WO2006134698A1 - マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置 - Google Patents

マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置 Download PDF

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WO2006134698A1
WO2006134698A1 PCT/JP2006/305439 JP2006305439W WO2006134698A1 WO 2006134698 A1 WO2006134698 A1 WO 2006134698A1 JP 2006305439 W JP2006305439 W JP 2006305439W WO 2006134698 A1 WO2006134698 A1 WO 2006134698A1
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atp
microchannel
reagent
degrading enzyme
solution
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PCT/JP2006/305439
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Keiichi Watanabe
Tomonari Kogure
Original Assignee
Bussan Nanotech Research Institute, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a microchannel chip and a microorganism detection apparatus.
  • ATP adenosine triphosphate
  • background ATP ATP other than ATP in microorganisms
  • Patent Documents 1 and 2 As a method for removing such background ATP and enhancing the detection accuracy of microorganisms in a specimen, in Patent Documents 1 and 2 below, ATP-degrading enzyme (adenosine phosphate deaminase or luciferase) is contained in the specimen. A method of decomposing the knock-out ATP has been proposed. Patent Document 3 below proposes a method for degrading Nottag Round ATP by enclosing ATP-degrading enzyme (avirase) in a semipermeable membrane tube and immersing this tube in the sample solution. Talk!
  • avirase enclosing ATP-degrading enzyme
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11-56393
  • Patent Document 2 JP 2000-189197 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-210197
  • sample liquid sample solution or liquid sample
  • reagent solution sample solution or liquid sample
  • a microchannel chip is suitable.
  • the present invention provides a microchannel chip capable of detecting microbes (bacteria, fungi, etc.) in a specimen in a short time with sufficiently high accuracy and simple operation, and
  • An object of the present invention is to provide a microorganism detecting apparatus used.
  • the present invention includes a microchannel and a flow path connected to the microchannel through at least one connecting portion provided in the middle of the microchannel.
  • An ATP-degrading enzyme is immobilized on the inner wall surface of the microchannel on one end side of the microchannel with respect to the at least one connection portion. .
  • sample liquid sample solution or liquid sample
  • the ATP-degrading enzyme is immobilized! Then, first, only the sample solution flows through the microchannel, and the knockout ATP is decomposed and removed by the ATP-degrading enzyme. Next, when one of the ATP extraction reagent and the ATP detection reagent is introduced into the microchannel from one or a plurality of flow paths, either first or both at the same time, these are mixed with the sample liquid.
  • ATP in the microorganisms is extracted by the ATP extraction reagent, and the extracted ATP reacts with the ATP detection reagent to emit light. By detecting the generated light, microorganisms in the specimen are detected.
  • knockout ATP is decomposed and removed before the sample solution is mixed with the ATP extraction reagent or the ATP detection reagent, so that the ATP in the microorganisms has sufficiently high accuracy. Can be detected.
  • the ATP-degrading enzyme since the ATP-degrading enzyme is immobilized on the inner wall surface of the microchannel, the ATP-degrading enzyme does not reach the connecting portion where the sample liquid and the ATP extraction reagent or the ATP detection reagent are mixed. . Therefore, it is not necessary to deactivate the ATP-degrading enzyme for detecting ATP in microorganisms, and it is possible to detect ATP in microorganisms in a short time with a simple operation. [0011] Furthermore, since background ATP and ATP-degrading enzyme come into contact in a very narrow space called a microchannel, knockout ATP is rapidly removed and the removal of ATP is performed in a short time.
  • ATP in microorganisms can be detected with sufficiently high accuracy and in a short time.
  • the sample liquid, the ATP extraction reagent, and the ATP detection reagent are mixed in an extremely narrow space called a microchannel, so that the variation in the mixed state of the sample liquid and the reagent is small, so that the reproducibility of the ATP measurement results is improved. Can do.
  • the microchannel chip has an ADP (adenosine diphosphate) in addition to the ATP degrading enzyme on the inner wall surface of the microchannel on one end side of the microchannel with respect to the at least one connection portion. ) It is preferable that the degrading enzyme is immobilized, or that the ATP degrading enzyme also serves as an ADP degrading enzyme.
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP in order to detect ATP in a microorganism with higher sensitivity, it is preferable to detect the ATP in the microorganism by amplifying it with an ATP amplification reagent.
  • ADP is converted to ATP and amplified during the ATP amplification reaction, so ADP (hereinafter referred to as ⁇ background ADP '') mixed in the sample liquid is amplified.
  • ⁇ background ADP '' ADP
  • the ADP-degrading enzyme is immobilized on the inner wall surface of the microchannel on one end of the microchannel with respect to at least one of the connections, or the ATP-degrading enzyme is ADP.
  • the ATP-degrading enzyme is ADP.
  • the knockout ATP and background ADP are decomposed and removed before the sample solution is mixed with the ATP extraction reagent, ATP amplification reagent, or ATP detection reagent. Therefore, ATP in microorganisms can be detected with sufficiently high accuracy.
  • the ATP amplification reagent can be mixed with the sample solution at the same time as or before the ATP detection reagent to detect ATP in microorganisms with higher sensitivity. Can be issued.
  • the ATP-degrading enzyme also serves as the ADP-degrading enzyme, it is not necessary to fix the ATP-degrading enzyme and the ADP-degrading enzyme separately in the microchannel. . In addition, it is easy to control the quantitative ratio of ATP-degrading enzyme and ADP-degrading enzyme immobilized on the inner wall of the microchannel.
  • ATP-degrading enzyme also serves as ADP-degrading enzyme
  • ADP-degrading enzyme means that ATP-degrading enzyme, that is, a substance (for example, protein) having ATP-degrading enzyme activity is further ADP-degrading enzyme. This means that the substance has an ATP-degrading enzyme active site and an ADP-degrading enzyme active site different from each other.
  • the present invention also provides a microorganism detection apparatus including the microchannel chip and a photodetector that detects light generated in the microchannel.
  • microbe detection apparatus includes the microchannel chip, it is possible to detect microbes in a sample with sufficiently high accuracy and sensitivity and in a short time with a simple operation with high reproducibility. enable.
  • the ATP extraction reagent is a reagent that kills microorganisms and extracts ATP in the microorganisms.
  • examples include lytic enzymes (lysozyme, chitinase, chitosanase, etc.), cationic surfactants (salts). ⁇ Benzalkol, salt ⁇ benzethonium, salt ⁇ cetyltrimethyl ammonium, etc., nonionic surfactant (polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene sorbitan ester) And sorbitan fatty acid esters).
  • the ATP extraction reagent may contain, for example, a nonionic surfactant, a chelating agent (such as ethylenediamine tetraacetic acid), or a sugar (such as sucrose, glucose, or fructose) in addition to the lytic enzyme.
  • a nonionic surfactant such as ethylenediamine tetraacetic acid
  • a sugar such as sucrose, glucose, or fructose
  • An ATP detection reagent is a reagent that detects ATP by reacting with ATP to generate luminescence, for example, a reagent that also has luciferin, luciferase, and divalent metal ion (Mg 2+, etc.) power. Is mentioned. ATP reacts with luciferin and luciferase in the presence of oxygen and divalent metal ions to produce luminescence by luciferin. [0021]
  • the ATP amplification reagent is a reagent for amplifying ATP, and examples thereof include a reagent composed of AMP (adenosine phosphate), polyphosphate, adenylate kinase, and polyphosphate kinase.
  • ATP reacts with AMP in the presence of adenylate kinase to produce two molecules of ADP, which react with polyphosphate in the presence of polyphosphate kinase to yield two molecules of ATP. Arise. By repeating this reaction, ATP is amplified.
  • a microchannel chip capable of detecting microbes (bacteria, fungi, etc.) in a specimen in a short time with sufficiently high accuracy and simple operation, and The used microorganism detection apparatus is provided.
  • FIG. 1 is a plan view of a microchannel chip according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microchannel chip according to the first embodiment, taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is a partial cross-sectional view of the microchannel chip according to the first embodiment, cut along a plane perpendicular to the extending direction of the microchannel.
  • FIG. 4 is a plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a side view of the microorganism detection device according to the first embodiment, viewed in the direction of arrow V in FIG.
  • FIG. 6 is a partially cutaway plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment at a temporary point where the liquid is flowing through the microchannel.
  • FIG. 7 is a partially cutaway plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment at a temporary point where the liquid is flowing through the microchannel.
  • FIG. 8 is a partially cutaway plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment at a temporary point where the liquid is flowing through the microchannel.
  • FIG. 9 is a partially cutaway plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment at a temporary point where the liquid is flowing through the microchannel.
  • FIG. 10 is a plan view of a microchannel chip according to a second embodiment.
  • FIG. 11 is a microchannel extension direction of a microchannel chip according to another embodiment.
  • 2 is a partial cross-sectional view taken along a plane parallel to the substrate and perpendicular to the surface of the substrate.
  • FIG. 12 is a partial cross-sectional view of a microchannel chip according to another embodiment, cut along a plane perpendicular to the extending direction of the microchannel.
  • FIG. 13 is a partial cross-sectional view of a microchannel chip according to another embodiment, cut along a plane perpendicular to the extending direction of the microchannel.
