안 염화나트륨 대비 분해를 제한하였던, pH 5.0 조성물의 경우에는 반대였다(도 61). SE-HPLC에 의해, 길항제 A 안정성은 염화나트륨 또는 소르비톨의 존재에 의해 영향을 받은 반면, 베바시주맙의 안정성은 두 장성 조절제 사이에 대등한 상태를 유지하였다. pH 5.0-6.0 조성물의 경우, 염화나트륨의 존재는 소르비톨보다 응집 또는 단편화를 방지하였다(도 62). 다른 pH로 분석시, 길항제 A는 소르비톨을 이용한 pH 4.0에서 더 낮은 순도를 나타내었다(도 62). pH 7.0 및 pH 8.0에서 제형화된 길항제 A(도 62), pH 4.0, pH 7.0, 및 pH 8.0에서 제형화된 베바시주맙(도 63)은 장성 조절제로서 소르비톨 또는 염화나트륨을 이용시 대등한 순도를 유지하였다.
안정성에 대한 1:1 혼합물의 효과
분석된 또 하나의 파라미터는 길항제 A 및 상업적 베바시주맙을 혼합하는 효과였다. 또한, 고정된 베바시주맙의 농도를 갖는 상이한 길항제 A의 농도를 함유하는 조성물(1:1 Mix (F24) 및 1:1 Mix (F26)을 분석하였다. 또한, 37℃에서 조성물d에게 스트레스를 주는 것은 길항제 A 및 베바시주맙 모두의 분해에 대해 정보를 제공하였다.
길항제 A 단독의 경우, 30 mg/mL(F12) 또는 3 mg/mL(F25)에서 제형화하는 것은 AEX-HPLC 및 SE-HPLC에 의한 안정성 프로파일에서 차이가 없었다. 상업적 아바스틴?을 다양한 길항제 A 농도(15 mg/mL 및 3 mg/mL)와 혼합시, 두 조성물 내의 길항제 A는 37℃에서 8주까지 대등한 안정성을 유지한 반면, 15 mg/mL의 길항제 A를 12.5 mg/mL의 베바시주맙과 제형화하는 것은 AEX-HPLC에 의해 관찰된 바와 같이 약간의 분해를 생성하였다(도 64).
베바시주맙의 농도가 본 연구에서의 모든 조성물에서 일정하였음에도 불구하고, 다양한 농도의 길항제 A는 베바시주맙의 안정성에 영향을 미쳤다. 37℃에서 8주 보관 후, WCX-HPLC는 3 mg/mL 길항제 A(F26) 또는 15 mg/mL 길항제 A(F24)를 이용하여 제형화될 때 베바시주맙의 분해 프로파일에서 사소한 차이를 밝혀내었다(도 65). SE-HPLC에 의해, 2가지 농도에서 직접 1:1 혼합하는 것(F24 및 F26)과 비교하여 30 mg/mL 및 3 mg/mL의 길항체 A 사이에 순도 프로파일에서의 유의미한 차이가 나타나지 않았다(도 66). 그러나, 베바시주맙의 경우, 15 mg/mL 길항제 A를 갖는 조성물(F24)은 3 mg/mL 조성물 1:1 믹스(F26) 및 상업적 아바스틴?의 희석된 형태(F18; 도 67)와 비교하여 베바시주맙의 더 가용성인 응집 및 단편화를 생성하였다.
F19 조성물의 안정성
24주 연구 내내, 조성물 F19는 분석된 모든 조성물 중에 가장 좋은 안정성을 나타내었다. 연구 내내, 모든 F19 조성물은 시각적으로 맑은 상태를 유지하였고 표적화된 pH 값을 유지하였다. 본 섹션은 이 조성물의 안정성 프로파일을 강조한다.
AEX-HPLC 분석에 의해, F19 조성물은 4℃ 및 25℃에서 24주 내내 대등한 길항제 A 순도를 유지하였다(도 68). 그러나, 37℃에서 보관될 때, 길항제 A의 순도는 2주째에 대략 5% 더 낮았다(도 68). 길항제 A에 대한 다른 보관 조건과 비교하여 길항제 A 순도가 대략 20%까지 떨어졌기 때문에, 37℃에서의 이 추세는 다음 12주 동안 계속되었다(도 68).
WCX-HPLC 분석은 F19 조성물에서 보관 온도 및 베바시주맙 분해 속도 사이에 상관관계를 밝혀내었다. 37℃에서 2주 후, 베바시주맙 순도는 4℃ 샘플과 비교하여 대략 10% 떨어졌다(도 69). 이 추세는 12주까지 계속되었고, 여기서 37℃에서 보관된 베바시주맙의 순도는 4℃와 비교하여 대략 50% 떨어졌다(도 69). 25℃에서의 보관은 4주까지 4℃와 대등한 순도를 유지하였다(도 42). 그러나, 8주에, 25℃ 샘플은 4℃ 샘플 대비 7% 낮아졌다(도 69). 25℃에서 보관된 베바시주맙의 증가된 분해는 24주 연구의 마지막 동안 계속되었고, 여기서 말기에 베바시주맙 순도는 4℃에서 보관된 샘플보다 대략 20% 더 낮았다(도 69). 4℃에서의 보관은 연구의 24주 내내 출발값과 대등한 순도를 유지하는 것으로 보였다(도 69).
조성물 F19는 SE-HPLC에 의한 출발값과 대등한 길항제 A의 추가의 가용성 응집 또는 단편화를 막았다(도 70). 37℃에서 보관된 F19 내 베바시주맙은 최대 2주 동안 4℃ 및 25℃에서의 보관과 대등한 순도를 유지하였고, 그 후 4주에 가용성 응집이 생겼다(도 71). 베바시주맙 순도는 25℃에서 최대 8주 동안 유지되었고, 그 후 12주에 유의미한 가용성 응집이 생겼다(도 71). 4℃에서, 베바시주맙은 24주 동안 초기 시점과 대등한 순도 값을 유지하였다(도 71).
조성물 F19를 길항제 A 또는 베바시주맙만을 포함하는 조성물과 비교할 때, 길항제 A 및 베바시주맙 사이에 순도의 차이가 관찰되었다. 37℃에서 2주부터 8주까지, 조성물 F25는 AEX-HPLC 분석에 의해 F19보다 5-8% 더 높은 길항제 A 순도를 유지하였다. 그러나, 12주에, 두 조성물은 유사한 순도 수준까지 낮아졌다(도 72). 더욱이, 4℃ 및 25℃에서, 두 조성물은 대등한 순도 수준을 유지하였다(도 72). SE-HPLC에 의해, 일부 분석 가변성이 관찰되었음에도 불구하고, 조성물 F12는 각각의 보관 조건에서의 F19보다 더 나은 것으로 보였고, 가장 큰 차이는 4℃에서 관찰되었다(도 73).
F19에서 베바시주맙을 제형화하는 것은 상업적 아바스틴?의 희석된 형태(F18)와 비교하여 더 나은 안정성을 제공하였다. WCX-HPLC에 기초하여, F19는 25℃ 및 특히 37℃의 F18보다 베바시주맙을 더 안정화시켰고, 이는 2-12주로부터 8%-11% 개선을 나타내었다(도 74). 유사하게, SE-HPLC 분석은 37℃에서 보관된 F18과 비교하여 베바시주맙의 응집 또는 단편화를 더 잘 막는 것으로 나타났다(도 75).
