CN115508561A - 一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒。所述方法由布鲁氏菌抗原刺激牛抗凝全血和刺激后牛抗凝全血上清检测特异性IFN‑γ两步组成。采用布鲁氏菌菌体灭活抗原(1×109CFU/mL)刺激牛抗凝全血，刺激后牛抗凝全血上清经牛IFN‑γ夹心ELISA方法检测，当牛群布鲁氏菌特异性IFN‑γ检测的个体阳性率≥80％判为免疫了布病疫苗，个体阳性率＜80％判为未免疫布病疫苗或免疫不合格，适用于评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗。本发明所述方法从细胞免疫水平监测布病疫苗免疫后牛群的整体免疫状况，克服了传统血清学抗体监测方法敏感性低、监测期短的技术难题，检测敏感性与特异性更高。

Description

一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒，属于兽用生物制品领域。
背景技术
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。WHO将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。
上世纪90年代我国曾通过疫苗免疫成功控制了人间与畜间布病疫情的发生率，进入2000年之后随着畜牧养殖业的快速发展和动物跨区域频繁调运，不论人间还是畜间疫情都呈现快速反弹趋势。根据农业农村部“兽医公报”发布的动物疫情，分析近6年我国牛羊报告新增病例情况(图1)：布病每年报告的新增病例占牛羊所有疾病报告病例总数的88.2％，其余8种相对重要的疫病报告新发病例总和只占11.2％。而2021年卫健委官方网站报道的人间布病新发病例为69767例，创历史最高水平，按照国际认可的实际发病人数是报道病例的10～25倍测算，我国2021年人间实际新增布病的人数达到惊人的69万人～172万人，健康和生产力损失无法计算。
世界布病防控实践反复证实，控制好动物布病是防控人间布病最经济最有效的策略。在布病流行严重的情况下，疫苗免疫是有效控制布病的唯一选择。我国政府已经充分认知到当前布病防控形势的严峻性，以及疫苗免疫对布病防控的重要性。2022年1月4日，农业农村部印发《国家动物疫病强制免疫计划指导意见(2022-2025年)》，历史上第一次明确提出对种畜以外的牛羊进行布病免疫，标志着我国布病防控政策由“分区免疫”调整为“全面免疫”。2022年3月28日，农业农村部进一步关于印发《畜间布鲁氏菌病防控五年行动方案(2022—2026年)》的通知，强调布病强制免疫工作要有效开展，要求免疫地区免疫密度常年保持在90％以上，免疫建档率100％，免疫奶牛场备案率100％，免疫评价工作开展率100％。
布鲁氏菌为胞内寄生细菌，目前国内外使用的所有布病疫苗均为活疫苗，我国可用于牛的布病疫苗主要有2种，分别为猪种布鲁氏菌S2株以及牛种布鲁氏菌A19株，相比于S2疫苗的口服免疫方式，A19疫苗因其注射免疫方式对人与环境更安全，因此在牛群免疫中应用最广泛。但是由于布病活疫苗以细胞免疫为主，无论采取注射免疫还是口服免疫方式，免疫后动物机体产生抗体水平均较低，采用传统抗体监测方法不能有效评估动物群体的免疫实施状况。在此背景下，建立一种能够评估牛群是否免疫了布病疫苗的方法显然是确保我国布病防控政策落实落地的有效保障。
本发明主要通过构建一种检测牛伽马干扰素(IFN-γ)的方法，经布鲁氏菌特异性抗原刺激后，从细胞免疫水平监测布病疫苗免疫后牛群的整体免疫状况，克服了传统血清学抗体监测方法敏感性低、监测期短的技术难题，最终发明了适用于评价牛群是否免疫了布病疫苗的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、敏感性高的利用结合牛IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体夹心法检测布病活疫苗(A19、S2)免疫后肉牛和奶牛血浆中经布鲁氏菌特异性抗原刺激前后的IFN-γ含量差异以评估牛群是否免疫布病疫苗的方法，解决目前布病疫苗免疫评估的技术难题。
本发明技术方案为：
1.一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于免疫了布病疫苗的牛群，在其免疫后的2～6周内采集抗凝全血，按本方法经布鲁氏菌特异性抗原刺激和牛IFN-γ夹心ELISA检测，根据检测结果计算待检牛群中布病个体阳性率即可判定该牛群是否免疫了布病疫苗。
2.本发明所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述方法分两步实现。第一步对采集的抗凝全血用布鲁氏菌特异性抗原刺激；第二步采用夹心ELISA方法检测抗原刺激后血浆中牛IFN-γ含量差异。
3.本发明所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述布鲁氏菌特异性刺激抗原的制备与刺激方法为：
(1)将猪种布鲁氏菌A19株(CVCC70202来自国家兽医微生物菌种保藏中心)菌悬液，80℃热灭活2小时后，用无菌0.01M PBS洗涤3次后重悬，调节菌液浊度，使其浊度约为1×109CFU/ml，以200W超声10分钟(超声5S，间歇5S)后即为特异性刺激抗原。
(2)无菌采集布病疫苗免疫后2～6周内牛抗凝全血，转移至24孔细胞板内，每孔1.5ml，每个样品转移2孔。第1孔中加入布鲁氏菌特异性刺激抗原，100μl/孔；第2孔中加入无菌0.01M PBS，100μl/孔。细胞板置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时，孵育后吸取上清为待检样品。
