KR100353617B1 - 발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율평가 방법 - Google Patents

발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동결건조 균주를 이용하여 독성물질의 분해에 따른 독성의 감소를 측정하는 방법에 관한 것이다.
독성물질의 분해도 및 처리공정의 효율을 측정하기 위하여, 본 발명은 독성의 정도에 따라 빛을 감소시키는 동결 건조된 발광미생물과 특정한 독성에 대하여 빛을 방출하도록 유전공학적으로 재조합된 발광박테리아를 이용함으로써, 종래의 기기적 분석법으로는 측정하지 못하는 중간산물이 생물체에 미치는 독성까지도 측정할 수 있고 또한 이들 중간산물이 생물체에 미치는 전반적인 독성뿐만 아니라 특정부위에 작용하는 독성까지도 추적할 수 있으므로 그 물질이 생물체의 어느 부위에 특정한 손상을 주는지에 대한 정보까지도 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 동결 건조된 발광성 미생물을 이용하므로 수송이 용이하고 보관이 간편하므로 현장적용을 위한 휴대화가 가능할 뿐만 아니라, 측정방법이 간단하여 일반인에 의해서도 손쉽게 측정이 가능하고, 부수적인 장치 및 소모품을 필요로 하지 않으므로 매우 경제적인 방법이기도 하다.

Description

발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율 평가 방법{The Method for Evaluating Performance of Degradation and Treatment Process of Recalcitrants Using Bioluminescent Bacteria}
본 발명은 동결건조 균주를 이용하여 독성물질의 분해에 따른 독성의 감소를 측정하는 방법으로 좀더 상세하게는 독성의 정도에 따라 빛을 감소시키는 동결 건조된 발광미생물과 특정한 독성에 대하여 빛을 방출하도록 유전공학적으로 재조합된 발광박테리아를 이용하여 독성물질의 분해도 및 처리공정의 효율을 측정하는 방법에 관한 것이다.
독성 물질의 분해도 및 처리공정 효율을 측정하기 위하여 종래부터 사용되고 있는 방법은 복잡한 추출과 전처리 과정을 요하는 LC, GC, GC/MS, LC/MS 등을 포함한 기기적 분석법으로서, 이들 방법은 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 숙련된 기술자를 요한다는 단점이 있다. 또한 이들 방법은 초기의 독성 물질이나 불특정한 분해산물에 대해서 정량, 정성적인 정보는 제공할 수 있으나, 이들이 생태계에 어떠한 영향을 미치는지를 평가하기 위한 생물학적 독성을 분석하기란 거의 불가능하다.
따라서 근래에는 다양한 특정 효소의 활성저해정도와 발광성 미생물의 발광 저해 정도를 비교하여 독성의 분해에 따른 감소를 평가하려는 노력이 진행되고 있다. 하지만 이러한 평가방법은 특정한 효소와 기질을 필요로 하며, 실험실 단위에서만 측정이 가능하다는 한계가 있다. 또한 독성 물질의 분해에 따른 생물학적 독성의 감소를 개괄적으로 나타내 줄 수는 있지만, 분해 산물이 생물체의 어느 부위에 특정하게 독성을 미치는지는 판단할 수 없는 한계를 지니고 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 분석방법들이 안고 있는 제반 문제점을 해결하기 위한 방안을 연구하여 오던 중, 동결건조된 미생물로서 독성물질이 세포 내에 유입되면 생물학적 빛을 감소시키는 해저 발광성 미생물과 독성물질의 유입이 생물체의 특정부위를 손상시켰을 때 생물학적 빛을 발생하도록 유전자를 재조합한 발광성 박테리아를 이용하면 특별한 처리 없이도 현장에서 독성물질의 분해도 및처리공정효율을 평가할 수 있다는 사실을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 독성물질의 분해도 및 처리공정효율을 측정하는 방법으로서, 독성의 정도에 따라 빛을 감소시키는 동결 건조된 발광미생물과 특정한 독성에 대하여 빛을 방출하도록 유전공학적으로 재조합된 발광박테리아를 이용하여 독성물질의 분해도 및 처리공정의 효율을 측정하는 새로운 생물학적 방법을 제공하는 데에 있으며, 뿐만 아니라 동결건조된 발광성 미생물을 이용함으로써 수송이 용이하고 보관이 간편하며, 현장적응을 위한 휴대화가 가능한 새로운 측정방법을 제공하는 데에 본 발명의 또 다른 목적이 있다.