  • FIG. 14 is a plan view of a microchannel chip used in Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the reaction time (circulation time) and ATP concentration in Example 1.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the reaction time (immersion time) and ATP concentration in Comparative Example 1.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between the concentration of Escherichia coli in a sample solution and the amount of luminescence in Example 2 and Comparative Example 2.
  • a reagent that also comprises AMP, polyphosphate, adenylate kinase, and polyphosphate kinase is used as the ATP amplification reagent.
  • a reagent capable of AMP and polyphosphate is referred to as “ATP amplification reagent (1)”
  • a reagent that also serves as adenylate kinase and polyphosphate kinase is referred to as “ATP amplification reagent ( ⁇ ⁇ )”.
  • FIG. 1 is a plan view of the microchannel chip according to the first embodiment.
  • the microchannel chip 10 according to the first embodiment has a microchannel 12 and two connecting portions 13a and 14a provided in the middle of the microchannel 12, respectively. Two flow paths 13 and 14 connected to each other.
  • an ATP-degrading enzyme is immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12 on one end side of the microchannel 12 with respect to the two connecting portions 13a and 14a. It has been done.
  • the microchannel 12 is formed in a meandering shape.
  • One end of the microchannel 12 is provided with a well 15 for containing the sample liquid, and the other end is provided with a well 18 for containing the reaction liquid flowing through the microchannel 12.
  • the ends of the channels 13 and 14 are provided with wells 16 and 17 for accommodating various reagent solutions, respectively.
  • the ATP extraction reagent solution force is contained in the wall 16 and the ATP detection reagent solution is contained in the well 17.
  • the microchannel chip 10 first, when the sample liquid contained in the well 15 is introduced into the microchannel 12, only the sample liquid flows through the microchannel 12 up to the connection portion 13 a. In this process, the background ATP in the sample liquid is decomposed and removed by the ATP-degrading enzyme immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12. Next, when the ATP extraction reagent solution accommodated in the well 16 is introduced into the microchannel 12 through the flow path 13, the mixed solution of the sample liquid and the ATP extraction reagent solution flows to the connection portion 14a. During this process, ATP in the microorganism is extracted.
  • the ATP detection reagent solution contained in the well 17 is introduced into the microchannel 12 through the flow path 14, the mixed solution of the sample solution, the ATP extraction reagent solution, and the ATP detection reagent solution flows to the well 18.
  • the previously extracted ATP undergoes a luminescent reaction and emits light. By detecting this light, microorganisms in the specimen can be detected.
  • the portion of the microchannel 12 between the hole 15 and the connecting portion 13a is formed in a meandering shape and is sufficiently long, so that the background ATP in the sample liquid is fixed to the inner wall surface of the portion. It is almost completely decomposed and removed by the trapped ATP-degrading enzyme.
  • the portion of the microchannel 12 between the connection portion 13a and the connection portion 14a is also formed in a meandering shape, and is sufficient. Therefore, ATP in microorganisms is almost completely extracted by the ATP extraction reagent.
  • the portion of the microchannel 12 between the connection portion 14a and the tool 18 is also formed in a meandering shape and is sufficiently long, so that the light generated by the luminescence reaction is reliably at the peak position of the luminescence intensity. Can be detected.
  • the knock-out ATP is almost completely decomposed and removed before the sample liquid and the ATP extraction reagent or ATP detection reagent are mixed. Can be detected with high accuracy.
  • microchannel chip 10 If the microchannel chip 10 is used, it is not necessary to deactivate the ATP-degrading enzyme for the detection of ATP in microorganisms. In addition, since knock-in ATP and ATP-degrading enzyme come into contact in a very narrow space called a microchannel, the removal of background ATP, which accelerates the ATP-degrading reaction, is performed in a short time. In addition, since the sample liquid, the ATP extraction reagent, and the ATP detection reagent are mixed in an extremely narrow space called a microchannel, a luminescent reaction occurs in a short time (several seconds). Therefore, it is possible to detect ATP in microorganisms with sufficiently high accuracy and in a short time.
  • the sample liquid, the ATP extraction reagent, and the ATP detection reagent are mixed in a very narrow space with the microchannel, and the variation in the mixed state of the sample liquid and the reagent is small. Therefore, the reproducibility of ATP measurement results can be improved.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microchannel chip according to the first embodiment, taken along line II-II of FIG.
  • FIG. 3 is a partial cross-sectional view of the microchannel chip according to the first embodiment, taken along a plane perpendicular to the extending direction of the microchannel.
  • the microchannel chip 10 includes three layers of substrates lla to llc, and the microchannel 12 and the wells 15 to 18 are formed on the substrate 11a.
  • the substrate 1 la to l lc is made of a light-transmitting material!
  • a light-transmitting material examples include polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET), polydimethylsiloxane (PDMS), polyimide, polystyrene (PS), polymethylmethacrylate (PMMA), and the like, quartz glass or pyrex ( (Registered trademark) glass, etc.
  • the cross-sectional shape of the microchannel 12 is such that the long side is the surface of the substrate. A rectangle parallel to the surface.
  • the width and depth of the microchannel 12 are preferably 1 mm or less, more preferably 0.1 ⁇ m to 500 ⁇ m, and still more preferably 0.1 ⁇ m to 100 / zm.
  • the width and depth exceed lmm, the reaction between the sample liquid and various reagents during the luminescence reaction becomes more uneven and the reaction is slower than when the width and depth are less than lmm.
  • the reproducibility of the measurement result of light emission tends to be low. Width and depth force SO.
  • the microchannel width is the maximum value of the length of the microchannel in the direction perpendicular to the extending direction of the microchannel and parallel to the surface of the substrate.
  • the microchannel depth is the maximum length of the microchannel in the direction perpendicular to the surface of the substrate. In FIG. 3, the length of the long side of the rectangle formed by the cross section of the microchannel 12 corresponds to the width, and the length of the short side corresponds to the depth.
  • microchannel chip 10 can be manufactured, for example, as follows.
  • a resist is applied on a silicon wafer, and after patterning (exposure and development) into a shape corresponding to the microchannel 12, the flow path 13, the flow path 14, and the wells 15 to 18, a surface portion of the silicon wafer is formed. Etch. Thus, convex portions corresponding to the microchannel 12, the flow paths 13, 14 and the wells 15-18 are formed on the silicon surface.
  • the resist is removed and uncured PDMS is applied. Then, the PDMS is cured (125 ° C., 20 minutes), and the PDMS is peeled off to obtain a cured PDMS having the shape of the microchannel 12, the flow paths 13, 14 and the holes 15-18. PDMS cured products can be further processed (for example, drilling).
  • Examples of the ATP-degrading enzyme immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12 include avirase, adenosine phosphate deaminase, and luciferase. ATP-degrading enzyme may also serve as ADP-degrading enzyme. A pyrase is mentioned.
  • the immobilization of ATP-degrading enzyme can be performed, for example, as follows. First, after circulating the enzyme solution through the microchannel 12, seal all open parts (wells) and leave in the refrigerator (about 4 ° C) for about 5 hours. Next, a buffer is passed through the microchannel 12 to remove an enzyme that is easily desorbed. Finally, the inside of the microchannel 12 is replaced with air.
  • the enzyme is immobilized and the ATP resolution of the immobilized enzyme, for example, after the ATP solution is circulated through the microchannel 12, the reacted solution contained in the well 18 is removed. Collect the luciferin and luciferase here, and measure the amount of luminescence with a Lumitester. If the amount of luminescence is reduced compared to the original ATP solution, it can be determined that the ATP-degrading enzyme is immobilized. In addition, ATP resolution can be determined by the amount of decrease in light emission.
  • FIG. 4 is a plan view of the microorganism detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a side view of the microorganism detection apparatus according to the first embodiment, viewed in the direction of arrow V in FIG.
  • FIG. 4 and 5 includes a microchannel chip 10 and a photodetector 25 (not shown in FIG. 4) that detects light generated in the microchannel 12. It is equipped with.
  • the reflector 19 a lid 21-23 with tubes 21a-23a (not shown in FIG. 4), and a pump connected to the tubes 21a-23a (not shown in FIGS. 4 and 5). Not).
  • Well 18 is open to the atmosphere.
  • the photodetector 25 has a light receiving portion 24, and a light receiving surface in a portion of the microchannel 12 between the connection portion 14 a and the well 18, that is, a region where light emission occurs (hereinafter referred to as “light emitting region”).
  • the microchannel chip 10 is arranged on one surface (the surface of the substrate 1 lc) so that 24a faces each other.
  • the reflector 19 is arranged on the surface opposite to the photodetector 25 (the surface of the substrate 1 la) with respect to the microchannel chip 10 so that the reflecting surface 19a faces the light receiving surface 24a of the light receiving unit 24. Has been.
  • the lids 21 to 23 cover the wells 15 to 17, respectively. Tubes 21a to 23a attached to the lids 21 to 23 communicate with the wells 15 to 17 and the inside of the pump, respectively.
  • the liquid contained in uel 15 can be pumped directly by pumping pressure. Introduced into microchannel 12. Further, the liquid contained in the walls 16 and 17 is introduced into the microchannel 12 through the flow paths 13 and 14 by applying pressure with a pump, respectively. The flow speed of the liquid flowing through the microchannel 12 and the flow paths 13 and 14 can be adjusted by pumps connected to the tubes 21a to 23a, respectively.