24주의 안정성 시험 동안 수집된 데이터에 기초하여, F19가 길항제 A 및 베바시주맙의 가장 안정한 조성물이라는 것이 결정되었다. 시험된 조성물 중에, F19는 적어도 24주까지 4℃에서 보관될 때 3 mg/mL 길항제 A 및 12.5 mg/mL 베바시주맙 모두를 안정화시키는 것을 도왔다. 또한, F19 조성물에서의 길항제 A 및 베바시주맙 모두의 순도는 25℃에서 적어도 4주까지 유지되었다.
실시예 3
라니비주맙 및 길항제 A 모두를 포함하는 조성물의 생물학적 활성
본 연구의 목적은 라니비주맙(Lucentis?) 또는 길항제 A만을 포함하는 조성물과 비교하여, 라니비주맙 및 길항제 A 모두를 포함하는 조성물의 생물학적 활성을 평가하는 것이었다. 상기 활성은 그의 각 세포성 수용체에 결합하는 VEGF 및 PDGF-BB의 억제의 기능으로서, 실시간 PCR을 이용한 유전자 발현의 수준을 통해 측정되었다. 3개의 상이한 라니비주맙+길항제 조성물을 분석하였다: F6, F8, 및 F11(실시예 1 참고). 이들 조성물을 본 연구에 사용하기 전에 12개월간 4℃에서 보관하였다.
단독으로 또는 또한 길항제 A를 포함하는 조성물 내에 존재하는, 라니비주맙 항-VEGF 활성을 인간 제대혈 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 조직 인자(TF) 유전자의 VEGF 유도를 억제하는 능력에 의해 결정하였다. 샘플을 삼반복하여 분석하고 모든 데이터를 VEGF 단독 처리에 대해 얻은 데이터로 정규화하였다. 도 76에 나타난 바와 같이, 모든 조성물 및 Lucentis? 단독에 대해 결정된 항-VEGF EC50(nM) 값은 5% 신뢰 구간에서 동일하였다.
단독으로 또는 또한 라니비주맙을 포함하는 조성물 내에 존재하는 길항제 A 항-PDGF 활성을 3T3 섬유아세포 세포에서 BTG2 유전자 발현의 PDGF-BB 유도을 억제하는 능력에 의해 결정하였다. 샘플을 삼반복하여 분석하고 모든 데이터를 PDGF-BB 단독 처리에 대해 얻은 데이터로 정규화하였다. 도 77에 나타난 바와 같이, 모든 조성물 및 길항제 A 단독에 대해 결정된 항-PDGF EC50(nM) 값은 95% 신뢰 구간에서 동일하였다. 이들 결과는 라니비주맙 및 길항제 모두를 포함하는 조성물이 4 ℃에서 보관될 때 적어도 12개월 동안 각각의 제제에 대해 활성을 보인다는 것을 입증한다.
구체적으로, 길항제 A 및 라니비주맙의 공제형이 길항제 A 또는 라니비주맙의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하기 위해, 12개월 동안 4℃에서 보관된 공제형 내에 존재하는 길항제 A의 항-PDGF 활성 및 라니비주맙의 항-VEGF 활성을 결정하였다. 본 연구에 사용하기 전에 12개월간 4℃에서 보관한 후, 길항제 A 및 라니비주맙 모두를 포함하는 3개의 상이한 조성물을 분석하였다: F6, F8, 및 F11(실시예 1 참고). 또한, 길항제 A 또는 라니비주맙(Lucentis?) 중 하나를 포함하는 조성물을 대조군으로서 분석하였다.
라니비주맙 활성
라니비주맙의 항-VEGF 활성을 인간 제대혈 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 VEGF-유도성 유전자, 조직 인자(TF) 유전자의 VEGF 유도를 억제하는 능력으로서 측정하였다.
HUVEC(passage 8 to 9; Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland)를 24웰 플레이트에 시딩하고(50,000 세포/웰), 하이드로코르티손이 없는 내피 성장 배지(EGM2; Lonza)에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 다음날, 세포를 처리 전 4시간 동안 0.5% FBS 및 50 μg/ml 겐타마이신을 함유하는 EGM 기초 배지(기아 배지)에서 혈청 기아시켰다.
라니비주맙의 EC50을 결정하기 위해, 세포를 VEGF(양성 대조군; 328 pM 인간 VEGF165 (Preprotech)) 단독 또는 F6, F8,F11, 길항제 A 또는 Lucentis?과 조합된 VEGF로 처리하였다. 이들 처리를 위해, 하기 조성물 각각의 연속 희석물을 기아 배지에서 준비하고 시험하였다: F6, F8, F11, 및 Lucentis?. 각 시리즈 희석물에서의 라니비주맙 및 길항제 A 농도는 하기와 같았다: 라니비주맙 = 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM (9.6, 1.92, 0.38, 0.077, 0.015 μg/ml); 및 길항제 A = 580 nM, 116 nM, 23.2 nM, 4.64 nM, 0.928 nM (5.97, 1.19, 0.24, 0.048, 0.009 μg/ml). VEGF+길항제 A 처리의 경우, 한 가지 농도의 길항제 A만을 시험하였다(580 nM=5.97 μg/ml). 세포를 37℃, 5% CO2에서 1.5시간 동안, 상기 기재된 농도로, 상기 기재된 연속 희석물 중 하나와 조합하여 또는 단독으로, VEGF로 처리하였다. 추가의 대조군 세포는 처리하지 않은 상태로 두었다.
처리 후 즉시, 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini 스핀 칼럼 키트(Qiagen)를 이용하여 각각의 웰로부터 RNA 샘플을 수집하였다. 수득한 총 RNA를 DNAse I으로 처리하여 임의의 오염원성 게놈 DNA를 제거하고 260 nm에서 광학 밀도(O.D.)에 의해 정량화하였다. 그리고 나서, 총 RNA를 제조자의 설명에 따라 QuantiTect RT 키트(Qiagen)를 이용하여 역전사에 사용하였다. VEGF 활성을 억제하는 조성물의 능력을 평가하기 위해, 특이적 인간 TaqMan 프로브(Applied Biosystems)를 이용하여 TF 유전자 상에서 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 대조군 하우스-키핑 유전자로서 인간 HPRT TaqMan 유전자 분석을 사용하였다(Applied Biosystems).
상기 실험은 삼반복하여 수행하였고, 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다. 통계적 및 비-선형회귀 분석을 위해 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하였다. 각 조건에 대한 TF 유전자 발현 변화의 수준(즉, VEGF-유도된 유전자 발현의 억제)을 결정하기 위해, 실시간 PCR로부터의 모든 데이터를 VEGF-단독 처리(양성 대조군)에 대해 정규화하였다. 시험된 각 조성물의 상이한 농도에 대해 결정된 상대적 TF 유전자 발현 수준이 도 76에 나타나 있다. 표 7에 나타난 바와 같이, 길항제 A 부재시 라니비주맙 및 모든 공-제형된 샘플에 대해 결정된 항-VEGF EC50(nM) 값은 95% 신뢰 구간에서 동일하였다. 길항제 A 단독(즉, 라니비주맙의 부재시)에 의해 VEGF 활성의 억제가 관찰되지 않았다(데이터 도시되지 않음).
