PT84519B - Meio de deteccao de microbios numa amostra - Google Patents

Description

MEIO DEDETECÇÃO DE MICRÓBIOS NUMA AMOSTRA

Este invento visa a detecção de micróbios numa amostra, tal como, água, alimentos ou análogos. Mais particularmente,esinvento refere—se à detecção dum micróbio de alvo por meio do uso dum meio de análise, não necessariamente esterilizado, que contenha ym nutriente que possa ser metabolizado significativa mente apenas pelo micróbio de alvo e que, uma vez metabolizado liberte uma metade que altere uma caracteristica da amostra. 0 meio é portanto um meio especifico na medida em que apoia só o crescimento de micróbios de alvo de preferencia a um meio ge_ neralizado que também apoiaria o crescimento de outros micróbios sem ser o micróbio de alvo.

A fim de serem detectados patogenos microbianos em especimes, quer de origem humana, animal ou ambiental, é usado, por via de regra, o seguinte processo geral: os micróbios de alvo (e outrod) no especirae são inoculados com o especime num meio de cultura no qual são abastecidos com todos os nutrientes de que carecem para o seu crescimento. 0 especime pode ser urna amostra natural, sem tratamento, ou também pode ser uma amostra que tenha sido pré-tratada, por exemplo, por filtração com membrana. O meio de cultura tem os nutrientes e outros pro dutos quimicos selectivos, tais como, anti-metabólicos ou anti^ bióticos que sejam selectivamente activos contra micróbios sem ser os micróbios de alvo· 0 meio de cultura é um meio geral, mesmo com os produtos químicos selectivos,

V na medida em que

apoia o crescimento tanto de micróbios em alvo como de micróbios relacionados e consequentemente só é parcialmente es pecifico para os micróbios de alvo.

meio de cultura, que pode ser uma solução aquosa ou um gel aquoso, é esterilizado para o libertar de quaisquer micróbios contaminantes que possam estar presentes e que podiam desta forma interferir com a análise. 0 meio de cultura deve ser refrigerado e acondicionado de maneira a evitar a con tâminação depois da sua fabricação.

Depois de um ou mais meios de cultura terem sido inoculados com o especime, os meios inoculados são incubados durante, pelo menos, dezasseis a dezoito horas ou mais, em condições atmosféricas controladas. Depois da incubação, os meios de cultura são examinados a respeito de crescimento compatível com o micróbio de altío. Se fôr observado esse crescimento, é tirada uma amostra para continuação da análise, visto que a presença do micróbio de alvo só pode ser estabelecida isolando-o em estado puro, não misturado com outros micróbios. Uma vez isolado em meios de cultura subsequentes, os micróbios de alvo são identificados analisaddo—os a respeito dum certo número de caracte— risticas fisicas e químicas. Se os crescimentos do micróbio de alvo aparentes não forem isolados, podem resultar testes negativos falsos.

É facilmente compreendido que este processo analítico muito vulgar é moroso e tem de ser realizado cuidadosamente para preservar a esterilidade.

Uma área em que têm sido feitos esforços consideráveis para simplificar e acelerar os processos de análise é a da aná lise da água a respeito de micróbios. Lo seguimento, estão e— xemplos desses esforços.

Manja idealizou um teste de campo para a detecção de poluição fecal de agua potável pela análise de ácido sulfidrico directaraente dum caldo de reacção. Este teste não experimentou um uso muito divulgado porque é mais concludente para o isola2

1' mento de Salnonella e não selecciona Eacherichia coli (E. coli ) . Smith desenvolveu um teste confirmatório rápido com um tubo simples para E. coli. .Codificou lauril triptose reduzindo a metade a quantidade de lactose e adicionando 1C de triptofane. Ceasoner desenvolveu um teste rápido, de sete horas, de coliforme fecal, baseado no processo de filtraçao com membrana. Depois duma da através duma membrana, amostra de 100 ml ter sido filtra é colocada num meio chamado m—7 e incubada a 44,5²C durante sete horas,

Colifortnes fecais sao amarelos, indicando fermentação de lactose. Embora a técnica seja rápida, não é realizável em trabalho de campo e so fre duma certa falta de especificidade como processo MPB (número mais provável).

vários investigadores tentaram detectar sub-produtos bacterianos como meio de análise de abastecimentos de água.

Jorgensen utilizou uin ensaio de lisato de Limulus para detectar endotoxinas bacterianas. A presença de bactérias também foi determinada por medições de impedancia electricas, ensaios ATP e o ensaio do substrato chamado Carbono 14. Xo en tanto, nenhum destes testes foi aceite no campo porque eles não analisam especificamente micróbios associados com uma exis tência intracolónica e que possam ser utilizados como bactérias sentinelas que possam prever a presença de patogenos gastro-intestinais.

Ha indicadores de crescimento microbiano que só mudam de côr depois do micróbio se desenvolver. No entanto, não pai· ticipam como substancia aliihentar do micróbio. São acessórios dos produtos químicos que proporcionam sustento aos micróbios de alvo. Participam apenas reagindo quimicamente com um subproduto metabólico produzido pelos micróbios de alvo. Xao exercem qualquer efeito estimulante sobre os micróbios de alvo. iêm sido usados produtos químicos que mudam de côr quando

altera ο p'í para marcar a presença ou ausência de crescimento bacteriaao. Indicadores de pK utilizados vulgarmente incluem vermelho de fenol, azul bromocresol e vermelho neutro.

