JPH0262942A - 細胞内の物質測定方法 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
A、産業上の利用分野
本発明は、体細胞や菌体内に存在する物質を測定する方
法に関するものである。
法に関するものである。
B 発明の概要
本発明は、細胞膜を界面活性剤により破壊して細胞内の
被測定物質を抽出し、その後この物質を例えば光学的手
法により測定する方法において、界面活性剤の他にクロ
ロホルムを添加することによって、 抽出効率を高めると共に、室温においても十分な抽出が
できるようにしたものである。
被測定物質を抽出し、その後この物質を例えば光学的手
法により測定する方法において、界面活性剤の他にクロ
ロホルムを添加することによって、 抽出効率を高めると共に、室温においても十分な抽出が
できるようにしたものである。
C1従来の技術
細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定量的
に測定することにより有効な知見を得ることができる。
に測定することにより有効な知見を得ることができる。
例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネル+
−代謝の役割を果たしているアデノンン三リン酸(AT
P)が必ず存在し、死細胞中にはATPが存在しないこ
とが知られている。また1個の細胞中に存在するATP
[は、同一細胞では同−濃度のATPが存在する。従っ
てATPが定量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞
かの判定や細胞の活性度が測定できることになる。
−代謝の役割を果たしているアデノンン三リン酸(AT
P)が必ず存在し、死細胞中にはATPが存在しないこ
とが知られている。また1個の細胞中に存在するATP
[は、同一細胞では同−濃度のATPが存在する。従っ
てATPが定量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞
かの判定や細胞の活性度が測定できることになる。
また水道原水中や大気浮遊粉塵中には、種々の発癌関連
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ames法またはその変法を用いた復帰突然変異試験が
広く使用されている。これらの短期テストは方法が簡便
で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質のD
NA傷害を短時間に検出する有効な短期テストがいくつ
か提出されている。これらの短期テストは、特定の閑と
化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がDNA
傷害を誘起し、それに伴って生じるSO8反応をβ−D
−ガラクトシダーゼ活性から求める方法である。従って
菌体内に発生したβ−D−ガラクトンダーゼ活性を測定
することができれば、化学物質が発癌関連物質であるか
否かの判定ができることになる。
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ames法またはその変法を用いた復帰突然変異試験が
広く使用されている。これらの短期テストは方法が簡便
で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質のD
NA傷害を短時間に検出する有効な短期テストがいくつ
か提出されている。これらの短期テストは、特定の閑と
化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がDNA
傷害を誘起し、それに伴って生じるSO8反応をβ−D
−ガラクトシダーゼ活性から求める方法である。従って
菌体内に発生したβ−D−ガラクトンダーゼ活性を測定
することができれば、化学物質が発癌関連物質であるか
否かの判定ができることになる。
このように細胞内に存在する物質または生成した物質を
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。
一方最近において、可溶化することが困難な非常に疎水
性の強い蛋白質を比較的温和な条件で可溶化できる界面
活性剤の種類が増えてきた。
性の強い蛋白質を比較的温和な条件で可溶化できる界面
活性剤の種類が増えてきた。
界面活性剤はその電気的な性質に基づいて、陰イオン性
界面活性剤、陽イオン性界面活性剤2両性界面活性剤及
び非イオン性界面活性剤に分類される。また電気的な性
質とは無関係にコール酸。
界面活性剤、陽イオン性界面活性剤2両性界面活性剤及
び非イオン性界面活性剤に分類される。また電気的な性
質とは無関係にコール酸。
デオキシコール酸などのようなステロイド骨格を持つ界
面活性剤も存在する。この中で膜蛋白質の可溶化には、
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び胆汁