표 7. 다양한 조성물에서 길항제 A 및 라니비주맙의 EC 50 95% 신뢰 구간 값
조성물 EC 50 95% 신뢰구간 ( nM )
라니비주맙 0.5235 내지 1.134
F6 0.7847 내지 1.452
F8 0.6257 내지 1.451
F11 0.4417 내지 0.9030
길항제 A 활성
길항제 A의 항-PDGF 활성을 NIH-3T3 섬유아세포 세포에서, PDGF-유도성 유전자인 B-세포 전좌 유전자 2(BTG2)의 PDGF-BB 유도를 억제하는 능력에 의해 결정하였다.
NIH 3T3 세포를 24웰 플레이트에 시딩하고(50000 세포/웰), DMEM(Gibco) 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 다음날, 처리 전에 세포를 DMEM 1% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(기아 배지)에서 16시간 동안 혈청 기아시켰다.
길항제 A의 EC50을 결정하기 위해, 세포를 PDGF-BB(양성 대조군) 단독 또는 F6, F8, F11, 길항제 A 또는 Lucentis?과 조합된 PDGF-BB로 처리하였다. PDGF-BB는 1.65 nM(40 ng/ml; Peprotech)의 농도로 사용하였다. 이들 처리를 위해, 하기 조성물 각각의 연속 희석물을 기아 배지에서 준비하고 시험하였다: F6, F8, F11, 및 길항제 A. 각 시리즈 희석물에서의 길항제 A 및 라니비주맙 농도는 하기와 같았다: 길항제 A = 580 nM, 116 nM, 23.2 nM, 4.64 nM, 0.928 nM (5.97, 1.19, 0.24, 0.048, 0.009 μg/ml); 및 라니비주맙 = 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM (9.6, 1.92, 0.38, 0.077, 0.015 μg/ml). PDGF-BB+Lucentis? 처리를 위해, 한 가지 농도의 라니비주맙만을 시험하였다(200 nM=9.6 μg/ml). 세포를 37℃, 5% CO2에서 1.5시간 동안, 상기 기재된 농도로, 상기 기재된 연속 희석물 중 하나와 조합하여 또는 단독으로, PDGF-BB로 처리하였다. 추가의 대조군 세포는 처리하지 않은 상태로 두었다.
처리 후 즉시, 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini 스핀 칼럼 키트(Qiagen)를 이용하여 각각의 웰로부터 RNA 샘플을 수집하였다. 수득한 총 RNA를 DNAse I으로 처리하여 임의의 오염원성 게놈 DNA를 제거하고, 260 nm에서 O.D.에 의해 정량화하였다. 그리고 나서, 총 RNA를 제조자의 설명에 따라 QuantiTect RT 키트(Qiagen)를 이용하여 역전사에 사용하였다. PDGF-BB 활성을 억제하는 조성물의 능력을 평가하기 위해, 특이적 마우스 TaqMan 프로브(Applied Biosystems)를 이용하여 BTG2 유전자 상에서 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 대조군 하우스-키핑 유전자로서 마우스 GAPDH 유전자 분석을 사용하였다(Applied Biosystems).
상기 실험을 반복하여 수행하고, 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다. 통계적 및 비-선형회귀 분석을 위해 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하였다. 각 조건에 대한 BTG2 유전자 발현 변화의 수준(즉, PDGF-유도된 유전자 발현의 억제)을 결정하기 위해, 실시간 PCR로부터의 모든 데이터를 PDGF-단독 처리(양성 대조군)에 대해 정규화하였다. 시험된 각 조성물의 상이한 농도에 대해 결정된 상대적 BTG2 유전자 발현이 도 77에 나타나 있다. 표 8에 나타난 바와 같이, 길항제 A 단독 및 모든 공-제형된 샘플에 대해 결정된 항-PDGF EC50(nM) 값은 95% 신뢰 구간에서 동일하였다. 라니비주맙 단독(즉, 길항제 A의 부재시)에 의해 PDGF-BB 활성의 억제가 관찰되지 않았다(데이터 도시되지 않음).
표 8: 다양한 조성물에서 길항제 A 및 라니비주맙의 EC 50 95% 신뢰 구간
조성물 EC 50 95% 신뢰구간 ( nM )
길항제 A 0.8287 내지 3.656
F6 0.7018 내지 3.987
F8 0.7102 내지 3.852
F11 0.7024 내지 3.602
이들 연구는, 길항제 A 및 라니비주맙의 예시적인 공제형이 적어도 12개월 동안 4℃에서 보관된 후에도, 길항제 A가 VEGF 활성을 억제하는 라니비주맙의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것과 라니비주맙이 PDGF-BB 활성을 억제하는 길항제 A의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 4
길항제 A 및 라니비주맙을 포함하는 조성물의 안정성에 대한 보관 조건의 효과
상이한 보관 온도 및 상이한 보관 용기의 효과를 평가하기 위해, 다양한 조성물에서 길항제 A 및 라니비주맙의 안정성을 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 이용하여 조사하였다. 미세-유동 이미지화(MFI)에 의해 길항제 A(30mg/mL), 라니비주맙(10 mg/mL 및 40 mg/mL), 및 길항제 A 및 라니비주맙의 다양한 조합에 대해 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 수행하였다. 각 제형에 대한 육안으로 보이지 않는 입자 수에 대한 보관 온도(4시간 동안 5℃ 및 30℃) 및 보관 용기(2 cc 바이알 및 1 mL 주사기)의 효과를 평가하기 위해 총 5개의 별개의 조성물을 상이한 보관 조건 후 분석하였다. 각 샘플에 대한 MFI 결과들을 특정 입자 크기 범위(총, ≥ 2 μm, ≥ 5 μm, ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm를 포함)로 나타내었다. 입자 수의 일부 상대적 상관관계가 동일한 조건 하에서 보관된 상이한 샘플에 대해 관찰되었다.
물질
하기 길항제 A 및 라니비주맙 조성물을 연구에 사용하였다:
(1) 10 mM 인산나트륨 및 150 mM 염화나트륨, pH 7.3(조성물 F27) 중에 30 mg/mL 길항제 A 0.23 mL을 함유하는 30개의 바이알.
(2) 10 mM 히스티딘 HCl, 10% α,α-트레할로오스 및 0.01% 폴리소르베이트 20, pH 5.5(조성물 F28; Genentech, South San Francisco, CA) 중에 10 mg/mL 라니비주맙 0.5 mL을 함유하는 9개의 바이알 .
(3) 10 mM 히스티딘 HCl, 10% α,α-트레할로오스 및 0.01% 폴리소르베이트 20, pH 5.5(조성물 F29; Genentech, South San Francisco, CA) 중에 40 mg/mL 라니비주맙 0.5 mL을 함유하는 7개의 바이알.
조성물 제조를 위해 사용된 용기 물질이 표 9에 열거되어 있다.
