HU220855B1 - Process and method of investigation of the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular materials thereof - Google Patents

Process and method of investigation of the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular materials thereof Download PDF

Info

Publication number
HU220855B1
HU220855B1 HU9700091A HU9700091A HU220855B1 HU 220855 B1 HU220855 B1 HU 220855B1 HU 9700091 A HU9700091 A HU 9700091A HU 9700091 A HU9700091 A HU 9700091A HU 220855 B1 HU220855 B1 HU 220855B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
adp
sample
atp
reagent
luciferase
Prior art date
Application number
HU9700091A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76563A (en
Inventor
David James Squirrell
Original Assignee
Secr Defence Brit
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Secr Defence Brit filed Critical Secr Defence Brit
Publication of HUT76563A publication Critical patent/HUT76563A/hu
Publication of HU220855B1 publication Critical patent/HU220855B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

KIVONAT
A találmány tárgya eljárás mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározására, melynek során meghatározzák a mintában lévő adenilát-kináz mennyiségét - azon képessége alapján, hogy az hozzáadott magnéziumionok jelenlétében az adenozin-difoszfátot (ADP) adenozintrifoszfáttá (ATP) alakítja át és az adenilát-kináz mennyiségéből az organizmus és/vagy intracelluláris anyagai jelenlétére és/vagy mennyiségére következtetnek. Szintén a találmány tárgyát képezik az eljárás megvalósításához szükséges reagensek (beleértve a tisztított ADP-t és az adenilát-kináztól mentes luciferázt), valamint a reagenseket tartalmazó reagenskészletek.
HU 220 855 B1
A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 2 lap ábra)
HU 220 855 BI
A találmány tárgya eljárás mikroorganizmusok kimutatására és vizsgálatára, valamint az eljárásban alkalmazható reagensek és reagenskészletek, mely utóbbiak az eljárás megvalósítása szempontjából nélkülözhetetlen reagenseket tartalmazzák.
Kémiai energia forrásaként valamennyi élő organizmus adenozin-trifoszfátot (ATP) alkalmaz, melynek ismert meghatározási módszere az ATP-irányította luciferáz/luciferin reakció. Ezen enzimreakció során fény képződik, amely fénykibocsátás-mérővel (luminométer) mérhető, és amely a jelenlévő ATP mennyiségével arányos. Az ATP mikrobaszám indexeként való alkalmazhatósága az 1960-as évek közepe óta ismert [lásd „ATP Luminescence Rapid Methods in Mícrobiology” szerk.: Stanley és munkatársai, Blackwell Scientific Publications, London, 1-10. oldal (1989)]. Az eljárás fő előnye gyorsasága és érzékenysége. E vizsgálati módszer alkalmazásával egyszerű minták percek alatt analizálhatók, és az összetett minták vizsgálata is mindössze fél órát vesz igénybe, és az ATP kimutatási határa 10“12 mól/liter. Ennek ellenére szükség van olyan eljárásokra, amelyek mikroorganizmusok vagy azok sejttartalmának detektálásában még nagyobb érzékenységet biztosítanak, miközben gyorsaságuk és egyszerű megvalósíthatóságuk megmarad.
Felismertük, hogy az ATP-n alapuló eljárás sebessége és érzékenysége jelentős mértékben növelhető, ha a vizsgálat célpontjaként az ATP helyett az ATP-t előállító enzimet - az adenilát-kinázt - alkalmazzuk. Az adenilát-kináz valamennyi organizmus által - az adenozin-difoszfát (ADP) adenozin-trifoszfáttá (ATP-vé) történő átalakításához - használt enzim. Az ATP helyett az adenilát-kináz megcélzása - a találmány szerinti előnyös eljárás, reagensek és reagenskészletek alkalmazásával - mindössze 10 20 mól/liter koncentrációjú intracelluláris adenilát-kináz marker kimutatása is lehetséges.
Az adenilát-kináz - aktivitásának meghatározására - luciferáz/luciferin rendszerrel végzett vizsgálati eljárása ismert [Brolin és munkatársai: Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1, 163 (1979); Shutenko és munkatársai: Biotekhnologiya, 4, 542 (1988)], s ezt az eljárást felhasználták bizonyos emlős és növényi szövetek tanulmányozására is [lásd például Rodionova és munkatársai: Fiziologiya Rastenii 25(4), 731 (1978)]. Az ilyen vizsgálati rendszerek mikroorganizmusok kimutatására és elemzésére történő alkalmazását azonban nem javasolták; a vizsgálat előnyeinek - vagyis a fokozott érzékenység - felismerése nem is az enzimet önmagában tanulmányozó kutatók feladata.
Bár az adenilát-kináz kisebb mennyiségben van jelen, mint az ADP vagy az ATP, a mikroorganizmusok biológiai markereként történő alkalmazása fokozott érzékenységet biztosít; az enzim minden jelenlévő mólja 10 perces inkubálás alatt 400 000 mól ADP-t alakít át ATP-vé. Az enzim mennyiségének - az általa katalizált reakció szubsztrátjának vagy termékének mérése alapján végzett - meghatározása már mindössze 10~20 mól kimutatási határtól alkalmazható.
A találmány tárgyát mintában lévő mikroorganizmusok - a minta ADP-t ATP-vé átalakító képességén (ami a mikroorganizmusok vagy intracelluláris termékeik jelenlétére utal) alapuló - meghatározási eljárás képezi. Az eljárás magnéziumionokat szolgáltat az ADP átalakításához. Az ilyen eljárás alkalmazásával megvalósított példákban detektált sejtek száma körülbelül 102-nak bizonyult, míg 103 vagy nagyobb sejtszám esetén statisztikailag megalapozottabb eredményeket kaptunk; a luminometriás impulzusszám és a sejtszám között egyenes összefüggés tapasztalható.
Megfelelő módon az alkalmazott reagenseket úgy kezeljük, hogy az adenilát-kináz nagyobb mértékű tisztaságát érjük el, miáltal a detektálható mikroorganizmusok száma - 200 μΐ térfogatú mintában - inkább tízes, mint százas nagyságrendű, és a sejtszám és az ATP-eredetű fény mennyisége között egészen 10 sejtig egyenes összefüggés tapasztalható.
A találmány tárgya egy eljárás egy mintában lévő mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározására, melynek során a mintában lévő adenilát-kináz mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a mintát adenozindifoszfáttal (ADP) elegyítjük, meghatározzuk a minta által az ADP-ből előállított adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét, és az így termelődött ATP mennyiségéből következtetünk az adenilát-kináz, illetve a mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétére és/vagy mennyiségére. Az ADP ATP-vé történő átalakítását - az ADP ATP-vé történő, maximális mértékű átalakításához elégséges moláris koncentrációjú - magnéziumion jelenlétében végezzük. A magnézium előnyösen olyan mennyiségben van jelen, ami biztosítja, hogy az ADP-molekulák mindegyike legalább egy magnéziumionnal kapcsolódhasson.