Pata usar que crece no ácidos, sais, vitaminas, ácidos gordos e energia. 0 indica substancia acessória. Ta terminologia logia, o meio é geral a numerosos micróbios, na dor é uma de Uicrobiomedida em que apoia o crescimento de numerosos micróbios, com adicionado

Têm sido feitas tentativas para medir o crescimento bacteriano usando outros indicadores de p

Tem sido medidos tais como, irnpedancia electrica, quantidade de ATP -trifosfato de conductividade electrica, adenosina), turvação (densidade óptica), num tneio geral, com a adição dum quimico que é medido. Por exemplo, Golber (Patente dos EUA 3.206.317) utiliza cloreto de trifenil tetrazo lio num meio contendo proteínas, extracto de fermento, dextro, se, cloreto de sódio e fontes de outros nutrientes. Descreve ainda na niesma patente, um meio geral com um indicador de ρΙΓ, vermelho de fenol. Uma amostra que se presume conter o(s) micróbio (s) de alvo é inoculada no meio. O meio contem todos os constituintes necessários para o crescimento, metabolismo e multiplicação não só dos micróbios de alvo mas também de outros. Depois dos micróbios crescerem, metabolizam um ou mais constituintes no meio. Os micróbios, depois da metabolização, eliminam o resíduo e outros produtos. 0 resíduo e outros produtos podem ser medidos pela reacção com o indicador. Por exem pio, uma classe de produto residual dos micróbios é hidrogénio iónico, que cria um estado ácido e muda o vermelho de fenol de vermelho para amarelo. Outros produtos residuais são agentes reductores. Estes reagem com o cloreto de tetrazólio para converter este corante de incolor para azul—purpura.

I·

Berger et al (Patente dos EUA 3.496.066) descreve o _z z emprego duma nova serie de compostos que as bactérias convertem de precursores em substancias alimentares. Revelam que várias bactérias podem converter vários precursores em vários corantes de cores. Em todos os casos, os precursores não servem como alimento para as bactérias. Depois dos micróbios metabolizarem, crescerem e multiplicarem-se em meios gerais, os precursores são convertidos em substancias corantes.

Bochner (Patente dos EUA 4.129.463) descreve um meio de identificar ou analisar um micróbio pela mudança dum indicador de oxidação-redução. O micróbio cataboliza o indicador de oxidação-redução, um composto de tetrazólio, que sofre uma alteração de cor. Uma necessidade do invento é a inclusão no meio dum nutriente que apoie o crescimento dos microrganismos sem ele próprio afectar o indicador. Bochner exige na seu invento que o indicador seja um composto não-biodegradável e que participe por niudança de côr depois de ser reduzido.

Este invento detecta micróbios de alvo numa amostra usando um indicador que é_v . o nutriente preferido ou principal do micróbio de alvo mas não pode > ser metabolizado substancialmente por quaisquer outros micróbios viáveis que possam estar presentes na amostra em conjunto com o micróbio de alvo. 0 invento usa portanto um selector activo dos micróbios de alvo de preferencia aos reactores passivos usados pela técnica antiga. 0 indicador muda uma caracteristi ca da amostra logo que o nutriente é metabolizado pelo micróbio de alvo. A característica pode ser: côr (ou visivel, ultra violeta ou infravermelho); conductividade eléctrica, impedância electri ca ou análogos. 0 modo preferido de realizar o invento abran ge detectar-se os micróbios de alvo pelo uso dum indicador-nutriente que, quando metabolizado, muda a côr visivel ou fluorescente duma solução aquosa contendo o espécime.

indicador-nutriente participa activamente no cresci mento dos micróbios de alvo servindo como fonte nutriente principal ou preferida. Os micróbios de alvo podem crescer,

.aetabolizar e muA tipli car-se porque pies e essencialmente so eles podem usar o indicador corno alimento principal. Os indi. cadores pode.n incluir cromogenos ligados a: sais; carbono; azoto; enxofre, amino ácidos; ácidos gordos; peptideos; ou outros nutrientes principais, selectivoj , para microbios. Graças ao facto de outros micróbios sem ser os micróbios de alvo ficam impedidos de crescer, metabolizar ou multiplicar-se, os meios são tão especificos que o invento nao tem de ser esterilisado antes de uso. A competição entre os micróbios de alvo e outros micróbios pelos nutrientes à disposição nos meios é eliminada pelo presente invento. 0 meio pode ser fabticado e embalado na forma dum pó que é adicionado à amostra que está a ser analisada. Como já foi indicado, não é necessária a esterilização. 0 meio pode ser dissolvido em água e a amostra pode ser adicionada à solução ou, se a amostra fôr aquosa, o meio pode ser adicionado directamente à a— mostra. Não há necessidade dum período de incubação rainimo para garantir o crescimento dos micróbios de alvo, visto que nenhuns outros micróbios'na amostra poderão metabilizar consideravelmente o nutriente nos meios.

desenvolvimento duma côr especifica indica a presença dos micróbios de alvo. Esse desenvolvimento pode ocorrer em qualquer altura depois de ser iniciado o processo. Não há qualquer necessidade de purificar os micróbios de alvo. Não há também qualquer necessidade de realizar uma análise quimica da amistra para determinar se está presente o micróbio de alvo .