도 1은 본 측정 방법을 이용한 독성 물질의 분해도 및 처리공정 효율을 평가하기 위한 개략도
도 2는 동결 건조된Photobacterium을 이용한 crystal violet의 독성탐지 특징
도 3 (a)는 spectrophotometer를 이용한 crystal violet의 분해 측정 결과
(b)는 동결 건조된Photobacterium을 이용한 crystal violet의 분해도 탐지
sta 0 : Crystal violet을 포함하지 않은 배지를 0분간 39 도에서 방치
c 0 : Crystal violet을 포함한 배지를 0분간 39 도에서 방치
c 1 : Crystal violet을 포함한 배지를 1분간 39 도에서 방치
c 5 : Crystal violet을 포함한 배지를 5분간 39 도에서 방치
c 60 : Crystal violet을 포함한 배지를 60분간 39 도에서 방치
s 0 : Crystal violet을 배양액을 이용한 39 도에서 0 분간 분해
s 1 : Crystal violet을 배양액을 이용한 39 도에서 1분간 분해
s 5 : Crystal violet을 배양액을 이용한 39 도에서 5 분간 분해
s 60 : Crystal violet을 배양액을 이용한 39 도에서 60 분간 분해
도 4는 동결 건조된Photobacterium을 이용한 2,4,5-chlorophenol의 독성탐지 특성
도 5(a)는 액체크로마토그래프 (LC)를 이용한 2,4,5-chlorophenol의 분해측정 결과
(b)는 동결 건조된Photobacterium을 이용한 2,4,5-chlorophenol의 분해도 탐지
c: 탐지용 균주만 배양한 경우
sta 0: 2,4,5-chlorophenol을 포함하지 않은 배지를 0분간 39 도에서 방치
sta 180: 2,4,5-chlorophenol을 포함하지 않은 배지를 180분간 39 도에서 방치
c 0: 2,4,5-chlorophenol을 포함한 배지를 0분간 39 도에서 방치
c 180: 2,4,5-chlorophenol을 포함한 배지를 180분간 39 도에서 방치
s 0: 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39도에서 0분간 분해
s 15: 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39도에서 15분간 분해
s 30: 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39도에서 30분간 분해
s 120: 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39도에서 120분간 분해
s 180: 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39도에서 180분간 분해
도 6는 동결 건조된 TV1061을 이용한 2,4,5-chlorophenol의 독성 탐지 특성
도 7는 동결 건조된 TV1061을 이용한 2,4,5-chlorophenol의 분해도 탐지
sta : 2,4,5-chlorophenol을 포함하지 않은 배지를 180분간 39 도에서 방치
c 0 : 2,4,5-chlorophenol을 포함한 배지를 0분간 39 도에서 방치
c 180 : 2,4,5-chlorophenol을 포함한 배지를 180분간 39 도에서 방치
s 0 : 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39 도에서 0 분간 분해
s 15 : 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39 도에서 15 분간 분해
s 120 : 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39 도에서 120 분간 분해
s 180 : 2,4,5-chlorophenol을 배양액을 이용하여 39 도에서 180 분간 분해
본 발명은 특별한 처리 없이 현장에서도 독성 물질의 분해도 및 처리공정 효율을 평가할 수 있도록 휴대화 할 수 있는 동결건조된 측정용 균주를 이용한다.
