JP5405650B1 - 細胞由来のアデノシン三リン酸を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 アデノシン三リン酸分解酵素を内包するマイクロカプセルを用いて、試料中の遊離アデノシン三リン酸を分解した後、試料中に存在する細胞からアデノシン三リン酸を抽出し、抽出されたアデノシン三リン酸を測定することを含む、細胞由来のアデノシン三リン酸を測定する方法。
【選択図】 図1
Description
(1)アデノシン三リン酸分解酵素を内包するマイクロカプセルを用いて、試料中の遊離アデノシン三リン酸を分解した後、試料中に存在する細胞からアデノシン三リン酸を抽出し、抽出されたアデノシン三リン酸を測定することを含む、細胞由来のアデノシン三リン酸を測定する方法。
(2)アデノシン三リン酸分解酵素が、アピラーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、ヌクレアーゼP及びデアミナーゼからなる群より選択される少なくとも1種の酵素である(1)記載の方法。
(3)マイクロカプセルの被膜が、分子量1000以下のイオンは透過させ、アデノシン三リン酸分解酵素は透過しない半透膜である(1)又は(2)記載の方法。
(4)マイクロカプセルの被膜が、アルギン酸、メトキシペクチン、硫酸セルロース、ゼラチン、キトサン、カラギーナン及びワックスからなる群より選択される少なくとも1種の材料を含む(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)1カプセル中のアデノシン三リン酸分解酵素含有量が0.1 ng〜1 mgである(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応により、アデノシン三リン酸を測定する(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)アデノシン三リン酸分解酵素を内包するマイクロカプセル。
(8)(7)記載のマイクロカプセルを含む、アデノシン三リン酸分解試薬。
(9)(8)記載のアデノシン三リン酸分解試薬を含む、アデノシン三リン酸測定キット。
マイクロカプセルの比重は、1.0以上が適当であり、1.0〜3.0が好ましく、1.0〜2.0がより好ましい。比重は、ピペット法(JIS Z8820-2:2004)に従い、測定することができる。
また、1カプセル中のATP分解酵素含有量は、0.1 ng〜1 mgであるとよく、好ましくは1 ng〜500μgであり、より好ましくは1 ng〜1μgである。カプセルに内包させるATP分解酵素量は、カプセル形成前の溶液に投入する酵素量により調節が可能である。
〔実施例1〕
I.ATP消去ビーズの調製方法
1.アピラーゼジャガイモ由来GradeIII(シグマ・アルドリッジ社)1.1 ml、アルギン酸ナトリウム(和光純薬)2 g、顔料インキ(グラフテック社 インクペン用水性顔料インク青)200 μlを純水200 mlに溶解した。
2.溶解液をマイクロビーズ作製装置(日本ビュッヒ社 Encapsulator B-390)にセットした。
3.マイクロビーズ作製装置に直径約150 μmの液滴を生成させた。
4.液滴を2%塩化カルシウム溶液中に滴下した。
5.表面がゲル化した、アピラーゼおよび顔料インキを含んだマイクロビーズを0.2 μm孔径のフィルター(ナルゲン フィルターユニット)を用いてろ過した。
6.フィルター上のろ物(マイクロカプセル)を10 mM HEPESバッファーで洗浄した。
7.マイクロカプセルを適当量の10 mM HEPESバッファーに再懸濁した。
8.上記操作で得られた上清100 μlに10-7mole/lのATP標準液(東洋ビーネット社)10μlを混合し、30分間反応させた。その後、LL発光試薬(菌士郎ATP発光試薬 LL100-1 東洋ビーネット社)100 μlを混合し30秒間反応させた後、その発光をルミノメーター(LB9507 ベルトールド社)で測定した。なお、測定の積算時間は10秒間とした。本操作により得られた結果と純水100 μlに10-7mole/lのATP標準液1 μlを添加したものの発光量を測定した結果を比較し、上清液の発光量が純水の発光量に対して95%以上であることを確認し、マイクロカプセル芯剤に含有されなかったアピラーゼが存在していないことを証明した。上清液とマイクロビーズ(ATP消去ビーズ)の外観を図2に示す。
マイクロビーズの物性値は、以下の通りである。
・平均粒度:155.2 um
・粒度分布:16.4%