A classificação de micróbios é uma ciência chamada ta— xonomia. Começa—se com certas caracteristicas grosseiras e con tinua-se desta forma até se chegar a uma árvore de decisão. Quanto mais se avança até à árvore de decisão, mais especificas são as caracteristicas de modo a colocar um dado micróbio a esse nivel. Cada nivel tem o seu nome próprio, tal como, reino, tribo, farailia, etc. Gene’ e espécie são os dois últimos níveis na árvore de decisão. Ê pelo nome~do gege^.

- 6 espécie que são conhecidos os micróbios.

.'icróbios, tal como seres humanos,

têm dois nomes para descrever o seu lugar no nome da espécie. 0 gene partilha caracteristicas mundo cientifico. É o nome do gene e o refere—se a um grupo de micróbios que é semelhante a em comum. Por analogia, um nome de fa.milia do ser humano. A espécie é a

Λ não pode ser mais sub-dividida. Ê semelhante ao homem. Todavia, analogamente aos nomes humanos, classificação que primeiro nome do os micróbios que têm o mesmo nome de gene e espécie (por ex., Escherichia coli) podem não ser absolutamente idênticos. C nome do genej vem antes do nome da espécie (semelhantemente ao ultimo nome primeiro).

Conforme usado nesta descrição, o termo micróbios de alvo pode referir-se a um micróbio simples, una espécie de micróbios relacionada ou um grande geH.e. de micróbios possuindo uma caracteristica taxonómica comum. 0 indicador só precisa de ser especifico para o micróbio de alvo. Por exemplo, estão à disposição indicadores para detectar um micróbio único, tal como Escherichia coli (E. coli ) ou para detectar qualquer um duma espécie de micróbios infimamente relacionada, tal como

--lebsiella — Znterobacter — Serratia, ou qualquer um dum grande ge^_e de micróbios, tais como bactérias Eram negativas. Cs cromogenos usados no indicador-nutriente pode produzir côr no espectro visível, no espectro ultra—violeta ou no espectro infra—vermelho. Como se pode deduzir do supracitado, o indicador-nutriente, de preferencia, é incolor no estado não—metabolizado e de pre ferencia liberta uma quota-parte de côr depois de ser metabolizado pelos microbios. A côr pode ser visível, fluorescente ou legível mecanicamente. Como já se referiu, usando o invento, bá muito pouca ou liem ha sequer competição pelo alimento ou nutriente nos meios entre os micróbios porque o único nutriente presente nos s o meios pode ser metabolizado de uma fornia muito significativa pelos micróbios de alvo. Xesta conformidade, Um número considera- 7 -

os processos da técnica anterior, são eliminados por este invento. 0 nutriente usado deve ser um que os micróbios de alvo prefiram largamente em relação a quaisquer outros nutrientes e também um a que outros micróbios dêem pouca ou nenhuma preferencia. Assim, só a presença dos micróbios de alvo no especimen pode resultar em metabolismo suficiente do nutriente para fazer com que a cor ou outra caracteristica mudem na amostra .

Visto o indicador-nutriente ser só consideravelmente especifico para o micróbio de alvo e ser o nutriente preferido ou principal nos meios para o micróbio de alvo, o micróbio de alvo é atraído para o indicador-nutriente, acelerando assim a mudança de cor.

Por consequência, é um objecto deste invento apresentar um processo para detectar micróbios numa amostra ao mudar por rneiode metabolismo uma caracteristica detectavel dessa amostra .

É um objecto adicional deste invento apresentar um processo do carácter descrito segundo o qual a côr da amostra é mudada por metabolização dum micróbio de alvo.

É outro objecto deste invento apresentar um processo do caracter descrito em que a mudança de côr é proporcionada por metabolismo dum nutriente adicionado à amostra, nutriente que in clue uma parte cromogénica que só é detectavel depois do nutriente ser metabolizado.

É ainda mais um objecto deste invento apresentar um processo do carácter descrito em que o nutriente que tem a parte cromogenica só pode ser metabolizado significativamente pelo micróbio de alvo.

Estes e outros objectos do invento tornar-se-ão mais facilmente evidentes pela seguinte descrição pormenorizada de várias formas de execução preferidas do invento.

\'+—y

São apresentados a seguir três exemplos do emprego do invento paa detectar um gene e uma espécie dum oicróbio gram negativo (Escherichia coli), um gene e uma espécie de micróbio gram positivo (Streptococcus faecalis), e uma classe taxonomica consistindo dum grande grupo contendo muitos membros (micróbios gram negativos). Quando é examinado um especimen a respeito de qualquer destes três micróbios, cada um é classificado como o(s) micróbio(s) de alvo.

Escherichia coli nutriente é um substrato de 3-glucuronidase de enzima. Se se quiser determinar a presença de E. coli pela mudança de cór, o indicador-nutriente pode ser ortonitrofenil-B-Dglucuronido (amarelo), 3-naftalamida-B-D-glucuronido (púrpura), alfa-naftol-B-D-glucuronido (vermelho), ou metilumbiliferil-B-Dglucuronido (fluorescente) ou análogos.

indicador-nutriente serve co.no fonte essencial de carbono. 0 resto do meio é distribuído de forma que cada ingrediente forne a um requisito para E. coli.

Em primeiro lugar, para evitar a competição de micróbios sem ser os da vasta categoria de bactérias gram negativas, sao iadi‘ionados os antibióticos vancomicina e ansiomicina na percentagem em peso de 5 r>· Estes antibióticos podem estar presentes nos limites de 1,-- a 10p em pêso.