도 1은 본 발명의 측정 방법을 이용하여 독성 물질의 분해도 및 처리공정 효율을 평가하기 위한 개략도를 나타내고 있다. 본 발명은 종래의 측정방법이 안고 있는 기술적 과제를 해결하기 위하여 독성물질에 의해 야기되는 전반적인 생물학적 독성을 나타내기 위한 방안으로서 독성물질이 세포 내에 유입되면 생물학적 빛을 감소시키는 해저 발광성 미생물(Photobacterium)을 이용하며, 독성물질에 의한 생물체의 특정 부위의 손상여부를 나타내기 위한 방안으로서는 독성물질의 유입이 생물체의 특정부위를 손상시켰을 때 생물학적 빛을 발생하도록 유전자를 재조합한 발광성 박테리아를 이용한다.
포토박테리아(Photobacterium)는 해저에 사는 미생물로서 그들이 사는 어두운 서식지에 적응하기 위하여 일상적인 조건하에서 빛을 발하는 특성을 지니고 있다(항시 발광성 박테리아). 하지만 독성물질이 존재할 경우 이들 박테리아는 독성물질에 의해 손상을 입게 되며 빛을 내는 반응 또한 저해된다. 이러한 특성으로 인하여 포토박테리아(Photobacterium)를 이용하여 독성의 증가를 빛의 감소로서 추정할 수 있게 되는 것이다. 이러한 포토박테리아로는 포토박테리움 앙구스텀 (Photobacterium angustum ,ATCC25915), 포토박테리움레이오그나치 (Photobacteriumleiognathi,ATCC25521), 포토박테리움 포스포륨(Photobacterium phosphorium,KTCC 2852) 등이 있다.
반면, 유전자 재조합된 발광성 박테리아(bioluminescent bacteria)는 특정한 부위가 손상되었을 때 이를 회복하는데 관여하는 프로모터와 프로모터의 작동여부를 빛으로서 알려주는 발광유전자(lux유전자)를 인위적으로 결합시킨 플라스미드 (plasmid)를 함유하고 있다. 따라서 특정 부위에 미치는 독성은 그에 상응하는 프로모터를 작동시키며, 이는 발광유전자의 발현을 통해 빛으로 나타나게 된다. 따라서 독성 물질의 독성으로 인한 생물체의 특정부분의 손상은 재조합 발광성 박테리아의 빛의 증가로서 나타나게 되는 것이다.
생물체의 특정 부위가 손상되었을 경우 빛을 발하도록 프로그램 된 재조합 박테리아의 종류는 다양하며, 이러한 균주들은 모두 분해도 및 처리공정 효율을 평가하는데 이용될 수 있다. 이러한 균주를 이용하여 평가할 경우 그 분해산물이 생물체의 어떤 부위(유전자, 단백질, 세포막, 산화적 손상 등)를 어느 정도로 손상시키고 있는지를 추정할 수 있다. 표 1은 이러한 특성을 나타내는 재조합 발광성 미생물의 대표적 예를 나타내 주고 있다.
< 표 1 > 여러 가지 스트레스에 반응하는 다양한 재조합 박테리아
균주 플라즈미드/숙주 피노타입(Phenotype)
TV 1061 pGrpELux5/RFM443 KanR, AmpR, luminescent, Membrane-damage sensitive
DPD 2794 pRecALux3/RFM443 KanR, AmpR, luminescent, DNA-damage sensitive (ex, mitomycin C)
DPD 2511 pKatGLux2/RFM443 KanR, AmpR, luminescent, Oxidative-damage sensitive (ex, H2O2 and UV irradiation)
DPD 2540 pFabALux6/RFM443 KanR, AmpR, luminescent, Fatty acid-damage sensitive(ex, cerulenin)
* 본 균주들은 미국의 뒤퐁(DuPont)사로부터 연구목적으로 분주받았음.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 본 발명의 실시예에서는 분해도 및 처리공정 효율에 따른 생물학적 독성의 감소를 확인하기 위하여, 독성의 증가에 따라 빛을 감소시키는 포토박테리아 (Photobacterium phosphorium,KTCC 2852)를 이용하고, 독성물질이나 그 분해산물이 생물체의 특정한 부위에 미치는 독성을 탐지하기 위하여는 여러 가지 재조합 발광성 박테리아 중 특히 독성물질이 단백질을 손상시켰을 때 빛을 발하도록 유전적으로 재조합된 독성탐지용 박테리아 TV1061(ATCC 69315)를 이용하고 있으나, 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 본 발명의 내용에 의하여 독성물질의 독성에 따라 적절한 발광성 미생물을 선택할 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에한정되지는 아니한다.
