JPH08511938A - 毒性の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本願は、（ｉ）試料と発光生物の懸濁液とを混合するステップと、（ii）発光の波長に感応する光電検出器を用いて、時間（ｔ_o−ｔ_n）の間、連続的に光出力（Ｅ）をモニタリングするステップと、（iii）微分ｄ（ｌｏｇＥ）／ｄｔを計算して、毒性濃度の測定値を得るステップとを有する流体試料の毒性測定方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 毒性の測定 本発明は、流体試料に露出された発光微生物の光出力を測定することにより流 体試料の毒性をモニタリングする方法に関する。試料媒体のメータリング及び該 試料媒体と前記微生物の流体懸濁液との混合を自動的に制御し、且つこの結果生 じる光出力を運動理論を用いて解釈し、これらのデータをＥＣ₅₀値のような毒性 学的意味をもつパラメータに関連付け、これにより試料の毒性の量的評価を行な う。 発光細菌を用いて毒性を測定する多数の方法が良く知られている。例えば、こ のような１つの方法として、多数の水性試料の逐次稀釈液に、Photobacterium P hosphoreum属の細菌の懸濁液を添加する方法がある。各稀釈アリコートは、予め 定めた２つの時間間隔で、P．Phosphoreum代謝による光束について逐次測定され る。比較のため、試料のいかなる部分をも含有しないブランクが使用される。良 く知られたＥＣ₅₀のような毒性学的意味をもつパラメータを、所定の数学的算法 を用いて評価するのに、発光、試料濃度及び時間データが使用される。試料及び 該試料の稀釈剤を支持するモニタリング装置を恒温的に制御するため、このよう な測定を一定温度で行なわなくてはならないことは良く知られている。海水中に 自然発生する種である細菌は、試料の稀釈アリコートの全体を通して一定のイオ ン強度、従って一定の浸透状態を維持するため、試料の塩度を入念に調節する必 要がある。 通常、このような毒性試験は水性試料に適用され、この場合、一般的な試験に は0.5cm³の試料が必要とされるに過ぎない。冷凍乾燥された標準製品からの再構 成により毎日発生される液体懸濁試薬として細菌が使用される。このような測定 装置のポピュラーな具体例として、試料、浸透調整剤及び細菌懸濁アリコートの 手による集中操作に基づくものがある。一般的には、試料キュベットを、各試験 懸濁液中の細菌から発生する光の波長に感応する検出装置に手で装填する。これ らの方法に共通する特徴は、発光の検出を妨げる試料溶液の他の特性に付随す る問題である。このような特性の例として、着色された又は濁った試料がある。 この方法では、試験の試料と細菌懸濁試薬との混合物からの発光が減衰され、試 料の毒性の評価を誤らせることがある。上記減衰の効果を解消する技術は、通常 、多チャンバ形測定キュベットのような機器の付加を必要とし且つ光学的測定装 置及びデータ解釈手順の複雑さを増大させる。 本発明は、毒性検定の複雑さを軽減させ且つ同時に測定精度を高める測定方法 を得るため、運動速度理論（kinetic rate theory）に関連して発光生物を用い る良く知られた原理を使用する毒性試験に関する。他の特徴は、この運動速度方 法が、発光生物に基づいた完全自動毒性試験を行なう優れた手段を提供すること である。 本発明によれば、 （ｉ）試料と発光生物の懸濁液とを混合するステップと、 （ii）発光の波長に感応する光電検出器を用いて、時間（ｔ_o−ｔ_n）の間、連 続的に前記混合物の光出力（Ｅ）をモニタリングするステップと、 （iii）微分ｄ（ｌｏｇＥ）／ｄｔを計算して、毒性濃度の測定値を得るステ ップとを有することを特徴とする流体試料の毒性測定方法が提供される。 上記流体試料の毒性測定方法には、更に、 （iv）毒性のない流体試料と発光生物の懸濁を含有する溶液とを混合するステ ップと、 （v）前記時間（ｔ_o−ｔ_n）に等しい時間の間、連続的に混合物の光出力（Ｂ ）をモニタリングして、自然ファクタ及び環境ファクタによる光出力の減衰を測 定するステップと、 （vi）光出力（Ｂ）の値を用いて、ステップ（iii）に使用する補正光出力値 （Ｅ′）を得るステップとを付加することができる。 