Em segundo lugar, para serem seleccionados E. coli de bactérias gram negativas, são usados os seguintes ingredientes:

INGREDIENTE	FONTE	7’ preferido em pêso	âmbito de % em pêso
azo	sulfato de amónio	37,0	10-50
amino ácidos	histidina	0,0697	0,02-0,1
	metionina	0,1860	0,02-0,4
	triptofan	0,2325	0,02-0,5

INGREUL ENTE

FONTE preferido em peso

Vi taminas	biotina	v , c 0 2 3 2
	pantotenato	0,0033
	ácido fólico	0,000232
	inoeitol	C ,0'186
	acido p—aminobenzoico cloridrato de pirido-	0,0 4 6
	xina	0,093
	ribaflavina	0,037
	tiamina	0,037
Elementos	cloreto férrico	0,0'+6
	sulfato de cobre	0,001860
	sulfato de manganésio	0,0037
	cloreto de potássio	o,0000009
	iodeto de potássio	0,0000046
	sulfato de zinco	0 ,046
	acido bórico	0,46o
	cloreto de magnésio	0,019
Sai s	vosfato de potássio
	monobásico fosfato de potássio	9,C
	bibásico	23,0
	carbonato de sódio	23,0
	sulfato de magnésio	4,6
	cloreto de sódio	0,9
	cloreto de cálcio	0,9
	piruvato de sódio	0,023

Indicador-nutriente

0,3'45

âmbito de γ em pêso

0,0001-0,001

0,001-0,03 ,0001-0,02

0,01-0,02

0,01-0,1

0,05-0,3

0,01-0,06

0,01-0,06

0,02-0,1

0,001-0,002

0,002-0,007

0,00001-0,001

0,000001-0,00001

0,01-0,08

0,01-0,5

0,01-0,05

1- 15

2- 30

2-30

1-10

0,2-5

0,2-5

0,01-0,1

0,2-2

Streptococcus faecalis

Streptococcus faecalis é um micróbio considerado como causa de infecção no tracto urinário. Também é a maior bactéria analisada na água de piscinas.

indicador—nutriente é um substrato de L—pironidoni1 aminopeptidase de enzima. Se se quiser determinar a presença de S.faecalis por uma mudança de cór, a molécula do indicador-nutriente pode ser ortonitrofenil-3-L-pironidonil (amarelo), 3-naftalamida-B-I-pironidonil (púrpura ), alfa-nafto1-B-L-pironidonil (vermelho) e metilumbilxferil-B-L-pironidonil (fluorescente).

O indicador-nutriente serve como fonte essencial de carbono. 0 resto do meio é distribuído de forma que cada ingrediente forneça um requisito para S. faecalis.

Em primeiro lugar, para evitar a competição de micróbios sem ser a vasta categoria de bactérias gram positivas, são adicionados os antibióticos colistina, ácido naladixico e ansiomicina.

Em segundo lugar, para seleccionar B. faecalis de bactérias gram positivas, é usada a mesma mistura de ingredientes especificada para E, coli com o indicador-nutriente e antibióticos acima indicados. 0 indicador-nutriente está presente numa concentração de 0,3^5 por cento em peso, o limite usavel sendo aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2,0 por cento em pê_ so e os antibióticos estão presentes na concentração de 5 P^or cento em pêso, sendo o limite usavel cerca de 1 a cerca de 10 por cento em pêso.

Bactérias gram negativas

Há duas vastas classes de bactérias; gram positivas e gram negativas. As bactérias gram negativas são importantes porque contêm um material tóxico como parte dos seus corpos, chamado endotoxina. Também podem contaminar produtos farmacêuticos e outras preparações médicas.

indicador—nutriente é un substrato de L-alanina aminopeptidase de enzima. Se se desejar determinar a presença de bactérias gram negativas por uma mudança de côr, a molécula do indicador-nutriente pode ser L-alanina-B-ortonitrofenilo (amarelo), beta-naftalamida—3-L-alanina (púrpura), alfa-naftol-B-L-alanina (vermelho) e metiluthbiligeri 1-B-T-alanina (fluores^ cente).

O indicador-nutriente serve como fonte essencial de carbono. 0 resto do meio é distribuído de forma que cada ingrediente forneça um requisito para bactérias gram negativas.

Primeiramente, para eliminar micróbios

larga categoria de bactérias gram negativas, são adicionados os antibióticos ansiomicina (elimina a levedura! e vancomicina (e limina gram positivos) em quantidades de 5 por cento era pêso.

í usada a mesma mistura de ingredientes acima indica da estando o indicador-nutriente presente numa quantidade de 0,3^5 por cento em pêso e nos limites de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2,0 por cento em pêso e os antibióticos podem estar presentes nos limites de aproximadamente 1 a aproximadamente 1C por cento em pêso.