4.本发明所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述牛IFN-γ夹心ELISA检测方法按如下步骤建立：
(1)根据GenBank(FJ263670)中牛IFN-γ的基因序列设计一对特异性引物，利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的IFN-γ基因片段，大小为432bp。将其将克隆至pFastBacHTA中构建重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ，将重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒Bacmid-B-IFN-γ，转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒Bac-B-IFN-γ；应用sf21昆虫细胞悬浮培养技术表达大量目的蛋白，经纯化后得到纯度较高的重组牛IFN-γ。
(2)以纯化的牛IFN-γ免疫小鼠，采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，通过间接ELISA方法筛选分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行多次亚克隆，获得6株能稳定分泌特异性抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12。采用腹水诱生法大量制备单克隆抗体，并运用亲和层析法进行纯化。采用测相加指数法检测该6株单抗针对2个不同的抗原表位。经过配对ELISA建立以1D4单克隆抗体为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的4B5单克隆抗体为检测抗体的牛IFN-γ夹心ELISA方法。
(3)将纯化重组牛IFN-γ用含5％马血清的PBS稀释至15ng/ml作为牛IFN-γ夹心ELISA检测方法的阳性对照；将含5％马血清的PBS溶液作为牛IFN-γ夹心ELISA检测方法的阴性对照。
5.本发明所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品处理：布病活疫苗免疫后2～6周，无菌采集牛颈静脉血放于抗凝采血管，轻轻颠倒混匀后，分装至24孔细胞培养，每份抗凝全血分装至2个细胞培养孔，每孔1.5ml。在第1孔中加入布鲁氏菌特异性刺激抗原，100μl/孔；在第2孔中加入无菌0.01M PBS，100μl/孔。轻轻振荡混匀，细胞板置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时。收集上清，备用。
(2)加样：取1D4单抗包被板，每孔先加入50μl含1％BSA的PBS，再分别加入50μl检测样品(包括布鲁氏菌特异性抗原刺激和PBS刺激上清)，同时加入阴、阳性对照各1孔，50μl/孔。充分混匀，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl PBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。
(3)加入酶标抗体：用含1％BSA的PBS将辣根过氧化物酶标记的4B5单克隆抗体稀释100倍，100μl/孔，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl PBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。
(4)显色与终止：加入TMB显色液，100μl/孔，室温(22～26℃)避光反应30分钟。随后加入50μl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
(5)判定标准：当阳性对照ODPOS≥2.0；阴性对照ODNEG＜0.1，试验成立。待检样本经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值不低于0.2(即ODBRU-ODPBS≥0.2)为布病阳性；待检样品经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值低于0.2(即ODBRU-ODPBS＜0.2)为布病阴性。计算布病个体阳性率(即布病阳性个体数/牛群总数)，当待评估牛群布病个体阳性率≥80％判为免疫了布病疫苗，个体阳性率＜80％判为未免疫布病疫苗或免疫不合格。
6.本发明还提供了一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括上述方法中用到的试剂。
本发明的有益效果
本发明主要通过构建一种检测牛伽马干扰素(IFN-γ)的方法，经布鲁氏菌特异性抗原刺激后，可从细胞免疫水平对肉牛和奶牛免疫布病疫苗的状况进行监测，解决了布病疫苗免疫后不易监测的技术难题，满足了我国当前布病防控政策中对布病疫苗免疫效果评估的技术要求。
附图说明
图1 2016～2021年我国牛牛重要疫病报告病例统计图
图2扩增牛IFN-γ基因序列比对结果图
图3纯化后的牛IFN-γSDS-PAGE检测
图4牛IFN-γ夹心ELISA效价测定散点图
图5布鲁氏菌S2株、A19株灭活抗原超声10min后刺激阳性样本OD450nm差值图
具体实施方式
1.本发明建立了一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法及试剂盒