上記ステップ（iv）及び（ｖ）は、ステップ（ｉ）及び（ii）と同時に行なう ことができ、光出力の補正値（Ｅ′）は、次式すなわち、 Ｅ′_t＝Ｅ_t／Ｂ_t normalised を用いて求めることができる。 別の構成として、上記ステップ（iv）及び（ｖ）を、ステップ（ｉ）及び（ii ） の前に行なって光出力値（Ｂ１）を求め且つ再びステップ（ｉ）及び（ii）の後 に行なって光出力値（Ｂ２）を求め、光出力Ｅ′の補正値を、次式すなわち、 を用いて求めることができる。 上記発光生物は、細菌Photobacterium Phosphoreumにすることができる。 上記流体試料は都市流出液又は工業流出液で構成できる。微分ｄ（ｌｏｇＥ′ ）／ｄｔの負の値は、生物に対する実質毒性濃度を表示し且つ許容できない毒性 レベルの指標を与える。 本発明は、本発明の方法を実施する装置の一形態を例示する添付図面のうちの 幾つかの図面に関連する以下の説明から一層明白になるであろう。 第１図は、時間に対する光出力のグラフであり、毒性負荷条件下（ａ）と、ブ ランク試料条件下（ｂ）での発光細菌の一般的挙動を示すものである。 第２図は、毒性負荷条件下（ａ）及びブランク試料条件下（ｂ）での時間に対 する光出力の対数のグラフである。 第３図は、毒性濃度に対する時間当りの補正光出力の対数をプロットした傾斜 を示すグラフである。 第４図は、本発明の装置を示す概略図である。 第５図は、第４図の装置に使用できる多数のフローセル設計を示す図面である 。 本発明の方法は、発光生物の懸濁液との混合による流体試料の毒性試験に適用 される。時間及び試料の毒性の両者の関数として光出力の減衰間の算術的関係を 推測して試料の毒性を評価するため、発光は、時間に関してモニタリングされる （第１図参照）。本発明の方法は、モニタリング時間中、任意の試料の毒性薬剤 の濃度Ｃ_Tが一定に維持されるとの基本的仮定に基づいている。また、発光生物 のその後の挙動は、次のプロセスすなわち、 により説明されると仮定する。 更に、一般的な測定方法のタイムスケールで且つこのタイムスケールに関して 生物を直ぐに死滅させるほど高くない毒性濃度範囲に亘って、反応は、試料の懸 濁試薬混合物中の生物の濃度とは無関係の速度定数Ｋ_r、で、擬似１次運動挙動 に続いて生じると仮定する。速度の式は良く知られており、 である。ここで、ｔは時間、ａは最初の光出力、ｘは光出力の増大である。ｔに 対するｌｏｇ（ａ−ｘ）すなわちｌｏｇ（Ｅ）をプロットすると、傾斜Ｋ_rの直 線になる（第２図）。Ｋ_rと反応半減期ｔ_0.5との関係は、 である。 反応半減期はＥＣ₅₀条件に一致し、これにより、標準毒性薬剤（例えば、３， ５−ジクロロフェノール）を用いた測定のアプリオリ（a priori）キャリブレー ションにより推測されよう。発光生物の挙動の他の特徴は、毒性薬剤が存在しな い場合でも、発光生物が光出力の自然減衰を呈することである。このことは、第 １図（ａ）及び（ｂ）に示すように、第１近似まで、毒性試験に使用するのと同 じ測定算法の下で、小さな負の傾斜により表される。従って、この背景すなわち ブランクの減衰は、毒性試験を受ける試料の測定に関連する標準ブランクの別の 測定プロセスによる正しい発光値（Ｅ′）を与えるべく補正される。 第３図は、微分ｄ（ｌｏｇＥ′）／ｄｔと毒性濃度との間の関係を示す。微分 の負の値は、生物に有毒な濃度を示し且つ多くの条件に対する許容できない毒性 濃度の指標を与える。 ここで第４図を参照すると、本発明を実施する装置は、本質的に、試験すべき 試料と、稀釈剤と、細菌懸濁液と、検量体（calibrant）とを一連の弁Ｖを介し て、マイクロプロセッサＣに報告する光電検出器Ｐ１、Ｐ２によりモニタリング される第１及び第２フローセルＦ１、Ｆ２の各々に所要の比率を収容することが できる２チャンネル流体フロー分析マニホルドを有する。 試料（適当なサンプリング装置から得られる連続流としての試料、手操作によ り供給されるバッチ試料、又は例えば自動サンプラ装置を用いて供給される一連 の試料）が、フローマニホルド内に導入される。マニホルドは、試料導入の流れ 特性及び移送特性を制御する寸法範囲をもつ種々の材料で作られたチューブ又は 導管で構成できる。同様に、塩水のような稀釈剤を正確な方法で試料に添加でき る。従って、試料の流れは、変更することなく又は所定の稀釈ファクタで移送で きる。