Exemplos adicionais £ode ser usada uma fonte de carbono primária, como nutriente primário na detecção da família Klebsiellae na água. As bactérias na família Klebsiellae podem metabolizar fontes de car bono nas quais o carbono em moléculas de açúcar está ligado por ligações 3—D. Uma formulação de detecção deste espécie inclue co_ mo fonte nutriente de carbono primário, uma molécula de glucose ligada através da ligação B-D a ortonitrofenilo, uma parte cromogénica e os antibióticos colistina e ácido naladixico. Um especimen é inoculado com a formulação de detecção. Se estiver presente a família Klebsiellae, a ortonitrofenil-E-D-glucose é metabolizada com a libertação da parte ortonitrofenilo. Esta par te, quando liberta, torna-se amarela. Por isso, a cor amarela no especimen indica a presença dos micróbios de alvo, isto é, a família Klebsiellae. Não se desenvolvem outros micróbios porque não podem metabolizar o indicador, ortonitrofenil-β-D-glucose. '<ão haverá competição microbiana com outros micróbios porque não se desenvolvem nem metabolizam.

Staphylococcus aureus pode ser identificado na presença de outros Staphylococci numa amostra de águas misturadas porque este micróbio de alvo pode metabolizar PO,. Ortonitrofe•4 nilo ligado a fosfato pode ser usado como indicador metaboliza— vel no meio de análise para detectar esta espécie. Após a amos12 tra que contem a mistura ser misturada com o meio, só Staphylo- * coccus aureus pode metabolizar o nutriente no meio e libertar o indicador, fazendo com que seja observada uma côr amarela. Sao eliminados do especi.nen, bactérias gram negativas e levedura p£ la adição de colistina, ácido naladixico e ansiomicina, respec tivamente .

Azoto e enxofre são metabolizados por micróbios prin cipalmente nas suas formas reduzidas como amino grupos e sais de amónia

e grupos absolutamente necessários sulfidrilo (SI:) . : al como carbono para o desenvolvimento, azoto e , são enxofre. Este invento utiliza o mesmo principio descrito para carbo no para sintetisar testes que utilizam substratos hidrolizaveis ligados a azoto ou enxofre para detectar e enumerar micróbios.

Um dos exemplos é a detecção de iycobacterium fortui tum Esta bactéria requer como fonte de enxofre, o ião de sulfato, SO, 0 indicador-nutriente sulfato de fenolftalei na é normalmente in color. Xum meio com todos os constituintes requeridos para crescimento, excepto uma fonte de enxofre, só Mycobacterium fortui tum do gene iycobacterium pode utilizar sulfato. Por isso, só esta espécie cresce e metaboliza. A sua presença é demonstrada pela coloração vermelha produzida pela fenolftaleina, parte cromogénica liberta.

Outro exemplo do uso dum nutriente que pode ser convertido num indicador—nutriente é o composto triglicerido-ortonitrofenilo. 0 geng Fusobacterium é a única bactéria anaeróbia gram negativa de importância médica que utiliza triglicérido para crescer e metabolizar. Se fôr inoculada una amostra contendo Fusobacterium num meio anaeróbio contendo todos os requisitos de desenvolvimento e triglicérido—ortonitrofenilo como fonte primária de triglicérido, só Fusobacterium pode metabolizar. 0 seu me tabolismo é demonstrado pela cor amarela produzida pela libertação da sua parte ortonitrofenilo.

Este invento é efectuado para o individual, espécie ou genus de micróbios de alvo escolhendo-se um indicador-nutriente que só os micróbios de alvo podem usar como nutriente primário para substituir um nutriente geral no meio. Assim, o meio é especifico e não um melo geral.

Γ. coli nao pode metabolizar o adonitol do açúcar, enquanto que Xlebsiella pneumoniae (K. pneuiioniae) pode. Por isso, E. coli não se desenvolve, -netaboliza ou multiplica se adonitol fôr o único nutriente no meio, ao passo que com 11. pneumoniae é o contrário. Pode ser criado um meio, baseado neste facto proporcionando todos os factores de crescimento que n.pneumoniae requer sendo adonitol o nutriente principal com que K.pneumoniae metaboliza e se desenvolve. Se estiver E. coli, uma bactéria relacionada, presente no mesmo meio, não se desenvolve nem metaboliza. Por consequência, uma parte cromogénica ligada a adonitol serve como indicador-nutriente para detectar o crescimento e me tabolismo de K. pneumoniae na presença dum especimen misturado com E. coli.

Os indicadores—nutrientes são moléculas artificiais que até agora nunca foram usados como nutrientes primários. Tal como o exemplo de adonitol, um cromogeno—nutriente particular é atacado pelo micróbio de alvo e liberto por uma parte que provoca coloração. Graças ao facto de outros micróbios não o poderem te, bem metabolizar, nao se desenvolvem.

Uma amostra do especimen é introduzida num recipien— um frasco. 0 invento é adicionado ao especimen e Se a amostra fôr sólida, pode estiverem presentes o micróbio tal como, mis turado te aquoso. Se em ser usado um diluen— ou grupo de micrócôr (em qualquer bios em alvo, altura a partir da pèrxodo de inoculação). Não há tempo técnico ou trabalho requerido depois da o invento provoca a mudança de inoculação do invento. Também, pelo facto de o ponto final ser é preciso pessoal treinado para uma mudança de cor definida, nao determinar a positividade.

Estão à disposição substratos para detectar especifi camente coliformed fecais (E. coli), coliformes totais, o grupo

Klebsiella-Enterobacter-Serratia e Streptococcus faecalis.

I

Este invento é particularmente util para analisar água. Para analisar água, se necessário, pode ser adicionado tiosulfato de sódio ou sódio EDTA para neutralizar antibacterias que se encontram na água.