酸(コール酸、デオキシコール酸)がよく利用されてい
る。
面活性剤も存在する。この中で膜蛋白質の可溶化には、
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び胆汁
酸(コール酸、デオキシコール酸)がよく利用されてい
る。
こうしたことから界面活性剤を用いて細胞内の物質を抽
出することが試みられている。
出することが試みられている。
D1発明が解決しようとする課題
ところが、界面活性剤は表面張力を著しく低下させる作
用を有し、細胞の膜破壊にも実際にいくつかの界面活性
剤が使用されているものの、従来の界面活性剤を用いた
方法では、体細胞のような比較的膜破壊の容易な細胞を
対象とした場合には、良好な抽出を行うことができるが
、微生物細胞の場合には、膜破壊作用が弱く、抽出効率
が低下する欠点があった。さらに界面活性剤を用いた抽
出方法は、一般に時間がかかることも問題点となってい
た。
用を有し、細胞の膜破壊にも実際にいくつかの界面活性
剤が使用されているものの、従来の界面活性剤を用いた
方法では、体細胞のような比較的膜破壊の容易な細胞を
対象とした場合には、良好な抽出を行うことができるが
、微生物細胞の場合には、膜破壊作用が弱く、抽出効率
が低下する欠点があった。さらに界面活性剤を用いた抽
出方法は、一般に時間がかかることも問題点となってい
た。
本発明の目的は、細胞内の被測定物質の抽出効率が高く
、しかも操作が簡単で、短時間で分析を行うことのでき
る測定方法を提供することにある。
、しかも操作が簡単で、短時間で分析を行うことのでき
る測定方法を提供することにある。
E1課題を解決するための手段
本発明は細胞と界面活性剤及びクロロホルムとを混合し
、その混合液を振盪することにより細胞膜を破壊して細
胞内の被測定物質を抽出し、次いてこの被測定物質を測
定することを特徴とする。
、その混合液を振盪することにより細胞膜を破壊して細
胞内の被測定物質を抽出し、次いてこの被測定物質を測
定することを特徴とする。
F、実施例
(実施例1)
凍結保存された大腸菌の菌液を解凍し、菌液1mQを試
験管に分取してクロロホルム0.2mQを加え、更に界
面活性剤である1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS
)溶液を0.2mC加える。なおsDsの濃度単位の「
%」については、1%が0.019/m+2の意味であ
る。次いでこの試験管をポルテックスミキサー等の振盪
器を用いて20秒間撹拌振盪し、これにより細胞膜を破
壊する。
験管に分取してクロロホルム0.2mQを加え、更に界
面活性剤である1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS
)溶液を0.2mC加える。なおsDsの濃度単位の「
%」については、1%が0.019/m+2の意味であ
る。次いでこの試験管をポルテックスミキサー等の振盪
器を用いて20秒間撹拌振盪し、これにより細胞膜を破
壊する。
次にATPと他の細胞成分を分離するために遠心分離器
により3000rpmの回転数で5分間遠心分離し、そ
の後上澄成分をピペットで静かに別の試験管に分取し、
これを蒸留水で10倍に希釈する。そしてこの反応液0
.5mQを測定装置専用のバイヤルビンに分取し、発光
試薬を含む反応試薬を0.5mQ自動的に分注して、分
注直後から30秒間の発光量を計測する。
により3000rpmの回転数で5分間遠心分離し、そ
の後上澄成分をピペットで静かに別の試験管に分取し、
これを蒸留水で10倍に希釈する。そしてこの反応液0
.5mQを測定装置専用のバイヤルビンに分取し、発光
試薬を含む反応試薬を0.5mQ自動的に分注して、分
注直後から30秒間の発光量を計測する。
以上において上記の発光法は、生物発光法と呼ばれ、以
下に示すようにATPとルシフェリンとルンフェラーゼ
との反応により発生する光の量にもとづいてATPの績
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。
下に示すようにATPとルシフェリンとルンフェラーゼ
との反応により発生する光の量にもとづいてATPの績
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。
ルンフェラーゼ
ATP+ルシフェリン 7デニルル
ゾ7エリンアデールルン71リン十〇、−7デニルオ竹
ルシフ工リン+光第1図は、試料としてATP標準液を
用い、当該実施例の方法によりATPの量を測定した場
合の検量線の一例である。また発光量から検量線を介し
てATP抽出量(濃度)を求め、このATP抽出量と菌
体濃度との関係を調べたところ、第2図に示すような直
線性が得られた。従って抽出が良好に行われていること
が裏付けられている。
ゾ7エリンアデールルン71リン十〇、−7デニルオ竹
ルシフ工リン+光第1図は、試料としてATP標準液を
用い、当該実施例の方法によりATPの量を測定した場
合の検量線の一例である。また発光量から検量線を介し
てATP抽出量(濃度)を求め、このATP抽出量と菌