< 실시예 1 > 동결 건조된 포토박테리아을 이용한 크리스탈바이오렛(crystal violet)의 독성탐지 특성
포토박테리아를 염료의 분해효율을 측정하는데 사용될 수 있는지를 살펴보기 위해 동결 건조된 포토박테리아를 깨운 후 이미 알고 있는 농도의 염료 (crystal violet)을 첨가하며 포토박테리아의 빛의 감소를 측정하였다. 그 결과 도 2에서 보는바와 같이 염료의 농도가 증가할수록 독성도 증가하여 포토박테리아에 의해 방출되는 생물학적 빛이 감소됨을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2 > 동결 건조된 포토박테리아를 이용한 크리스탈바이오렛(crystal violet)의 분해도 탐지
염료(crystal violet)의 분해에 효율적인 것으로 알려진 하얀 곰팡이 (Phanerochaete chrysosporium)의 배양액을 이용하여 crystal violet 5 ppm을 분해한 후 정량적인 분해정도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도의 감소로써 분석하고 분해에 따른 독성의 감소를 도 3에서와 같이 포토박테리아의 빛의 증가로서 확인하였다. 그 결과 도 3에서 보는 바와 같이 스펙트로포토미터의 흡광도가 감소함에 따라 독성이 감소되고 있음을 포토박테리아의 빛을 측정함으로써 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, 염료의 분해도를 본 발명에 의한 방법으로 효율적으로 탐지할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 3 > 동결 건조된 포토박테리아를 이용한 2,4,5-chlorophenol의 독성탐지 특성
포토박테리아를 페놀류의 분해효율을 측정하는데 사용할 수 있는지를 살펴보기 위해 동결 건조된 포토박테리아를 이용하여 이미 알고 있는 농도의 2,4,5-클로로페놀을 첨가하며 포토박테리움의 빛의 감소를 측정하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 2,4,5-클로로페놀의 농도가 증가할수록 독성도 증가하여 포토박테리아에 의해 방출되는 생물학적 빛이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 이들 측정용 균주가 페놀류의 독성을 민감하게 탐지할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4 > 동결 건조된 포토박테리아를 이용한 2,4,5-클로로페놀의 분해도 탐지 염료의 분해뿐만 아니라 페놀류의 분해에도 효율적인 균주로 알려진 하얀 곰팡이 (Phanerochaete chrysosporium)의 배양액을 이용하여 2,4,5-클로로페놀을 분해한 후 정량적인 분해정도를 HPLC로 분석하고 분해에 따른 독성의 감소를 포토박테리아의 빛의 증가로서 확인하였다. 그 결과 도 5에서 보는 바와 같이 HPLC 측정 결과 독성물질의 정량적 농도가 감소함에 따라 독성이 감소되고 있음을 포토박테리아의 빛을 측정함으로써 확인할 수 있었다. 이 결과는 이들 박테리아가 실제적인 독성물질의 분해도 및 처리공정 효율을 평가하는데 이용될 수 있음을 보여준다.
< 실시예 5 > 동결 건조된 TV1061을 이용한 2,4,5-클로로페놀의 독성 탐지 특성
단백질 손상에 민감하게 빛을 발하는 TV1061이 2,4,5-클로로페놀에 대하여어떠한 반응을 나타내는지를 확인하기 위하여 기지의 농도의 2,4,5-클로로페놀에 반응하여 방출하는 TV1061의 빛의 양을 측정하였다. 그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 농도가 증가함에 따라 단백질의 손상도 증가되어 TV1061에 의한 빛의 방출이 증가되었으며, 어느 한계농도 이상에서는 빛을 내는 반응까지도 저해할 정도로 측정용 균주에 심각한 손상을 가져와서 빛의 감소를 수반하였다. 따라서 독성 물질의 농도가 증가함에 따라 TV1061이 방출하는 생물학적 빛의 세기도 증가하다가 어느 한계 농도 이상에서는 독성물질에 의한 측정용 균주의 심각한 손상으로 인해 발광하는 빛의 양이 감소하게 되는 것이다.