Para analisar água a respeito de E. coli pelo invento, é seguido o seguinte processo:

1. í colhida uma amostra de água. Usando uma pipeta pré-calibrada, são metidos em cada uin de três tubos 1,0 milili- tros, 0,1 mililitro e 0,01 mililitro. C meio supracitado invento é adicionado em forma de pó (alternativamente, o pode estar presente em fornia de pó nos tubos).

2. Os tubos são incubados a entre 20⁹C (?0 F) deste invento (lhoep).

3. A presença de E. coli é indicada pela mudança de cor no tubo.

4. Se estiverem presentes mais do que 100 E. coli/ml, tubo de 0,01 dá resultado positivo; se estiverem mais do que

E. co1i/m1 presentes, o tubo de 0,1 ml dá resultado positivo; estiver presente menos do que um E. coli/ml, só o tubo de 1 dá resultado positivo.

Um teste positivo pode tempo depois da inoculação com urha amostra inoculada pesadamente até 20 horas, se houver uma de amostra. A única manipulação técnica é a adição da água aos tubos por meio das pipetas pré-calibradas.

se ml dar-se em qualquer altura, pouco bactéria presente por mililitro mesmo meio conforme acima descrito foi usado para analisar água no teste de presença ou ausência (p-A) de E. coli.

1. Uma anostra de 100 ml foi metida num recipiente contendo o meio supracitado deste invento.

2. Quando a mistura de reacção muda de côr (um máximo de 18 horas), E. coli está presente e o teste é positivo.

2. Testes confirmatórios ou quaisquer outros não são necessários.

e procedeu-se à análise de acordo com o protocolo EPA para a certificação de novos dispositivos. 0 processo deste invento é especifico e não requer quaisquer testes confirnatórios. 0 teste foi realizado para dois micróbios de alvo; E. coli e coliformes totais. A fórmula de base foi feita conforme acima descrito; só foi mudado o substrato hidrolizavel para a detecção dos micró bios de alvo, particulares.

A descrição deguinte refere-se ao fornato para formulação de auto-analise rápida.

A formulação de auto—análise foi feita com vários substratos para 3-glucuronidase e B-galactosidase e analisada no campo. 0 substrato de B-glucuronidase é para E, coli; a formulação de B-galactosidase é para coliformes totais; os dois substratos em os micróbios simultaneamente. Foi feita de auto-análise no formato do teste P-A com membrana.

auto—análise foi efectuada para dois conjunto identificam ambos a comparação da formulação com a técnica de filtração

A formulação de tipos de micróbio(s) de alvo: E. coli e coliformes totais. Foram analisados substratos diferentes para B-glucuronidase (E. coli)e B-galactosidase (coliformes totais) de acordo com as partes de produção de côr

Os substratos foram variados (cromogénicas) da molécula ânnlisados

Substratos para B-glucuronidase 1) Os seguintes substratos para separadamente a respeito da sua

B-glucuronidase foram capacidade em detectar ortonitrofenil-glucuronido: fica amarelo quando hidrolisado

- metilumbeliferono-glucuronido; torna-se fluorescente a 366 nra quan do BiiHrolizado.

- bromo-cloro-indolo-glucuronido: torna-se azul quando hidrolizado.

2) Os seguintes substratos para B-galactosidase foram analisados separadamente a respeito da sua capacidade dm detectar coliformes totais.

- ortonitrofenil galactosido: torna-se amarelo quando hidrolizado.

- metilunbeliferono-galactosido: torna-se fluorescente a 366 mn quando hidrolizado.

3) As seguintes combinações foram analisadas a respeito da sua capacidade em determinar simultaneamente a presença de E. coli e/ou coliformes totais:

- netilumbeliferono-glucosido + ortonitrofenilgalactopiranosido: se estiver presente E. coli (coliformes fecais), a solução do teste torna-se fluorescente a 366 nm; se estiverem presentes co — liformes totais, torna-se amarela; se estiverem presentes ambos os tipos de coliformes, a solução torna-se fluorescente e amarela.

bromo-cloro-indolo-B-glucosido para detectar E.coli (coliformes fecais) + metilumbelifono-galactopiranosido para detectar coliformes totais: se estiver presente E. coli (coliformes fecais), a solução do teste torna-se azul; se estiverem presentes coliformes totais, torna—se amarela; se estiverem presentes ambos, a solução torna—se azul e fluorescente.

Meios jásicos analisados

1’ são usadas as seguintes formulas básicas:

- substratos cromogénicos em formulação de auto-análise.

- substratos cromogénicos em caldo de lauril lactose triptose.

Resultado s

1) Ensaio a respeito da presença de E.coli com o uso de metilumbeliferono glucuronido em caldo de lauril lactose triptose. Úsaram-se 75 especimens de água natural, sem tratamento proveniente dum lago de reservatório. A técnica de filtração por membrana deu 12 resultados positivos para colifor.nes totais e 12 para coliformes fecais. C caldo de lauril lactose triptose que continha o indicador detectou 6 casos de coliformes totais e 2 casos de E. coli. 0 tempo médio de identificação foi 16,5 horas. Os pontos finais foram difíceis de determinar devido à turvação e fermeíação da lactose provocada por bactérias eem ser as coliformes. 0 uso de lauril lactose como base foi interrompido e este meio não continuou a ser investigado .