표 9: 샘플 제조에 사용된 용기 물질
항목 설명 판매인 Cat #
5cc 바이알 제 1형 보로실리케이트 유리, 20mm 피니쉬 Schott 68000344
2cc 바이알 제 1형 보로실리케이트 유리, 13mm 피니쉬 Schott 68000314
13mm 바이알 스토퍼 FluroTec 코팅된 13mm 혈청 스토퍼 West 19700004
13mm 알루미늄 씰 플립-오프 캡을 갖는 알루미늄 크림프 씰 West 54130229
1mL 주사기 Luer-Lok 팁 멸균한 주사기 BD 309628
주사기 스토퍼 브로모부틸 제형, 4023/50 Gray West
1000㎕ 배리어 팁* 전-멸균한, 천연 폴리프로필렌 1000㎕ 팁 Neptune BT1000
25G 11/2 니들 precisionGlide 바늘 BD 305127
† 바이알은 밀리-Q로 세정하고 사용 전 건조함
* Potein Simple에 의한 MFI 기기를 사용할 것이 추천됨.
조성물 제조
본 연구에서 조사된 조성물을 제조하기 위해, 동일한 샘플, 즉, 길항제 A 또는 라니비주맙의 바이알들을 함께 모았다. 이 과정에서 30 mg/mL 길항제 A의 30개의 바이알(0.20mL/바이알)을 5 cc 유리 바이알에 모으고, 10 mg/mL 라니비주맙의 7개의 바이알(0.5mL/바이알)을 별도의 5 cc 유리 바이알에 모으고, 40 mg/mL 라니비주맙의 7개의 바이알(0.5 mL/바이알)을 세 번째 5 cc 유리 바이알 내로 모았다. 30 mg/mL 길항제 A의 바이알이 0.23 mL를 함유하는 것으로 의도되었음에도 불구하고, 모을 때 각 바이알마다 단지 ~0.2 mL만이 회수되었다. 각 바이알로부터 마개를 제거하고 무균 방식으로 피펫을 통해 내용물을 옮김으로써 모으는 것을 수행하였다. 상기 모여진 물질의 다양한 조합을 이용하여 깨끗한 유리 바이알 내에서 2개의 추가적인 샘플을 제조하였다. 표 10은 본 연구를 위해 제조된 5개의 샘플 각각에 대한 내용물을 상세히 설명한다. 샘플 청결을 보증하고 입자 오염을 막기 위해, 모든 통합 및 샘플 제조를 클래스 100 생물학적 안전성 캐비닛(Nuaire NU-425-600)에서 수행하였다.
표 10: MFI 분석을 위한 조성물 매트릭스
조성물 샘플 설명 충전된 용기 용기 당 채워진 용량
F27 30 mg/mL Ant. A 3 바이알 및
2 주사기		 0.5 mL
F28 10 mg/mL 라니비주맙 3 바이알 및
2 주사기		 0.5 mL
F29 40 mg/mL 라니비주맙 3 바이알 및
2 주사기		 0.5 mL
F30 50% F27 및 50% F28
(용적에 의한)		 3 바이알 및
2 주사기		 0.5 mL
F31 80% F27 및 20% F29
(용적에 의한)		 2 바이알 및
2 주사기*		 0.5 mL
* 하나의 바이알을 충진하는데 충분한 부피의 F31을 이용할 수 없었으므로, 이 제형의 경우 단지 2개의 바이알을 충진하였음.
"Ant. A"는 길항제 A임.
이 과정에서, 2개의 주사기 및 2개의 바이알에서 제조된 F31을 제외하고, 총 2개의 1 mL 주사기 및 0.5 mL 충진 부피의 3개의 2 cc 유리 바이알에서 각 샘플을 제조하였다. 상기 다양한 조성물들을 개별적으로 준비하여 MFI 기기 상에 정확한 시점 분석을 가능하게 하였다. 제조 후, 각 용기에 스토퍼를 장착하고, 샘플을 안정성-연구 조건에 두었다.
보관 상태
육안으로 보이지 않는 입자의 수준에 미치는 보관 온도 및 용기 유형의 영향을 결정하기 위해, 각 조성물의 샘플을, 바이알 또는 주사기에서, 4시간 동안 5℃ 또는 30℃에서 보관하였다. 충진 후 즉시 유리 바이알 내 샘플에 대해 T=0 분석을 수행하였다. 본 연구를 위한 온도 조건 및 분석 시점이 표 11에 나타나 있다.
표 11: 온도 조건 및 분석 시점
샘플 유형 보관 온도 시점(들)
바이알 중 조성물 5℃ 및 30℃ 0 및 4 시간
주사기 중 조성물 5℃ 및 30℃ 4 시간
분석적 분석 및 데이터 가공
크기 측정 및 육안으로 보이지 않는 입자 수를 Brightwell Technologies, model # DPA-4200을 이용하여 수집하였다. 각 샘플 0.5 mL을 분석을 위한 유동 셀의 상부에 올려진 유입구 포트를 통해 피펫 팁을 이용하여 직접 적용하였다. 이 과정에서, 유동 셀을 0.17 mL의 샘플로 퍼징하여, 입자 평가를 위해 대략 0.30 mL를 제공하였다.
총 입자 수에 포함된 공기 기포 및 비-단백질성 입자의 수를 줄이기 위해 MFI 데이터를 삭감하였다. 이 과정에서, 각 샘플에서 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질성 입자를 분리하고 평가하기 위한 시도로, 부착된 입자, 느리게 이동하는 입자, 높은 원형도를 갖는 기포-유사 입자들을 데이터로부터 제거하였다. 각 입자의 특성이 적절하게 스크리닝될 수 있도록, 에지 입자를 또한 본 삭감에서 제거하였다
MFI 분석으로부터의 결과들을 샘플 당 입자수로서 수득하였다. 획득된 입자 수를 분석된 정확한 부피(대략 0.30 mL)로 나눠, 이들 데이터를 샘플 mL 당 입자의 단위로 변환하였다. 샘플의 mL 당 입자의 값은 가장 가까운 정수로 반올림하였다.
결과 및 논의
표 12는 본 연구에서 분석된, 5개의 조성물, F27 내지 F31에 대한 MFI 분석의 결과를 요약한다. 각 보관 조건 하에 조성물에 대한 미가공 및 삭감된 MFI 데이터가 총 입자 수/mL, 및 ≥ 2 μm, ≥ 5 μm, ≥ 8 μm, ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm의 입자 크기에서 입자 수/mL로 제시되어 있다. 상이한 온도 및 용기 조건 동안 다양한 결과들이 관찰되었다.
