CN114034860A - 一种结核分枝杆菌mtb39a蛋白抗体间接elisa检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种结核分枝杆菌mtb39a蛋白抗体间接elisa检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种结核分枝杆菌MTB39A(PPE18)蛋白抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒，该方法及试剂盒针对MTB39A(PPE18)蛋白抗体具有特异性强、灵敏度高、稳定性良好等优势。

Description

一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法及其 试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体检测领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法，以及根据该检测方法制备的检测试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病(tuberculosis，TB)的病原体，也是单一感染微生物导致死亡的最重要原因，是一类世界性的人兽共患传染病，一直受到国内外研究者的普遍关注。
该菌的致病物质主要是荚膜，脂质以及蛋白质；1999年，Corixa Corporation公司克隆了一个新基因—MTB 39A(PPE18)，该蛋白分子量为39kD，等电点为4.8088。免疫印迹分析证明MTB 39A(PPE18)在结核分枝杆菌的裂解物中，表明它不是分泌性抗原。纯化的重组MTB 39A(PPE18)在12名PPD(结核菌素)阳性个体中的9名外周血单核细胞中引发了强烈的T细胞增殖和γ干扰素反应。
目前多项研究均认为，MTB 39A(PPE18)蛋白可以提供对结核分枝杆菌的部分保护。这些结果可以进一步评估MTB 39A(PPE18)作为亚单位疫苗的组成部分，因此MTB 39A(PPE18)可以被用作结核分枝杆菌的诊断性生物标志物进行检测。
目前，对该蛋白的检测尚缺乏相关的检测产品，临床上亟需一种操作方便，敏感性高，特异性好，稳定可靠的方法进行养殖场动物及人类中结核分枝杆菌的流行病学调查和抗体水平的检测，因此，建立一种针对结核分枝杆菌MTB39A(PPE18)蛋白抗体的间接ELISA检测方法非常有必要。
发明内容
为解决上述问题，一方面本发明提供一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括MTB 39A(PPE18)蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液。
另一方面，本发明提供一种检测结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的方法，包括如下步骤：
(1)抗原包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白；
(2)洗涤液洗板，封闭；
(3)洗涤液洗板，加入待测抗体或待测血清，以及阴性对照；
(4)洗涤液洗板，加入酶标山羊抗兔IgG作为二抗；
(5)洗涤液洗板，加入显色液；
(6)加入终止液，测定OD450nm数值；
(7)结果判断：当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。
本发明所提供的检测方法及检测试剂盒具有以下优点：
1、特异性强，利用本方法对实验室保留的结核分枝杆菌牛阳性血清及人阳性血清和采集的健康牛和人血清进行检测，结果显示，只有结核分枝杆菌阳性血清为阳性，而健康人或健康牛血清均为阴性，表明所建立的检测体系具有良好的特异性；
2、灵敏度高，将兔多克隆抗体按照倍比稀释，对建立并优化好的间接ELISA检测方法进行敏感性测试，实验结果显示在兔多克隆抗体稀释到1:32768时OD450为1.385，仍在阳性临界值0.282以上，说明建立并优化好的间接ELISA检测方法敏感性较高；
3、稳定性良好，利用建立好的间接ELISA检测方法，对结核分枝杆菌MTB 39A蛋白、抗体进行批次和批间检测，计算变异系数，验证该方法的稳定性，试验结果显示3次批内检测变异系数为1.01％-2.38％，3次批间检测变异系数为1.10％-1.82％，批间和批内重复的变异系数均小于5％，表明建立的该方法具有良好的稳定性。
附图说明
图1：结核分枝杆菌MTB 39A蛋白的表达、纯化及鉴定结果图；泳道1:1mM IPTG诱导表达后沉淀；泳道2：1mM IPTG诱导表达后上清；泳道3-4：纯化后蛋白；泳道5-6：包涵体蛋白粗制品；泳道7：包涵体蛋白粗制品上清。
图2：重组蛋白的SDS-PAGE的His鉴定；泳道1:包涵体蛋白粗制品上清；泳道2：包涵体蛋白粗制品；泳道3-6：纯化后蛋白；
图3：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与人阳性血清进行western blot鉴定；
图4：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与人阴性血清进行western blot鉴定；
图5：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与牛阳性血清进行western blot鉴定。
图6：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与牛阴性血清进行western blot鉴定。
图7：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA反应条件的优化结果，其中7-A为抗原包被浓度优化，7-B为封闭时间优化，图7-C为一抗稀释比例优化，7-D为二抗稀释比例优化；
图8：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA临界值的确定。
