JPH0265799A - 細胞内の物質測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は体細胞や菌体内に存在する物質を測定する方法
に関するものである。

Ｂ１発明の概要 本発明は、細胞膜を酸により破壊して細胞内の被測定物
質を抽出し、その後この物質を光学的手法により測定す
る方法において、 酸により抽出した液に対して緩衝液による希釈処理を行
い、その後光学的手法により例えば定量分析を行うこと
によって、 操作を簡略化し、測定に要する時間の短縮化を図ったも
のである。

Ｃ１従来の技術 細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定量的
に測定することにより有効な知見を得ることができる。

例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネルギ
ー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。またｌ個の細胞中に存在するＡ　Ｔ
　Ｐ　ｊｉｌは、同一細胞では同一濃度のＡＴＰが存在
する。従ってＡ　Ｔ　Ｐが定量できれば、細胞の数及び
生細胞か死細胞かの判定や細胞の活性度が測定できるこ
とになる。

また水道原水中や大気浮遊粉塵中には、種々の発癌関連
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ａｍｅ　ｓ法またはその変法を用いた復帰突然変異試験
が広く使用されている。これらの短期テストは方法が簡
便で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質の
ＤＮＡ傷害を短時間に検出する汀効な短期テストがいく
つか提出されている。これらの短期テストは、特定の菌
と化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がＤＮ
Ａ傷害を誘起し、それに伴って生じるＳＯ８反応をβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ活性から求める方法である。従っ
て菌体内に発生したβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ活性を測
定することができれば、化学物質が発癌関連物質である
か否かの判定ができることになる。

このように細胞内に存在する物質または生成した物質を
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。

既に検討している方法の一つに酸により細胞膜を破壊す
る方法がある。この方法を簡単に説明すると、先ず試料
１ｍＣに酸１ｒＭを加え、その混合液を振盪することに
より細胞膜を破壊して被測定物質を抽出し、次いでこの
酸が光学的測定に影響しないようにエーテルにより酸を
抽出する。更にこのエーテルを窒素ガスを吹き込むこと
により除ノミし、その後反応液を緩衝液で希釈して光学
的測定を行う。

Ｄ、　ｆ９明が解決しようとする課題 しかしながら上記の方法は、酸のエーテル抽出処理や窒
素ガスの吹き込みを行っているため、操作が繁雑で自動
化しにくい上、分析に時間がかかる欠点がある。また抽
出効率に対する酸濃度の影響や反応時間の影響などの最
適条件について定量的な実験がなされていないために、
それらの最適条件が不明であった。

本発明の目的は操作を簡略化し、測定に要する時間の短
縮化を図ることにする。

Ｅ　課題を解決するための手段 本発明は、細胞と酸とを混合し、その混合液を振盪する
ことにより細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出
し、次いでその抽出液に緩衝液を加えた後？ｆｉ測定物
質を光学的手法により測定することを特徴とする。

Ｆ、実施例 （実施例１；トリクロル酢酸による大腸菌中のＡＴＰの
測定） 大腸菌を含む菌懸濁液０．５ｍ（！を試験管に分取し、
この試験管に５％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）０．５ｍ
Ｑを加えて、ポルテックスミキサーで１０秒間撹拌振盪
し、これにより細胞膜を破壊する。

なおＴＣＡの濃度単位として用いている「％」について
は、１％が０．０１９／ｒｒｌの意味である。

更に０．２ｍ０ｔ２／Ｑのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液９ｍ
（ｌを加え、この反応液０．５ｍｆ！を測定装置専用の
バイヤルビンに分取し、発光試薬を含む反応試薬を０．
５ｍＱ自動的に分注して、分注直後から３０　＃　１ｉ
ｉｉの発光量を計測する。

以」二において上記の発光法は、生物発光法と呼ばれ、
以下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルアフェラー
ゼとの反応により発生する光の川にもとずいてＡ　Ｔ　
Ｐの量を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である
。なおホタルの光はこれに相当する。

ルア７１ラーゼ ＡＴＰ＋ルシフェリン　　　　　　　　　　　　　７ｆ
ニルルゾ７１リノ７デニルルゾフ１リン十〇、−一÷　
１ｆニルオキシルンフ工リン十光種々の菌体濃度におい
て、本実施例に従ってＡＴＰを抽出した結果を第１図の
黒丸にて示す。また同図の白丸は従来法に従ってＡＴＰ
を抽出した結果であり、このグラフから本発明法と従来
法とではデータに差のないことがわかる。

次ぎにＴＣＡ′ａ度と発光阻害との関係を調べたところ
、第２図に示す結果が得られた。第２図中縦軸は、ＴＣ
Ａ濃度Ｏ％のときの発光量を基準とした各ＴＣＡ濃度で
の発光阻害をとっている。このグラフかられかるように
ＴＣＡ濃度の増加とともに発光値が低下している。ＴＣ
ＡＩ度が５％より大きくなると発光阻害が顕著であるが
、これはＰ　Ｈの低下（１０％のときＰＨ５，３７）に
よるものと、忠われる。

本実施例の測定プロセスにおいて、添加するＴＣＡの濃
度が１．２５．２．５．５．０．１０．０．２０．０％
のときに、菌濃度と抽出したＡＴＰ濃度との関係がどの
ように変わるかを調べたところ、第３図に示す結果が得
られた。同図中白丸はＴＣ八へ度が１，２５．２．５．
５．０，１０．０％のときの結果であり、黒丸は２０．
０％のときの結果である。このグラフから、１．２５〜
ＩＯ３０％のＴＣΔ濃度において、路間等の抽出ができ
ることがわかった。

（実施例２：過塩素酸による大腸菌中のＡＴＰ測定） 実施例Ｉにて用いた５％のＴＣＡの代わりに５％の過塩
素酸０．５　ｍｆｆを使用した他は実施例１と全く同様
の操作を行って、菌体濃度と抽出したＡＴＰ濃度との関
係を調べた。結果は第４図に示すとおりである。この結
果から良好な測定が行われていることが理解される。

以上において、本発明の対象となる細胞は、微生物ある
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類あ
るいは原生動物等が挙げられる。

抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。

抽出した物質については、生物発光法や化学発光法を利
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。

Ｇ５発明の効果 本イこ明によれば、従来行っていた酸をエーテルで抽出
する処理や窒素ガスの吹き込みによるエーテル除去処理
を行−）でいないので、抽出操作が簡１１１であって自
動化が容易であり、また分析を短時間で行うことができ
る。

、１　図面のＩ！Ｔｉｌ１１な説明 第１図、第３図及び第４図は、各々ＡＴＰ濃度と菌体濃
度との関係図、第２図は発光阻害と菌体濃度との関係図
である。

第２図 発光「１１．りと’ｒ　ｃ　、〜濃１ｆとの関係図ＴＣ
Ａａ変（％）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞と酸とを混合し、その混合液を振盪すること
   により細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、
   次いでその抽出液に緩衝液を加えた後被測定物質を光学
   的手法により測定することを特徴とする細胞内の物質測
   定方法。