A találmány előnyös megvalósítási módjaiban a mintát vizes szuszpenzió vagy oldat formájában vizsgáljuk, és az adenilát-kináz - és általa a mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik - értékelését úgy végezzük, hogy a mintához ADP-t és magnéziumionokat adunk (olyan körülmények között, melyek biztosítják, hogy a mintában lévő valamennyi adenilát-kináz ATP-vé alakítsa az ADP-t), a mintát előre meghatározott - az ADP ATP-vé történő átalakításához szükséges - ideig inkubáljuk, majd luciferázt és luciferint adunk hozzá, meghatározzuk a minta által kibocsátott fény mennyiségét, és az eredményből az adenilát-kináz jelenlétére és mennyiségére következtetünk.
A mintát előnyösen olyan mennyiségű ADP-vel elegyítjük, amely az elegyben 0,005 mM feletti, előnyösebben 0,01 mM feletti, legelőnyösebben 0,08 mM feletti ADP-koncentrációt biztosít. Az átalakítási reakcióelegyben az ADP különösen előnyös mennyisége körülbelül 0,1 mM.
Amennyiben magnéziumiont felhasználó reagenseket, például kelátképző/komplexképző szert (mint például az EDTA) és foszfátpuffereket kívánunk alkalmazni, az ADP optimális átalakulásához megfelelő mennyiségű magnéziumion biztosítása érdekében a magnéziumionoknak előnyösen feleslegben kell jelen lenniük. Az
HU 220 855 BI
ADP fentebb említett előnyös koncentrációi esetében a magnéziumionok koncentrációja a szuszpenzióban vagy oldatban - az ADP ATP-vé történő átalakulása során előnyösen 1 mM vagy annál nagyobb, előnyösen 5 mM vagy nagyobb, legelőnyösebben 10 mM vagy nagyobb. A magnéziumionokat magnéziumsók, előnyösen magnézium-acetát alakjában adhatjuk az elegyhez.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a luciferin/luciferáz luminometriás reagenseket az inkubálás elején adjuk a mintához, előnyösen az ADP-vel és a magnéziumion-forrással egy reagensként. A luciferázt előnyösen a kivonószertől elkülönítve tároljuk.
A találmány olyan megvalósítási módjaiban, amelyekben valamennyi reagenst az ADP ATP-vé történő átalakítása kezdetén adjuk a mintához, és/vagy (ha a luciferin/luciferáz hozzáadását külön lépésként valósítjuk meg) amelyekben a luminometriás értékelést a luciferin/luciferáz hozzáadását követően végezzük, a magnéziumot a luciferin/luciferáz reagenssel együtt adhatjuk be. Mivel az ADTA és a foszfátionok megkötik a magnéziumionokat, ez utóbbiak mennyiségét - előzetes kísérletezéssel vagy számítással - feleslegben kell biztosítani. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy egy adott - ADP-t, vizsgálandó mintát és luciferin/luciferáz reagenst tartalmazó - elegyhez hozzáadandó magnéziumsó optimális mennyisége (ismert mennyiségű baktériumot, például E. colit tartalmazó minta alkalmazásával végzett kísérlettel, melyben az optimális magnéziumkoncentrációnál maximális jelet kapunk) könnyen meghatározható. A 3. ábrán bemutatjuk egy vizsgálati elegyhez adandó magnézium-acetát optimális mennyiségét.
Mivel a Mg2+-ionok elősegítik az ADP - szennyezésként jelenlevő adenilát-cikláz működése által bekövetkező - átalakulását, előnyös, ha a magnéziumionokat és az ADP-t felhasználás előtt elkülönítve tartjuk; az átalakulás megelőzése céljából az ADP-oldatba kelátképző szert, például EDTA-t elegyíthetünk. A magnéziumionokat és az ADP-t előnyösen közvetlenül az ADP-átalakítási lépés előtt hozzuk érintkezésbe egymással. Amennyiben a reagenseket együtt kívánjuk tárolni, az ADP korai ATP-vé történő alakulásának megelőzése érdekében előnyös, ha a reagenseket liofilizált alakban tartjuk.
Amint azt fentebb említettük, annak ellenére, hogy más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók, az ATP-t előnyösen - a mintában lévő ATP mennyiségére utaló, fotometriásan detektálható jelet adó - luciferin/luciferáz rendszer alkalmazásával detektáljuk. A luciferin/luciferáz készítmények és az ATP kimutatási eljárásaiban történő alkalmazásuk a szakemberek számára jól ismert és szokványos (lásd például Brolin és munkatársai). Egy általános készítmény, például 0,1-10 mg/liter luciferázt, 15-1000 pmol/liter D-luciferint és egyéb szereket, például MgCl2-ot (2,5-25 mmol), EDTA-t, BSA-t és semleges kémhatású puffért tartalmaz (lásd például EP 054676 számú európai szabadalmi leírás).
Az adenilát-kináz találmány szerinti tesztelési eljárásaiban az egy reagenses alkalmazáshoz előnyös, ha a pH-t úgy állítjuk be, amely mindkét enzim számára optimális, hogy az ADP ATP-vé történő átalakulásakor a fotometriás számlálás folytatódhasson. A megfelelő pH-t ismert mennyiségű baktériumot tartalmazó minta alkalmazásával végzett szokványos kísérlettel határozhatjuk meg.
A mintát, ADP-t és a magnéziumionok forrását bármilyen - az adenilát-kinázos reakcióhoz megfelelő pH-t biztosító - pufferben elegyíthetjük. Ennek megfelelően az 5,5-től 8,5-ig terjedő pH-tartományon belüli kémhatást biztosító pufferek alkalmazhatók; az optimális kémhatás pH=6-7, előnyösen pH=6,5. A megfelelő pufferek példái közé tartoznak a Tris- és foszfátpufferek. A mintát legelőnyösebben a találmány szerinti eljárás előkészítésekor elegyítjük és/vagy hígítjuk a pufferben.
A találmány szerinti adenilát-kinázos vizsgálat érzékenységét - más érzékenységnövelő vizsgálatokhoz hasonlóan - a reagensek tisztasága korlátozza. Esetünkben a jelentős szennyezést az ADP-szubsztrátban lévő ATP, valamint a luciferázkészítményben lévő adenilátkináz jelenti. A mikroorganizmusok érzékeny kimutatási eljárásaiban való alkalmazást illetően - különösen, ahol a mikroorganizmusok potenciálisan ártalmasak lehetnek, és kis mennyiségük kimutatására van szükség - az egyes reagenseknek (a vizsgálatban velük reagáló anyag vonatkozásában) a lehető legnagyobb tisztaságúaknak kell lenniük.