2) Ensaio a respeito da presença de E. coli (coliformes fecais) com o uso de ortonitrofenil-galactosido em formulação de auto-análise. Foram Analisados 35 especimens de água natural, sem tratamento, proveniente dum lago de reservatório. 0 método de auto-analise e filtração com membrana, cada um destes, obteve um resultado positivo.

o tempo médio de identificação foi de 18 horas.

3) Substrato de metilumbeliferono-3-glucuronido para E. coli (coliformes fecais) + ortonitrofenil-B-galactopiranosido para coliformes totais, ensaiados simultaneamente.

Foram analisados 80 especimens de água natural, sem tratamento, proveniente dum lago de reservatório. A técnica de filtração por membrana obtive zero resultados positivos para coliformes fecais e oito para coliformes totais. A formulação de auto-análise detectou zero E. coli e oito casos positivos de coliformes totais, o tempo médio de detecçao foi de 18 horas.

U ) 'oro no-c loro-indolo-“-F-glucuroni do para E. coli (coliformes fecais) -r íietilunbeliferono-galactopiranosido para coliformes totais, ensaiados simultaneamente,

Foram analisados 10 especimens de ágna natural, sem tratamento proveniente dum lago de reservatório. A técnica de

filtração com	membrana deu um resultado positivo para colifor
mes totais. A	formulação auto-analitica detectou um resultado
positivo para	coliformes totais na mesma amostra. 0 tempo mé-

dio de identificação foi de 22 horas.

5) Crtonitrofenil-3-galactopiranosido para coliformes totais.

Foram analisados 50 especimens de água tratada proveniente do sistema de distribuição. A técnica de filtração com membrana deu dois resultados positivos para coliformes totais ( 2 CFU/lCO :nL). A formulação de auto—análise detectou os mesmos dois coliformes totais. 0 tempo médio de detecção foi de 17 horas.

6) metilumbeliferono-3-galactosido para coliformes totais.

Foram analisados 20 especimens de água tratada proveniente do sistema de distribuição. As técnicas de filtração com membrana e formulação de auto-análise obtiveram ambas um caso positivo total e o mesmo de coliformes totais. 0 tempo médio de identificação foi de 18 horas.

7) letilumbeliferono-B-glucuronido para E. coli (coliformes totais ) + bromo-cloro-indolo-3-galactosido para coliformes totais ensaiados simultaneamente.

Foram analisados 5θ especimens de água natural, sem tratamento proveniente dum lago de reservatório. A técnica de filtração com membrana deu 16 resultados positivo para coliformes totais e dois para E. coli. A formulação detectou os mesmos 16 mais dois casos adicionais de coliformes totais e dois casos de E. coli. C tempo médio de identificação foi de 13 horas.

Indicadores—nutrientes utéis em ligação com este invento podem ser produzidos da maneira seguinte:

erivados de ortonitrofenilo

A mistura solvidos em 420 ml de reacção é: 42 g de C-nitrofenilo são disde água destilada contendo 16,8 g de EaCE.

A esta solução foi topiranosilo em

620 ml de acetona. Pepois da reacção ser reasolvente suspenso lac topi rano sido

Parani trofeniIsulfatase fecidos para

4?C, são adicionados 7,2 ml de ácido clorosulfónico e ainda

13,9 g‘ de p-ni trof enol, misturados e repousar durante a noite. * adicionados hidróxido deixados a de potássio

0,4X 10G ml. São capturados cristais amarelos brilhantes aquecendo a mistura a 80²C., sendo evaporado o disulfureto de carG substrato, p-nitrofenilo, e recristalizado de álcool embalado em quantidades prontas-a-usar, especificas, para uma grande variedade de micróbios de alvo. 0 meio assim preparado pode incluir componentes antibióticos, caso se queira.

Visto que podem ser usadas muitas alterações das formas de execução reveladas deste invento sem que haja afastamen to do conceito inventivo, não se pretende limitar o invento a não ser ao que é necessário pelas reivindicações apensas.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para determinar a presença ou ausência de micróbios-alvo numa amostra, caracterlzado por se combinar um meio específico com uma amostra do especimen o referido meio compreendendo quantidades operativas de ingredientes essenciais necessários para apoiar o crescimento do referido micróbio-alvo e um indicadornutriente que é essencialmente o único nutriente no referido meio que pode ser metabolizado pelo referido micróbio-alvo e com respeito aos micróbios viáveis no especimen só pode ser metabolizado pelo referido micróbio-alvo incluindo o referido indicador nutriente uma parte metabolizável e uma parte que altera a amostra sendo esta última apenas liberta quando o referido indicador-nutriente for metabolizado pelo referido micróbio-alvo com o que é alterada uina caracteristica sensível da amostra.
2. 2. Processo como reivindicado em 1, caracterizado por compreender ainda uma quantidade efectiva de material antibiótico para impedir que o referido indicador-nutriente seja metabolizado por quaisquer micróbios competitivos nãoalvejados,sendo o referido material antibiótico ineficaz contra o micróbio-alvo.