  • 6 to 9 are partially cutaway plan views of the microorganism detection device according to the first embodiment at a temporary point where the liquid is flowing through the microchannel.
  • the microbe detection apparatus is illustrated with a part of the substrate 11a of the microchannel chip 10 cut away so that a part of the microchannel 12 (part indicated by a solid line) appears on the surface for convenience.
  • a set of dots represents a liquid. 6 to 9 do not show the photodetector 25, the reflection plate 19, the lids 21 to 23, the tubes 21a to 23a, and the pump.
  • the pressure of P1 is applied to the sample liquid stored in the well 15, the sample liquid is introduced into the microchannel 12, and the microchannel 12 is circulated to the connecting portion 13a.
  • the background ATP in the sample liquid is decomposed and removed by the ATP-degrading enzyme immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12.
  • the pressure of P2 is added to the ATP extraction reagent solution contained in the well 16, and the ATP extraction reagent solution Is introduced into the microchannel 12 through the flow path 13, and the mixed solution of the sample liquid and the ATP extraction reagent solution is circulated to the connecting portion 14a.
  • ATP in the microorganism is extracted.
  • the pressure of P3 is added to the ATP detection reagent solution contained in wel 17, and the ATP detection reagent solution Is introduced into the microchannel 12 through the flow path 14 and the mixed solution of the sample solution, the ATP extraction reagent solution and the ATP detection reagent solution is allowed to flow to the well 18.
  • the previously extracted ATP undergoes a luminescent reaction and emits light. By detecting this light, microorganisms in the sample can be detected.
  • the microbe detection apparatus 100 includes the microchannel chip 10, if this is used, the microbe in the sample is detected with sufficiently high accuracy and sensitivity in a short time with a simple operation with high reproducibility. be able to.
  • the directional fluorescent light on the side opposite to the light receiving surface 24a is also reflected by the reflecting surface 19a and enters the light receiving surface 24a.
  • the microchannel 12 is densely formed in a meandering manner in the portion of the light emitting region sandwiched between the reflecting plate 19 and the light receiving portion 24, the amount of directional light on the light receiving surface 24a and the reflecting surface 19a is extremely small. Many. Therefore, microorganisms can be detected with extremely high sensitivity.
  • a photomultiplier tube As the photodetector 25, a photomultiplier tube, a luminometer, a germanium photodiode, a gallium arsenide photodiode, a phototransistor, a CCD element, or the like can be used.
  • the reflection plate 19 may be made of a material that reflects light. Examples of such a material include metals such as aluminum, nickel, titanium, chromium, gold, copper, and iron.
  • FIG. 10 is a plan view of the microchannel chip according to the second embodiment.
  • the microchannel chip 20 according to the second embodiment is connected to the microchannel 12 through the microchannel 12 and the connection portion 26a provided between the connection portions 13a and 14a.
  • the microchannel chip 10 is different from the microchannel chip 10 according to the first embodiment in that it further includes a flow path 26 and is provided with a tool 27 for containing a reagent solution at an end of the flow path 26.
  • the inner wall surface of the microchannel 12 on one end side of the microchannel 12 with respect to the three connecting portions 13a, 26a and 14a, that is, the well 15 and the connecting portion 13a Is different from the microchannel chip 10 according to the first embodiment in that an ATP-degrading enzyme that also serves as an ADP-degrading enzyme is immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12.
  • the ATP extraction reagent solution is contained in the well 16
  • the ATP amplification reagent (I) solution is contained in the well 27, and the ATP amplification reagent ( ⁇ ) and ATP detection are produced in the well 17.
  • Trial It shall contain a solution of a drug (hereinafter, ATP amplification reagent (II) and ATP detection reagent are referred to as “ATP amplification-detection reagent”).
  • the ATP amplification reagent is AMP, polyphosphate, adurate kinase, and If the reagent is also a polyphosphate kinase, it is preferable that polyphosphate alone or AMP and polyphosphate and the other reagents constituting the ATP amplification reagent are separately introduced into the microchannel.
  • the microchannel chip 20 first, when the sample liquid contained in the well 15 is introduced into the microchannel 12, only the sample liquid flows through the microchannel 12 up to the connection portion 13 a. During this process, the background ATP and background ADP in the sample liquid are immobilized on the inner wall surface of the microchannel 12 and are decomposed and removed by the ATP-degrading enzyme that also functions as an ADP-degrading enzyme. Next, when the ATP extraction reagent solution contained in the well 16 is introduced into the microchannel 12 through the flow path 13, the mixed solution of the sample solution and the ATP extraction reagent solution flows to the connection portion 26a. In this process, ATP in the microorganism is extracted.
  • the ATP amplification reagent (I) solution contained in the well 27 is introduced into the microchannel 12 through the flow path 26, the mixed solution of the sample solution, the ATP extraction reagent solution, and the ATP amplification reagent (I) solution is obtained. Distribution up to connection 14a. In this process, not all of the reagents constituting the ATP amplification reagent are introduced into the microchannel 12, so that the extracted ATP will not be amplified.
  • the sample solution, the ATP extraction reagent solution, the ATP amplification reagent (I) solution, and the ATP amplification-detection reagent flows up to ul 18.
  • the previously extracted ATP undergoes a luminescence reaction while being amplified and emits light. By detecting this light, microorganisms in the specimen can be detected.
  • the portion of the microchannel 12 between the hole 15 and the connecting portion 13a is formed in a meandering shape and is sufficiently long.
  • the background ATP and the background ADP in the sample liquid It is almost completely decomposed and removed by the ATP-degrading enzyme that also functions as an ADP-degrading enzyme.
  • the portion between the connecting portion 13a and the connecting portion 14a in the microchannel 12 is also formed in a meandering shape and is sufficiently long, ATP in the microorganism is almost completely extracted by the ATP extraction reagent.
  • the portion of the microchannel 12 between the connecting portion 14a and the well 18 is also formed in a meandering manner and is sufficiently long, the extracted ATP is sufficiently amplified, and the light generated by the luminescence reaction is also generated. Can be reliably detected at the peak position of the emission intensity.
  • the knockout ATP and background ADP are almost completely decomposed before the sample solution and the ATP extraction reagent, ATP amplification reagent (I), or ATP amplification detection reagent are mixed. Since it is removed, ATP in microorganisms can be detected with sufficiently high accuracy. In addition, since the ATP amplification reagent is mixed with the sample solution at the same time as or before the ATP detection reagent, ATP in the microorganism can be detected with higher sensitivity.
  • microchannel chip 20 If the microchannel chip 20 is used, it is not necessary to deactivate the ATP-degrading enzyme for the detection of ATP in microorganisms. In addition, since knock-in ATP and ATP-degrading enzyme come into contact in a very narrow space called a microchannel, the removal of background ATP, which accelerates the ATP-degrading reaction, is performed in a short time. Similarly, the removal of knock ground ADP takes place in a short time. In addition, since the sample solution, ATP extraction reagent, ATP amplification reagent (I), and ATP amplification detection reagent are mixed in an extremely narrow space called a microchannel, ATP amplification reaction and luminescence reaction occur in a short time (several seconds). Therefore, ATP in microorganisms can be detected with sufficiently high sensitivity and accuracy in a short time.
  • the sample liquid, the ATP extraction reagent, the ATP amplification reagent (I), and the ATP amplification-detection reagent are mixed with the microchannel in a very narrow space, and the sample liquid and the reagent are mixed. Because of the small fluctuation in the mixed state with ATP, the reproducibility of the ATP measurement results can be improved.
  • Examples of the ATP degrading enzyme that also serves as an ADP degrading enzyme include avirase.
  • Embodiments of the present invention are not limited to the first and second embodiments described above. Other embodiments are illustrated below.
  • ADP decomposition is further performed on the inner wall surface of microchannel 12 on one end side of microchannel 12 with respect to at least one connecting portion provided in the middle of microchannel 12.
  • the enzyme may be immobilized.
  • the ATP degrading enzyme may or may not also serve as the ADP degrading enzyme.
  • ADP-degrading enzyme can be immobilized in the same manner as ATP-degrading enzyme.
  • the number of flow paths connected to the microchannel 12 may be 1 or 4 or more.
  • the number of channels is 1, for example, only an ATP extraction reagent and an ATP detection reagent are used as reagents for detecting ATP in microorganisms, and these reagents are simultaneously used from one channel. What is necessary is just to introduce into microchannel 12.
  • the ATP extraction reagent, the ATP amplification reagent (I), the ATP amplification reagent (II), and the ATP detection reagent should be separately introduced into the microchannel 12 as well. Is possible. In this case, first, the ATP extraction reagent is introduced from one flow path on the most upstream side, and then the ATP amplification reagent (I) and the ATP amplification reagent (II) are introduced from the two flow paths ( Finally, the ATP detection reagent is introduced from one channel on the most downstream side. Further, using any one to three channels, various reagents can be introduced into the microchannel 12 as in the case where the number of channels is 1 to 3. In this case, the end of the flow channel that is not used for introducing the reagent or the well provided here is sealed with a lid or the like.
  • the number of flow paths is 5 or more, use any one to four flow paths, and introduce various reagents into the microchannel 12 in the same way as the case where the number of flow paths ⁇ to 4 can do.
  • the end of the channel not used for reagent introduction or the well provided here is sealed with a lid or the like.