Az első probléma megoldása érdekében a nagy tisztaságú, szokványos ADP-t (>95%-os tisztaság) oszlopkromatográfiás tisztítás után alkalmazzuk. Erre azért van szükség, mert a szennyezésként jelenlévő ATP kis mennyisége is elegendő lehet ahhoz, hogy magas háttérszintet okozzon. Például dietil-amino-etil-cellulóz-oszlop és 0,02 mM koncentrációjú sósav eluens alkalmazásával az ATP lassabban eluálódik az oszlopról, mint az ADP, ami lehetővé teszi alapos elkülönítésüket. Más kromatografáló anyag és eluens kombinációi - például „Nucleosil” oszlop (Technicol, Stockport Chesire, Egyesült Királyság), mint például a „Nucleosil 3” és „Nucleosil 5” oszlop alkalmazásával, 77:23 térfogatarányú 0,06 M KH2PO4: metanol eleggyel (pH = 6) és 5 mM tetrabutil-ammónium-hidrogén-szulfáttal végzett HPLC - szintén hasonló eredménnyel alkalmazhatók. A nagy ADP/ATP arányt mutató frakciókat megtartjuk, és tisztaságukat - az ADP szintjének mérése érdekében adenilát-kinázos reakciót követően, az ATP-szennyezés szintjének mérése érdekében pedig adenilát-kinázos reakció nélkül - luciferin/luciferáz reagens közvetítette biolumineszcencia alapján értékeljük.
Az előnyös „Econopaq Q” erős anioncserélő géltöltet (Biorad) - melyet 20 mM koncentrációjú kálium-foszfát-pufferrel (pH=4,6) ekvilibráltunk - alkalmazásával, 400 mM-ig KP, koncentrációlépésenként végzett elúcióval azt találtuk, hogy az ADP erősen kötődött az oszlophoz, és egyetlen koherens csúcsként eluálódott, míg az ATP az ADP után jött le az oszlopról. Ezzel a módszerrel legfeljebb 2x10 x mol% mennyiségű ATP-t tartalmazó ADP-t kapunk. A szakirodalomból általunk ismert legnagyobb tisztaságú
HU 220 855 Bl
ADP 0,001%-os (Shutenko és munkatársai, lásd fentebb); az általunk tisztított, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható ADP 0,001 mol%-nál kisebb, előnyösebben 2xl0~8 mol% vagy még kisebb mennyiségű ATP-t tartalmaz.
Az ATP ADP-szubsztrátból történő eltávolításának egy másik eljárása során olyan enzimeket alkalmazunk, amelyek specifikusan az ATP-t bontják le (ilyen például a luciferáz vagy az apiráz). Az ilyen enzimek a kromatográfiás úton tisztított ADP további tisztításához is alkalmazhatók, vagy más módon, az enzim alkalmazásával tisztított ADP oszlopkromatográfiával tisztítható tovább. Meg kell jegyezni, hogy az apiráz egyben ADP-ázként is funkcionál, de ez - mivel az ATP-t nagyobb aktivitással bontja, és az ADP sokkal nagyobb mennyiségben van jelen - nem jelent lényeges problémát.
A második problémát illetően, az adenilát-kináz, amely egy kulcsfontosságú „háztartási” enzim, gyakorlatilag valamennyi organizmusban - és általában a luciferázkészítményekben is - jelen van. Az ilyen készítményekben rendszerint kis mennyiségű szennyezésként van jelen, de - mivel célunk a mintában lévő nagyon kis mennyiségű adenilát-kináz mérése - jelenléte mégis korlátozó tényező lehet. Meghatároztuk, hogy az adenilát-kináz aktivitásának egy egységeként az enzim azon mennyiségét tekintve, amely 20 °C-on, pH=7,8 kémhatás mellett, 0,5 mM ADP és 4,5 mM Mg2+ jelenlétében percenként 1 pmol ADP-t alakít át 1 pmol ATP-vé - a szokványos luciferázkészítmények 10~7 E/ml vagy még több adenilát-kináz-aktivitást tartalmazhatnak, míg a luciferáz szubsztrátja, a luciferin, mindenféle aktivitásból nagyon kis mennyiséget tartalmaz. Ezen kívül, a luciferázt általánosan valamilyen stabilizálószerrel, rendszerint proteinnel [például szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA)] stabilizálják, s az ilyen készítményekről megállapítottuk, hogy jelentős szintű adenilát-kináz-aktivitást mutatnak.
A luciferáz és az adenilát-kináz molekulatömege lényegesen eltér egymástól (61 kD, illetve 21 kD). Ezen kívül, a luciferáz membránkötött protein, így viszonylag hidrofób, míg az adenilát-kináz oldékony enzim. E tények ismeretében az adenilát-kinázt - például méretkizárásos kromatográfiával, reverz fázisú kromatográfiával vagy a kettő együttes alkalmazásával - eltávolíthatjuk a luciferázkészítményekből. Más módon - vagy ezen kívül - a luciferáz adenilát-kinázos szennyezésének problémája oly módon is elkerülhető, hogy a biolumineszcens reagenseket (luciferázt és luciferint) közvetlenül a mérések megkezdése előtt adjuk a reakcióelegyhez, ezáltal a szennyező adenilát-kináznak nincs ideje jelentős hatást kifejteni.
A luciferáz tisztításának előnyös eljárásaiban - kis pórusméretű gél [például Sephadex G-25; lásd Nielsen és Rasmussen: Acta Chemica Scandinavica 22, 1757 (1968)] alkalmazásával - oszlopkromatográfiás frakcionálási végzünk; vagy Sephadex és Sepharose oszlopokon (például „Blue Sepharose”) folytatólagos kromatográfiát, és/vagy SDS-gélelektroforézist [lásd Devine és munkatársai: Biochimica et Biophysica Acta 1172,
121 (1993)], illetve - emelt környezeti hőmérsékleten - bizonyos ideig öregítést alkalmazunk.
Az adenilát-kináz-aktivitást egyéb anyagokból - például szarvasmarha-szérumalbuminból - szintén oszlopkromatográfia alkalmazásával távolíthatjuk el. Egy másik, e téren hatásosnak bizonyult tisztítási eljárás a BSA kémiai kezelése, melynek során luciferázt stabilizáló képessége megmarad, de az adenilát-kináz-aktivitás csökken vagy teljesen megszűnik. E célra az enzimaktivitás proteinekből történő eltávolításának bármely hagyományos kémiai kezelése alkalmazható. Más lehetőség szerint - a BSA kiegészítéseként vagy helyettesítéseként nem protein luciferázstabilizátor is alkalmazható.