표 12. 다양한 조건에서 보관된 조성물 F27 내지 F31의 MFI 결과
조성물 조건 원 MFI 데이타
(입자 / mL ) 		공제된 MFI 데이타
(입자 / mL )
총 ≥2㎛ ≥5㎛ ≥10㎛ ≥25㎛ 총 ≥2㎛ ≥5㎛ ≥10㎛ =≥25㎛
물 없음 498 239 39 13 0 318 141 23 7 0
F27 T=0 30482 5046 531 75 20 27185 4552 406 69 16
5 ℃ 바이알에서 (4 시간) 29050 4466 518 49 3 25380 3749 200 23 0
30 ℃ 바이알에서
(4 시간)		 29748 4322 321 46 3 26192 3870 262 46 3
5 ℃ 주사기에서 (4 시간) 59955 15995 2835 226 3 51408 12865 1380 72 3
30 ℃ 주사기에서
(4 시간)		 60351 16181 2638 265 3 51041 12305 983 36 0
F28 T=0 22788 4231 193 23 3 20399 3788 167 20 3
5 ℃ 바이알에서 (4 시간) 29902 5990 623 151 26 26989 5155 406 102 20
30 ℃ 바이알에서
(4 시간)		 26553 5322 531 102 13 24207 4811 416 82 10
5 ℃ 주사기에서 (4 시간) 20648 3490 210 43 13 18649 3188 197 43 13
30 ℃ 주사기에서
(4 시간)		 54082 11554 1583 292 52 48908 10555 1265 249 49
F29 T=0 17889 3598 426 69 7 16398 3342 383 49 3
5 ℃ 바이알에서 (4 시간) 37190 7956 1268 216 36 33965 7396 1222 213 33
30 ℃ 바이알에서
(4 시간)		 68393 14068 2212 210 23 62373 13442 2127 206 23
5 ℃ 주사기에서 (4 시간) 57917 12489 2066 380 39 51027 10416 1774 338 36
30 ℃ 주사기에서
(4 시간)		 42190 9405 1462 220 13 38753 8923 1396 216 13
F30
T=0 58241 14759 2320 383 36 49908 11708 1065 236 36
5 ℃ 바이알에서 (4 시간) 80979 19770 2681 315 49 79210 18000 1616 197 33
30 ℃ 바이알에서
(4 시간)		 76893 17905 1891 151 13 67033 15123 1167 111 13
5 ℃ 주사기에서 (4 시간) 90128 22820 2972 279 29 76392 17708 1104 72 13
30 ℃ 주사기에서
(4 시간)		 84961 20723 2123 141 26 73583 16994 1232 111 20
F31
T=0 69978 19046 3161 310 27 53929 9712 722 78 17
5 ℃ 바이알에서 (4 시간)* N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
30 ℃ 바이알에서
(4 시간)△ 		401875 132486 25652 3883 239 324874 107470 16198 3277 233
5 ℃ 주사기에서 (4 시간) 103463 28893 4832 683 89 87777 22848 2578 290 41
30 ℃ 주사기에서
(4 시간)		 104495 26232 3628 288 23 90518 22565 2048 111 23
* 이 특정 조건을 분석하는데 충분한 부피의 F31이 이용될 수 없었음.
△ F31의 낮은 부피로 인해, 이 샘플은 주사기 내로 들어온 F31의 일부로부터 제조되었음.
T=0에서의 온도는 실온이었음.
상이한 보관 조건 후, 조성물 F27 내지 F31에 대한 삭감된 MFI 결과가 각각 도 79 내지 83 내의 히스토그램으로서 그래프로 나타나 있다. 이들 히스토그램은 1 내지 2 μm, 2 내지 5 μm, 5 내지 10 μm, 10 내지 25 μm, 25 내지 50 μm, 50 내지 75 μm 및 75 내지 100 μm를 포함하는, 다양한 크기 범위에서 각 샘플에 대한 입자 수를 제시한다. 이들 도면은 또한 상이한 보관 조건 후 조성물에 대한 다양한 결과를 보여준다.
도 84는 상이한 보관 조건에서 각각의 샘플에 대해 삭감된 MFI 결과를 비교한다. 이 도면에서, 1 내지 2 μm, 2 내지 5 μm, 5 내지 10 μm, 10 내지 25 μm, 25 내지 50 μm 및 50 내지 75 μm에서 입자 수를 평가하였다. 30℃에서 4시간 후 유리 바이알에서 F31에 대해 관찰된 높은 입자 수는 샘플 처리 사안으로부터 비롯될 수 있다. 그러나, 부가적인 샘플을 재분석에 이용할 수 없었다.
결론
길항제 A, 라니비주맙 및 길항제 A 및 라니비주맙의 다양한 조합에 대한 입자 분석의 실행을 MFI에 의해 수행하였다. 5가지 조성물의 총 24개의 상이한 샘플을 2 cc 유리 바이알 또는 1 mL 주사기에서 5℃ 및 30℃에서 4시간 보관한 후 본 연구에서 분석하였다. 각각의 샘플에 대한 결과들을 ≥ 2 μm, ≥ 5 μm, ≥ 10 μm, ≥ 25 μm를 포함하는 특정 입자 크기 범위 및 총 입자 수로서 제시하였다. 상당한 차이가 관찰되지 않았으나, 30℃ 보관 후 유리 바이알에서 F31에 대해 더 높은 입자 수가 검출되었다.
실시예 5
길항제 A의 합성
길항제 A의 32-머 올리고뉴클레오타이드의 반복적인 화학적 합성을 통과액 반응기 설계를 이용하여 고체상 역전된 데옥시리보티미딘 조절된 공극 유리(CPG) 지지체 상에서 수행하였다. 올리고뉴클레오타이드 합성 공정은 하기 순서로 수행된 4개의 화학적 반응으로 구성되었다: (a) 디메틸옥시트리틸(DMT) 보호된 뉴클레오사이드 또는 초기 올리고뉴클레오타이드의 탈블로킹(탈트리틸화); (b) 들어오는 포스포르아미다이트의 활성화 및 커플링(아미다이트); (c) 그 결과로 생긴 포스파이트 트리에스테르의 5가 인산염 연결로의 산화; 및 (d) 성공적으로 쌍을 이루지 못한 올리고뉴클레오타이드 사슬의 캡핑.
역전된 티미딘 CPG 지지체(3'-DMT-5'-dT-CPG)로 개시하여, 헥실아미노 링커로 끝나는 원하는 올리고뉴클레오타이드가 합성될 때까지 순서대로 포스포르아미다이트를 첨가하는 상기 4단게를 반복하였다. 내부 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 다른 포스포르아미다이트과 동일한 방식으로 커플링하였다.
상기 사이클의 제 1 단계는 초기 올리고뉴클레오타이드 사슬의 말단 하이드록실 그룹 상의 디메티옥시트리틸 보호 그룹의 제거를 포함하였다. 이것은 CPG 상의 DMT 보호된 올리고뉴클레오타이드를 디클로로메탄 중의 디클로로아세트의 용액으로 처리함으로써 달성되었다. 이 반응은 비보호된 말단 하이드록실 그룹을 생산하였다. 디클로로아세트산/디클로로메탄(DCA/DCM) 용매를 이용하여 상기 절단된 DMT 그룹을 제거하였다. 그리고 나서, CPG를 아세토니트릴(ACN)로 세정하였다.
제 2 단계는 들어오는 포스포르아미다이트를 에틸티오테트라졸(ETT)로 활성화시켜 이전 단계에서 생성된 말단 하이드록실 그룹과 빠르게 쌍을 이룰 종을 생산하는 것을 포함하였다. 그 결과로 생긴 포스파이트 트리에스테르를 ACN으로 세정하여 활성제 및 미반응된 포스포르아미다이트를 제거하였다.
제 3 단계는 새로 형성된 포스파이트 트리에스테르를 5가 인산염으로의 산화하는 것이었다. 이것은 포스파이트 트리에스테르를 물 중의 요오드 및 피리딘의 혼합물과 반응시킴으로써 달성되었다. 사용되지 않은 산화제를 ACN을 이용하여 CPG로부터 세정하였다.
