JP2021176282A

JP2021176282A - 非食品試料の腐敗検査方法

Info

Publication number: JP2021176282A
Application number: JP2020082348A
Authority: JP
Inventors: 昭宏栗田; Akihiro Kurita; あゆみ堀; Ayumi Hori; 豊山岸; Yutaka Yamagishi
Original assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Current assignee: Artience Co Ltd
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-11-11

Abstract

【課題】本発明は、工業製品やその原料・仕掛品等の非食品試料の、粘度・濁度が高い傾向がある物質中に存在している微生物量を培養や遠心分離の操作を経ず、簡便、迅速かつ感度の高い腐敗検査方法を提供すること目的とする。【解決手段】非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍容量以上のアデノシン三リン酸（以下ATP）発光試薬溶液を添加することを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法であって、発光試薬溶液が、ATP１０−１５moll/mlに対しての発光量が、ATP０moll/mlに対しての発光量（ブランク）を１としたとき、１０以上となる量の発光試薬を含むことを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法。【選択図】なし

Description

本発明は、非食品試料である製品あるいはその原料等に存在する微生物などの生体をAT
P発光試薬を用いることにより簡便に検査する方法に関する。

非食品である、日用品、工業製品、合成医薬品の製造においては、腐敗のリスクが伴う
ため、最終製品やそれらの原料、中間体、仕掛品等の腐敗検査を実施することが広く行わ
れている。非食品分野での腐敗検査方法としては現在のところ培養法が主流である。しか
し、培養法は結果が出るまで少なくとも2日以上必要とされ、出荷検査日を短縮できない
ボトルネックとなっている工程である。また、培養法は培地の準備、検体の播種、コロニ
ーの計数など多数の工程を経なければならず、結果判定も繁殖状態などを考慮し一義的で
ない場合がある。また、繁殖が過度に進んだ場合、判定不能で試料を減らして再検査する
必要がある。培養法を簡便に行うキットも販売されているが、日数の短縮や結果判定の簡
略化に大幅に寄与するものとは言い難い。

非食品の工業製品などには腐敗防止のため防腐剤の投入が定常的に行われている。防腐
剤は複数種の微生物の繁殖を完全に抑制される濃度になるよう複数の防腐剤を過剰に投入
されており、腐敗検査を短時間で完結できる手法があれば防腐剤に関わる費用や手間を圧
縮できる。防腐剤が必要な時に必要量を添加する制御も可能となり、非食品業界に対する
インパクトは大きい。

一方、迅速微生物試験法のひとつにＡＴＰ発光法を利用した方法がある。この方法は、
食品中の微生物が有するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）と化学発光して光を生じるルシフ
ェラーゼ及びルシフェリンを使用して、食品内のATPとルシフェラーゼ、ルシフェリンの
反応により生じた発光を計測し、発光量から微生物の存在や数を算出する方法である。Ａ
ＴＰ発光法は酵素反応であるため、感度と迅速性に優れているが、非食品製品は着色され
ている、濁度が高い、粘度が高いなどの場合が多く、発光反応の至適条件から外れたり、
測定機器の精度を著しく低下させ、微生物由来ATPの検出感度を低下させてしまう問題な
どがあり、非食品製品の検査でも培養法が採用されている。

この問題を解決する方法として提案もなされており、例えばフィルターに濾過集菌した
菌体中のアデノシン−３−リン酸（ATP）の量をルミノメーターで測定し、これから菌体
数を算出するバイオミルネッセンス法（特許文献１、２）、が知られている。しかし、こ
の方法は、高濁度・高粘度な試料に不向きであり、低濁度・低粘度の試料であっても濾過
によってフィルターが目詰まりしてしまう問題があるため、適用できる検体が限定されて
いる。食品分野では、遠心法との組合せも行われているが、エマルションなどの工業製品
には適用できない。さらに、フィルターを画像解析するためのシステムを必要としており
、簡便かつ迅速に検体に混入している微生物などの生体量を見積もる方法として適用する
ことは困難である。