Meghatároztuk, hogy a szokványos BSA adenilátkináz-aktivitása - savas vagy lúgos pH-η végzett egyszerű hőkezeléssel - az eredeti szint 2%-a alá csökkenthető. Az egyik megfelelően hatásos hőkezelési eljárás során a BSA-t pH=5,6 vagy pH=10 kémhatás mellett, 24 óra hosszat 50 °C-on melegítjük. Az adenilátkináztól mentes BSA egy másik forrása a kémiailag kezelt, acetilált BSA, amely a Sigmától és a BDH-tól szerezhető be. A szakemberek tudni fogják, hogy egyéb, kémiailag kezelt szarvasmarha-szérumalbuminok szintén alkalmazhatók.
Annak érdekében, hogy a vizsgálandó mikroorganizmusok összes adenilát-kinázát hozzáférhetővé tegyük a találmány szerinti - ADP-ből, magnéziumionokból és luciferáz/luciferin készítményből álló - vizsgálati elegy számára, a mikroorganizmusokat fel kell tárni, hogy intracelluláris anyagaik kiszabaduljanak. Az ilyen feltárást végezhetjük mechanikai módon, például ultrahanggenerátor alkalmazásával, hidegsokk és ozmózisos sokk együttes alkalmazásával, valamint olyan reagensekkel, mint a lizozim, vagy előnyösebben, detergensek felhasználásával. Az ilyen detergensek - melyek a „kivonószer” általános néven ismertek - kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. A jellemző kivonószerek közé tartoznak az általános kationos detergensek, mint például a CTAB (cetil-trimetil-ammónium-bromid), és más kivonószerek, mint például a „Biotrace XM” (Biotrace, Bridgend, Egyesült Királyság), a „Celcis UK” kationos kivonószerek és a „Lumac NRM” (nukleotidfelszabadító reagens; Lumac BV, Hollandia). A CTAB alkalmazása esetén az előnyös összetételű készítmény vízben 0,01-1% (például 0,2%) CTAB-t tartalmaz, de más koncentrációk is alkalmazhatók.
A fentieknek megfelelően, mielőtt a - feltételezhetően mikroorganizmusokat tartalmazó - vizsgálati mintához ADP-t és luciferáz/luciferin reagens(eke)t adnánk, a mikroorganizmusokat előnyösen feltáró reagens alkalmazásával feltáljuk, hogy intracelluláris anyagaikat hozzáférhetővé tegyük a luminometriás reagensek számára. Amennyiben szükség van a célsejtek és egyéb sejtek (például gombaspórák) megkülönböztetésére, lehetőség van arra, hogy két külön vizsgálatot végezzünk: az egyiket - csak a spórák és a multicelluláris, szomatikus állati sejtek feltárására képes - nemionos detergens (például Triton X-100) alkalmazásával, a másikat pedig a fentebb leírt - valamennyi sejt feltárására képes - kationos kivonószer alkalmazásával kezelve. Lehetőség van
HU 220 855 Β1 arra is, hogy ezeket a vizsgálatokat ugyanazon a mintán végezzük; ilyen esetben a detergens/luciferáz/mérés ciklusok között ATP-ázt (például apirázt) adunk a mintához - az egyik ciklust nemionos, a másik ciklust kationos detergens alkalmazásával végezzük, s a ciklusok között szűrési lépéseket iktatunk be.
Ismert, hogy a kivonószer lényeges hatást gyakorol a luciferáz/luciferin rendszerre [lásd például Simpson és munkatársai: J. Biolumin Chemilumin 6(2), 97 (1991)]. A kationos detergensekről ismert, hogy elősegítik a reakciót, de a luciferáz fokozatos inaktiválását okozzák; az anionos detergensek gátolják a reakciót, míg a nemionos és az ikerionos detergensek széles tartományban serkentik azt. A találmány szerinti megoldás céljaira 0,15% kationos detergens és 0,25% tercier-diamin felületaktív anyag (Celcis, Cambridge, Egyesült Királyság) elegye kielégítőnek bizonyult, de a szakemberek számára nem okoz gondot egyéb - az adenilát-kináz- és a luciferázaktivitás azonos oldatban való együttes jelenlétének optimális arányát biztosító - kivonószerek felkutatása.
Az összes kulcsfontosságú lépés (vagyis az ADP ATP-vé történő átalakulása és az azt követő luciferázluciferin reakció) megtörténte után az elegyből kibocsátott fényt úgy mérhetjük, hogy a mintát - közvetlenül a luciferáz és a luciferin, illetve (a kulcsfontosságú lépések lejátszódását elősegítő) egyéb reagensek hozzáadása után, vagy azzal egy időben - egy fénydetektáló készülékben lévő luminometriás csőbe helyezzük.
A találmány egy másik tárgya reagenskészlet, amely a találmány szerinti eljárás megvalósítása szempontjából kulcsfontosságú reagenseket (azaz adenozintrifoszfátot, magnéziumion-forrást, és előnyösen luciferázt és luciferint) tartalmaz. A reagenskészlet előnyösen valamennyi felsorolt reagenst tartalmazza; a luciferázt és a luciferint egyetlen reagensoldat formájában. A reagenskészlet tartalmaz egy detergenst is, amely a vizsgálni kívánt célsejtek feltárására alkalmas. A mikroorganizmusok vizsgálata céljára rendszerint csak kationos detergensre van szükség, míg abban az esetben, ha a vizsgálandó mintában valószínűleg jelentős mennyiségben találhatók gombaspórák és szomatikus sejtek, ezek számának meghatározása érdekében a reagenskészletnek nemionos detergenst is kell tartalmaznia. A reagenskészletet egy csomagként állítjuk elő, amely előnyösen a találmány szerinti eljárás megvalósítására vonatkozó útmutatást is tartalmaz. A készlet a reagenseket a közvetlen vagy hígítás utáni felhasználáshoz megfelelő erősségű edényekben tartalmazza.
Amennyiben a luciferáz/luciferin reagenst az ADP ATP-vé történő átalakulásának kezdete előtt kívánjuk a mintához adni, előnyös lehet, ha a reagenskészlet a magnéziumionokat a luciferáz/luciferin reagenssel együtt tartalmazza, de a reakció beindulása után a magnéziumionoknak feleslegben kell lenni (mivel a reagensben lévő EDTA és foszfátpuffer az ionok bizonyos hányadát megköti), és mennyiségüket az adenilát-kináz és a luciferáz igényeihez igazítva kell biztosítani. Mikrobiális kimutatáshoz a magnéziumionokat előnyösen a mintagyűjtő vagy -hígító pufferrel együtt biztosítjuk, de más alkalmazásokhoz más formációk alkalmazhatók. A magnéziumokat legelőnyösebben a mintagyűjtő vagy -hígító pufferben, az ADP-t a detergenssel vagy felületaktív kivonószerrel - és adott esetben stabilizálószerrel, például EDTA-val - együtt, a luciferázt és luciferint pedig egy reagensként biztosítjuk, ami azt jelenti, hogy a reagenskészlet három reagensből áll. Más módon, az összes reagenst egy reagensként - a felhasználás előtti (például az ADP lebomlását okozó), egymás közötti kölcsönhatások kiküszöbölése érdekében - liofilizált állapotban biztosíthatjuk.