제 4 단계는 쌍을 이루지 못한 임의의 미반응된 하이드록실을 캡핑하는 것을 포함하였다. CPG를 CAP NMI(ACN 중의 N-메틸이미다졸) 및 CAP ALA(아세트산 무수물, 2,6-루티딘, ACN)의 혼합물로 처리하였다. 이들 시약을 ACN을 이용하여 CPG로부터 세정하였다.
이러한 4개 반응의 사이클을 정확한 길이 및 서열의 올리고뉴클레오타이드가 고형 지지체 상에서 조립될 때까지 반복하였다. 마지막 포스포르아미다이트(올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 있는 헥실아미노 링커)를 합성에서 사용된 다른 포스포르아미다이트와 동일한 방식으로 반응시켰으나, 이 링커는 캡핑되지 않았다.
합성된 미가공 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 고형 지지체를, t-부틸 아민/암모늄 하이드록사이드 용액으로 처리함으로써 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고 절단하였다. CPG를 상기 탈보호되고 절단된 올리고뉴클레오타이드로부터 분리하였다. 완전히 탈보호된 미가공 올리고뉴클레오타이드의 순도를 분석적 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정하였고, 이는 50%를 초과하는 사양을 만족하였다.
그 결과로 생긴 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨에 대해 정용여과하여 아민 염을 제거하였다.
그리고 나서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 있는 일차 아민과 페길화 시약(mPEG2-NHS 에스테르) 사이에 공유 결합을 형성시켰다. 상기 반응은 나트륨 보레이트 완충액 중에서 pH 9에서 수행하였다. 상기 반응은 기재된 페길화 조건을 이용하여 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 있는 헥실아미노 링커에 부위 특이적인 것으로 입증되었다.
상기 페길화된 올리고뉴클레오타이드를 접합되지 않은 PEG 시약으로부터 정제하고, 페길화되지 않은 앱타머, 및 다른 부산물을 분취 음이온 교환 크로마토그래피(AX HPLC)에 의해 정제하였다. 개별적인 분획들을 분석 AX HPLC에 의해 분석하였다. 전장 페길화된 올리고뉴클레오타이드의 선택된 분획을 모으고, 얻어진 집단을 탈염하고, 농축하고, 여과하였다.
얻어진 길항제 A를 진공 동결건조시켜 수분 함량을 감소시켰다.
실시예 6
길항제 A 및 길항제 A + 아플리버셉트 공제형에 의한 3T3 섬유아세포 세포에서 PDGF-BB-유도된 BTG2 발현의 억제
길항제 A와 아플리버셉트와의 공제형이 길항제 A의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 입증하기 위해, PDGF-BB 활성을 억제하는, 길항제 A 또는 길항제 A 및 아플리버셉트 모두를 포함하는 조성물의 능력을 결정하였다.
물질 및 방법
길항제 A의 항-PDGF 활성을, NIH 3T3 세포에서, PDGF-BB 반응성 유전자인 B-세포 전좌 유전자 2(BTG2)의 PDGF-BB 유도를 억제하는 능력에 의해 결정하였다.
NIH3T3 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Gibco), 10% 소혈청(CS), 2 mM 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 0.5 mL의 배양 배지에서 24-웰 플레이트 상에 시딩하고(4 x 104세포/웰), 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 24시간 후, 세포를 처리 전 9시간 동안 1% CS, 2 mM 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(기아 배지)에서 혈청 기아시켰다.
길항제 A의 EC50을 결정하기 위해, 세포를 PDGF-BB(양성 대조군) 또는 하기 조성물 중 하나와 조합된 PDGF-BB로 처리하였다: 길항제 A(조성물 F32); 길항제 A + 아플리버셉트(조성물 F33); 또는 길항제 A + PBS(조성물 F34). PDGF-BB는 1.65 nM의 농도로 사용하였다(인간 PDGF-BB; Preprotech, London, UK). 조성물을 제조하기 위해 사용된 길항제 A의 스톡 용액은 10 mM Na 인산염 및 150 mM NaCl, pH 7.3 중에 30 mg/ml 길항제이다. 시판되는 Eylea?(10 mM 인산나트륨, 40 mM 염화나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 20, 및 5% 수크로오스, pH 6.2 중에 40 mg/mL 아플리버셉트)를 조성물 F33을 제조하기 위한 스톡 용액으로서 사용하였다. 조성물 F33의 경우, 길항제 A 및 아플리버셉트를 등몰 농도로 배양하고 사용하기에 앞서 4℃에서 밤새 보관하였다. 대조군으로서 조성물 F33의 경우, 길항제 A 및 아플리버셉트를 등몰 농도로 배양하고 사용하기 앞서 4℃에서 밤새 보관하였다. 조성물 F33에 대한 대조군으로서, 길항제 A를 PBS와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다(조성물 F34). 이들 처리를 위해, 사용하기 전 즉시 조성물 F32, F33 및 F34의 연속 희석물을 기아 배지에서 제조하였다. 시리즈 희석물에서의 길항제 A 농도는 하기와 같았다: 각각 400 nM, 80 nM, 16 nM, 3.2 nM 및 0.64 nM. 조성물 F33의 연속 희석물에서 아플리버셉트의 몰 농도는 조성물 F33의 각각의 연속 희석물에서의 길항제 A의 몰 농도와 동일하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안, 상기 기재된 농도에서, 상기 기재된 연속 희석 중 하나와 조합으로 또는 단독으로, PDGF로 처리하였다. 추가의 대조군 세포는 처리하지 않은 상태로 두었다.
처리 후 즉시, 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini 스핀 칼럼 키트(Qiagen, Germantown, MD)를 이용한 RNA 단리를 위해 세포를 수확하였다. 얻어진 총 RNA를 260 nm에서 광학 밀도(O.D.)에 의해 정량화한 후 DNAse I로 처리하여 임의의 오염원성 게놈 DNA를 제거하였다. 그리고 나서, 제조자의 설명에 따른 QuantiTect? 역전사 키트(Qiagen)를 이용한 역전사에 의해 cDNA 합성을 수행하였다. 아플리버셉트의 부재시 길항제 A(조성물 F32 및 F34) 및 길항제 A + 아플리버셉트 혼합물(조성물 F33)의 PDGF-BB 활성을 억제하는 능력을 평가하기 위해, 특이적 마우스 TaqMan 프로브(Applied Biosystems; Foster City, CA)를 이용하여 BTG2 유전자 상에서 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 내부 대조군으로서 마우스 베타-액틴 TaqMan 유전자 분석을 사용하였다(Applied Biosystems).
상기 실험을 삼반복으로 수행하였고, 데이터를 평균값 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다. 통계적 및 비-선형회귀 분석을 위해 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하였다. 각 조건에 대한 BTG2 유전자 발현에서의 상대적 변화를 결정하기 위해,실시간 PCR 실험으로부터 수득한 모든 데이터를 길항제 A의 부재시 PDGF-BB-처리된 샘플(양성 대조군)에 대해 정규화하였다.