特開平２−１６３０９８号特開平６−２３７７９３号

工業製品などの非食品製品、特に高粘度・高濁度の製品またはそれらの原料、仕掛品等
の腐敗検査は、培養法が主となっている。該製品の品質管理項目に腐敗検査が必須である
場合が多数であるが、培養法は結果が出るまで数日を要するため、出荷時に、該製品の腐
敗の度合いが合格範囲内であるかを迅速に判定できない諸問題を解決する手段とはならな
い現状がある。
迅速に製品中の腐敗を検査する方法として、透明度が低い検体における微生物量をバイ
オルミネッセンス法で測定する場合、検体溶液を濾過してフィルター上に残存した微生物
からＡＴＰを抽出してフィルター上でバイオルミネッセンスを生じせしめてフィルターを
画像解析する方法が採られている。しかしながら、この方法は、微生物などの生体が、生
体のまま濾過されていることが前提であり、また、専用の画像解析装置や解析プログラム
が必要である。
このような現状より、本発明は、工業製品やその原料・仕掛品等の非食品試料の、粘度
・濁度が高い傾向がある物質中に存在している微生物量を培養や遠心分離の操作を経ず、
簡便、迅速かつ感度の高い腐敗検査方法を提供すること目的とする。

すなわち本願発明は、非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍容量以上のアデノシ
ン三リン酸（以下ATP）発光試薬溶液を添加することを特徴とする非食品試料の腐敗検査
方法であって、
発光試薬溶液が、ATP１０^−１５mol/mlに対しての発光量が、ATP０mol/mlに対しての発光
量（ブランク）を１としたとき、１０以上となる量の発光試薬を含むことを特徴とする非
食品試料の腐敗検査方法に関する。

また、本願発明は、非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍容量以上のアデノシン
三リン酸（以下ATP）発光試薬溶液を添加することを特徴とする非食品試料の腐敗検査方
法であって、
発光試薬溶液が、ATP１０^−１3mol/mlに対して、発光量が10以上となる量の発光試薬を含
むことを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法に関する。

また、本願発明は、非食品試料と、ATP発光試薬溶液とを接触させる前、あるいは同時
に、緩衝能を有する物質を非食品試料に添加することを、特徴とする上記非食品試料の腐
敗検査方法に関する。

また、本願発明は、ATP発光試薬溶液を接触させる前の非食品試料が、ヒドロキシ基お
よび／またはアミノ基を２つ以上有する物質を含む上記非食品試料の腐敗検査方法に関す
る。

本発明により、工業製品やその原料・仕掛品等の非食品試料の、粘度・濁度が高い傾向
がある物質中に存在している微生物量を培養や遠心分離の操作を経ず、簡便、迅速かつ感
度の高い腐敗検査方法を提供することが可能となった。

本発明は、非食品試料が固体や粘度の高いものの場合は、溶剤を加えて溶液とする。非
食品試料が液状の場合は、溶剤を加えてもよいし、そのままでもよい。
本発明では、液状である非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍以上のATP発光試
薬溶液を添加することを特徴とする。
非食品試料に添加できる溶剤としては、一般的に用いられている生理食塩水、ペプトン
加生理食塩水、５質量％グルコース溶液などがあげられる。好ましくは、ヒドロキシ基お
よび／またはアミノ基を２つ以上有する物質を含む溶液である。具体的には、ペプトン、
低分子ペプチドなどアミノ酸、グルコースなどの糖類、あるいは、グリセリンを含む溶液
があげられる。ヒドロキシ基および／またはアミノ基を２つ以上有する物質は、生菌など
の生体を維持する効果が高いので好ましい。
非食品試料は強酸、強アルカリである場合が多く、バイオルミネッセンス反応を著しく
低下させる懸念がある。従って、非食品試料に、トリス、トリシン、MES等の緩衝能を有
する物質（緩衝剤）を添加して、pHを6.5〜8.5に維持することも好ましい。

本発明においては、非食品試料は、ATP発光試薬を添加する前のATP抽出試薬を添加する
。本発明で、用いられるATP抽出試薬は市販されているもので十分であるが、その成分と
してセチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、非イオン性界面活性剤であ
るエトキシル化アルキルフェノール等を含み、これらもバイオルミネッセンス反応を低下
させることが報告されているので、使用量は少ないことが好ましい。

ホタルルシフェラーゼによるバイオルミネッセンス反応を生じさせるATP発光試薬も、
市販されているもので十分である。ATP発光試薬は、希釈された検体溶液とATP抽出試薬と
を足し合わせた容量に対して、食品試料分野では等容量が推奨されるのに対し、少なくと
も３倍以上の容量を混合することを必要とする。一般的に、市販の発光試薬を混合したら
直ちにバイオルミネッセンス反応が開始するが、発光カイネティクスが安定するまでの時
間は販売されている試薬に依存する。故に、発光測定を開始するまでの待機時間は発光試
薬の取扱説明書の記載に従う。発光測定する装置は、光電子増倍管（フォトマルチプライ
ヤー）が装着されたルミノメーターであれば任意のものを使用できる。
検体が動植物由来の原料を含む場合がある。その場合、腐敗により生じた微生物由来の
ATP抽出操作を行う以前に高濃度のATPが既に存在している。これが原因となり、微生物由
来のATPと区別がつかなくなる。これを解決するため、微生物由来のATPを抽出する前に検
体中のATPを除去する操作が可能であると推察される。本願発明においても、この操作を
適用することができる。