A találmány szerinti előnyös tesztelő reagenskészlet 99,999%-nál nagyobb tisztaságú ADP-reagenst, és BSA-t tartalmazó - luciferáz/luciferin reagenst tartalmaz, amely lényegében mentes az adenilát-kináz-aktivitástól. Más módon, az alkalmazott luciferáz/luciferin arány (amelyet a reagenskészlet használati útmutatója és/vagy relatív koncentrációjuk alapján ismerhetünk) olyan, hogy a luciferáz a luciferinszubsztrátra elég gyorsan fejti ki hatását ahhoz, hogy a kezdeti fénykibocsátás befejeződése után az összes, luciferázzal kapcsolatos adenilát-kináz termeljen ATP-t, így a mikroorganizmusból származó adenilát-kinázt egy hirtelen kinetikai reakció, a szennyező ATP-t pedig egy izzási reakció jelzi.
Az előnyös, tisztított reagensek a fentebb leírt eljárásokkal állíthatók elő. Megjegyezzük, hogy a luciferázban az adenilát-kináz-aktivitás úgy is lecsökkenthető, ha a luciferázt hónapokig vagy évekig állni hagyjuk.
A találmány szerinti eljárásokat, reagenseket és reagenskészleteket az alábbiakban a - nem korlátozó jellegű - példák és ábrák segítségével mutatjuk be, melyek alapján a szakemberek felismerhetik a találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjait.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a találmány szerinti javított vizsgálati eljárással kapott luminometriás jel logaritmusos görbéjét mutatjuk be 200 μΐ térfogatú mintában lévő mikroorganizmusok száma logaritmusának függvényében (a vizsgálati elegyet a luciferin/luciferáz reagens hozzáadása előtt egy, illetve öt percig inkubáltuk).
A 2. ábrán a magnézium hiányában kapott luminometriás jel E. coli sejtek számának logaritmusa függvényében készített logaritmusos görbéjét mutatjuk be.
A 3. ábrán a magnéziumion-koncentráció - meghatározott számú P. aeruginosat tartalmazó mintából (pH=7,5, illetve pH=8,0 kémhatás mellett) származó luminometriás jelre gyakorolt hatását mutatjuk be. A luminometriás jel tízszeres növekedése hozzáadott magnéziumionok nélkül következik be.
1. példa
Tisztított adenozin-difoszfát-reagens előállítása
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető, nagy tisztaságú (>99,95%) ADP (Sigma) további tisztításához - 20 mM kálium-foszfát-pufferrel (pH=4,6) ekvilibrált - 5 ml Econopac Q töltet (Biorad) felhasználásával folyadékkromatográfiát alkalmaztunk [a gélre 5 ml 1 mM ADP-oldatot (2,1 mg) vittünk fel]. Az elúciót 400 mM-ig KP, koncentrációlépésenként végeztük, miáltal az ADP erőteljes visszatartását értük el, és egyetlen csúcsként, hozzávetőleg 340 KP; koncentrációnál
HU 220 855 Bl eluálódott. A rendszert szivattyúval (5 ml/perc) és gradienskeverővei felszerelve, összesen 200 ml térfogatban, 50 mM-tól 1 M KPj koncentrációig terjedő gradienssel végeztük az elúciót, és 5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az ADP a 12. és 17. frakció között éles csúcsként eluálódott, míg az ATP a gradiens végén kezdett megjelenni. A maradék ATP-t a KP; koncentráció egy lépésben 1 M-ra történő növelésével eluáltuk. Az oszlopról származó legtisztább frakciók 2 χ 10 8 mol%-nál kevesebb ATP-t tartalmaztak.
2. példa
Adenilát-kináztól mentes luciferázreagensek előállítása
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető luciferin/luciferáz reagensből (Biotrace HM) az adenilátkináz-aktivitást magas környezeti hőmérsékleten (körülbelül 30 °C), 12 hónapig, száraz alakban végzett öregítéssel távolítottuk el.
3. példa
A kinázmentes luciferázreagensek előállításának másik eljárása
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető luciferázt - Devine és munkatársai által leírt (1983) eljárással - „Blue Sepharose” alkalmazásával, a fentebb leírtak szerint, oszlopkromatográfiával tisztítottuk.
4. példa
Adenilát-kináztól mentes BSA előállítása „Sigma Fraction V” (RÍA Grade, katalógusszám: A-7888) szarvasmarha-szérumalbumint 200 ml steril vízzel 1 m/V% koncentrációra hígítottunk, miáltal pH=5,6 kiindulási kémhatást értünk el. Az oldat két 50 ml-es mintáját 100 ml-es Duran-palackokba töltöttük, a maradék kémhatását 5 M NaOH-oldattal pH=10-re állítottuk be, majd az így kapott oldatból mindkét Duranpalackba 50-50 ml-t tettünk. A palackokba - a mikrobiális növekedés megakadályozása érdekében 0,02% végkoncentrációban timerozált adtunk, és az oldatokat 37 °C-on vagy 50 °C-on 24 óra hosszat inkubáltuk, majd kémhatásukat - 5 M sósavval vagy 5 M NaOHoldattal - pH=7,6-ra állítottuk be. Az adenilát-kinázaktivitás méréséhez az így elkészített BSA-minta 100 μΐét 100 μΐ 30 mM koncentrációjú magnézium-acetátoldattal elegyítettük, a kapott elegyet luminométerben
3,5 ml-es luminometriás csőbe helyeztük, és az 1. példában előállított ADP-oldat 100 μΐ-ét, valamint 100 μΐ luciferin/luciferáz reagenst (Celcis, Cambridge, Egyesült Királyság) (melynek adenilát-kináz-aktivitását előzetesen oszlopkromatográfia alkalmazásával eltávolítottuk) adtunk hozzá, és megkezdtük a BSA kémiai kezelését. Öt másodperces késleltetés után mértük a 10 másodperc alatt összegzett fénykibocsátást, melyet számítógépen regisztráltunk. Az ATP-termelődés meghatározásához tíz egymás utáni, 10 másodperces mérés eredményeit alkalmaztuk; az analízist két ismétléssel végeztük. A fénykibocsátást 5 μΐ 10 ng/ml koncentrációjú (91 femtomol) vizes ATP-oldatból kibocsátott fény négy ismételt mérése alapján kalibráltuk (jel középérték=2950/femtomol).