  • the microchannel chip has a well! A sample solution or various reagent solutions can be introduced to the V, microchannel 12 or flow path with a well by using a syringe or the like. If you do not have a well 18 for containing the reaction solution that has flowed through the microchannel 12, place a container, etc., for containing the reaction solution in the microchannel 12 If it is provided at the downstream end,
  • FIG. 11 is a partial cross-sectional view of a microchannel chip according to another embodiment, cut along a plane parallel to the extending direction of the microchannel and perpendicular to the surface of the substrate.
  • the flow path connected to the microchannel 12 may be formed vertically on the surface of the substrate 11a as the flow path 28 in FIG.
  • various reagent solutions can be injected into the flow path with a syringe or the like.
  • FIGS. 12 and 13 are partial cross-sectional views of a microchannel chip according to another embodiment, taken along a plane perpendicular to the extending direction of the microchannel.
  • the microchannel 12 may be formed on an intermediate substrate l ie of the three layers of substrates l ld to l lf.
  • the microchannel chip may be composed of two layers of substrates l lg and l lh. The grooves constituting the micro channel 12 are formed on both of the two layers of substrates 1 lg and 1 lh. It ’s formed!
  • the cross-sectional shape of the microchannel may be a square, a trapezoid, a circle, a semicircle, an ellipse, or the like.
  • a check valve may be provided in the microchannel 12 and the flow path. If a check valve is provided, it is possible to prevent backflow of liquid and prevent problems caused by backflow.
  • the wels 15 to 17 may be opened to the atmosphere, the wel 18 may be covered with a lid, and communicated with the inside of the pump.
  • the liquid is circulated through the microchannel 12 and the flow path by depressurizing the inside of the well 18 with a pump.
  • the microbe detection apparatus may be provided with a thermostat. Since the reaction occurring in the microchannel 12 is exothermic or endothermic, the reaction may become unstable due to temperature change unless the reaction temperature is adjusted. Further, when the temperature changes, the liquid expands and unnecessary bubbles are generated, which may cause clogging of the microchannel 12. If a constant temperature device is provided, such troubles can be prevented.
  • FIG. 14 is a plan view of the microchannel chip used in Example 1.
  • the microchannel chip 30 used in Example 1 is provided with a meandering microchannel 31 (width 33 ⁇ m, depth 38 ⁇ m, length 160 mm) and both ends thereof. Has two wels 32 and 33.
  • the microchannel chip 30 is composed of three layers of substrates: the substrate 29a (outer layer) and the substrate 29b (intermediate layer) are each a PDMS substrate, and the other outer layer (not shown in FIG. 14) is a glass substrate. is there.
  • Microchannel 31, wells 32 and 33 are formed on substrate 29a.
  • ATP1 X 10 _7 M buffer 50 mM Tris—HC1, 8 mM MgCl
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between reaction time (circulation time) and soot concentration in Example 1.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the reaction time (immersion time) and ATP concentration in Comparative Example 1.
  • the microchannel chip 10 and the microorganism detection apparatus 100 according to the first embodiment shown in FIGS. 1 to 5 were used.
  • a PDMS substrate was used as the substrates 11a and ib
  • a glass substrate was used as the substrate 11c
  • avirase was used as the ATP-degrading enzyme.
  • a 10 nM ATP solution containing E. coli as a sample solution, 0.01% salt benzalco-um as an ATP extraction reagent, and luciferase as an ATP detection reagent (0.25 mgZmL, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , D (-)-luciferin (2.5 mM, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and MgCl ⁇ 6 ⁇ O (10 mM)
  • the amount of light emitted (cps) was measured with a photo detector.
  • the sample solution was introduced into microchannel 12 at a well of 15 to 30 ⁇ LZmin, the ATP extraction reagent at a well of 16 to 30 ⁇ LZmin, and the ATP detection reagent at a well of 17 to 60 ⁇ LZmin.
  • a photomultiplier tube H7155, manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.
  • Example 2 Except that the ATP-degrading enzyme is not immobilized on the inner wall surface of the microchannel, the same operation as in Example 2 was performed using the microchannel chip and the microbe detection apparatus 100, which are the same as the microchannel chip 10 and the microbe detection apparatus 100. It was.
  • Example 2 and Comparative Example 2 are shown in Table 1 and FIG. FIG. 17 is a graph showing the relationship between the concentration of E. coli in the sample solution and the amount of luminescence in Example 2 and Comparative Example 2.
  • Example 2 and Comparative Example 2 it was confirmed that microorganisms can be detected with sufficiently high accuracy by using the microchannel chip and the microorganism detection apparatus of the present invention. Industrial applicability
  • microchannel chip and the microorganism detection apparatus of the present invention can be used for detection of microorganisms (bacteria, fungi, etc.) in food and drink.

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Abstract

　本発明は、マイクロチャネル１２と、マイクロチャネル１２の途中に設けられた二つの接続部１３ａ及び１４ａでマイクロチャネル１２に接続されている流路１３及び１４と、を有し、二つの接続部１３ａ及び１４ａに対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されているマイクロチャネルチップ１０を提供する。本発明によれば、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置が提供される。