图9：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白的兔多克隆抗体特异性试验结果。
图10：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA检测方法灵敏度试验结果。
图11：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA检测方法稳定性试验。
具体实施方式
一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括MTB 39A(PPE18)蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液；
优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白具有SEQ ID NO:1所示的序列；
优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.25-2.5μg/mL，例如0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，1.5μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL；优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.25-1.5μg/mL；更优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.5μg/mL；
优选地，所述酶标山羊抗兔IgG为HRP-山羊抗兔IgG；
优选地，所述洗涤液为PBST；更优选地，所述洗涤液为1L的0.01M PBS溶液(8mMNa2HPO4，8mM NaCl，8mM KH2PO4，8mM KCl)中加入2‰Tween-20混匀制得的PBST；
优选地，所述包被液为0.5-1.0M的Na2CO3/NaHCO3缓冲液；更优选地，所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液；
优选地，所述封闭液为BSA或脱脂奶粉，封闭液浓度为1-5％；更优选地，所封闭液为5％BSA；
优选地，所述显色液为TMB；
优选地，所述终止液为H2SO4，例如2M H2SO4。
在一个优选的实施方案中，本发明结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被浓度为0.5μg/mL的MTB 39A(PPE18)蛋白(SEQ ID NO:1)，HRP-山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液；
优选地，所述洗涤液为1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得的PBST；
优选地，所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液；
优选地，所述封闭液为5％BSA；
优选地，所述显色液为TMB；
优选地，所述终止液为2M H2SO4。
另一方面，本发明提供一种检测结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的方法，包括如下步骤：
(1)抗原包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白；
(2)洗涤液洗板，加入封闭液封闭；
(3)洗涤液洗板，加入待测抗体或待测血清，以及阴性对照；
(4)洗涤液洗板，加入酶标山羊抗兔IgG作为二抗；
(5)洗涤液洗板，加入显色液；
(6)加入终止液，测定OD450nm数值；
(7)结果判断：当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。
优选地，步骤(1)抗原包被是以包被液稀释包被抗原至0.25-2.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB39A蛋白(SEQ ID NO:1)，所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液，pH值为9.6；
优选地，步骤(2)所述封闭液为5％BSA；封闭孵育时间为30-120min；
优选地，步骤(3)所述待测抗体为结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白的抗体，待测血清为含有结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的血清，所述阴性对照为正常兔血清；
优选地，步骤(4)所述酶标山羊抗兔IgG为HRP-山羊抗兔IgG；
优选地，步骤(5)所述显色液为TMB；
优选地，步骤(6)所述终止液为2M H2SO4；
优选地，步骤(2)-(5)中洗涤液为PBST；
优选地，步骤(7)中X为0.207，标准差SD为0.025，阳性临界值为0.282，阴性临界值为0.257。
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种检测结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的方法，包括如下步骤：
(1)以包被液稀释包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白(SEQ ID NO:1)；所述包被液为0.85MNa2CO3/NaHCO3缓冲液，pH值为9.6；
(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入5％BSA作为封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；
(3)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入待测抗体或待测血清，阴性对照为正常兔血清，100μL/孔，37℃保温1小时；