体濃度との関係を調べたところ、第2図に示すような直
線性が得られた。従って抽出が良好に行われていること
が裏付けられている。
ここで上記の測定プロセスの中でSDSの濃度を変えて
、抽出したATP濃度を調べたところ第3図に示す結果
が得られた。この結果からSDSの最適濃度は約1%が
最適であることがわかる。
、抽出したATP濃度を調べたところ第3図に示す結果
が得られた。この結果からSDSの最適濃度は約1%が
最適であることがわかる。
更に上記の測定プロセスの中で振盪時間を変えて、抽出
したATP濃度を調べたところ第4図に示す結果が得ら
れた。この結果から振盪時間はATP抽出量に対して影
響を及ぼさないことがわかる。
したATP濃度を調べたところ第4図に示す結果が得ら
れた。この結果から振盪時間はATP抽出量に対して影
響を及ぼさないことがわかる。
(実施例2)
SDS溶液の代わりに1%モノラウリル酸ソルビタン溶
液を用いる他は実施例1と同様にして、菌体濃度と抽出
したATP濃度との関係を調べたところ、第5図に示す
結果が得られた。この結果から良好な抽出が行われてい
ることが理解される。
液を用いる他は実施例1と同様にして、菌体濃度と抽出
したATP濃度との関係を調べたところ、第5図に示す
結果が得られた。この結果から良好な抽出が行われてい
ることが理解される。
(実施例3)
SDSf8Mの代わりに1%コール酸ナトリウム溶液を
用いる他は実施例1と同様にして、菌体濃度と抽出した
ATP濃度との関係を調べたところ、第6図に示す結果
が得られた。この結果から良好な抽出が行われているこ
とが理解される。
用いる他は実施例1と同様にして、菌体濃度と抽出した
ATP濃度との関係を調べたところ、第6図に示す結果
が得られた。この結果から良好な抽出が行われているこ
とが理解される。
(実施例4)
大腸菌をLB培地(各種の栄養分を備えた培地)で−夜
培養し、その培養液を波長600nmにおける吸光度が
0.1 になるようにLB培地で希釈調製する。こうし
て得られた試験液3.OrlにDNA損傷を引き起こす
化学物質0.05meを加え、37℃で2時間培養する
。これにより大腸菌中にβ−D−ガラクトシダーセか生
成する。次いで培養した試験液1.0mffに0.1m
of2/CのNaPBSl、0mQ、 りooホルム0
.1rl及び1%の5l)SO,1m12を加え、10
秒間振借した後5分間静1位した。しかる後にこの反応
tgL0.25m1!に0.1moC/CのNa P
I35(リン酸緩衝液)2.25mQ、、0.1mQ、
/QのN a N30.5 m1210.25moL’
i2のラクトース1.Omg及びGU/ml!(t、’
とは酵素活性を表す単位である。)のタルコースオギノ
ダーゼ1m9を加え、37℃で2時間酵素反応さUた。
培養し、その培養液を波長600nmにおける吸光度が
0.1 になるようにLB培地で希釈調製する。こうし
て得られた試験液3.OrlにDNA損傷を引き起こす
化学物質0.05meを加え、37℃で2時間培養する
。これにより大腸菌中にβ−D−ガラクトシダーセか生
成する。次いで培養した試験液1.0mffに0.1m
of2/CのNaPBSl、0mQ、 りooホルム0
.1rl及び1%の5l)SO,1m12を加え、10
秒間振借した後5分間静1位した。しかる後にこの反応
tgL0.25m1!に0.1moC/CのNa P
I35(リン酸緩衝液)2.25mQ、、0.1mQ、
/QのN a N30.5 m1210.25moL’
i2のラクトース1.Omg及びGU/ml!(t、’
とは酵素活性を表す単位である。)のタルコースオギノ
ダーゼ1m9を加え、37℃で2時間酵素反応さUた。
なおNa−PI352.25+tlを加えた理由は、ラ
クトースとクルコースオキンダーゼと反応液との比率を
一定にするためである。
クトースとクルコースオキンダーゼと反応液との比率を
一定にするためである。
その後この酵素反応液Q、2mQに2XlO−7m。
Q/!2のルミノール0.5m&と6 X I O−3
mo(1/Q、のフエリノアノ化カリウム0.5m(2
を加え、1秒後から30秒間の発光量を計測した。
mo(1/Q、のフエリノアノ化カリウム0.5m(2
を加え、1秒後から30秒間の発光量を計測した。
ここで上記のプロセス中の酵素反応と化学発光反応とは
次の通りである。
次の通りである。
く酵素反応〉
α−D−グル]−ス
β−D−グル]−ス
く化学発光反応〉
第7図は既知jitのβ−D−ガラクトンダーゼ活性と
発光量との関係を示ケ検m線であり、この検fit線を
利用して4−二ト〔Jキノリン−N−オキノド(1)
N A損傷を引き起こす化学物質(4,N Q O))
の定量を行った結果を第8図に示W0β−[)−カラク
トシダーゼ活性濃度と4−ニトロキノリンN−オキノド
濃度は比例関係にあり、その定数は酵素反応の種類及び
反応時間等により定まる。
発光量との関係を示ケ検m線であり、この検fit線を
利用して4−二ト〔Jキノリン−N−オキノド(1)
N A損傷を引き起こす化学物質(4,N Q O))