本発明の腐敗検査方法において用いられるATP発光試薬は、食品試料分野より、容量を
多く必要とする。しかし、ATP発光試薬の溶液中の濃度を、食品試料分野での方法より減
らしてしまっては、本発明の技術思想を達成することはできない。本発明においては、AT
P発光試薬溶液の濃度を規定する。すなわち、ATP発光試薬溶液が、ATP１０^−１５molに対
しての発光量が、ATP０mol/mlに対しての発光量（ブランク）を１としたとき、１０以上
となる量の発光試薬を含むか、あるいは、ATP１０^−１３mol/mlに対して、発光量が10以
上となる量の発光試薬を含むことが必要である。そして、その結果、実施例において具体
的に説明するが、食品試料分野における方法が１０倍程度であるのに対しより高感度とな
っている。

なお、本発明において「腐敗」とは微生物などの生体による有機物の分解・官能基変換
などで異なる有機物となることを意味し、発酵や熟成を含み、「腐敗検査」は、前記有機
物の分解などの度合いを検査する必要があるときに行うものであり、検査する者にとって
「腐敗」が有用かどうか、または無害かどうかには関係しない。
また、市販のATP抽出試薬が使用を想定していた食品試料分野以外の分野でも、本発明
の規定する方法を用いることにより、「腐敗検査」ができることになった。本発明は、液
状の試料はもとより、粘稠な試料、固形の試料にも、幅広い非食品試料分野で適用できる
。

例えば、非食品試料の具体な適用例として、水溶性切削油剤について説明する。
水溶性切削油剤は、旋削加工で使用する機器（NC旋盤、タイレット旋盤等）の潤滑や冷
却を目的として添加が必要不可欠な工業製品である。水溶切削油剤は微生物が生育・繁殖
する好条件下にあるのが一般的である。使用期間により水溶性切削油剤の腐敗による悪臭
が発生し、工場内の作業環境の悪化や工場周辺地域の公害問題に発展するケースもある。
切削油剤の防腐対策は悪臭が発生後、対症療法的に防腐剤や殺菌剤を投与するのが一般的
であって、それらに関わる費用がかさむ傾向にある。従って、水溶性切削油剤の腐敗を人
間の官能に依存することなく迅速に予見できる手法が望まれている。

以下、実施例に本発明を具体的に説明するが、これらの発明を限定するものではない。
以下、特に断らない限り数字は質量基準を表し、「％」は、「質量％」を表す。

あらかじめ、菌士郎ATP発光キット（東洋ビーネット株式会社製）のATP発光試薬の濃度
を測定した。当該発光試薬溶液は、ATP１０^−１５mol/mlに対しての発光量が、ATP０mol/
mlに対しての発光量（ブランク）を１としたとき、１０以上であった。
また、ATP１０^−１３mol/mlに対して、発光量が１０以上であった。

比較例１
エチレン酢酸ビニルポリマー 1mlを検体希釈液である0.1%ペプトン加生理食塩水 9ml
と混合することにより１０倍希釈した。この希釈したエチレン酢酸ビニルポリマー溶液に
、大腸菌JM109株を約１０^７個/mlになるよう混合し検体溶液とした。この溶液中の微生物
量を見積もるため、ホタルルシフェラーゼの発光反応によるATPアッセイを行った。まず
、一般的に実施されている、菌士郎ATP発光キットの取扱説明書に記載されている方法で
測定を試みた。すなわち、検体溶液100μlを測定用チューブに分取し、等量のATP抽出試
薬100μlを添加した。1分間室温に静置することにより微生物からATPを抽出した。この溶
液100μlを新しいチューブに分取し、100μlのATP発光試薬を添加した。軽く撹拌し、チ
ューブを発光測定装置LB9506（ベルトールドジャパン）にセットし、10秒間の発光量を測
定した。
大腸菌を混合していないブランクでは、473（RLU/10秒）であったのに対し、大腸菌を
混合した試料は、3,326（RLU/10秒）であった。感度は、3326/473＝7倍であった。

