CN1237211A - 检测化学制品和物质混合物的毒性及诱变效应的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种方法和装置,该方法和装置通过使用固定化发光细菌或合适的质粒载体的转化而被赋予生物发光能力的微生物来检测化学制品和物质混合物的毒性及诱变效应,所述装置装有光检测的光电子部分以便于通过这种方式形成生物感应器。由于生物学效应的检测可以在很长的一段时间内进行,所以本发明能够被用来进行监测环境参数及控制农业和工业的生产过程。

Description

检测化学制品和物质混合物的毒性 及诱变效应的方法和装置
本发明是利用固定化发光细菌或者利用通过转入合适的质粒载体来发磷光的基因工程微生物来检测化学制品与物质混合物的毒性及诱变效应的方法和装置。由于生物学效应的检测可能会持续一段很长的时间，所以本发明能够被用来监测环境参数和控制农业和工业的生产。
可被利用来检测毒性及诱变效应的微生物和离体培养的细胞是众所周知。为了检验有毒物质的毒性，可以使用细菌(DE-OS3902982；LüMMEN,P.:forum mikrobiologie 10,428-434(1998))，离体培养的细胞(ROSSI,A.et al.:Pharmacol.&Toxicol.68,424-429(1991))，原生动物(BRINKMANN,G.:Z.Wasser-und Abwasser-Forsch.11,210-215(1978))，植物原生质体(OVERMEYER,S.et al.:UWSF-Z.Umweltchem.kotox.6,5-8(1994))和绿藻(BRINKMANN,G.u.R..Kühn:Z.Wasser-und Abwasser-Forsch.10,87-98(1997))。此外，肠杆菌(ODA,Y.et al.:Mutation Res.147,219-229(1985))和发光细菌(ULITZUR.S.et al.:Mutation Res.74,113-124(1980))被建议用来检测诱变效应。以前使用的检测方法存在着一些不足即其不但费时而且还需要有特殊设备的实验室。因此，只能进行一些样品的单一检测而不可能开展田间的研究。
本发明的目的是研制可用于有毒物质检测的方法。基于此考虑，发光细菌以及微生物被固定化。被固定化了的细胞和光检测装置连接构成了一个生物传感器。这种新研制的生物传感器被用在模型的已知的流动注射系统中来控制样品的供应。
自然的发光细菌和基因工程产生的发光细菌以及其它相应的微生物，其固定化的步骤如下：
1．将微生物的机械内含物置于一个带有多孔膜的测量室内，多孔膜可透过污染物。
2．在基质内进行固定化，基质如琼脂、胶原或聚丙烯酰胺。
3．包埋在海藻酸钙或硫酸纤维素的钡盐中。
4．在合适的固定剂的作用下，吸附在膜或其它载体物质的表面上，固定剂为戊二醛或带有环氧基团的物质。
生物传感器的光检测装置是由一个通过例如光电二极管可以检测到相当微弱放射线的测量系统和相应的信号预放大器及显示装置构成。
将固定化细胞(生物传感器的生物学成分)在有一些部分可透光的测量容器内培养，可透光的部分安装着一个光测量系统，以用来测量微生物的生物发光。也可以使用一个遮光测量室，此测量室仅和一个纤维光束相连接以传导信号到光测量装置。样品的供应是通过置于模型的已知的流动注射系统中的生物传感器的附件来完成的，流动注射系统由几个可以被一个微处理器或一个外部计算机控制的泵和磁性通口构成(附图1)。
本发明是将已知技术和新改进特征相结合，现有技术和新改进的特征是相互影响的，且二者结合后可以用来检测化合物和物质混合物经过一段时间间隔后的生物学效应以监控环境参数及控制农业和工业的生产过程，并产生了预料的成功。
所述的固定化发光细菌或通过转入合适的质粒载体来发磷光的基因工程细菌的使用，出现了令人惊讶的解决了普通问题的新的用途。例如一些环境参数监测任务，如空气、地表水、废水或沥滤液的控制和农业与工业的生产过程的控制。此外，固定化细菌的使用可以允许重复多次的单独测量，因此在不同样品的研究过程中固定化细菌有着多重的用途。
除了在环境参数的研究上的新的应用外，还可以应用于化合物、化妆品、药物、杀虫剂、部分物体或食品的毒性与诱变性的筛选。
附图1：
1        带有饱和气载体一液体的容器
2        气动泵
3-5      液体泵
6        六道磁性通口
7        注入口
8        三道磁性通口
9        带有固定化细胞的测量室
10       带有固定化细胞的暗室
P1-P4    样品1-4
S1-S2    标准1和标准2
Pu1-Pu4  缓冲剂卜4
Aw       废水
本发明可期望通过下面的实施例得到说明：
典型实施例
实施例1：