また、稀釈剤は、マニホルドを通る別々の試料ボリュームを連続的に運ぶ 不活性媒体として機能する。稀釈剤の他の特徴は、該稀釈剤を、検量（キャリブ レーション）を目的とするブランク試料として適用することである。更に、過剰 の稀釈剤は、必要に応じて一気に流し、これにより検定毎にマニホルドを洗浄す るのに使用できる。この例では稀釈剤が多機能をもつものであるが、ブランクの 検量及び洗浄操作のための適当な弁又は分流器とリンクされた別のリザーバを導 入できることは明白である。 フローセルは、使用する特定微生物の発光の波長を透過する材料で構成しなけ ればならない。フローセルは、全混合物を収容できる体積又は発光の一部のみを 収容できる体積にすることができる。発光測定の最高の光学的精度を維持するに は、混合物が、運動モニタリング期間中にフローセル内で静止していることが好 ましい。 試薬及び試料リザーバを含むマニホルド全体は、一定温度に維持すべきである 。微生物の活動範囲内に維持され且つマニホルド内の液体粘度に悪影響を与えな い任意の温度を使用できる。温度制御は、任意の既知の手段により行なうことが できる。 この好ましい実施例では、エジェクタによりマニホルドを通して液体を吸引す ることにより液体を移送するけれども、液体移送の前記目的を達成するのに多く の他の方法を考えることができることは明白である。例えば、液体を加圧して、 マニホルドを通して液体を押し出すこともできる。或いは、幾つかの又は全ての マニホルド分枝にポンプ装置を導入できる。更に、小形の形態として、電気浸透 による移送を用いることもできる。また、他の実施例として、重力、毛管作用又 は遠心運動による流れを用いることもできる。 光学検出器からの出力は、デジタル化してマイクロプロセッサに入力するのに 適した電圧又は電流を発生させるため、信号プロセッサにより電子的に修正され る。或いは、アナログ計算を行なうこともできるが、デジタル手段が好ましい。 時間系列内でのマニホルド形状の選択及び発光の時間との関数のモニタリングを 含む全測定作動は、全て、マイクロプロセッサＣを用いて整理できる。生物運動 モニタリングの上記原理は、マイクロプロセッサＣに導入される適当な算法によ り実施できる。この方法では、所望の情報及び毒性検定操作から得られる測定パ ラメータを搬送するための読出しが作られる。オペレータの情報として、別のス テータス情報を発生させることも有効である。 第５図には、フローセルについての可能性のある４つの設計が示されている。 各フローセルは、光学検出器を用いてセル体積内の混合物からの発光をインター フェースする手段と組み合わされる液体入口及び出口を有している。第５図（ａ ）に示すセルは、光学的に透明な材料で構成された単一チューブからなる。長さ 及び内部断面の寸法は、研究対象の混合物体積と一致するセル体積を形成すべく 選択される。断面形状は任意の幾何学的設計にすることができるけれども、円形 又は矩形の断面形状が好ましい。 第５図（ｂ）のフローセルは、第５図（ａ）のフローセルと同様であるが、混 合物の発光面積を増大させるように設計された薄層部分が付加されている点で異 なっている。この設計は、強く着色される試料に特に適しており、この設計によ り吸収経路が最小になる。 第５図（ｃ）は、第５図（ａ）の特性に基づいたスパイラルフローセルを示す 。スパイラル設計により、流れを細いボアのチューブ内に維持すると同時に、光 学検出装置の活性領域境界内により大きな混合物体積を維持することが可能にな る。一般に、細いボアのチューブは拡散が小さいため、混合物の押し出し流れ（ plug）の一体性を維持する。 第５図（ｄ）は薄層壁ジェット流セルを示し、該セルは、細いボアのジェット 入口及び低流量制限出口の手段を備えたセル本体内に取り付けられた平らな円形 の光学窓Ｗ１を有する。 弁Ｖ１は純粋な試料及び純粋な稀釈剤を選択するか、試料の調節された部分を 混合して稀釈混合物を形成する。弁Ｖ２は、稀釈剤を、２チャンネル機器のいず れかの分枝に指向させる。弁Ｖ３は、細菌懸濁液と稀釈剤との間に、バックグラ ウンド混合物（background admixture）が形成されることを可能にする。弁Ｖ４ は、細菌懸濁液を２チャンネル機器のいずれかの分枝に指向させ、これにより、 毒性モニタリング及びバックグラウンド減衰曲線モニタリングの両者の発光試薬 を与える。