Description

マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置
技術分野
[0001] 本発明は、マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置に関する。
背景技術
[0002] 近年、飲食品中の微生物（細菌、真菌等）を検出するために、すべての生物中に存 在する ATP (アデノシン三リン酸)を指標とし、ルシフヱリン—ルシフェラーゼ反応に 基づく発光を利用して検体中の ATP量を測定することが行われている。しかし、検体 中には微生物中の ATP以外の ATP (以下、「バックグラウンド ATP」という。）が混入 していることが多ぐ必ずしも高い精度で微生物を検出できるわけではな力つた。
[0003] そのようなバックグラウンド ATPを除去し、検体中の微生物の検出精度を高める方 法として、下記特許文献 1及び 2では、検体中に ATP分解酵素（アデノシンリン酸デ アミナーゼ又はルシフェラーゼ）を添カ卩して、ノ ックグラウンド ATPを分解するという方 法が提案されている。また、下記特許文献 3では、半透膜からなるチューブに ATP分 解酵素（アビラーゼ）を封入し、このチューブを検体溶液中に浸すことにより、ノ ッタグ ラウンド ATPを分解すると ヽぅ方法が提案されて!ヽる。
特許文献 1：特開平 11― 56393号公報
特許文献 2：特開 2000— 189197号公報
特許文献 3 :特開 2003— 210197号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] しかし、上記特許文献 1及び 2の方法では、検体中に ATP分解酵素を添加してバ ックグラウンド ATPを分解した後、微生物中の ATPの検出のために ATP分解酵素を 失活させる必要があるので、操作が煩雑である。また、上記特許文献 3の方法では、 ノ ックグラウンド ATPがチューブ内に拡散する必要があるので、ノ ックグラウンド ATP の除去に長時間を要する。
[0005] ところで、飲食品中の微生物の検出は、微量の検体液 (検体溶液又は液体検体） 及び微量の試薬溶液を混合させることができる装置を用いて行うのが好ま 、。この ような装置としては、マイクロチャネルチップが適して 、る。
[0006] そこで、本発明は、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生 物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを 用いた微生物検出装置を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成するために、本発明は、マイクロチャネルと、前記マイクロチャネル の途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロチャネルに接続されて ヽ る流路と、を有し、前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方 の端部側の、前記マイクロチャネルの内壁面に、 ATP分解酵素が固定ィ匕されている ことを特徴とするマイクロチャネルチップを提供する。
[0008] このようなマイクロチャネルチップでは、 ATP分解酵素が固定化されて!/、る側の、マ イクロチャネルの端部カゝら検体液 (検体溶液又は液体検体)をマイクロチャネルに導 入すると、まず、検体液のみがマイクロチャネルを流通し、ノ ックグラウンド ATPが AT P分解酵素によって分解除去される。次いで、 ATP抽出試薬及び ATP検出試薬を、 いずれかを先に、又は両方を同時に、一つ又は複数の流路からマイクロチャネルに 導入すると、これらが検体液と混合される。そして、検体液中に微生物が存在する場 合は、微生物中の ATPが ATP抽出試薬によって抽出され、抽出された ATPが ATP 検出試薬と反応して発光する。生じた光を検出することによって、検体中の微生物が 検出される。
[0009] 上記マイクロチャネルチップを用いれば、検体液と ATP抽出試薬又は ATP検出試 薬とが混合される前に、ノ ックグラウンド ATPが分解除去されるので、微生物中の A TPを十分に高い精度で検出することができる。
[0010] また、 ATP分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定ィ匕されているので、検体液 と ATP抽出試薬又は ATP検出試薬とが混合される接続部に ATP分解酵素が到達 することがない。従って、微生物中の ATPの検出のために ATP分解酵素を失活させ る必要がなぐそれだけ簡便な操作で短時間に微生物中の ATPを検出することがで きる。 [0011] 更に、バックグラウンド ATP及び ATP分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭 い空間で接触するため、 ATP分解反応が速ぐノ ックグラウンド ATPの除去が短時 間で行われることになる。また、検体液、 ATP抽出試薬及び ATP検出試薬がマイク ロチャネルと ヽぅ極めて狭 ヽ空間で混合されるため、短時間（数秒)で発光反応が生 じることになる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中の ATPを検出 することができる。
[0012] 更に、検体液、 ATP抽出試薬及び ATP検出試薬がマイクロチャネルという極めて 狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、 ATP量 測定結果の再現性を高めることができる。
[0013] なお、本発明において、「酵素が固定化されている」とは、酵素が物理吸着、化学 結合等により固体表面に結合しており、固体表面を水又は水溶液と接触させても、酵 素が固体表面から脱離しな！/ヽことを!ヽぅ。
[0014] 上記マイクロチャネルチップは、上記少なくとも一つの接続部に対してマイクロチヤ ネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内壁面に、 ATP分解酵素の他に、更に ADP (アデノシン二リン酸)分解酵素が固定化されている力、または、上記 ATP分解 酵素が ADP分解酵素を兼ねることが好ま 、。
[0015] すなわち、微生物中の ATPをより高い感度で検出するには、 ATP増幅試薬によつ て微生物中の ATPを増幅して検出するのが好ましい。しかし、 ATP増幅試薬によつ て ATPを増幅する場合、 ADPは ATP増幅反応の過程で ATPに変換されて増幅さ れるので、検体液中に混入している ADP (以下、「バックグラウンド ADP」という。）は 、検体液と ATP増幅試薬とが混合される前に除去しておく必要がある。上記少なくと も一つの接続部に対してマイクロチャネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内 壁面に、更に ADP分解酵素が固定ィ匕されているカゝ、または、上記 ATP分解酵素が ADP分解酵素を兼ねれば、 ATP増幅試薬を用いた場合にも、検体液と ATP抽出 試薬、 ATP増幅試薬又は ATP検出試薬とが混合される前に、ノ ックグラウンド ATP 及びバックグラウンド ADPが分解除去されるので、微生物中の ATPを十分に高い精 度で検出することができる。また、 ATP検出試薬と同時力、又はそれより前に、 ATP 増幅試薬を検体液と混合させることによって、微生物中の ATPをより高い感度で検 出することができる。なお、 ATP分解酵素が ADP分解酵素を兼ねれば、 ATP分解 酵素及び ADP分解酵素を別々にマイクロチャネルに固定ィ匕する必要がなぐそれだ けマイクロチャネルチップの製造の際の作業が簡便になる。また、マイクロチャネルの 内壁面に固定ィ匕する ATP分解酵素及び ADP分解酵素の量的比率を制御しやすい
[0016] なお、本発明にお ヽて、「ATP分解酵素が ADP分解酵素を兼ねる」とは、 ATP分 解酵素、すなわち ATP分解酵素活性を有する物質 (例えば、タンパク質)が更に AD P分解酵素活性を有することを意味し、この物質にぉ 、て ATP分解酵素活性部位及 び ADP分解酵素活性部位が異なって 、てもよ 、。
[0017] 上記マイクロチャネルチップを用いて検体中の微生物を検出する場合、マイクロチ ャネル中の発光反応によって生じる光は光検出器により検出される。すなわち、本発 明はまた、上記マイクロチャネルチップと、そのマイクロチャネル内で生じた光を検出 する光検出器と、を備える微生物検出装置を提供する。
[0018] このような微生物検出装置は、上記マイクロチャネルチップを備えるので、十分に高 い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の微生物を検 出することを可能にする。
[0019] なお、 ATP抽出試薬とは、微生物を死滅させて微生物中の ATPを抽出する試薬 であり、例として、溶菌酵素（リゾチーム、キチナーゼ、キトサナーゼ等）、陽イオン界 面活性剤（塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、塩ィ匕べンゼトニゥム、塩ィ匕セチルトリメチルアンモ -ゥム等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキ シエチレンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ソル ビタン脂肪酸エステル等）が挙げられる。 ATP抽出試薬中には、溶菌酵素等に加え て、例えば、非イオン性界面活性剤、キレート剤（エチレンジァミン四酢酸等)又は糖 類 (スクロース、グルコース、フルクトース等）が含まれていてもよい。
[0020] ATP検出試薬とは、 ATPと反応して発光等を生じさせることにより、 ATPを検出す る試薬であり、例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオン（Mg2+等） 力もなる試薬が挙げられる。 ATPは、酸素及び 2価金属イオンの存在下でルシフェリ ン及びルシフェラーゼと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。 [0021] ATP増幅試薬とは、 ATPを増幅させる試薬であり、例えば、 AMP (アデノシンーリ ン酸）、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬が挙げ られる。 ATPは、アデ-ル酸キナーゼの存在下で AMPと反応して 2分子の ADPを 生じ、この 2分子の ADPは、ポリリン酸キナーゼの存在下でポリリン酸と反応して 2分 子の ATPを生じる。この反応を繰り返すことにより、 ATPは増幅される。
発明の効果
[0022] 本発明によれば、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生 物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを 用いた微生物検出装置が提供される。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
[図 2]第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図 1の II II線に沿った断面図 である。
[図 3]第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に 垂直な平面で切断した部分断面図である。
[図 4]第 1実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。
[図 5]第 1実施形態に係る微生物検出装置の、図 4の矢印 Vの向きに見た側面図であ る。
[図 6]マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第 1実施形態に係る微生物 検出装置の一部切欠き平面図である。
[図 7]マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第 1実施形態に係る微生物 検出装置の一部切欠き平面図である。
[図 8]マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第 1実施形態に係る微生物 検出装置の一部切欠き平面図である。
[図 9]マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第 1実施形態に係る微生物 検出装置の一部切欠き平面図である。