実施例１
エチレン酢酸ビニルポリマー 1mlを検体希釈液である0.1%ペプトン加生理食塩水 9ml
と混合することにより１０倍希釈した。この希釈したエチレン酢酸ビニルポリマー溶液に
、大腸菌JM109株を約１０^７個/mlになるよう混合し検体溶液とした。検体溶液を100μlで
なく10μlをチューブに分取した。続けてATP抽出試薬を100μl投入して大腸菌からATPを
抽出した。ATP発光試薬を100μl混合し、10秒間の発光量をルミノメーターで測定した。
大腸菌を混合していないブランクでは、521（RLU/10秒）であったのに対し、大腸菌を
混合した試料は、113,775（RLU/10秒）であった。感度は、113775/521＝218倍であった。
比較例１と実施例１とを比較した結果、既存の標準的な測定法より本願発明の方法での測
定法は約31倍の発光量が確認された。

実施例２
トーヨーケム株式会社が製造販売している水性アクリル樹脂の各ロット1mlを検体希釈
液である0.1%ペプトン加生理食塩水9mlと混合することにより10倍希釈した。この溶液中
の微生物量を見積もるため、ホタルルシフェラーゼの発光反応によるATPアッセイを行っ
た。すなわち、希釈した溶液10μlをチューブに分取した。続けてATP抽出試薬を100μl投
入して大腸菌からATPを抽出した。ATP発光試薬を300μl混合し、10秒間の発光量をルミノ
メーターで測定した。結果、長期開封放置して陽性が確定しているサンプルの発光量は21
,217（RLU/10秒）であり、ブランクの発光量が644（RLU/10秒）であることより、約32倍
の発光量が認められた。発光測定の操作は開始から約30分間で完了し、培養法には実現で
きない迅速な結果判定を本願発明では実現できた。

実施例３
次に、本願発明の方法が水溶性切削油剤に適用できるかを試験した。
水溶性切削油剤「ユニクールUE-95S」「ユニクール77S」（いずれも株式会社ユニテッ
ク社製）を取扱説明書に記載の通り純水で10倍希釈した。この溶液1mlを検体希釈液であ
る1M トリス硫酸（pH7.8）により緩衝作用を持たせた0.1%ペプトン加生理食塩水9mlと混
合することによりさらに10倍希釈した。水溶性切削油剤の腐敗を再現するため、上記で調
製した溶液10mlに対して大腸菌溶液を10μl添加した。この溶液中の微生物量を見積もる
ため、ホタルルシフェラーゼの発光反応によるATPアッセイを行った。すなわち、希釈し
た溶液10μlをチューブに分取した。続けてATP抽出試薬を100μl投入して大腸菌からATP
を抽出した。ATP発光試薬を300μl混合し、10秒間の発光量をルミノメーターで測定した
。
「ユニクールUE-95S」において、大腸菌を混合していないブランクでは、402（RLU/10秒
）であったのに対し、大腸菌を混合した試料は、164,119（RLU/10秒）であった。感度は
、164119/402＝408倍であった。
「ユニクール77S」において、大腸菌を混合していないブランクでは、781（RLU/10秒）で
あったのに対し、大腸菌を混合した試料は、140,307（RLU/10秒）であった。感度は、140
307/781＝179倍であった。
結果、大腸菌を混入させた水溶性切削油剤のサンプルの発光量はその種類を問わず無菌の
サンプルの発光量より２桁上昇した。

Claims

非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍容量以上のアデノシン三リン酸（以下ATP
）発光試薬溶液を添加することを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法であって、
発光試薬溶液が、ATP１０^−１５mol/mlに対しての発光量が、ATP０mol/mlに対しての発光
量（ブランク）を１としたとき、１０以上となる量の発光試薬を含むことを特徴とする非
食品試料の腐敗検査方法。
非食品試料に、前記非食品試料の容量の３倍容量以上のアデノシン三リン酸（以下ATP
）発光試薬溶液を添加することを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法であって、
発光試薬溶液が、ATP１０^−１3mol/mlに対して、発光量が10以上となる量の発光試薬を含
むことを特徴とする非食品試料の腐敗検査方法。
非食品試料と、ATP発光試薬溶液とを接触させる前、あるいは同時に、緩衝能を有する
物質を非食品試料に添加することを、特徴とする請求項１または２記載の非食品試料の腐
敗検査方法。
ATP発光試薬溶液を接触させる前の非食品試料が、ヒドロキシ基および／またはアミノ
基を２つ以上有する物質を含む請求項１〜３いずれか記載の非食品試料の腐敗検査方法。