SU1745769A1

SU1745769A1 - Способ определени пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразного действи

Info

Publication number: SU1745769A1
Application number: SU904785371A
Authority: SU
Inventors: Александр Анатольевич Прокопов; Александр Владимирович Святковский; Елена Борисовна Никольская; Людмила Павловна Кузнецова
Original assignee: Ленинградский Технологический Институт Им.Ленсовета; Институт Эволюционной Физиологии И Биохимии Им.И.М.Сеченова
Priority date: 1990-01-22
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1992-07-07

Abstract

Использование: аналитическа хими , химико-токсикологический анализ, контроль объектов окружающей среды. Сущ- ность изобретени : фермент, обладающий холинзстеразной активностью, смешивают с субстратной хромогенной смесью и анализируемой пробой, определ ют степень угнетени активности фермента по скорости изменени окраски в сравнении с контролем и содержание анализируемых веществ о пробе по степени угнетени активности Фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N- фталилхитозана, к которому перед смешиванием добавл ют воду или буферный раствор до содержани М-фталилхито- зана 0,02-0,1 мае. %. 1 табл.

Description

Изобретение относитс к аналитической химии, в частности к химико-токсикологическому и клиническому анализу и контролю объектов окружающей среды.

Известен способ определени пестицидов антихолинэстеразного действи , использующий фермент в виде нормальной сыворотки крови лошади. и включающий смешение фермента, анализируемой пробы и субстрата и оценку степени угнетени активности фермента по скорости изменени окраски по сравнению с контролем. Этот метод используетс дл определени микроколичеств дихлофоса, диброма, циодри- на, а после концентрировани экстрактов - хлорофоса и амидофоса.

Недостатками метода вл ютс невысока чувствительность, узкий круг определ емых веществ и сложность проведени анализа.

Известен способ, использующий фермент в виде промышленных препаратов. По данному способу в чейку ввод т раствор препарата фермента, анализируемую пробу (экстракт из патматериала), раствор субстрата (ацетилхолин) и бромтимоловый синий (индикатор). Степень угнетени активности фермента устанавливают по изменению окраски индикатора от синей до синевато-желтой.

Недостатками прототипа вл ютс недостаточно высока чувствительность, ограVI

4 СЛ VI О

О

ниченные технологические возможности и сложность проведени анализа.

Целью изобретени вл етс повышение чувствительности, расширение технологических возможностей и упрощение анализа.

Поставленна цель достигаетс тем, что фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N- фталилхитозана, и перед смешением к ферменту добавл ют воду или буферный раствор до концентрации М-фталилхитоза- на 0,02-0.1 мас.%.

П р и м е р 1. Готов т 0,2%-ный водный раствор натриевой соли М-фталилхитозана. К10 мл раствора полимера добавл ют 76 мг промышленного препарата бутирилхолинэ- стерезы из сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8) с активностью 6Е/мг (обща активность 456 Е). Полученный раствор разливают в чейки планшета по 0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Перед определением параоксона в 10 чеек с твердым раствором внос т по 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8;0), раствор ют в течение 1 мин (получают 0,04 %-ный раствор полимера ), последовательно в каждые 2 чейки добавл ют по 0,02 мл водного раствора параоксона в концентраци х 0; 1 моль/л, фиксиру врем внесени ингибитора. Точно через 2 мин инкубации ингибитора с ферментом в чейки добавл ют по 0,08 мл 8-10 4 моль/л раствора индофенилацетата в 8 об.%-ном этаноле. Измер ют врем изменени окраски от желтого до зеленого цвета. Весь анализ провод т при комнатной температуре.

Результаты определени представлены в таблице.

П р и м е р 2. Провод т определение параоксона аналогично примеру 1 в концентраци х 0; моль/л, увеличив врем инкубации ингибитора с ферментом до 10 мин.

П р и м е р 3. Провод т определение параоксона аналогично примеру 1, получа после растворени твердого раствора 0,02- 0,2%-ные растворы аммониевой соли N- фталилхитозана.

Пример 4. В услови х примера 1, использу 0,1%-ные растворы полимера и не провод инкубацию фермента1 с ингибитором , определ ют атропин, метацин, N-ме- тил-4-пиперидинилбензилат и скопаламин. вз тые в концентраци х 1 1 5х хЮ ; 1 -10 соответственно.

П р и м е р 5. Провод т определение диизопропилфторфосфата аналогично примеру 1.

П р и м е р 6. Провод т определение

хлорофоса в концентраци х 0; 1 10 ; 1 -10 аналогично примеру 1.

П р и м е р 7. Провод т определение хлорофоса аналогично примеру 1. Растворы предварительно активируют при 70°С и рН9 ,0 в течение 0,5 ч.

Примерз. Провод т определение ДДВФ аналогично примеру 1.

Пример 9. Юг тщательно измельченного м са помещают в скл нку с притертой

пробкой и заливают 10 мл хлороформа, содержащего параоксон в концентрации 1х хЮ моль/л, и экстрагируют в течение 1 ч. Затем фильтруют через вату, отбирают 1 мл экстракта и высушивают на воздухе. Сухой

остаток раствор ют в 1 мл дистиллированной воды. Определение параоксона в полученном растворе провод т аналогично примеру 1. Хлороформ в контрольной пробе не содержит параоксона.

П р и м е р 10. Готов т 0,1 %-ный водный раствор натриевой соли М-фталилхитозана. К 10 мл раствора добавл ют 100 Е промышленного препарата ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (КФ 3.1.1.7) и

1,5 мг бромтимолового синего. Полученный раствор разливают в чейки планшета по 0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Передопределением армина в чейки внос т по 0,1 мл 0.01 моль/л фосфатного буфера (рН « 7,5), раствор ют в течение 1 мин (получают 0,02 %-ный раствор полимера), последовательно в каждые две чейки добавл ют по

0,02 мл водного раствора армина в концентраци х 0; l-. 1- 10 7; 1 -10 6 и 1-Ю 5 моль/л, фиксиру врем внесени ингибитора . Точно через 5 мин инкубации фермента с ингибитором в чейки добавл ют по

0,08 мл 2, моль/л ацетилхолинхлори- да. Измер ют врем изменени окраски от синей до зеленовато-желтой. Одновременно определение армина провод т по известному и предлагаемому способам с

иммобилизованной в желатине ацетилхоли- нзстеразой.

Пример 11. Провод т определение параоксона аналогично примеру 1. Используют твердые растворы бути рил холи нэсте5 разы в аммониевой соли N-фталилхитозана, приготовленные непосредственно перед определением, за 1 и 3,5 года до него.

Предлагаемый способ позвол ет быстро и легко проводить определение широкого круга соединений, обладающих антихо- линэстерэзной активностью, обеспечивает низкий предел обнаружени ингибиторов, имеет широкие технологические возможности (например, проведение анализа в массовом пор дке в полевых услови х).

Claims

1.-Э-

о

I.10-

ыо- 1 .ir;

1И(ГТ

ыо-

1.

0

ыо- ью-7 ыо-« .tff

1.10- |.|0 т

1-10-«

10

Ю-

10

13

5

Врем инкубации увеличено до Ю

Окраска мен ете от желтого цвета до розового

ю-

ю

ю10

1010

ю-6 ю-ь

)0-

ю-

Ингибитор экстрагировали из мнса

ю-г

Известный способ

1,5 и Фермент иммобилизо (включа ван мелатине врем набукамин )

0,04 I Лараоксон

ЫО

О 1-10

г

,-

г«

10

1010

Сразу после приготовлени твердого раствора

Черва I год после приготовлени

Черв 3,5 года после приготовлени