JP2001504353A - 化学物質および混合物質の毒性作用および突然変異誘発作用を測定するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、化学物質および混合物質の毒性作用および突然変異誘発作用を検出するための方法および装置に関する。この方法は、固定化した発光細菌または適当なプラスミドベクターの導入により生物発光性を与えられた生物を使用し、またこの装置は、バイオセンサーが形成されるように測光用の光電子要素を備える。生物学的作用の長期的な検出を行うことができるため、この発明は、環境の調査作業を行うこと、ならびに農業および工業の工程管理を行うことを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 化学物質および混合物質の毒性作用および突然変異誘発作用を 測定するための方法および装置発明の分野 本発明は、固定化した発光細菌を用いて、または適当なプラスミドベクターの 導入により発光するよう遺伝子操作された微生物を使って、化学物質や混合物質 の毒性作用および突然変異誘発作用を測定するための方法および装置を提供する 。生物学的作用の長期的な測定が可能であため、本発明は、環境的なパラメータ の調査作業、ならびに農業および工業における工程管理を可能とする。発明の背景 毒性作用および突然変異誘発作用を測定するために微生物や単離した細胞を使 用することは良く知られている。有害物質の毒性作用を証明するために、細菌 単離した細胞(ROSSI,A.ら：Pharmacol．＆ Toxicol.68．424-429(1991))、原生 動物(BRINKMANN，G．：Z.Wasser-und Abwasser-Forsch.11.210-215(1978))、 Abwasser-Forsch.10,87-98(1977)）を使用していた。さらに、腸内細菌（ODA，Y .ら：Mutation Res．147，219-229(1985)）および発光細菌（ULITZUR，S.ら：Mu tation Res．74，113-124(1980)）により突然変異誘発作用を測定することが提 案された。以前使用されていた方法は、時間がかかるというだけでなく、特別な 設備を備えた研究室が必要であるという不利益を有する。従って、野外調査が不 可能であり、サンプルの単一測定のみが可能であった。好適な実施の形態の詳細な説明 本発明の目的は、有害物質の測定を可能にする方法を開発することであった。 このた めに、発光細菌および微生物を固定化した。固定化細胞に光検出要素を結合して バイオセンサーを完成させた。新しく開発されたこのバイオセンサーは、サンプ ル供給を操作する来公知のフローインジェクションシステムにおいて使用される 。 微生物に適した発光細菌(天然のものおよび遺伝子操作されたもの)の固定化法 を、以下に記載する。 １．汚染物質を透過させる多孔性膜を備えた測定チャンバの中に微生物を機械的 に入れる。 ２．寒天、コラーゲンまたはポリアクリルアミドなどのマトリックス中で固定化 する。 ３．アルギン酸カルシウムもしくはバリウムまたは硫酸セルロース中に包み込む 。 ４．例えばグルタルアルデヒドまたはエポキシド基を有する物質などの適当な固 定剤などを用いて、膜または他の支持体物質の表面上へ付着させる。 該バイオセンサーの光検出要素は、例えばフォトダイオードから放射されるか なり弱い輻射線を検出する測定システム、これに対応する信号のプレ増幅器およ び指示装置から構成される。 固定化細胞（バイオセンサーの生物学的要素）を、部分的に光を通す該測定チ ャンバ（光検出システムが配置されている）の中でインキュベートし、該微生物 の生物発光を測定する。また、該信号を光測定装置に送るための光ファイバが１ つだけ接続された暗い測定チャンバを使用することも可能である。サンプルの供 給は、マイクロプロセッサまたは外部コンピュータにより操作することができる 数個のポンプおよび磁気孔を含む従来公知のフローインジエクシェンシステムの 中に、本発明のバイオセンサーを組み込むことにより行われる(図１)。 本発明は、周知の特徴と新しく開発した特徴とを相互補完的および協働的に組 み合わせて、環境的なパラメーターの調査ならびに農業および工業における工程 管理を行うために、化合物および混合物質の生物学的作用の長期間にわたる測定 を成功させることを意図する。 ここに提示されたように、固定化された発光細菌または適当なプラスミドベク ターを導入することにより発光するように遺伝子操作された固定化細菌を使用す ることにより、上記の一般的な課題解決に向けられた驚くべき新しい用途を提供 する。例えば、空気、地表水、排水または浸出水の制御などの環境的なパラメー タの調査作業や、農業および工業における工程管理がある。さらに、固定化細菌 の使用により、単一測定を繰り返すことが可能となる。これにより、固定化され た細菌は、異なるサンプルを調査する間、多面的に使用される。 環境的なパラメータの調査への新しい応用に加え、化合物、化粧品、医薬品、 農薬、日用品または食料品などの毒性および突然変異誘発性のスクリーニングが 提供される。図１ １ 空気飽和したキャリア液体を入れたチャンバ ２ 気圧ポンプ ３〜５ 液体ポンプ ６ 六方磁気孔 ７ 注入孔 ８ 三方磁気孔 ９ 固定化細胞を入れた測定チャンバ １０ 固定化細胞を入れたブランクチャンバ Ｐ１〜Ｐ４ サンプル１〜４ Ｓ１〜Ｓ２ 標準１および２ Ｐｕ１〜Ｐｕ４ 緩衝液１〜４ Aw 排水 本発明は、以下の実施例により説明するものとする。モデル例 実施例１： V.fischeriの黒っぽい突然変異体（自然に発生）を、（単位g/l）ペプトン5g 、グリセロール3g、NaCl15.5g、KCI0.75g、MgSO₄x7H₂O12.3g、CaCl₂ｘ2H₂O1.45g 、 K₂HPO₄x2H₂O0.075gおよびNH₄Cl1.0gの溶液中でインキュベートする。