A 37 °C-on inkubált BSA-minta tiszta maradt, míg az 50 °C-on inkubált mintában csapadék képződött, amelynek mennyisége 10-es pH-nál kevés, 5,6-os pHnál nagyon sok volt. Az 50 °C-on inkubált 10-es pH-jú minta esetében csekély színvesztést is megfigyeltünk. Az e mintákban maradt adenilát-kináz-aktivitást (luminometriás impulzusszám/perc értékben kifejezve) az I. táblázatban mutatjuk be.
Ha a BSA-készítményt valamennyi ideig tárolni kívánjuk, ajánlatos az adenilát-kináz-aktivitás inaktiválására hosszabb időtartamú, enyhébb kezelést alkalmazni, vagy a BSA-t azonnal liofilizálni, mivel két hét után az 50 °C-on inkubált, 10-es pH-jú minta használhatatlanná vált (a fokozott színvesztés miatt). A 37 °C-on inkubált minták ilyen módon nem mentek tönkre, így ezek a stabil, adenilát-kináztól mentes BSA kialakítására (az inkubációs idő megnövelésével) nagyobb lehetőséget biztosítanak. Az a tény, hogy a Biotrace HM reagense 40 °C-on történő tárolás esetén száraz alakban elvesztette aktivitását, jól demonstrálja a lehetőségeket.
1. táblázat
Kezelés Luminometriás szám Különbség d[ATP]/dt (fm-scc*1)
15-15 t95—105
37° C/pH=5,6 9350 41727 23207 7,1
9845 26041 (átlagok)
11896 32945
37° C/pH=10 7192 30602 17943 5,5
5047 20577
4469 19377
50°C/pH=5,6 606 1191 595 0,18
343 948
50 °C/pH=10 460 1 014 500 0,15
342 847
314 754
HU 220 855 Β1
5. példa
BSA-t tartalmazó luciferin/luciferáz reagens előállítása
A szokványos luciferin/luciferáz készítmények általában, szükségszerűen tartalmaznak BSA-t. A 4. példában leírtak szerint kémiailag kezelt BSA-t vagy a kereskedelmi forgalomban (például a BDH-tól vagy a Sigmatól) beszerezhető acetilált BSA-t szabályos arányban adenilát-kináztól mentes - luciferázzal és más standard Celcis-reagensekkel elegyítettük, miáltal olyan Celcis LDR luciferin/luciferáz lumineszcens reagenst kaptunk, amelynek adenilát-kináz-aktivitása a vizsgálati térfogatra (azaz 300 μΐ-re) vonatkoztatva 10~9 egység volt.
6. példa
A találmány szerinti reagenskészlet
A találmány szerinti reagenskészlet az alábbi komponenseket tartalmazza:
(i) 15 mM koncentrációjú magnézium-acetát-oldatot (a minták begyűjtéséhez és hígításához) tartalmazó tartályt;
(ii) az 1. példában leírtak szerint előállított, tisztított (az
ATP vonatkozásában >99,99999998%-os tisztaságú) ADP-oldatot [kálium-foszfát-pufferben (7,5 mM, pH=6,5) 0,3 mM koncentráció], valamint 0,2 mM EDTA-t és 0,15% kationos detergensből és 0,25% tercier-diamin felületaktív anyagból álló, kevert kivonószert tartalmazó tartályt; és (iii) biolumineszcens luciferin/luciferáz LDR reagenst (Celcis, Cambridge, Egyesült Királyság) (melynek adenilát-kináz-aktivitása 10 8 Ε/ΙΟΟμΙ-nél kisebb) tartalmazó tartályt.
A készlet adott esetben tartalmazhat egy nemionos detergens oldatot (0,2%-os Triton Χ-100-at vagy ekvivalensét) tartalmazó tartályt és/vagy - a nemionos detergens mintára gyakorolt hatása következtében felszabadult ATP lebontása céljából - ATP-ázt (például apirázt) tartalmazó tartályt is, mely ATP-áz lehetővé teszi, hogy a minta a kationos detergens hozzáadásával újra vizsgálható legyen.
7. példa
Ismert mennyiségű E. coli vizsgálata a találmány szerinti eljárás alkalmazásával
Törzsoldatként 200 μΐ foszfátpufferelt sóoldatban (pH=7,4) 2,2 χ 107 sejtet tartalmazó, egy hetes E. coli folyadéktenyészetet alkalmaztunk, amelyet egymás után tízszer - magnéziumionokat tartalmazó - mintagyűjtő/hígító reagenssel [a 6. példa (i) pontjában említett reagens] hígítottuk, miáltal 200 μΐ-es mintatérfogatban 107-től 0,1 -ig terjedő mennyiségű sejtet tartalmazó mintákat kaptunk.
Mindegyik 200 μΐ-es mintát 2,5 ml-es luminometriás csőbe helyeztük, és a mintákhoz 100 μΐ ADP/kivonószer reagenst [6. példa, (ii) pont] adtunk, miáltal 300 μΐ össztérfogatot kaptunk. A kapott elegyet szobahőmérsékleten 1-5 percig inkubáltuk. Az inkubálás befejezése után az elegyhez 100 μΐ módosított Celcis LDR biolumineszcens reagenst [6. példa (iii) pont] adtunk, és a kibocsátott fényt Biotrace M3 luminométerben az első 10 másodpercben, majd egy percig, 10 másodperces időszakokban mértük, hogy a fény növekedését összegződő módon határozzuk meg. A kezdeti jelértéket kivontuk az utolsó értékből, miáltal a jel mérőszámát percenkénti impulzusszámként (cpm) kaptuk.
A találmány szerinti eljárás hatékonysága az 1. ábra alapján jól látható. Az 1. ábrán az E. coli sejtszáma és a minta által - 5 vagy 1 perces, ADP-vel végzett inkubálást követően - kibocsátott fény közötti, statisztikailag érvényes, lineáris összefüggést mutatjuk be. Az öt perces inkubálás esetében a lineáris összefüggést mintánként 10 vagy több organizmusra, míg az egy perces inkubálás esetében 100 vagy több organizmusra kaptuk (a kimutatási határ mindkét esetben körülbelül 10 organizmus/minta volt). Ez jelentősen felülmúlja a WO 94/17202 számú közrebocsátási iratban leírt eljárást, amely egy perces inkubálást követően, 100 organizmussal csak 26 cpm különbséget, 1000 organizmussal pedig 67 cpm különbséget adott; lineáris összefüggés csak 1000 vagy több sejt esetében volt megfigyelhető. Összehasonlításul, a találmány szerinti eljárás egy perces inkubálás után (mintánként 1000 sejt esetében) több ezerszeres cpm növekedést eredményez.