[図 10]第 2実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
[図 11]他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向 に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。
[図 12]他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向 に垂直な平面で切断した部分断面図である。
[図 13]他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向 に垂直な平面で切断した部分断面図である。
[図 14]実施例 1で用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。
[図 15]実施例 1における反応時間（流通時間）と ATP濃度との関係を示すグラフであ る。
[図 16]比較例 1における反応時間 (浸漬時間）と ATP濃度との関係を示すグラフであ る。
[図 17]実施例 2及び比較例 2における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を 示すグラフである。
符号の説明
[0024] 10…マイクロチャネルチップ、 l la〜l lh…基板、 12…マイクロチャネル、 13, 14 …流路、 13a, 14a…接続部、 15〜18· · ·ゥエル、 100…微生物検出装置、 19…反 射板、 19a…反射面、 21〜23· · ·蓋、 21a〜23a…チューブ、 24· · ·受光部、 24a…受 光面、 25· · ·光検出器、 20…マイクロチャネルチップ、 26· · ·流路、 26a…接続部、 27 …ゥエル、 28· · ·流路、 30· · ·マイクロチャネルチップ、 29a, 29b…基板、 31 · · ·マイク ロチャネル、 32, 33· · ·ゥエル。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明に おいては、同一または同等の要素には同一符号を用いるものとし、重複する説明は 省略する。
[0026] 以下の本発明の実施形態の説明においては、 ATP増幅試薬としては、 AMP、ポリ リン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼカもなる試薬を用いるものとする 。また、 AMP及びポリリン酸力 なる試薬を「ATP増幅試薬 (1)」といい、アデニル酸 キナーゼ及びポリリン酸キナーゼカもなる試薬を「ATP増幅試薬 (Π)」という。
[0027] (第 1実施形態） 図 1は、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第 1実施形態 に係るマイクロチャネルチップ 10は、図 1に示されているように、マイクロチャネル 12と 、マイクロチャネル 12の途中に設けられた二つの接続部 13a及び 14aでそれぞれマ イクロチャネル 12に接続されている二つの流路 13及び 14と、を有する。また、図 1に は示されていないが、二つの接続部 13a及び 14aに対してマイクロチャネル 12の一 方の端部側の、マイクロチャネル 12の内壁面には、 ATP分解酵素が固定ィ匕されて いる。
[0028] マイクロチャネル 12は、蛇行状に形成されている。マイクロチャネル 12の一方の端 部には、検体液を収容するためのゥエル 15が、他方の端部には、マイクロチャネル 1 2を流通した反応液を収容するためのゥエル 18が設けられている。また、流路 13及 び 14の端部にはそれぞれ、各種試薬溶液を収容するためのゥエル 16及び 17が設 けられている。以下、本発明の第 1実施形態の説明においては、ゥヱル 16に ATP抽 出試薬溶液力 ゥエル 17に ATP検出試薬溶液が収容されているものとする。
[0029] マイクロチャネルチップ 10では、まず、ゥエル 15に収容されている検体液をマイクロ チャネル 12に導入すると、接続部 13aまでは検体液のみがマイクロチャネル 12を流 通する。この過程で、検体液中のバックグラウンド ATPは、マイクロチャネル 12の内 壁面に固定ィ匕されている ATP分解酵素によって分解除去される。次いで、ゥエル 16 に収容されている ATP抽出試薬溶液を、流路 13を通じてマイクロチャネル 12に導入 すると、検体液及び ATP抽出試薬溶液の混合液が接続部 14aまで流通する。この過 程で、微生物中の ATPが抽出される。最後に、ゥエル 17に収容されている ATP検出 試薬溶液を、流路 14を通じてマイクロチャネル 12に導入すると、検体液、 ATP抽出 試薬溶液及び ATP検出試薬溶液の混合液がゥエル 18まで流通する。この過程で、 先に抽出された ATPは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって 、検体中の微生物を検出することができる。
[0030] マイクロチャネル 12のうちゥ ル 15と接続部 13aとの間の部分は蛇行状に形成され ていて十分に長いので、検体液中のバックグラウンド ATPは、その部分の内壁面に 固定ィ匕された ATP分解酵素によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチヤ ネル 12のうち接続部 13aと接続部 14aとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分 に長いので、微生物中の ATPは ATP抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更 に、マイクロチャネル 12のうち接続部 14aとゥヱル 18との間の部分も蛇行状に形成さ れて 、て十分に長 、ので、発光反応によって生じた光は発光強度のピーク位置で確 実に検出することができる。
[0031] マイクロチャネルチップ 10を用いれば、検体液と ATP抽出試薬又は ATP検出試 薬とが混合される前に、ノ ックグラウンド ATPがほぼ完全に分解除去されるので、微 生物中の ATPを十分に高い精度で検出することができる。
[0032] また、マイクロチャネルチップ 10を用いれば、微生物中の ATPの検出のために AT P分解酵素を失活させる必要がない。また、ノ ックグラウンド ATP及び ATP分解酵素 がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、 ATP分解反応が速ぐバ ックグラウンド ATPの除去が短時間で行われる。また、検体液、 ATP抽出試薬及び ATP検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（ 数秒)で発光反応が生じる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中の ATPを検出することがでさる。
[0033] 更に、マイクロチャネルチップ 10を用いれば、検体液、 ATP抽出試薬及び ATP検 出試薬がマイクロチャネルと ヽぅ極めて狭 、空間で混合され、検体液と試薬との混合 状態のバラツキが小さ 、ので、 ATP量測定結果の再現性を高めることができる。
[0034] 図 2は、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図 1の Π— II線に沿った断 面図である。図 3は、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネル の延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図 1〜図 3に示されて 、る ように、マイクロチャネルチップ 10は三層の基板 l la〜l lcを備え、マイクロチャネル 12及びゥエル 15〜18は、基板 11aに形成されている。
[0035] 基板 1 la〜l lcは、透光性を有する材料で構成されて!、ればよ 、。そのような材料 としては、ポリカーボネート（PC)、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリジメチルシ ロキサン（PDMS)、ポリイミド、ポリスチレン（PS)、ポリメチルメタタリレート（PMMA) 等の榭脂や、石英ガラス又はパイレックス (登録商標)ガラス等のガラスが挙げられる
[0036] 図 3に示されているように、マイクロチャネル 12の断面の形状は、長辺が基板の表 面に平行な長方形である。マイクロチャネル 12の幅及び深さは、好ましくは lmm以 下であり、より好ましく ίま 0. 1 μ m〜500 μ mであり、更に好ましく ίま 0. 1 μ m〜100 /z mである。幅及び深さが lmmを超えると、幅及び深さが lmm以下である場合と比 較して、発光反応の際の検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが大きくなつて、 反応が遅くなり、また、発光量の測定結果の再現性が低くなる傾向がある。幅及び深 さ力 SO. 1 μ m〜500 μ mであると、検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが小さ くなつて、反応が速くなり、また、測定結果の再現性が高くなる傾向が顕著である。幅 及び深さが 0. 1 μ m〜100 μ mであると、上記の傾向が更に顕著である。なお、マイ クロチャネルの幅とは、マイクロチャネルの延び方向に垂直で、基板の表面に平行な 方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。また、マイクロチャネルの深さ とは、基板の表面に垂直な方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。 図 3においては、マイクロチャネル 12の断面によって形成される長方形の長辺の長さ が幅に、短辺の長さが深さに当たる。
[0037] マイクロチャネルチップ 10は、例えば、次のように製造することができる。
[0038] まず、シリコンウェハ上にレジストを塗布し、マイクロチャネル 12、流路 13、流路 14 及びゥエル 15〜18に対応した形状にパターユング (露光、現像)した後、シリコンゥェ ハの表面部分をエッチングする。こうしてシリコン表面にマイクロチャネル 12、流路 13 、 14及びゥエル 15〜 18に対応した凸部が形成される。
[0039] 次に、上記レジストを除去し、未硬化の PDMSを塗布する。そして、 PDMSを硬化（ 125°C、 20分）させ、 PDMSを剥離することにより、マイクロチャネル 12、流路 13、 14 及びゥ ル 15〜18の形状を有する PDMS硬化物が得られる。 PDMS硬化物は、更 に加工（穴あけカ卩ェ等）してもよ!ヽ。
[0040] 最後に、ガラスウェハ上に別の未硬化の PDMSを塗布し、仮硬化（50°C、 10分）さ せる。仮硬化した PDMSの上に先の PDMS硬化物を貼り合わせ、仮硬化した PDM Sを硬化（125°C、 20分)する。
[0041] マイクロチャネル 12の内壁面に固定化される ATP分解酵素としては、アビラーゼ、 アデノシンリン酸デァミナーゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。 ATP分解酵素は A DP分解酵素を兼ねていてもよぐ ADP分解酵素を兼ねる ATP分解酵素としてはァ ピラーゼが挙げられる。
[0042] ATP分解酵素の固定ィ匕は、例えば、次のように行うことができる。まず、マイクロチ ャネル 12に酵素溶液を流通させた後、開放部（ゥエル)をすベてシールし、冷蔵庫内 (約 4°C)で約 5時間放置する。次いで、マイクロチャネル 12にバッファーを流通させ て、脱離しやすい酵素を取り除き、最後に、マイクロチャネル 12内部を空気で置換す る。
[0043] 酵素が固定化されたかどうか、及び固定化された酵素の ATP分解能を判定するに は、例えば、マイクロチャネル 12に ATP溶液を流通させた後、ゥエル 18に収容され た反応済溶液を回収し、ここにルシフェリン及びルシフェラーゼをカ卩えて、ルミテスタ 一で発光量を測定すればょ 、。元の ATP溶液と比較して発光量が減少して ヽれば、 ATP分解酵素が固定化されていると判定することができる。また、発光量の減少量の 大小によって、 ATP分解能を判定することができる。