< 실시예 6 > 동결 건조된 TV1061을 이용한 2,4,5-클로로페놀의 분해도 탐지
실시예 4에서와 마찬가지 방법으로 TV1061을 이용하여 실제 2,4,5-클로로페놀의 분해효율을 측정하였다. 대조군으로는 2,4,5-클로로페놀을 함유하지 않은 시료(sta0, sta180)에 대한 TV1061의 탐지반응을 선정하였으며, 이를 바탕으로 분해에 따른 TV1061의 탐지반응 정도를 비교하였다. 그 결과 도 7에서 보는 바와 같이 2,4,5-클로로페놀을 분해시키지 않은 경우(C0, C180)에 있어서는 이 화학물질의 독성이 측정용 균주에 심각한 손상을 일으켜서 빛을 방출하는 반응까지도 저해시켜, 대조군 보다 더 낮은 생물학적 빛을 나타내나,P.chrysosporium배양액을 이용하여 분해시킨 경우에 있어서는 이 분해산물에 대한 TV1061의 빛 방출 저해현상은 발견되지 않았으며, 오히려 대조군에 비해 높은 수준의 빛을 방출함으로써 단백질을 손상시키는 분해산물이 잔존하고 있음을 나타내었다.
본 발명은 독성물질의 분해 및 처리공정 효율에 따라 생물학적 독성이 얼마만큼 감소되었는지를 나타내 주므로 기기적 분석법으로는 측정하지 못하는 중간산물이 생물체에 미치는 독성까지도 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한 이들 중간산물이 생물체에 미치는 전반적인 독성뿐만 아니라 유전자 재조합된 발광성 박테리아를 이용하여 특정부위에 작용하는 독성까지도 추적할 수 있으므로 그 물질이 생물체의 어느 부위에 특정한 손상을 주는지에 대한 정보까지도 제공할 수 있다.
특히, 본 발명을 통해 제공되는 효율적인 염료의 분해도 탐지방법은 기기적 분석방법에서 오는 한계를 극복하였으며, 염료와 같이 기존의 정성적 기기분석법으로는 측정 될 수 없는 다양한 난분해성 물질의 분해도를 탐지할 수 있는 새로운 가능성을 제시해 준다.
본 발명은 또한 동결 건조된 발광성 미생물을 이용하므로 수송이 용이하고 보관이 간편하므로 현장적용을 위한 휴대화가 가능할 뿐만 아니라, 측정방법이 간단하여 초보자에 의해서도 손쉽게 측정이 가능하고, 부수적인 장치 및 소모품을 필요로 하지 않으므로 매우 경제적인 방법이기도 하다.

Claims (5)

  1. 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율을 측정하는 방법에 있어서,
    독성물질의 존재에 따라 발광량이 감소하는 성질을 가진 동결건조된 포토 박테리아와, 독성물질의 분해로 생성되며 생물체의 특정부위에 손상을 주는 중간산물에 의해 활성화되는 소정의 스트레스 프로모터와 이들의 작동여부를 알려주는 lux 유전자를 함유한 동결건조된 재조합발광성 미생물에 측정하고자 하는 시료를 각각 주입하는 단계와,
    시료내의 독성물질의 독성정도에 의존하는 상기 미생물의 발광량을 각가 측정함으로써 독성물질의 분해도 및 처리공정효율을 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율의 평가방법
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 발광성 미생물에 의한 측정용 시료는 염료 또는 페놀류 등의 독성물질임을 특징으로 하는 발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율의 평가 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 발광성 미생물은 포토박테리움 앙구스텀(ATCC25915),포토박테리움레이오그나치(ATCC25521), 포토박테리움 포스포륨(KTCC 2852) 중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율의 평가 방법.
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