の定量を行った結果を第8図に示W0β−[)−カラク
トシダーゼ活性濃度と4−ニトロキノリンN−オキノド
濃度は比例関係にあり、その定数は酵素反応の種類及び
反応時間等により定まる。
以上において、本発明の対象となる細胞は、微生物ある
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類あ
るいは原生動物等が挙げられる。
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類あ
るいは原生動物等が挙げられる。
抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アゾ/ノンすリン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−D−ガラクトシダーゼ等の酵素である。
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アゾ/ノンすリン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−D−ガラクトシダーゼ等の酵素である。
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン
性界面活性剤あるいはステロイド骨格をもつ界面活性剤
等を用いることができる。
性界面活性剤あるいはステロイド骨格をもつ界面活性剤
等を用いることができる。
陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸
ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−N−サ
ルコシン酸ナトリウム等が挙げられる。
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸
ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−N−サ
ルコシン酸ナトリウム等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、デシルエーテル、ドデ
シルエーテル、トリデシルエーテル、テトラデシルエー
テル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、オレイル
エーテル、セチル−ステアリルエーテル、p−t−オク
チルフェニルエーテル、p−オクチルフェニルエーテル
、p−/ニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビ
タン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸
ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン
酸ソルビタン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステ
アリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ラウ
リルジメチルアミンアキシト等を挙げることができる。
シルエーテル、トリデシルエーテル、テトラデシルエー
テル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、オレイル
エーテル、セチル−ステアリルエーテル、p−t−オク
チルフェニルエーテル、p−オクチルフェニルエーテル
、p−/ニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビ
タン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸
ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン
酸ソルビタン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステ
アリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ラウ
リルジメチルアミンアキシト等を挙げることができる。
ステロイド骨格をもつ界面活性剤としては、コール酸ナ
トリウム、デオキンコール酸ナトリウム、ケノデオキシ
コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニン等を挙げる
ことができる。
トリウム、デオキンコール酸ナトリウム、ケノデオキシ
コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニン等を挙げる
ことができる。
抽出した物質については、生物発光法や化学発光法を利
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。
G0発明の効果
本発明によれば、界面活性剤とクロロホルムとを組み合