[0044] 図 4は、第 1実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。図 5は、第 1実施形 態に係る微生物検出装置の、図 4の矢印 Vの向きに見た側面図である。
[0045] 図 4及び図 5に示される微生物検出装置 100は、マイクロチャネルチップ 10と、マイ クロチャネル 12内で生じた光を検出する光検出器 25 (図 4には示されていない）と、 を備えている。更に、反射板 19と、チューブ 21a〜23a (図 4には示されていない）付 きの蓋 21〜23と、チューブ 21a〜23aに連結されたポンプ（図 4及び図 5には示され ていない）と、を備えている。ゥエル 18は大気に開放されている。
[0046] 光検出器 25は受光部 24を有し、マイクロチャネル 12のうち接続部 14aとゥエル 18 との間の部分、すなわち発光が生じる領域 (以下、「発光領域」という。）に受光面 24a が対向するように、マイクロチャネルチップ 10の一方の表面（基板 1 lcの表面）側に 配置されている。また、反射板 19は、反射面 19aが受光部 24の受光面 24aに対向す るように、マイクロチャネルチップ 10に対して光検出器 25と反対の表面 (基板 1 laの 表面)側に配置されている。
[0047] また、蓋 21〜23は、それぞれゥエル 15〜 17を覆っている。蓋 21〜23に取り付けら れているチューブ 21a〜23aは、それぞれゥエル 15〜17とポンプ内部とを連通して いる。ゥエル 15に収容されている液体は、ポンプで圧力をカ卩えることによって、直接 にマイクロチャネル 12に導入される。また、ゥヱル 16及び 17に収容されている液体 は、ポンプで圧力を加えることによって、それぞれ流路 13及び 14を通じてマイクロチ ャネル 12に導入される。マイクロチャネル 12、流路 13及び 14を流通する液体の流通 速度はそれぞれ、チューブ 21a〜23aに連結されているポンプで調節することができ る。
[0048] 図 6〜図 9は、マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第 1実施形態に係 る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。図 6〜図 9においては、微生物検出 装置を、便宜上、マイクロチャネル 12の一部（実線で表した部分）が表面に現れるよ うに、マイクロチャネルチップ 10の基板 11aを一部切り欠いて図示している。図 6〜図 9における「P = 0」又は「P= +P1」等は、対応するゥエルに収容されている液体に加 えられた圧力が 0又は P1等であることを表す。また、ドットの集合は液体を表す。なお 、図 6〜図 9には、光検出器 25、反射板 19、蓋 21〜23、チューブ 21a〜23a及びポ ンプは示されていない。
[0049] 微生物検出装置 100では、まず、ゥエル 15に収容されている検体液に P1の圧力を 加えて、検体液をマイクロチャネル 12に導入し、接続部 13aまでマイクロチャネル 12 を流通させる。この過程で、検体液中のバックグラウンド ATPは、マイクロチャネル 12 の内壁面に固定化されている ATP分解酵素によって分解除去される。検体液が接 続部 13aの少し手前（例えば、図 6に示される位置）まで流通した時点で、ゥエル 16 に収容されている ATP抽出試薬溶液に P2の圧力をカ卩えて、 ATP抽出試薬溶液を、 流路 13を通じてマイクロチャネル 12に導入し、検体液及び ATP抽出試薬溶液の混 合液を接続部 14aまで流通させる。この過程で、微生物中の ATPが抽出される。検 体液が接続部 14aの少し手前 (例えば、図 7に示される位置)まで流通した時点で、 ゥエル 17に収容されている ATP検出試薬溶液に P3の圧力をカ卩えて、 ATP検出試 薬溶液を、流路 14を通じてマイクロチャネル 12に導入し、検体液、 ATP抽出試薬溶 液及び ATP検出試薬溶液の混合液をゥエル 18まで流通させる。この過程で、先に 抽出された ATPは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検 体中の微生物を検出することができる。光を検出する際は、発光強度のピーク位置 及びその前後で確実に光が検出されるように、すなわち、液体が図 8に示される位置 力 図 9に示される位置に至る過程、特に液体が蛇行部分を流通する過程で発光強 度がピークを示すように、 Pl、 P2又は P3を調節する。
[0050] 微生物検出装置 100はマイクロチャネルチップ 10を備えているので、これを用いれ ば、十分に高い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の 微生物を検出することができる。
[0051] また、微生物検出装置 100では、発光領域で生じた光のうち、受光面 24aと反対側 に向力ゝぅ光も、反射面 19aで反射されて受光面 24aに入射する。また、発光領域のう ち反射板 19及び受光部 24に挟まれた部分ではマイクロチャネル 12が蛇行状に密に 形成されているので、受光面 24a及び反射面 19aに向力 光の量は極めて多い。従 つて、極めて高い感度で微生物を検出することができる。
[0052] 光検出器 25としては、光電子増倍管、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイォー ド、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、 CCD素子等を用いることができる
[0053] 反射板 19は、光を反射する材料で構成されて ヽればよ ヽ。そのような材料としては 、アルミニウム、ニッケル、チタン、クロム、金、銅、鉄等の金属が挙げられる。
[0054] (第 2実施形態）
図 10は、第 2実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第 2実施形 態に係るマイクロチャネルチップ 20は、図 10に示されるように、マイクロチャネル 12と 、接続部 13a及び 14aの間に設けられた接続部 26aでマイクロチャネル 12に接続さ れている流路 26を更に有し、流路 26の端部に試薬溶液を収容するためのゥヱル 27 が設けられて ヽる点で、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップ 10と相違する。 また、図 10には示されていないが、三つの接続部 13a、 26a及び 14aに対してマイク ロチャネル 12の一方の端部側の、マイクロチャネル 12の内壁面、すなわちゥエル 15 と接続部 13aとの間の、マイクロチャネル 12の内壁面に、 ADP分解酵素を兼ねる AT P分解酵素が固定化されている点で、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップ 10 と相違する。
[0055] 本発明の第 2実施形態の説明においては、ゥエル 16に ATP抽出試薬溶液が、ゥェ ル 27に ATP増幅試薬 (I)溶液が、ゥエル 17に ATP増幅試薬 (Π)及び ATP検出試 薬 (以下、 ATP増幅試薬 (II)及び ATP検出試薬を「ATP増幅—検出試薬」という。 ) の溶液が収容されて 、るものとする。
[0056] なお、本発明のマイクロチャネルチップにお!、て、 ATP抽出試薬及び ATP検出試 薬の他に更に ATP増幅試薬を用いる場合、 ATP増幅試薬が AMP、ポリリン酸、ァ デュル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼカもなる試薬であるとすると、ポリリン酸の み、又は AMP及びポリリン酸と、 ATP増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とは別々 にマイクロチャネルに導入されるのが好ましい。ポリリン酸のみ、又は AMP及びポリリ ン酸と、 ATP増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とが予め混合されて ヽなければ、 各種酵素（アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びルシフェラーゼ）に不純物と して混入している可能性の高い ATPが増幅されることがなぐ本発明のマイクロチヤ ネルチップを用 、た検体中の微生物の検出をより高 、精度で行うことができる。
[0057] マイクロチャネルチップ 20では、まず、ゥエル 15に収容されている検体液をマイクロ チャネル 12に導入すると、接続部 13aまでは検体液のみがマイクロチャネル 12を流 通する。この過程で、検体液中のバックグラウンド ATP及びバックグラウンド ADPは、 マイクロチャネル 12の内壁面に固定化されて!/、る、 ADP分解酵素を兼ねる ATP分 解酵素によって分解除去される。次いで、ゥエル 16に収容されている ATP抽出試薬 溶液を、流路 13を通じてマイクロチャネル 12に導入すると、検体液及び ATP抽出試 薬溶液の混合液が接続部 26aまで流通する。この過程で、微生物中の ATPが抽出 される。次いで、ゥエル 27に収容されている ATP増幅試薬 (I)溶液を、流路 26を通じ てマイクロチャネル 12に導入すると、検体液、 ATP抽出試薬溶液及び ATP増幅試 薬 (I)溶液の混合液が接続部 14aまで流通する。この過程では、 ATP増幅試薬を構 成する試薬のすべてがマイクロチャネル 12に導入されているわけではないので、抽 出された ATPの増幅は起こらない。最後に、ゥエル 17に収容されている ATP増幅一 検出試薬溶液を、流路 14を通じてマイクロチャネル 12に導入すると、検体液、 ATP 抽出試薬溶液、 ATP増幅試薬 (I)溶液及び ATP増幅—検出試薬溶液の混合液が ゥ ル 18まで流通する。この過程で、先に抽出された ATPは増幅されながら発光反 応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出するこ とがでさる。 [0058] マイクロチャネル 12のうちゥ ル 15と接続部 13aとの間の部分は蛇行状に形成され て 、て十分に長 、ので、検体液中のバックグラウンド ATP及びバックグラウンド ADP は、その部分の内壁面に固定化されている、 ADP分解酵素を兼ねる ATP分解酵素 によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチャネル 12のうち接続部 13aと 接続部 14aとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、微生物中の A TPは ATP抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更に、マイクロチャネル 12のう ち接続部 14aとゥエル 18との間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、 抽出された ATPは十分に増幅され、また、発光反応によって生じた光は発光強度の ピーク位置で確実に検出することができる。
[0059] マイクロチャネルチップ 20を用いれば、検体液と ATP抽出試薬、 ATP増幅試薬 (I )又は ATP増幅一検出試薬とが混合される前に、ノ ックグラウンド ATP及びバックグ ラウンド ADPがほぼ完全に分解除去されるので、微生物中の ATPを十分に高い精 度で検出することができる。また、 ATP増幅試薬が ATP検出試薬と同時か、又はそ れより前に検体液と混合されるので、微生物中の ATPをより高 ヽ感度で検出すること ができる。
[0060] また、マイクロチャネルチップ 20を用いれば、微生物中の ATPの検出のために AT P分解酵素を失活させる必要がない。また、ノ ックグラウンド ATP及び ATP分解酵素 がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、 ATP分解反応が速ぐバ ックグラウンド ATPの除去が短時間で行われる。同様に、ノ ックグラウンド ADPの除 去も短時間で行われる。また、検体液、 ATP抽出試薬、 ATP増幅試薬 (I)及び ATP 増幅 検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間 (数秒)で ATP増幅反応及び発光反応が生じる。従って、十分に高い感度及び精度 で、かつ短時間に微生物中の ATPを検出することができる。
[0061] 更に、マイクロチャネルチップ 20を用いれば、検体液、 ATP抽出試薬、 ATP増幅 試薬 (I)及び ATP増幅—検出試薬がマイクロチャネルと ヽぅ極めて狭 ヽ空間で混合 され、検体液と試薬との混合状態のノ ラツキが小さいので、 ATP量測定結果の再現 性を高めることができる。