   5. Processo como reivindicado em 1, caracterizado pelo acto da referida parte que altera a amostra ser um cromogene que quando liberto por metabolização do indicador-nutriente altera a côr da amostra do especimen.
3. 4. Processo como reivindicado em 1, caracterizado por o meio específico para adição a uma amostra dum especimen a fim de determinar a presença ou ausência de E.Coli numa amostra do especimen compreender quantidades operativas de ingredientes essenciais necessários para apoiar o crescimento de E.Coli e um substracto croinogénio d eenzima de B-glucuronidase metabolizàvel por E.Coli e que quando metabolizado liberta um cromogeno que alter a côr do especimen.
4. 5.Processo como reivindicado em 4, caracterizado pelo facto do referido substracto cromogénico de B-glucuronidase ser um glucoronido escolhido do grupo que consiste de ortonitrofeni1-B-Dglucoronido, B-naftalamida-B-D-glucuronido e bromo-cloro-indoleB-D-g1ucoronido e mistruas destes.

   ó.Proceseo como reivindicado em 4,caracterizado por compreender ainda uma quantidade efectiva de material antibiótico operàvel para tornar quaisquer micróbio competitivo incapazes dc metabolizar o referido substracto cromogénico.
5. 7. Processo como reivindicado em 4,caracterizado pelo facto do referido material antibiótico ser operàvel selectivamente contra bactérias gram positivas.
6. 8. Processo para determinar a presença ou ausência de micróbios-alvo numa amostra caracterizado por o meio específico compreender quantidades operativas de ingredientes essenciais para apoiar o crcecimento de bactérias gram negativas quantidades efectivas de material antibiótico operàvel para tornar qualquer levedura e bactérias gram positivas na amostra do especimen incapazes de metabolizar nutrientes e um substracto cromogénico de enzima de L-alanina aminopeptidas e metabolizàvel por bactérias gram negativas e que,quando metabolizada liberta um cromogeno que altera a cor do especimen.
7. 9. Processo como reivindicado em 8,caracterizado pelo facto do referido substracto cromogénio de L-alanina aminopeptidase.ser uma alanina escolhida do grupo que consiste de L-alanina-B-ortoniLrofenilo,B-naftalamida-B-L-alanina, alfa-naftol-B-L-alanina, metilumbiliferil-B-L-alanina e misturas destes.
8. 10. Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por o referido meio ser na forma dum pó não esteri1izado,aquo-solúvel.
9. 11. Processo como reivindicado em 10,para determinar a presença ou ausência dum micróbio-alvo numa amostra dum especimen aquoso depois da sua adição, caracterizado por o referido meio compreender aproximadamente 10% e aproximadamente 50% em peso dum composto contendo azoto,aproximadamente 0,06% a aproximadamente 1,0% em peso de amino, ácidos essenciais ao desenovo1vimento do referido micróbio alvo,aproximadamente 0,09% e aproximadamente 0,60% em peso de vitaminas essenciais ao desenvolvimento do referido micróbio alvo,aproximadamente de 0,05% e aproximadamente 0,70% em peso de elementos essenciais ao desenvolvimento do referido micróbio alvo,aproximadamente de 6,4% e aproximadmaente 85% em peso de sais essenciais ao desenvilvimento do referido micróbio alvo e aproximadamente de 1,2^% a aproximadamente de 2,0%dum indicador-nutriente que é o único nutriente no referido meio que pode ser metabolizado pelo referido micróbio alvo e que é um nutriente que não pode ser metabolizado por outros micróbios viáveis na amostra o referido indicador-nutriente quando metabolizado pelo referido micróbio alvo libertando uma parte que altera uma caracteristica sensível da amostra.
10. 12. Processo como reivindicado em 1,caracterízado pelo facto dos ingredientes necessários para apoiar o crescimento do micróbio-alvo serem vitaminas e minerais.
11. 13. Processo para determinar a presença ou ausência de micróbios-alvo numa amostra caracterizado pelo referido processo compreender as seugintes fases:

    a) obter -se pelo menos uma amostra do especimen com um volume desconhecido;

    b )adicionar-se à amostra do especimen uma quantidade pré-determinada dum meio que é solúvel na amostra do especimen e que contém quantidades efectivas de ingredientes essenciais para provocar o desenvolvimento do micróbio-alvo e um indicadornutritivo que é o único nutriente no meio que o micróbio-alvo pode metabolizar e que não pode ser metabolizado por outros micróbios viáveis na amostra do especimen sendo o referido indicador-nutriente operável para alterar uma caracteristica sensível da amostra do especimen quando metabolizado pelo micróbio-alvo e,

    c)vigiar-se a amostra do especimen e o meio, misturados durante,pelo menos aproximadamente vinte horas ou até a referida caracteristica ter sido alterada para verificar a presença ou ausência do mciróbio-alvo.
12. 14. Processo de acordo com a reiu indicação 13,caracterizado pelo facto do referido meio ser adicionado a uma amostra do especímen de 1,0 ml a uma amostra do especímen de 01,1 ml e uma amostra do especímen de 0,01 e todas as misturas da amostra do especímen e meio serem vigiadas a respeito da alteração de caracteristica para se verificar a concentração do referido micróbio alvo no especímen.
13. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo facto do compreender ainda a fase de’serem incubadas as misturas amostra do especímen-meio a uma temperatura no âmbito de aproximadamente 20^ c e aproximadmaente 44,5^0 durante a sua vigilância.
14. 16. Processo de acordo com a reivindicação 13 , caracterizado pelo facto (de compreender ainda a fase de se adicionar à amostra do especímen uma quantidade efectiva d ematerial antibiótico a fim de tornar quaisquer micróbios,desde que não sejam os micróbios-a 1vo,incapazes de metabolizar o referido indicador-nutriente.