Egy ismeretlen számú mikroorganizmust tartalmazó minta találmány szerinti eljárás alkalmazásával végzett vizsgálatához ismert sejtszámokra kapott luminometriás impulzusszámok alapján kalibrációs görbét készítünk (például logaritmusos értékekkel) (lásd 1. és
2. ábra), és az ismeretlen számú mikroorganizmust (beleértve a nulla organizmust) tartalmazó mintából származó luminometriás impulzusszámok ismeretében - a kalibrációs görbe alapján - meghatározzuk az ismeretlen mintában lévő mikroorganizmusok számát.
A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy adott mikroorganizmusokban (például baktériumokban) lévő adenilát-kináz mennyisége eltérhet az egyéb mikroorganizmusokban lévő mennyiségtől. Például az élesztők méretük folytán - több adenilát-kinázt tartalmaznak, mint a baktériumok. Ilyenformán, egy bizonyos mikroorganizmushoz egy adott kalibrációs görbét készítünk és előfordulhat, hogy ugyanazon mikroorganizmus különböző (például legyengített, pH- vagy oxigénstresszhatás alatt álló) állapotaira is külön-külön kalibrációs görbét kell készíteni. A találmány szerinti eljárás további előnye a létező, ATP-n alapuló eljárásokkal szemben, hogy az adenilát-kináz-tartalom szorosabb összefüggést mutat a sejtszámmal, mint a nagymértékben változatos ATP-tartalom, amely - a sejt metabolizmusa hatására - csökken.

Claims (38)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás egy mintában lévő mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározására, amely szerint a mintában lévő adenilát-kináz mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a mintát adenozin-difoszfáttal (ADP) elegyítjük, meghatározzuk a minta által az ADP-ből előállított adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét, arányba
    HU 220 855 Β1 állítjuk az így termelődött ATP mennyiségét a mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétével és/vagy mennyiségével, azzal jellemezve, hogy reagensként magnéziumion-forrást adunk a mintához.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP ATP-vé történő átalakítását az ADP ATP-vé történő maximális mértékű átalakuláshoz elégséges moláris koncentrációjú magnéziumionok jelenlétében végezzük.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítási reakcióelegyben a magnéziumionokat olyan koncentrációban alkalmazzuk, hogy egy mól ADP-re egy mól magnézium jut.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát vizes szuszpenzióként vagy oldatként készítjük el, és a mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik értékelését úgy végezzük, hogy a mintához ADP-t és magnéziumionokat adunk az ADP-nek a jelen levő adenilát-kináz által ATP-vé alakítására alkalmas körülmények között, a mintát meghatározott ideig inkubáljuk, luciferáz- és luciferinreagenst adunk hozzá, meghatározzuk a mintából kibocsátott fény mennyiségét, és azt mikroorganizmusok és/vagy intracelluláris anyagaik jelenlétével és mennyiségével arányba állítjuk.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP-t 0,005 mM-nál nagyobb végkoncentrációban adjuk a mintához.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP-t 0,08 mM-nál nagyobb végkoncentrációban adjuk a mintához.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP-t körülbelül 0,1 mM végkoncentrációban adjuk a mintához.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szuszpenzióban vagy oldatban a magnéziumionok koncentrációját az ADP ATP-vé történő átalakulása során 1 mM vagy nagyobb értékre állítjuk be.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szuszpenzióban vagy oldatban a magnéziumionok koncentrációját 10 mM vagy nagyobb értékre állítjuk be.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a magnéziumionokat magnézium-acetát alakjában adjuk a mintához.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lumineszcens luciferin/luciferáz reagenst az inkubálás megkezdésekor, az ADP-vel és magnéziumion-forrással egy reagensként adjuk a mintához.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a magnéziumion-forrást és az ADP-t felhasználás előtt száraz alakban vagy külön oldatokként tartjuk, és közvetlenül a felhasználás előtt vagy az ADP átalakítási lépésében hozzuk érintkezésbe egymással vagy készítünk belőlük vizes oldatot.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a magnéziumion-forrást és a mintát az ADP hozzáadása előtt elegyítjük.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát a magnéziumion-forrást tartalmazó oldatban gyűjtjük össze vagy hígítjuk.
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP ATP-vé történő átalakítását 5,5 és 8,5 közötti pH-η végezzük.
  16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,001 mol%-nál kevesebb ATP-t tartalmazó ADP-t alkalmazunk.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2x 10~8 mol% vagy annál kevesebb ATP-t tartalmazó ADP-t alkalmazunk.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ADP-t kelátképző reagens jelenlétében tároljuk.
  19. 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 107 egység/ml-nél kevesebb adenilát-kinázt tartalmazó luciferáz/luciferin reagenst alkalmazunk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adenilát-kinázra nézve kimerített szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó luciferáz/luciferin reagenst alkalmazunk.
  21. 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát mikroorganizmussejteket feltáró és azok adenilát-kináz tartalmát az ADP és magnéziumionok számára hozzáférhetővé tévő kivonószerrel kezeljük.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nemionos detergenst tartalmazó kivonószert alkalmazunk.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos detergenst tartalmazó kivonószert alkalmazunk.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagot is tartalmazó kivonószert alkalmazunk.
  25. 25. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumsejteket határozunk meg oly módon, hogy a nemionos detergens jelenlétében felszabadult ATP mennyiségét kivonjuk a kationos detergens és a felületaktív anyag jelenlétében felszabadult ATP mennyiségéből, és a maradékot arányba állítjuk a baktériumok sejtszámával.
  26. 26. Reagenskészlet mikroorganizmusok és/vagy celluláris anyagaik kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására 1-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárással, amely reagenskészlet ADP-t és kivonószert tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a reagenskészlet magnéziumion-forrást is tartalmaz.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti reagenskészlet, amely ATP jelenlétében fény kibocsátására képes biolumineszcens reagens formájában luciferázt és luciferint is tartalmaz.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti reagenskészlet, amely a magnéziumion-forrást mintagyűjtő vagy mintahígító pufféról datként tartalmazza.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti reagenskészlet, amely magnézium-acetátot tartalmazó gyűjtő vagy hígító pufferoldatot tartalmaz.
    HU 220 855 Bl
  30. 30. A 27-29. igénypontok bármelyike szerinti reagenskészlet, amely az ADP mellett detergens és/vagy felületaktív anyag kivonószert tartalmaz.
  31. 31. A 27-30. igénypontok bármelyike szerinti reagenskészlet, amely az ADP-t, a magnéziumion-forrást 5 és a biolumineszcens reagenst három külön tartályban tartalmazza.
  32. 32. A 27-30. igénypontok bármelyike szerinti reagenskészlet, amely valamennyi reagenst egyetlen liofilizált állapotú reagensként tartalmazza.