결과
길항제 A는 3T3 세포에서 PDGF-BB-유도된 BTG2 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있었다(도 85). 더욱이, BTG2 발현을 억제하는 길항제 A의 능력은 아플리버셉트와의 전-배양에 의해 타협되지 않았다(도 86). 길항제 A에 대해 결정된 EC50 값이 표 13에 나타나 있다.
표 13. 다양한 조성물에서 길항제 A의 EC 50 95% 신뢰 구간
조성물 EC 50 95% 신뢰구간 ( nM )
F32 0.530 내지 1.547
F33 0.537 내지 1.701
F34 0.351 내지 0.659
이들 연구는 길항제 A 및 아플리버셉트의 공제형이 4℃에서 밤새 보관될 때, 그의 항-PDGF 생물학적 활성에 의해 측정된 바와 같이, 길항제 A의 안정성을 유지할 수 있었음을 입증하였다. 길항제 A와 아플리버셉트와의 공제형은 길항제 A의 활성에 대해 부정적인 영향을 미치지 않았다.
본 명세서에서 언급된 또는 임의의 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공보 모두는 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있다.
전술한 것으로부터, 본 발명의 특정 구현예가 예시를 위해 본원에 기재되었음에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이뤄질 수 있음이 인식될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Ophthotech Corp. Everett, Richard Chang, Byeong Seon <120> COMPOSITIONS COMPRISING AN ANTI-PDGF APTAMER AND A VEGF ANTAGONIST <130> OPHT-010/02WO 315137-2198 <150> US 61/778,208 <151> 2013-03-12 <150> US 61/654,672 <151> 2012-06-01 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> uridine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cytidine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> gm <400> 1 caggcuacg 9 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> uridine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> cytidine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> adenosine is 2'-O-Methyl <400> 2 cgtagagcau ca 12 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cytidine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> uridine is 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> inverted thymidine <400> 3 tgatccugt 9 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (10)..(32) <223> From nucleotides 10 to 32, all purines (A and G) and all pyrimdines (C and U) are 2'-O-Methyl <400> 4 caggctacga ugcaguuuga gaagucgcgc aucgtagagc atcagaaatg atcctgt 57 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (10)..(30) <223> From nucleotides 10 to 30, all purines (A and G) and all pyrimdines (C and U) are 2'-O-Methyl <400> 5 caggctacgu gcaguuugag aagucgcgca cgtagagcat cagaaatgat cctgt 55 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 6 cacaggctac ggcacgtaga gcatcaccat gatcctgtgt 40 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backbone between nucleotides 47-49 <400> 16 gtgaacgttc gagcaggcta cggcacgtag agcatcacca tgatcctgc 49 <210> 17 <211> 64 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> phoshporothiate backbone between nucleotides 1-23 <220> <221> misc_feature <222> (56)..(64) <223> phoshporothiate backbone between nucleotides 56-64 <400> 17 tgactgtgaa cgttcgagat gacaggctac ggcacgtaga gcatcaccat gatcctgttt 60 tttt 64 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-13 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(34) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 31-34 <400> 18 caggctacgt tcgtagagca tcaccatgat cctg 34 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(14) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-14 <220> <221> misc_feature <222> (32)..(35) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 32-35 <400> 19 caggctacgt ttcgtagagc atcaccatga tcctg 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(14) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-14 <220> <221> misc_feature <222> (32)..(35) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 32-35 <400> 20 caggcaacgt ttcgttgagc atcaccatga tcctg 35 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-13 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(34) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 31-34 <400> 21 caggcaacgt tcgttgagca tcaccatgat cctg 34 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(15) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-15 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 22 caggcaacgt tttcgttgag catcaccatg atcctg 36 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (32)..(35) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 32-35 <400> 23 caggctacgt ttcgtagagc atcaccatga tcctg 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-3 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(35) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-35 <400> 24 caggctacgt ttcgtagagc atcaccatga tcctg 35 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosporothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosporothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 25 caggcgtcgt tttcgacgag catcaccatg atcctg 36 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 26 caggcgtcgt cgtcgacgag catcaccatg atcctg 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 27 caggcttcgt cgtcgaagag catcaccatg atcctg 36 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 28 caggctacgt cgtcgtagag catcaccatg atcctg 36 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(14) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-14 <220> <221> misc_feature <222> (32)..(35) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 32-35 <400> 29 caggcaagct ttgcttgagc atcaccatga tcctg 35 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 1-4 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(15) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 8-15 <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> phosphorothioate backbone between nucleotides 33-36 <400> 30 caggcaagct tttgcttgag catcaccatg atcctg 36 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> gm <400> 31 caggctacg 9 <210> 32 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> adenosine is 2'-O-Methyl <400> 32 cgtagagcat ca 12 <210> 33 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <400> 33 tgatcctg 8 <210> 34 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> gm <400> 34 caggcuacg 9 <210> 35 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> adenosine is 2'-O-Methyl <400> 35 cgtagagcau ca 12 <210> 36 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <400> 36 tgatccug 8 <210> 37 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 37 caggctacg 9 <210> 38 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 38 cgtagagcat ca 12 <210> 39 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 39 tgatcctg 8 <210> 40 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(9) <223> All purines (A and G) and all pyrimidines (C and U) are 2'-O-Methyl <400> 40 caggcuacg 9 <210> 41 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> All purines (A and G) and all pyrimidines (C and U) are 2'-O-Methyl <400> 41 cguagagcau ca 12 <210> 42 <211> 8 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(8) <223> All purines (A and G) and all pyrimidines (C and U) are 2'-O-Methyl <400> 42 ugauccug 8 <210> 43 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 43 acaggctacg 10 <210> 44 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 44 tgatcctgt 9 <210> 45 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 45 cacaggctac g 11 <210> 46 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 46 tgatcctgtg 10 <210> 47 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> adenosine is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> gm <400> 47 caggctacg 9 <210> 48 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> um <400> 48 tgatccugu 9 <210> 49 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> um <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> gm <400> 49 tgatccugug 10 <210> 50 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> gm <400> 50 caggctacg 9 <210> 51 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> um <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> gm <400> 51 caggcuacg 9 <210> 52 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-Methyl adenosine <400> 52 cgtagagcat ca 12 <210> 53 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-Methyl adenosine <400> 53 cgtagagcau ca 12 <210> 54 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cm <400> 54 caggcuacg 9 <210> 55 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> cm <400> 55 cguagagcau ca 12 <210> 56 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> um <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> um <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <400> 56 ugauccug 8 <210> 57 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <400> 57 tgatccug 8 <210> 58 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> gm <400> 58 cacaggctac g 11 <210> 59 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 59 tgatcctgtg 10 <210> 60 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> um <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> gm <400> 60 tgatccugug 10 <210> 61 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> um <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> gm <400> 61 cacaggcuac g 11 <210> 62 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <400> 62 tgatccug 8 <210> 63 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> gm <400> 63 tgatcctg 8 <210> 64 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> gm <400> 64 cccaggctac g 11 <210> 65 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (8)..(10) <223> gm <400> 65 tgatcctggg 10 <210> 66 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (8)..