わせて細胞膜を破壊し、細胞内の被測定物質を抽出する
ようにしているため、実施例からも明らかなように抽出
効率が高くて精度の高い測定を行うことができる。また
陰イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤等種々の
ものを使用することができ、界面活性剤に制約がない。
わせて細胞膜を破壊し、細胞内の被測定物質を抽出する
ようにしているため、実施例からも明らかなように抽出
効率が高くて精度の高い測定を行うことができる。また
陰イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤等種々の
ものを使用することができ、界面活性剤に制約がない。
しかも室温で抽出することができ、その操作も簡単なた
め、自動化が容易である。その上抽出時間が短いため作
業上有利である。
め、自動化が容易である。その上抽出時間が短いため作
業上有利である。
第1図はATPの検量線を示すグラフ、第2図、第5図
及び第6図は、各々菌体濃度とATP濃度との関係を示
すグラフ、第3図はSDS濃度とATP濃度との関係を
示すグラフ、第4図はATP濃度と振盪時間との関係を
示すグラフ、第7図はβ−D−ガラクトシダーゼ活性の
検量線を示すグラフ、第8図は4NQOと発光量との関
係を示すグラフである。 第1図 ATPの検量線のグラフ =8−7 A T P tK(mol/ l) 第2図 菌体4文とATPa変との関係図 菌体fi!f(cells/1ube)第4図 ATPn文と種湯時間との関係図 圓 振l最時間(S) 第5図 菌体atとATP濃度との関係図 菌体濃度(cells/+ube) 第6図 菌体濃度とATP@度との関係図 1体1度(cells/+Lbe)
及び第6図は、各々菌体濃度とATP濃度との関係を示
すグラフ、第3図はSDS濃度とATP濃度との関係を
示すグラフ、第4図はATP濃度と振盪時間との関係を
示すグラフ、第7図はβ−D−ガラクトシダーゼ活性の
検量線を示すグラフ、第8図は4NQOと発光量との関
係を示すグラフである。 第1図 ATPの検量線のグラフ =8−7 A T P tK(mol/ l) 第2図 菌体4文とATPa変との関係図 菌体fi!f(cells/1ube)第4図 ATPn文と種湯時間との関係図 圓 振l最時間(S) 第5図 菌体atとATP濃度との関係図 菌体濃度(cells/+ube) 第6図 菌体濃度とATP@度との関係図 1体1度(cells/+Lbe)
Claims (1)
- (1)細胞と界面活性剤及びクロロホルムとを混合し、
その混合液を振盪することにより細胞膜を破壊して細胞
内の被測定物質を抽出し、次いでこの被測定物質を測定
することを特徴とする細胞内の物質測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21600288A JPH0262942A (ja) | 1988-08-30 | 1988-08-30 | 細胞内の物質測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21600288A JPH0262942A (ja) | 1988-08-30 | 1988-08-30 | 細胞内の物質測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0262942A true JPH0262942A (ja) | 1990-03-02 |
Family
ID=16681768
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21600288A Pending JPH0262942A (ja) | 1988-08-30 | 1988-08-30 | 細胞内の物質測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0262942A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5970591A (en) * | 1998-04-10 | 1999-10-26 | Suzuki Warper Ltd. | Electronically controlled sample warper having yarn exchange mechanism high speed warping method and yarn draw-back device |
US6318224B1 (en) * | 1996-06-01 | 2001-11-20 | Thurne Engineering Company Limited | Slicing of products |
-
1988
- 1988-08-30 JP JP21600288A patent/JPH0262942A/ja active Pending
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