[0062] ADP分解酵素を兼ねる ATP分解酵素としては、アビラーゼが挙げられる。 [0063] (他の実施形態）
本発明の実施形態は、上記の第 1実施形態及び第 2実施形態に限定されるもので はない。以下に他の実施形態を例示する。
[0064] マイクロチャネル 12の途中に設けられた少なくとも一つの接続部に対してマイクロ チャネル 12の一方の端部側の、マイクロチャネル 12の内壁面には、 ATP分解酵素 の他に、更に ADP分解酵素が固定ィ匕されていてもよい。ここで、 ATP分解酵素は、 ADP分解酵素を兼ねていても兼ねていなくてもよい。 ADP分解酵素の固定ィ匕は、 A TP分解酵素の固定化と同様に行うことができる。
[0065] マイクロチャネル 12に接続されている流路の数は 1又は 4以上であってもよい。
[0066] 流路の数が 1である場合は、例えば、微生物中の ATPを検出するための試薬とし て ATP抽出試薬及び ATP検出試薬のみを用い、これらの試薬を一つの流路から同 時にマイクロチャネル 12に導入すればよい。
[0067] 流路の数力 である場合は、 ATP抽出試薬、 ATP増幅試薬 (I)、 ATP増幅試薬 (II )及び ATP検出試薬を四つの流路カも別々にマイクロチャネル 12に導入することが できる。この場合、まず、 ATP抽出試薬を最上流側の一つの流路から導入し、次い で、 ATP増幅試薬 (I)及び ATP増幅試薬 (II)を二つの流路から導入し ( 、ずれが先 でもよい）、最後に、 ATP検出試薬を最下流側の一つの流路から導入する。また、い ずれか一つ〜三つの流路を用いて、流路の数が 1〜3の場合と同様に、各種試薬を マイクロチャネル 12に導入することができる。この場合、試薬の導入に使用されない 流路の端部、又はここに設けられたゥエルは蓋等で密閉しておく。
[0068] 流路の数が 5以上である場合は、いずれか一つ〜四つの流路を用いて、流路の数 力^〜 4の場合と同様に、各種試薬をマイクロチャネル 12に導入することができる。こ の場合、試薬の導入に使用されない流路の端部、又はここに設けられたゥエルは蓋 等で密閉しておく。
[0069] マイクロチャネルチップは、ゥエルを有して!/、なくてもよ!、。ゥエルが設けられて!/、な V、マイクロチャネル 12又は流路への検体液又は各種試薬溶液の導入は、シリンジ等 で行うことができる。マイクロチャネル 12を流通した反応液を収容するためのゥエル 1 8を有していない場合は、反応液を収容するための容器等をマイクロチャネル 12の 下流側の端部に設けておけばょ 、。
[0070] 図 11は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び 方向に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。マイクロチ ャネル 12に接続されている流路は、図 11の流路 28のように、基板 11aの表面に垂 直に形成されていてもよい。例えば、図 11の流路 28のように、流路が基板 11aの表 面に開口している場合は、シリンジ等で各種試薬溶液を流路に注入することができる
[0071] 図 12及び図 13は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチヤネ ルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図 12に示されるように、 マイクロチャネル 12は、三層の基板 l ld〜l lfのうちの中間層の基板 l ieに形成さ れていてもよい。また、図 13に示されるように、マイクロチャネルチップは二層の基板 l lg及び l lhからなるものでもよぐマイクロチャネル 12を構成する溝は、二層の基板 1 lg及び 1 lhの両方に形成されて!、てもよ!/、。
[0072] マイクロチャネルの断面の形状は、正方形、台形、円形、半円形、楕円形等であつ てもよい。
[0073] マイクロチャネル 12及び流路には、逆止弁が設けられていてもよい。逆止弁が設け られていると、液体の逆流を防いで、逆流によるトラブルを未然に防ぐことができる。
[0074] 微生物検出装置においては、ゥエル 15〜17が大気に開放され、ゥエル 18が蓋で 覆われ、ポンプ内部に連通されていてもよい。この場合は、ポンプでゥエル 18の内部 を減圧することによって、液体をマイクロチャネル 12及び流路に流通させる。
[0075] 微生物検出装置には、恒温装置が設けられていてもよい。マイクロチャネル 12内で 起こる反応は発熱又は吸熱を伴うため、反応温度を調節しないと、温度変化により反 応が不安定になるおそれがある。また、温度が変化すると、液体が膨張して不要な気 泡が発生し、マイクロチャネル 12の目詰まりが生じるおそれがある。恒温装置が設け られて 、れば、そのようなトラブルを未然に防ぐことができる。
実施例
[0076] 以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明する力 本発明は 、以下の実施例に限定されるものではない。 [0077] (実施例 1)
図 14は、実施例 1で用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。実施例 1 で用いられたマイクロチャネルチップ 30は、図 14に示されるように、蛇行状のマイクロ チャネル 31 (幅 33 μ m、深さ 38 μ m、長さ 160mm)、及びその両端部に設けられた 二つのゥエル 32及び 33を有する。マイクロチャネルチップ 30は三層の基板からなり、 基板 29a (外層）及び基板 29b (中間層）は各々、 PDMS基板であり、もう一方の外層 (図 14には示されていない）はガラス基板である。マイクロチャネル 31、ゥエル 32及 び 33は、基板 29aに形成されている。
[0078] ァピラーゼ（Sigma社製、 GradeVIl) 1. 34mgZmLのバッファー（50mM Tris— HC 1、 8mM MgCl、 pH 7. 4)溶液をゥエル 32に注入し、この溶液をマイクロチャネル 3
2
1に流通させた後、 4°Cで 5時間インキュベートした。次いで、バッファー（50mM Tris — HC1、 8mM MgCl
2、 pH 7. 4)のみをマイクロチャネル 31に流通させた。
[0079] 次いで、 ATP1 X 10_7Mのバッファー（50mM Tris— HC1、 8mM MgCl
2、 pH 7
. 4)溶液をゥヱル 32に注入し、この溶液をマイクロチャネル 31に流通させた後、溶液 100 μ Lを回収し、これにルシフェリン及びルシフェラーゼを含有する試薬 (ルシフエ ール 250プラス、キッコ一マン株式会社製） 100 Lを加えた。発光量 (RLU)をルミ テスターで測定し、溶液中の ΑΤΡ濃度を求めた。
[0080] 図 15は、実施例 1における反応時間（流通時間）と ΑΤΡ濃度との関係を示すグラフ である。
[0081] (比較例 1)
アビラーゼ（Sigma社製、 A6535) 50ユニット/ mLのリン酸バッファー（pH 7. 0)溶 液 200 Lを透析チューブ（三光純薬株式会社製、 UC8-32-25)に封入した。
[0082] ATPのリン酸バッファー（pH 7. 0)溶液中に上記透析チューブを 1時間 30分浸漬 した後、溶液 100 /z Lを回収し、実施例 1と同様に溶液中の ATP濃度を求めた。
[0083] 図 16は、比較例 1における反応時間（浸漬時間）と ATP濃度との関係を示すグラフ である。
[0084] 図 15及び図 16から明らかなように、 ATP濃度が反応前の濃度の約 1Z10に減少 するのに、実施例 1では 1秒を要しな力つたのに対して、比較例 1では 1. 5時間を要 した。すなわち、実施例 1及び比較例 1により、アビラーゼが固定化されたマイクロチ ャネルに ATP溶液を流通させると、極めて短時間に多量の ATPが分解除去されるこ とが確認された。
[0085] (実施例 2)
図 1〜図 5に示される、第 1実施形態に係るマイクロチャネルチップ 10及び微生物 検出装置 100を用いた。基板 11a及び l ibとして PDMS基板を、基板 11cとしてガラ ス基板を用い、また、 ATP分解酵素としてアビラーゼを用いた。
[0086] 検体液として大腸菌入りの 10nM ATP溶液を、 ATP抽出試薬として 0. 01%塩ィ匕 ベンザルコ -ゥムを、 ATP検出試薬として、ルシフェラーゼ（0. 25mgZmL、和光純 薬工業株式会社製)、 D (-)—ルシフェリン (2. 5mM、和光純薬工業株式会社製） 及び MgCl · 6Η O (10mM)からなる試薬を用いて、上記マイクロチャネルチップ及
2 2
び光検出器により発光量 (cps)を測定した。
[0087] なお、検体液はゥエル 15から 30 μ LZminで、 ATP抽出試薬はゥエル 16から 30 μ LZminで、 ATP検出試薬はゥエル 17から 60 μ LZminでマイクロチャネル 12に導入 した。光検出器としては、光電子増倍管 (H7155、浜松ホトニタス株式会社製)を用い た。
[0088] (比較例 2)
ATP分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定化されていない他はマイクロチ ャネルチップ 10及び微生物検出装置 100と同様の、マイクロチャネルチップ及び微 生物検出装置を用いて、実施例 2と同様の操作を行った。
[0089] 実施例 2及び比較例 2の結果を表 1及び図 17に示す。図 17は、実施例 2及び比較 例 2における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を示すグラフである。
[0090] [表 1] 発光 i、cps )
大腸菌 i J¾ (cel ls/m L)
実施例 2 (アビラ一ゼあり） 比較 ij 2 (アビラ一ゼなし）
1 1 07 92937 1 53601
1 X 1 06 1 7463 80902
1 x 1 05 2475 69290
1 1 04 294 72730
[0091] 表 1及び図 17から明らかなように、 ATP分解酵素が固定ィ匕されたマイクロチャネル チップを用いた場合は、検体液中の大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係 が認められたのに対して、 ATP分解酵素が固定ィ匕されていないマイクロチャネルチ ップを用いた場合は、大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係が認められなか つた。すなわち、表 1及び図 17は、 ATP分解酵素が固定ィ匕されたマイクロチャネル チップを用いれば、発光量を求めることによって検体液中の大腸菌濃度を十分に高 V、精度で求めることができることを示して 、る。
[0092] 実施例 2及び比較例 2により、本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装 置を用いれば、十分に高い精度で微生物を検出することができることが確認された。 産業上の利用可能性
[0093] 本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装置は、飲食品中の微生物（細 菌、真菌等)の検出に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] マイクロチャネルと、
前記マイクロチャネルの途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロ チャネルに接続されている流路と、を有し、
前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方の端部側の、前 記マイクロチャネルの内壁面に、 ATP分解酵素が固定ィ匕されていることを特徴とする マイクロチャネルチップ。
[2] 前記マイクロチャネルの前記内壁面に、更に ADP分解酵素が固定ィ匕されているこ とを特徴とする、請求項 1に記載のマイクロチャネルチップ。
[3] 前記 ATP分解酵素が ADP分解酵素を兼ねることを特徴とする、請求項 1に記載の マイクロチャネルチップ。
[4] 請求項 1〜3の!、ずれか一項に記載のマイクロチャネルチップと、
前記マイクロチャネル内で生じた光を検出する光検出器と、
を備えることを特徴とする微生物検出装置。
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