  33. 33. A 26-32. igénypontok bármelyike szerinti reagenskészlet, amely az ATP vonatkozásában 99,999 mol%-os vagy nagyobb tisztaságú ADP-t tartalmaz.
  34. 34. A 27-33. igénypontok bármelyike szerinti reagenskészlet, amely IO-7 egység/ml-nél kisebb adenilátkináz-aktivitású biolumineszcens reagenst tartalmaz.
  35. 35. A 33. igénypont szerinti reagenskészlet, amely adenilát-kináz-aktivitásának kimerítésére kémiailag kezelt szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó biolumineszcens reagenst tartalmaz.
  36. 36. Reagens, amely az ATP vonatkozásában 99,999 mol%-os vagy nagyobb tisztaságú ADP-t tartalmaz.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti reagens, amely kelátképző szert is tartalmaz.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti reagens, amelyben a kelátképző szer EDTA-t tartalmaz.
    HU 220 855 Bl Int.Cl.7: C 12Q 1/04
    HU 220 855 Bl Int. Cl.7: C 12Q 1/04
    2. ábra
HU9700091A 1994-07-13 1994-07-13 Process and method of investigation of the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular materials thereof HU220855B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/GB1994/001513 WO1996002665A1 (en) 1994-07-13 1994-07-13 Microbiological test method and reagents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT76563A HUT76563A (en) 1997-09-29
HU220855B1 true HU220855B1 (en) 2002-06-29

Family

ID=10749377

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700091A HU220855B1 (en) 1994-07-13 1994-07-13 Process and method of investigation of the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular materials thereof

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0788553B1 (hu)
JP (1) JP3856467B2 (hu)
AT (1) ATE215608T1 (hu)
AU (1) AU698916B2 (hu)
BR (1) BR9408598A (hu)
CA (1) CA2194457C (hu)
DE (1) DE69430327T2 (hu)
DK (1) DK0788553T3 (hu)
ES (1) ES2171457T3 (hu)
GB (1) GB2303919B (hu)
HU (1) HU220855B1 (hu)
NO (1) NO318646B1 (hu)
NZ (1) NZ268405A (hu)
WO (1) WO1996002665A1 (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9308411D0 (en) * 1993-04-23 1993-06-09 Celsis Ltd Detection of biological material
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US6861230B1 (en) 1998-01-21 2005-03-01 The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Antibiotic sensitivity testing
GB9803156D0 (en) * 1998-02-13 1998-04-08 Celsis Int Plc Assay
GB9823468D0 (en) 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme
GB9911095D0 (en) * 1999-05-13 1999-07-14 Secr Defence Microbiological test method and reagents
GB9925161D0 (en) 1999-10-26 1999-12-22 Secr Defence Novel enzyme
GB0111275D0 (en) 2001-05-09 2001-06-27 Secr Defence Analytical method and kit
GB0122790D0 (en) 2001-09-21 2001-11-14 Secr Defence Method of determining the presence of target bacteria
GB0202421D0 (en) * 2002-02-01 2002-03-20 Celsis Internat Plc Polyols in bioluminescence assays
GB0508981D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Acolyte Biomedica Ltd Distinguishing cells in a sample
GB0517005D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Enigma Diagnostics Ltd Analytical method and kit
GB0915664D0 (en) 2009-09-08 2009-10-07 Enigma Diagnostics Ltd Reaction method
EP3284831B1 (en) 2010-04-16 2019-07-24 Momentum Bioscience Limited Methods for measuring enzyme activity useful in determining cell viability in non-purified samples
US9284500B2 (en) 2013-03-14 2016-03-15 Exxonmobil Research And Engineering Company Production of base oils from petrolatum
EP3191600A1 (en) 2014-09-11 2017-07-19 Promega Corporation Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3933592A (en) * 1965-02-17 1976-01-20 Hazleton Laboratories, Incorporated Method of detecting living microorganisms
DE3047860A1 (de) * 1980-12-18 1982-07-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von hla-antigenen
CH678065A5 (en) * 1988-04-13 1991-07-31 Hamilton Bonaduz Ag Quantitative determn. of adenosine-tri:phosphate - by a bio-luminescent reaction capable of determining ATP in somatic and/or microbial cells
GB9301118D0 (en) * 1993-01-21 1993-03-10 Secr Defence Enzyme linked assays

Also Published As

Publication number Publication date
JP3856467B2 (ja) 2006-12-13
JPH10502538A (ja) 1998-03-10
EP0788553A1 (en) 1997-08-13
NO318646B1 (no) 2005-04-25
CA2194457C (en) 2009-05-12
NO970105D0 (no) 1997-01-10
GB2303919B (en) 1998-08-26
GB9627142D0 (en) 1997-02-19
AU7130594A (en) 1996-02-16
AU698916B2 (en) 1998-11-12
DE69430327T2 (de) 2002-10-31
WO1996002665A1 (en) 1996-02-01
DE69430327D1 (de) 2002-05-08
DK0788553T3 (da) 2002-06-17
CA2194457A1 (en) 1996-02-01
ATE215608T1 (de) 2002-04-15
ES2171457T3 (es) 2002-09-16
GB2303919A (en) 1997-03-05
NO970105L (no) 1997-03-13
BR9408598A (pt) 1997-11-18
EP0788553B1 (en) 2002-04-03
HUT76563A (en) 1997-09-29
NZ268405A (en) 1997-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5648232A (en) Microbiological best method and reagents
AU677627B2 (en) Microbiological test method and reagents
Lundin Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites
HU220855B1 (en) Process and method of investigation of the presence and/or amount of microorganisms and/or intracellular materials thereof
Alef et al. A comparison of methods to estimate microbial biomass and N-mineralization in agricultural and grassland soils
EP0774011B1 (en) Capture assays
Eiland A simple method for quantitative determination of ATP in soil
US6660489B2 (en) ATP extraction method
Siro et al. Continuous flow method for extraction and bioluminescence assay of ATP in baker's yeast
Singh et al. Evaluation of biomass
CN101126717A (zh) 一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂
CN1091804C (zh) 微生物检测法和试剂
WO1999011816A1 (fr) Reactifs pour controler la proprete et procede de controle de la proprete
CN110684822A (zh) 一种基于丙酮酸激酶检测样品中微生物的方法及试剂盒
WO1996007759A1 (en) Bioluminescence and assay reagents
WO1999041408A1 (en) Microbial assay
EP3218510A1 (en) Kit comprising atp-diphosphohydrolase for detecting bacterial atp in a sample
Katsev Utilities of luminous bacteria from the Black Sea
NO315276B1 (no) Mikrobiologisk fremgangsmåte, apparat for anvendelse derav samt testkit ogADP reagens
GB2293878A (en) Monitoring biocide content of industrial waters