将费氏弧菌的自然产生的黑色突变体置于每升含5g蛋白胨、3g甘油、15.5g NaCl、0.75g KCl、12.3g MgSO4.7H2O、1.45g CaCl2.2H2O、0.075g K2HPO4.2H2O和1.0g NH4Cl的溶液内培养。通过消光可以检测到所需要的细胞浓度(大约105个细胞ml-1)并将pH值调整到7.0。用生理盐水配成1.2％的褐藻酸钠溶液并进行过滤除菌。加入细菌的悬浮液，直到褐藻酸钠溶液的终浓度为1％。通过一个已安装了皮下注射用针头的细微注射器，在持续地加压下，上述溶液被逐滴地加到0.2M的CaCl2溶液中。在褐藻酸盐的凝固作用后，将固定化细胞用生理盐水润洗几次。通过与诱变性物质的接触，细菌的生物性发光增强了。因此，与阴性对照的控制测量相反的放射光的加倍是非常有价值作为物质的诱变效应的证据的。此外，用肝酶组分对样品的前处理(S9-mix)，也可以进行并发突变的检测。
实施例2
在加热和搅拌的条件下，将1.5g的琼脂溶解在100ml的蒸馏水中。冷却到40-45℃后，将费氏弧菌细菌的悬浮液(在30g NaCl、6.10gNaH2PO4.3H2O、0.204g MgSO4.7H2O、0.50g(NH4)2HPO4、3ml甘油、5g蛋白胨、0.5g酵母提取物中加水填充到11-1，用NaOH或HCl调pH值为7.2+/-0.2)混入已加热的溶液中。然后，此混合物在流动注射系统的测量室内凝固成琼脂斜面。通过与含有有毒物质，代谢物的样品接触，结果生物发光受到了抑制。因此，发光细菌的20％的生物发光量被抑制是存在毒性的证据。
实施例3
5ml费氏弧菌细菌的悬浮液(见实施例2)置于冰上冷却。在5ml的用冰冷却的0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中混入1.63g丙烯酰胺、0.08g N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg过氧化亚硫酸氨并且搅拌至完全溶解。在不断地搅拌下，将细菌悬浮液和0.08ml的N,N,N’,N’-四甲基乙烯二胺逐滴加入上述溶液中。60至90分钟后聚合反应结束。获得的凝胶用缓冲液洗涤并且培养在流动注射系统的测量室内。与实施例2一样，含化合物的样品的毒性效应就可测定了。
实施例4
通过转入LUX-基因复合体的基因工程大肠杆菌，如同实施例3中描述的一样，被固定化并用于毒性的研究。
实施例5
将如同实施例l的含4％纤维素硫酸钠的溶液，逐滴加在含聚二烯丙基二甲基氯化铵的0.9％NaCl溶液的2％溶液中，固化8分钟。通过低渗溶液中的已获得的球型体的传递，稳定、光滑、可渗透污染物的胶囊便形成了。利用注射器细小的皮下注射用针，发光细菌如费氏弧菌、哈氏弧菌、Ph.hosphoreum或Ph.leiognathi或其它有发光能力的微生物的悬浮液，可以被插入到胶囊内的空隙里。这些胶囊被送入流动注射系统的测量室中用来检测物质混合物或单个物质的毒性效应。
实施例6
在发光细菌或其它微生物(实施例1和5)的悬浮液中溶解2％的褐藻酸钠。将规定尺寸的无菌玻璃纤维过滤器完全浸入到上述溶液中，然后置于0.2M的CaCl2溶液中培养并且在0.9％的NaCl溶液中洗涤数次，这样稳定的玻璃纤维褐藻酸钠固定剂就获得了。然后将上述获得的固定剂插入生物传感器系统的测量室中。
实施例7
在如实施例1所述的细胞悬浮液中，完全溶解4％的硫酸纤维素钠。采用注射器和不同直径的皮下注射用针，在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中沉淀，再用0.9％NaCl溶液洗涤之后，就得到了不同直径大小的稳定的硫酸纤维素胶囊。这种固定化技术适合于不同的野生种以及发光细菌的暗色突变株和其它的有发光能力的细菌。

Claims (8)

1．通过生物传感器来检测化合物和物质混合物的毒效及诱变效应的方法，所述的生物传感器由具有生物发光能力的固定化细胞以及与其连接的光检测装置组成。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用了发光细菌或通过适当的质粒载体的转化而具有发光能力的基因工程生物体。
3．如权利要求1和2所述的方法，其特征在于，生物传感器是如附图1的流动系统。
4．如权利要求1至3所述的方法，其特征在于，生物传感器用于多次重复的单一检测。
5．用于检测化学制品和物质混合物的毒效及诱变效应的生物传感器装置，其由固定化的生物发光的生物体和光检测装置构成。
6．如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的生物体是发光细菌或者是通过合适的质粒载体的转化而具有生物发光能力的基因工程生物体。
7．如权利要求1至6所述的方法和装置，其特征在于，此方法和装置可以被用于环境的监测，例如：空气、地表水、废水或沥滤液的控制及农业和工业的生产过程的控制。
8．如权利要求1至7所述的方法和装置，其特征在于，此方法和装置可以被用于环境参数的检测和化合物、化妆品、药剂、杀虫剂、部分物质或食品的毒性与诱变性的筛选。
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