(顕微鏡観察(倍率40)でカプセルの直径を実測して、平均粒度と粒度分布を決定した。1回の観察で100粒測定し、それを3回繰り返した。平均粒度は300粒の平均値、粒度分布はその標準偏差で示す。)
・比重:1.6(ピペット法(JIS Z8820-2:2004) に従い測定した。)
・1カプセル中のアピラーゼ含有量:11.6 ng(直径150umのカプセルの内側に含まれる液量は約1.8ulであるので、本実験の条件では11.6 ngの酵素が含まれていると計算される。尚、カプセルに内包させる酵素量は、カプセル形成前の溶液に投入する酵素量により調節が可能である。本実験では、200mlの溶液に1.1mgのアピラーゼを混合したが、例えば、110mgのアピラーゼを混合した場合は、内包酵素量は110ngと推定される。>
I.(ATP消去ビーズの調製方法)の7.のマイクロカプセル懸濁液(表1では、「マイクロカプセル含有液」と表示)とIの8.の上清液の各々100 μlに10-7mole/lのATP標準液(東洋ビーネット社)10μlを混合し、30分間反応させた。その後、LL発光試薬(菌士郎ATP発光試薬 LL100-1 東洋ビーネット社)100 μlを混合し30秒間反応させた後、その発光をルミノメーター(LB9507 ベルトールド社)で測定した。なお、測定の積算時間は10秒間とした。結果を表1にまとめた(表1の「洗浄操作あり」)
また、I.(ATP消去ビーズの調製方法)の5.6.7を省略した場合についても、同様の測定を行い、結果を表1にまとめた(表1の「未洗浄」)。「未洗浄」の場合、上清液にマイクロカプセルに包摂されなかったと考えられるアピラーゼが残存し、これがATPを分解した結果、本来得られるはずである発光量を2桁下げていると考えられる。このことは、本来の目的物である抽出した微生物由来のATPが上清液に残存しているアピラーゼにより分解されてしまう可能性を示唆する。このため、マイクロカプセルをろ過にて回収後HEPESバッファーで洗浄する操作により、未包摂アピラーゼを除去することが好ましいと考えられる。なお、表1におけるマイクロカプセル含有液はカプセル中にアピラーゼを含んでいるのでATP分解活性がある。
1.検体(緑茶・ジュース・ATP標準サンプルなど)200 μlとマイクロビーズ含有液200 μlを混合し、室温で30分間放置した。この間にマイクロビーズが沈殿した。
2.反応後、上清100 μlを分取し、等量のATP抽出試薬(菌士郎ATP抽出試薬 LL100-2 東洋ビーネット社)を添加した。30秒間反応させた。
3.上記2の反応液に200 μlのLL発光試薬(菌士郎ATP発光試薬 LL100-1 東洋ビーネット社)を添加し、その発光をルミノメーターで測定した。
IIIの測定結果(検体:緑茶)を下記の表2に示す。
検体(緑茶)1 mlに大腸菌 5 x 105個を混入してその存在をATP量の変化で検出した結果を下記の表3に示す。
Claims (8)
- アデノシン三リン酸分解酵素を内包するマイクロカプセルを用いて、試料中の遊離アデノシン三リン酸を分解した後、マイクロカプセルを含まない試料中に存在する細胞からアデノシン三リン酸を抽出し、抽出されたアデノシン三リン酸を測定することを含む、細胞由来のアデノシン三リン酸を測定する方法。
- アデノシン三リン酸分解酵素が、アピラーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、ヌクレアーゼP及びデアミナーゼからなる群より選択される少なくとも1種の酵素である請求項1記載の方法。
- マイクロカプセルの被膜が、分子量1000以下のイオンは透過させ、アデノシン三リン酸分解酵素は透過しない半透膜である請求項1又は2記載の方法。
- マイクロカプセルの被膜が、アルギン酸、メトキシペクチン、硫酸セルロース、ゼラチン、キトサン、カラギーナン及びワックスからなる群より選択される少なくとも1種の材料を含む請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 1カプセル中のアデノシン三リン酸分解酵素含有量が0.1 ng〜1 mgである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応により、アデノシン三リン酸を測定する請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- アデノシン三リン酸分解酵素を内包するマイクロカプセルを含む、アデノシン三リン酸測定試薬。
- 請求項7記載のアデノシン三リン酸測定試薬を含む、アデノシン三リン酸測定キット。
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