(4)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入HRP-山羊抗兔IgG为二抗，100μL/孔，室温1小时；
(5)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入TMB溶液100μL/孔，室温下避光10分钟；
(6)加入2mol/L H2SO4溶液作为终止液，测定OD450nm数值；
(7)结果判断：当样品OD450nm值>0.282时，判定为阳性；OD450nm值<0.257时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑；
优选地，所述0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液的制备方法为称取NaHCO32.93g以及Na2CO3 1.59g，加蒸馏水定容至1L；
优选地，所述PBST溶液1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得；
优选地，所述5％BSA的制备方法为称取牛血清蛋白5g,，加0.01M PBS溶液定容至100mL。
在某些实施方案中，本发明提供一种结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗原包被条件，优选地，将MTB 39A重组蛋白用包被液稀释至浓度为0.25-2.5μg/mL，例如0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，1.5μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL；优选地，所述MTB 39A蛋白包被浓度为0.25-1.5μg/mL；更优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白稀释至浓度为0.5μg/mL。
在某些实施方案中，本发明提供一种优化的封闭液封闭孵育时间，优选为30-120min；更优选为120min。
在某些实施方案中，本发明提供一种优化的HRP-山羊抗兔IgG稀释比例，优选为1:1000-8000，例如1:1000、1:2000、1:4000、1:8000；更优选为1:4000。
在某些实施方案中，本发明待测抗体是指结合结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白的抗体，例如重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白的兔多克隆抗体；本发明待测血清是指含有结合结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的血清，例如含有重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白的兔多克隆抗体的血清；
在某些实施方案中，本发明待测抗体或待测血清稀释比例可以为1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096、1:8192、1:16384；优选为1:4096。
在某些实施方案中，本发明重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白序列(SEQ ID NO:1)为：MVDFGALPPEINSARMYAGPGSASLVAAAQMWDSVASDLFSAASAFQSVVWGLTVGSWIGSSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGQAELTAAQVRVAAAAYETAYGLTVPPPVIAENRAELMILIATNLLGQNTPAIAVNEAEYGEMWAQDAAAMFGYAAATATATATLLPFEEAPEMTSAGGLLEQAAAVEEASDTAAANQLMNNVPQALQQLAQPTQGTTPSSKLGGLWKTVSPHRSPISNMVSMANNHMSMTNSGVSMTNTLSSMLKGFAPAAAAQAVQTAAQNGVRAMSSLGSSLGSSGLGGGVAANLGRAASVGSLSVPQAWAAANQAVTPAARALPLTSLTSAAERGPGQMLGGLPVGQMGARAGGGLSGVLRVPPRPYVMPHSPAAGHHHHHH
实施例1：重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白表达与纯化
选择结核分枝杆菌H37Rv标准株MTB 39A蛋白特定抗原表位相应的基因序列(GenBank ID：NC_000962.3)，设计了MTB 39A基因。用NdeI和Hind III酶切位点将目的基因构建至pET28a(+)载体(Invirogen，美国)，从-80℃冰箱取出50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Invirogen，美国)，加入十分之一体积的质粒，冰上孵育30min，立即在42℃热激90s，放回冰上，冰浴2min；加入500μL无抗的液体LB培养基，37℃180rpm振荡培养45min；取100μL使用无菌涂布棒涂于Kanna(100μL/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。转化涂板培养过夜，挑取2-4个阳性克隆，送吉林省库美生物科技有限公司进行测序鉴定。选取含测序正确的重组质粒菌株，标记为BL21(DE3)pET28a-39A。
取BL21(DE3)(pET28a-39A)冻存菌株划线在含卡那青霉素的LB固体培养基(OXOID，英国)上，过夜培养，挑取单菌落摇瓶培养，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃诱导表达3h，12000rpm离心收获菌体。
蛋白纯化步骤包括：