必要な細菌 密度（約10⁵細胞/ml）を吸光度により測定し、pH値を7.0に調整する。生理学的N aCl溶液を用いて、1.2％のアルギン酸ナトリウム溶液を作成し、無菌濾過する。 細菌懸濁液を加え、該アルギン酸ナトリウム溶液の最終濃度を１％にする。細い 皮下針を注射器にはめ、一定圧力のもと、上記溶液を0.2M CaCl₂の溶液中に滴下 する。アルギン酸を固化させたあと、生理食塩水中で固定化細胞を数回洗浄する 。突然変異誘発物質と接触させることにより、細菌の生物発光が増強される。こ うして、陰性の対照測定とは反対に、発光される光の倍増は、物質の突然変異誘 発作用の証拠として評価される。さらに、肝酵素の画分（Ｓ９-mix）を用いて従 来のようにサンプル処理を行うことにより、共突然変異誘発物質の検出が可能に なる。 実施例２： 100mlの蒸留水中で寒天1.5gを温め攪拌しながら溶解する。40℃〜45℃にまで 冷却したあと、細菌V.fischeri(NaCl30g、NaH₂PO₄x3H₂O6.10g、MgSO₄x7H₂O0.204 g、(NH₄)₂HPO₄0.50g、グリセロール3ml、ペプトン5g、酵母エキス0.5g中にH₂Oを 加えて１リットルにし、NaOHまたはHClでpH7.2±0.2に調節)の懸濁液を、この加 熱溶液に混合する。次に、フローインジェクションシステムの測定チャンバの中 で傾斜した寒天として該混合物を固化させる。毒性物質を含むサンプルに接触さ せることにより、代謝したがって生物発光が阻害される。したがって、発光細菌 の生物発光が20％阻害されることが、毒性作用の証拠となる。 実施例３： V.fischeriの懸濁液（実施例２も参照のこと）5mlを氷上で冷却した。氷冷し た0.2Mリン酸カリウム緩衝溶液(pH7.0)、アクリルアミド1.63g、N,N-メチレン- ビスアクリルアミド0.08gおよび過硫酸アンモニウムを混合し、完全に溶解する まで撹拌する。ひきつづき攪拌しながら、細菌およびN,N,N',N'-テトラメチルエ チレンジアミンの懸濁液を上記溶液中に滴下する。60分後から90分にかけて重合 が起こる。ゲルを緩衝溶液で洗浄し、フローインジェクションシステムの測定チ ャ ンバ内でインキュベートする。実施例２と同様に、化合物を含むサンプルの毒性 作用が検出可能である。 実施例４： LUX-遺伝子複合体の導入により遺伝子操作した大腸菌（E.coli）細菌を実施例 ３で述べたように固定化し、毒性作用の調査に使用する。 実施例５： 実施例１と同様の溶液中の４％Na-硫酸セルロースを、0.9％NaCl溶液中の２％ 塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム溶液中に滴下し、８分間固化させる。得 られた球体を低張液に移すことにより、安定で軽い、汚染物質透過性カプセルが 作成される。注射器の細い皮下針を使って、V.fischeri，V.harvei，Ph．Phosph oreumもしくはPh.leiognathi等の発光細菌、または生物発光能力を有する他の微 生物の懸濁液を該カプセルの空洞の中に挿入することができる。これらのカプセ ルをフローインジェクションシステムの測定チャンバの中に入れ、混合物質また は単一物質の毒性作用を測定する。 実施例６： 発光細菌または他の微生物の懸濁液（実施例１および５）中に、２％Na-アル ギン酸を溶解する。所定サイズのグラスファイバフィルタをこの溶液中に完全に 浸漬させたあと、該フィルターを0.2M CaCl₂溶液中でインキュベートし、0.9％N aCl溶液で数回洗浄することにより、安定なグラスフアイバアルギン酸固定化生 成物を得る。得られた固定化生成物をバイオセンサーシステムの測定チャンバへ 挿入する。 実施例７： 実施例１に記載したように、細胞懸濁液中に４％Na-硫酸セルロースを完全に 溶解する。注射器によっておよび様々な直径の皮下針を介して、塩化ポリジアリ ルジメチルアンモニウム溶液中で沈殿させたあと、0.9％NaCl溶液中で洗浄し、 直 径の異なる安定な硫酸セルロースカプセルを得る。この固定化技術は、種々の野 生種や発光細菌の黒っぽい変種および発光能力を有する他の細菌に適している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 光検出要素に結合した生物発光能力を有する固定化細胞からなるバイオセ ンサーにより化合物および混合物質の毒性作用および突然変異誘発作用を測 定するための方法。 ２． 発光細菌または適当なプラスミドベクターの導入により生物発光可能に遺 伝子操作された生物を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３． バイオセンサーが図１のフローシステムであることを特徴とする、請求項 １または２に記載の方法。 ４． 複数の単一測定で使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか に記載の方法。 ５． 固定化された生物発光生物および光検出要素を含む、化学物質および混合 物質の毒性作用および突然変異誘発作用を測定するためのバイオセンサーの 装置。 ６． 前記生物が発光細菌または適当なプラスミドベクターの導入により生物発 光可能に遺伝子操作された生物であることを特徴とする、請求項５に記載の 装置。 ７． 前記方法または装置が、空気、地表水、排水もしくは浸出水の制御などの 環境の調査作業、ならびに農業および工業における工程管理などに使用され ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法または装置。 ８． 前記方法または装置が、環境パラメーターの測定ならびに化合物、化粧品 、医薬品、農薬、日用品または食料品の毒性および突然変異誘発性をスクリ ーニングするために使用されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか に記載の方法または装置。