弁５は、細菌懸濁液と、稀釈剤又は試料／稀釈剤混合物との間に混合 物を発生する。或いは、弁Ｖ５及びＶ１は、除勢すると、洗浄の目的で稀釈剤リ ザーバとフローセルとの間に一定流量を与えるように構成できる。同様に、弁Ｖ ３を除勢し且つ弁Ｖ２を付勢すると、フローセル２を洗浄することもできる。弁 Ｖ６は、フローセル１又はフローセル２のいずれかからの流出流れを選択する。 弁Ｖ７はフローセル流出液又は周囲空気の流入の選択を可能にする。これにより 、マニホルドの流れを、所望の長時間に亘って停止させることができる。水又は 空気の供給源により駆動されるエジェクタが、マニホルドを通る液体を分流器弁 の制御により設定されるあらゆる流れパターンに関連して吸引する好ましい手段 を構成する。 検出器Ｐ１、Ｐ２は、発光のバックグラウンド減衰を測定するためにのみ、試 験を受けている試料からの発光（Ｅ）及び稀釈剤と細菌懸濁液との混合物からの 発光（Ｂ）をモニタリングする。 マイクロプロセッサＣは、下記の式、すなわち、 を用いて補正値Ｅ′を計算する。 弁Ｂは、全てのデータ点を、シーケンスの第１データ点で割ることにより正規 化（normalised）される。 次に、毒性の測定値を得るため、微分ｄ（ｌｏｇＥ′）／ｄｔを計算する。 多くの適用例において、微分値が負であれば、これは毒性が許容できないレベ ルにあることの表示であり、アラーム信号を発生させることができる。 本発明は上記例のみに限定されるものではなく、当業者ならば、請求の範囲に より定められる本発明の範囲から逸脱することなく多くの変更を容易に行なうこ とができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 スヌーク リチャード デイヴィッド イギリス国 チェシャー シーダヴリュ12 ３ティーエフ コングルトン ハルトン クローズ 31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．流体試料の毒性を測定する方法において、 （ｉ）試料と発光生物の懸濁液とを混合するステップと、 （ii）発光の波長に感応する光電検出器を用いて、時間（ｔ₀−ｔ_n）の間、 連続的に光出力（Ｅ）をモニタリングするステップと、 （iii）微分ｄ（ｌｏｇＥ）／ｄｔを計算して、毒性濃度の測定値を得るス テップとを有することを特徴とする流体試料の毒性測定方法。 ２．（iv）毒性のない流体試料と発光生物の懸濁を含有する溶液とを混合するス テップと、 （v）前記時間（ｔ₀−ｔ_n）に等しい時間の間、連続的に混合物の光出力（ Ｂ）をモニタリングして、自然ファクタ及び環境ファクタによる光出力の減衰を 測定するステップと、 （vi）光出力（Ｂ）の値を用いて、ステップ（iii）に使用する補正光出力 値（Ｅ′）を得るステップとを更に有することを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の流体試料の毒性測定方法。 ３．前記ステップ（iv）及び（ｖ）を、ステップ（ｉ）及び（ii）と同時に行な い、光出力の補正値（Ｅ′）を、次式すなわち、 Ｅ′_t＝Ｅ_t／Ｂt normalised を用いて求めることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．前記ステップ（iv）及び（ｖ）を、ステップ（ｉ）及び（ii）の前に行なっ て光出力値（Ｂ１）を求め且つ再びステップ（ｉ）及び（ii）の後に行なって光 出力値（Ｂ２）を求め、光出力Ｅ′の補正値を、次式すなわち、 を用いて求めることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．前記発光生物が細菌Photobacterium Phosphoreumであることを特徴とする請 求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６．前記流体試料が都市流出液又は工業流出液からなり、微分ｄ（ｌｏｇＥ）／ ｄｔ又はｄ（ｌｏｇＥ′）／ｄｔの負の値により許容できない毒性レベルを判断 することを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。