步骤a：离心收集2600mL诱导后重组表达菌体，用50mM Tris-Hcl清洗一次，菌体沉淀加入原体积的1/10 50mM Tris-Hcl重悬，超声破碎50min后，以12000r/min离心30min，洗涤沉淀，对培养所得的菌体用15mL溶解液溶解，12000r/min离心20min。取上清样品使用3.5kDa透析袋对目的蛋白的溶解液进行透析复性。用0.22μm孔径的滤器除去粗悬浮物，即可作为AKTA蛋白纯化系统的上样样品；
步骤b：加入处理好的菌体裂解液上样至5mL Ni-NTA凝胶柱中，样品全部加完后，加入500mM咪唑洗脱液进行洗脱His标签蛋白，收获100mM咪唑洗脱峰蛋白。
重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白经SDS-PAGE电泳，发现PAGE凝胶上的39kDa处有目的条带，表明BL21(DE3)(pET28a-39A)表达并纯化所获得的目的蛋白为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白，如图1、2所示。
实施例2：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白western blot鉴定
对已获得的MTB 39A纯化蛋白进行Western-blot鉴定，经SDS-PAGE凝胶电泳后，小心撬开电泳凝胶板，裁取整块分离胶并放入预冷的湿转缓冲液，选取大小适当的NC膜，按“三明治”的形式从上到下依次摆放2层海绵、2张滤纸、分离胶、PVDF膜、2张滤纸、2层海绵，组装湿转系统，灌满预冷1×湿转缓冲液，没过“三明治”，室温300mA湿转120min；将PVDF膜从湿转系统中取出，并用0.1％TBST润洗2-3次，每次5min，加入适量5％脱脂牛奶，室温摇床上封闭60min；0.1％TBST润洗封闭后的PVDF膜3次，每次5min；孵育一抗(人结核病阳性血清；人阴性血清；牛结核病阳性血清；牛阴性血清)，稀释比例为1:100，4℃下摇床，过夜封闭；再用0.1％TBST润洗PVDF膜3次，每次5min；孵育二抗，稀释HRP标记的对应种属的二抗，比例为1:5000，室温下摇床孵育60min，0.1％TBST润洗PVDF膜3次，每次10min；按1：1的比例将ECL发光剂中A液和B液混匀，将膜取出并用滤纸吸干，加入配好的发光反应液，放入图像采集仪内成像。结果如图3-6所示，只有结核分枝杆菌阳性血清为阳性，表明所建立的检测体系具有良好的特异性。
实施例3：重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白多克隆抗体制备与纯化
将MTB 39A蛋白用BCA蛋白定量试剂盒分别定量后，均稀释成1mg/mL浓度备用。
动物免疫均使用背部皮下多点注射途径，在第0、10、20和30d分别进行免疫。每次免疫均用等体积弗氏佐剂对抗原进行乳化，即均为1mL佐剂+1mL1mg/mL浓度的抗原。其中，第一次免疫使用弗氏完全佐剂，其余三次加强免疫均使用弗氏不完全佐剂。在第0d免疫前分别对每组实验兔进行耳缘静脉取血，分离血清，作为阴性对照血清。在第37d对每组实验兔进行心脏取血，并分离血清。
将待纯化的抗血清用0.45μm滤膜过滤除杂后，上Protein AAgarose重力柱，并结合30min，使血清中的IgG与Protein A充分结合。弃去柱内液体，用10倍柱体积TBS溶液洗涤，去除非特异性结合的蛋白，并对洗脱下的液体通过NanoDrop测定280nm的吸光度，持续洗涤直至洗脱不下杂蛋白。洗涤完后，用10mL 50mmol/L的甘氨酸(pH 1.9)溶液作为洗脱液，洗脱结合上的特异性抗体。分管收集，根据蛋白浓度确定目标抗体洗脱在哪个收集管中。最后用1mol/L NaHCO3溶液中和洗脱后的抗体液，加入甘油至终浓度为50％，置于-20℃保存。
实施例4：蛋白抗原包被条件的确定
采用方阵滴定法，以MTB 39A重组蛋白为包被抗原，将MTB 39A重组蛋白用包被缓冲液作稀释，按每孔浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL稀释，酶标板每孔加100μL，4℃包被过夜；以5％BSA孵育120min为封闭条件，以纯化的兔多克隆抗体为一抗，HRP-山羊抗兔IgG(proteintech，SA00001-2)为二抗，TMB为显色液，2MH2SO4溶液为终止液，测定OD450nm数值检测吸光度值，当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。实验结果如图7-A所示，最佳包被浓度为0.5μg/mL。
实施例5：封闭条件的确定
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的MTB 39A(PPE18)重组蛋白为包被抗原，以5％BSA孵育30min、60min、90min和120min为封闭液，纯化的兔多克隆抗体为一抗，HRP-山羊抗兔IgG为二抗，TMB为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。如图7-B所示，封闭120min时，吸光值最大。
实施例6：MTB 39A(PPE18)重组蛋白多克隆抗体稀释比的确定
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的MTB 39A重组蛋白为包被抗原；以5％脱脂奶粉孵育120min为封闭条件，纯化的兔多克隆抗体为一抗，分别用0.01MPBS稀释至1:128、1:256,、1:512、1:1024、1:2048、1:4096，设PBS为空白对照，HRP-山羊抗兔IgG为二抗，TMB为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。结果如图7-C所示，最佳稀释倍数为1:4096。
实施例7：HRP-山羊抗兔IgG稀释度的确定；
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的MTB 39A(PPE18)重组蛋白为包被抗原，以5％脱脂奶粉孵育120min为封闭条件，纯化的兔多克隆抗体稀释1024倍为一抗，HRP-山羊抗兔IgG按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000梯度进行稀释为二抗，TMB为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。结果如图7-D所示，选取阳性OD450nm/阴性OD450nm的比值最大为最佳梯度稀释倍数，即1:4000。