(10) <223> gm <400> 66 tgatcctggg 10 <210> 67 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 67 tgatcctggg 10 <210> 68 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> cm <400> 68 tgatcctggg 10 <210> 69 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 69 aacgttcgag 10 <210> 70 <211> 87 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(87) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 70 gggaaaagcg aaucauacac aagaucgcca ggagcaaagu cacggaggag uggggguacg 60 aaugcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87 <210> 71 <211> 88 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 71 gggaaaagcg aaucauacac aagaccggga acucggauuc uucgcaugug gaugcgauca 60 guaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 72 <211> 88 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 72 gggaaaagcg aaucauacac aagaccggga acucggauuc uucacaugug gaugugauca 60 guaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 73 <211> 88 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 73 gggaaaagcg aaucauacac aagaccggaa acucggauuc uucgcaugug gaugcgauca 60 guaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 74 <211> 88 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 74 gggaaaagcg aaucauacac aagagagugg aggagguaug uaugguuugu gcgucuggug 60 cggugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PDGF aptamer <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> Inverted thymidine nucleotide that is attached to the 3' end of the oligonucleotide at the 3' position on the ribose sugar <400> 75 caggctacgc gtagagcatc atgatcctgt 30 <210> 76 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-VEGF antibody heavy chain variable domain <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa = Thr or Asp <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa = Asn or His <220> <221> VARIANT <222> (101)..(101) <223> Xaa = Tyr or His <220> <221> VARIANT <222> (105)..(105) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-VEGF antibody heavy chain variable domain <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 81 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-VEGF antibody light chain variable domain <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa = Met or Leu <400> 81 Asp Ile Gln Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 82 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-VEGF antibody light chain variable domain <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant hypervariable region of CDRH1 <400> 83 Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant hypervariable region of CDRH3 <400> 84 Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 85 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-Trap - dimeric fusion polypeptide comprising two fusion polypeptides <400> 85 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 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Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

Claims (49)

  1. 유효량의,
    (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 라니비주맙(ranibizumab) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및
    (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충제; 및 (d) 장성 조절제(tonicity modifier) 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘이거나 약 1 mM 내지 약 20 mM 소듐 포스페이트이고;
    상기 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 완충제는 약 1 mM 내지 약 20 mM L-히스티딘이고;
    상기 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (e) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 10 mM L-히스티딘; 및
    (d) 약 130 mM NaCl을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    (e) 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 10 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 5%(w/v) 소르비톨을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    (e) 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 10 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 130 mM NaCl을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    (e) 약 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 5 mM 소듐 포스페이트;
    (d) 약 5 mM 히스티딘 HCl;
    (e) 약 75 mM NaCl; 및
    (f) 약 5%(w/v) 트레할로오스를 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.5인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    (g) 약 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  13. 유효량의,
    (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및
    (b) 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 베바시주맙(bevacizumab) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및,
    (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0으로 달성 또는 유지할 수 있는 완충제; 및 (d) 장성 조절제(tonicity modifier) 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 완충제는 약 5 mM 내지 약 200 mM 소듐 포스페이트이거나 약 5 mM 내지 약 200 mM Tris.HCl이고;
    상기 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl, 약 1% 내지 약 20%(w/v) 소르비톨, 또는 약 1% 내지 약 20%(w/v) 트레할로오스인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 완충제는 약 5 mM 내지 약 200 mM 소듐 포스페이트이고;
    상기 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl이며,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0인, 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (e) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 50 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 130 mM NaCl을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    (e) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 50 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 5%(w/v) 소르비톨을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    (e) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 50 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 5%(w/v) 소르비톨을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    e) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  23. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 50 mM 소듐 포스페이트; 및
    (d) 약 150 mM NaCl을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 7.0인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    (e) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  25. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 50 mM Tris.HCl; 및
    (d) 약 130 mM NaCl을 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 8.0인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    (e) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  27. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 15 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 30 mM 소듐 포스페이트;
    (d) 약 75 mM NaCl; 및
    (e) 약 3%(w/v) 트레할로오스를 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.3인, 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    (f) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  29. 제14항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 3 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 12.5 mg/mL 베바시주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 30 mM 소듐 포스페이트;
    (d) 약 75 mM NaCl; 및
    (e) 약 3%(w/v) 트레할로오스를 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.3인, 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    (f) 약 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  31. 유효량의,
    (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트(aflibercept) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및,
    (c) 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0로 달성 또는 유지할 수 있는 완충제; (d) 장성 조절제(tonicity modifier); 및 (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM 포스페이트이고;
    상기 장성 조절제는 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 0.3 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 5 mM 내지 약 50 mM 포스페이트;
    (d) 약 10 mM 내지 약 200 mM NaCl; 및
    (e) 0 내지 약 10%(w/v) 수크로오스를 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0인, 조성물.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (f) 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.05%(w/v) 계면활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 6 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 40 mg/mL 아플리버셉트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 10 mM 포스페이트;
    (d) 약 40 mM NaCl; 및
    (e) 약 5%(w/v) 수크로오스를 포함하고,
    상기 조성물의 pH는 약 pH 6.2인, 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    (f) 약 0.03%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  37. 유효량의,
    (a) 약 3 mg/mL 내지 약 90 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 1.0 mg/mL 내지 약 30 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및,
    (c) 상기 조성물의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0으로 달성 또는 유지할 수 있는 완충제; 및 (d) 장성 조절제(tonicity modifier) 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 완충제는 약 1 mM 내지 약 100 mM 소듐 포스페이트이거나 약 1.0 mM 내지 약 10 mM 히스티딘.HCl을 포함하고;
    상기 장성 조절제는 약 0.5%(w/v) 내지 약 10%(w/v) 트레할로오스인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 15 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 5 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 5 mM 포스페이트;
    (d) 약 75 mM NaCl;
    (e) 약 5 mM 히스티딘.HCl; 및
    (f) 약 5%(w/v) 트레할로오스를 포함하는, 조성물.
  40. 제39항에 있어서,
    (g) 약 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 약 24 mg/mL 길항제 A 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (b) 약 8 mg/mL 라니비주맙 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
    (c) 약 8 mM 포스페이트;
    (d) 약 120 mM NaCl;
    (e) 약 2 mM 히스티딘.HCl; 및
    (f) 약 2%(w/v) 트레할로오스를 포함하는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서,
    (g) 약 0.002%(w/v) 폴리소르베이트 20을 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 안과적 질환의 치료 또는 예방이 필요한 포유동물에게 제1항, 제13항, 제31항 및 제37항 중 어느 하나의 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 안과적 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 안과적 질환은 노인성 황반 변성, 결절 맥락막 맥관병증, 맥락막 신생혈관형성과 연관된 병태, 고혈압 망막증, 당뇨 망막병증, 겸형 세포 망막증, 주변 망막 신생혈관형성과 연관된 병태, 미숙아 망막증, 정맥 폐쇄성 질환, 동맥 폐쇄성 질환, 중심 장액성 맥락망막병증, 포낭 황반 부종, 망막 모세혈관확장증, 동맥 대혈관류, 망막 혈관종증, 방사선-유도된 망막증, 홍채 조홍, 또는 종양인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 안과적 질환은 습성 노인성 황반 변성 또는 건성 노인성 황반 변성인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 조성물이 약물-전달 장치에 존재하는, 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 안구 내로 투여되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 안구 내 투여는 유리체내 투여 또는 전방 투여인, 방법.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법.
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