实施例8：间接ELISA检测方法临界值的确定
利用建立好的间接ELISA检测方法，对20份阴性抗体进行了ELISA测定，并计算这些样品的平均OD450值(X)和标准方差(SD)。当样品OD450值>X+3SD时，判定为阳性；OD450值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为疑似。通过统计学分析，其中阴性对照总体平均值为0.207，标准差SD为0.025，故阳性临界值为0.282，阴性临界值为0.257。如图8所示。
实施例9：本发明间接ELISA检测方法特异性验证
分别以MTB39A(PPE18)、沙门氏菌14208、藤黄微球菌、大肠杆菌83922、大肠杆菌83905、大肠杆菌83684的菌体培养物为包被抗原，以兔多克隆抗体为一抗，验证兔多克隆抗体的检测特异性。结果如图9显示，MTB39(PPE18)包被抗原OD450nm为2.241，其他几种菌OD450nm均低于阳性临界值0.282，说明兔多克隆抗体具有优秀的ELISA检测特异性功能。
实施例10：本发明间接ELISA检测方法灵敏度验证
通过将兔多抗按照倍比稀释，对建立并优化好的间接ELISA检测方法进行灵敏度验证，实验结果如图10所示，在兔抗血清稀释到1:32768时OD450nm为1.3855,仍在阳性临界值0.282以上，说明建立并优化好的间接ELISA检测方法灵敏度较高。
实施例11：本发明间接ELISA检测方法稳定性验证
利用建立好的间接ELISA检测方法，对PPE18蛋白的兔多克隆抗体、阴性抗体进行批次和批间检测，计算变异系数，验证该方法的稳定性，试验结果如图11所示，显示3批批内检测变异系数为1.01％-2.38％，3次批间检测变异系数为1.10％-1.82％，批间和批内重复的变异系数均小于5％，表明建立的该方法具有良好的稳定性。
序列表
<110> 宁夏大学
<120> 一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒
<141> 2021-11-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Ala Pro Gly Ala Leu Pro Pro Gly Ile Ala Ser Ala Ala Met
1 5 10 15
Thr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gly Met Thr
20 25 30
Ala Ser Val Ala Ser Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ser Ala Pro Gly Ser
35 40 45
Val Val Thr Gly Leu Thr Val Gly Ser Thr Ile Gly Ser Ser Ala Gly
50 55 60
Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Thr Val Ala Thr Met Ser Val Thr
65 70 75 80
Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Ala Gly Val Ala Val Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala
100 105 110
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Ala Leu Leu Gly
115 120 125
Gly Ala Thr Pro Ala Ile Ala Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Met
130 135 140
Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Met Pro Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ala
145 150 155 160
Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gly Ala Pro Gly Met Thr
165 170 175
Ser Ala Gly Gly Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Ser
180 185 190
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Leu Met Ala Ala Val Pro Gly Ala Leu
195 200 205
Gly Gly Leu Ala Gly Pro Thr Gly Gly Thr Thr Pro Ser Ser Leu Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro His Ala Ser Pro Ile Ser Ala
225 230 235 240
Met Val Ser Met Ala Ala Ala His Met Ser Met Thr Ala Ser Gly Val
245 250 255
Ser Met Thr Ala Thr Leu Ser Ser Met Leu Leu Gly Pro Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Ala Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Ala Gly Ala Gly Val Ala Ala
275 280 285
Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly
290 295 300
Val Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val
305 310 315 320
Pro Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Thr Pro Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Gly Ala Gly Pro Gly
340 345 350
Gly Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly Gly Met Gly Ala Ala Ala Gly
355 360 365
Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Ala Val Pro Pro Ala Pro Thr Val Met
370 375 380
Pro His Ser Pro Ala Ala Gly His His His His His His
385 390 395

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括MTB 39A蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液；所述MTB 39A蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述MTB 39A蛋白包被浓度为0.25-2.5μg/mL。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标山羊抗兔IgG为HRP-山羊抗兔IgG。
4.根据权利要求3所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述HRP-山羊抗兔IgG稀释比例为1:1000-8000。
5.根据权利要求1-4所述任意一项的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST；所述包被液为Na2CO3/NaHCO3缓冲液；所述封闭液为BSA或脱脂奶粉。
6.一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗原包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白，其蛋白序列如SEQ IDNO:1所示；
(2)洗涤液洗板，加入封闭液封闭；
(3)洗涤液洗板，加入待测抗体或待测血清，以及阴性对照；
(4)洗涤液洗板，加入酶标山羊抗兔IgG作为二抗；
(5)洗涤液洗板，加入显色液；
(6)加入终止液，测定OD450nm数值；
(7)结果判断：当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。
7.根据权利要求6所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：
步骤(1)抗原包被是以包被液稀释包被抗原至0.25-2.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液，pH值为9.6；
步骤(2)所述封闭液为5％BSA；封闭孵育时间为30-120min；
步骤(3)所述待测抗体为结核分枝杆菌MTB 39A蛋白的抗体，待测血清为含有结合结核分枝杆菌MTB 39A蛋白抗体的血清，所述阴性对照为正常兔血清；
步骤(4)所述酶标山羊抗兔IgG为HRP-山羊抗兔IgG；
步骤(2)-(5)中洗涤液为PBST；
步骤(7)中X为0.207，标准差SD为0.025，阳性临界值为0.282，阴性临界值为0.257。
8.根据权利要求7所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以包被液稀释包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白，具有如SEQ ID NO:1所示序列；所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液，pH值为9.6；
(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入5％BSA作为封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；
(3)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入待测抗体或待测血清，阴性对照为正常兔血清，100μL/孔，37℃保温1小时；
(4)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入HRP-山羊抗兔IgG为二抗，100μL/孔，室温1小时；
(5)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入TMB溶液100μL/孔，室温下避光10分钟；
(6)加入2mol/L H2SO4溶液作为终止液，测定OD450nm数值；
(7)结果判断：当样品OD450nm值>0.282时，判定为阳性；OD450nm值<0.257时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。
9.根据权利要求7-8任意一项所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述HRP-山羊抗兔IgG稀释比例为1:1000-8000。
10.根据权利要求6-9任意一项所述检测方法制备的结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。
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