其核心是制备了布鲁氏菌灭活抗原作为特异性刺激抗原，刺激牛抗凝全血后吸取上清作为待检样品。制备筛选了2株结合不同抗原表位牛IFN-γ单克隆抗体1D4、4B5，将纯化的单克隆抗体1D4经定量后包被ELISA板作为捕获抗体，再以纯化的单克隆抗体4B5标记辣根过氧化物酶作为检测抗体，将纯化重组牛IFN-γ作为阳性对照，将含5％马血清的PBS溶液作为阴性对照，建立牛IFN-γ夹心ELISA方法。从细胞免疫水平检测布病疫苗免疫后牛群个体阳性率，评估牛群是否有效免疫布鲁氏菌病疫苗。
(1)本发明所提供的上述布鲁氏菌特异性刺激抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)取100μl布鲁氏菌A19株接种到50ml TSB培养基中，37℃振荡培养48小时。将菌液经80℃水浴2小时后进行灭活。8000rpm/min离心10分钟。菌体用0.01M无菌PBS重悬后离心，连续洗涤3次，最后重悬于PBS中。
2)吸取100μl将重悬后的菌液到无菌血清稀释板中，连续做2倍稀释至第11孔，第12孔作为空白对照。用酶标仪测量其OD600nm值，按照OD600nm为0.1时，菌液浓度为2.5×109CFU/ml，计算原菌液浓度。将菌液稀释至1.0×109CFU/ml，在200W(超声5S，间歇5S)超声条件下超声10min，制得布鲁氏菌特异性刺激抗原。
(2)本发明所提供的上述牛IFN-γ夹心ELISA方法制备与检测方法，包括以下步骤：
1)所述阳性对照为重组牛IFN-γ，其制备与鉴定方法为：①根据GenBank中牛IFN-γ的基因序列设计一对特异性引物，引物序列：F：5’--CGGggatccAGCCACCATGCAGGGCCAATTTTTTAGAGA-3’；R：5’-GCCtctagaTTACGTTGATGCTCTCCGG-3’。利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的IFN-γ基因片段，大小为432bp(图2)。将其将克隆至pFastBacHTA中构建重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ，将重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒Bacmid-B-IFN-γ。②将sf21昆虫细胞调整到对数生长期，细胞计数后按2×106个/孔的密度将sf21细胞铺于6孔板中，每孔加入总体积为2ml的SF 900ⅡSFM培养基，置于28℃昆虫细胞培养箱中2小时，待细胞贴壁后进行转染。将2μg Bacmid-B-IFN-γ转染sf21细胞中，28℃培养5小时后弃去转染混合液，每孔加入2ml的SF 900ⅡSFM培养基，28℃培养48～72小时，收集上清中的重组杆状病毒Bac-B-IFN-γ。③应用sf21昆虫细胞悬浮培养技术表达大量目的蛋白，经HisTrapFF crude亲和层析柱纯化后得到纯度较高的重组牛IFN-γ，采用BCA蛋白定量分析对纯化后的蛋白进行定量，用PBS缓冲溶液(pH值7.2～7.4)稀释到浓度为0.2mg/ml。④将牛IFN-γ用SDS-PAGE法检测纯度，可见20kDa处出现清晰条带(图3)。VSV抑制病变法检测牛IFN-γ的抗病毒活性，其活性大于1.0×105IU/mg。采用ELISA方法对重组牛IFN-γ活性效价进行检测，选择15ng/ml的牛IFN-γ用于制备阳性对照。
2)所述2株结合不同抗原表位牛IFN-γ单克隆抗体1D4、4B5，其制备与鉴定方法为：①取纯化后的重组牛IFN-γ，按30μg/只的量与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹部皮下多点注射4～6周龄雌性BALB/c小鼠，之后每隔2周用相同剂量的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫4次，细胞融合前3日，腹腔加强免疫1次。②将加强免疫后的BALB/c小鼠摘眼球放血致死，收集血清作为杂交瘤细胞筛选时的阳性对照，采集小鼠脾脏分离脾细胞，按照脾细胞与骨髓瘤细胞3～5:1的比例进行融合，待细胞克隆长至孔底面积的1/4～1/3时，取各孔的细胞上清，采用间接ELISA检测抗牛IFN-γ抗体效价，挑出P/N值较大的细胞株，即阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆后，获得4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12，将这6个细胞株扩大培养，制备腹水并使用ProteinA亲和层析柱进行纯化，制得6株单克隆抗体1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12。③采用相加指数法初步检测单克隆抗体识别抗原表位的能力，经计算6株单克隆抗体识别牛重组IFN-γ的2个不同抗原表位，1D4和4F12识别一个抗原表位，1A4、3C3、3B11、4B5识别另一个抗原表位。④以纯化后的1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12作为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记后的1A4H、1D4H、3C3H、3B11H、4B5H、4F12H作为检测抗体，进行配对ELISA，结果以1D4作为捕获抗体，4B5H作为检测抗体，其OD450nm值最高，是夹心ELISA的最佳组合抗体。
3)所述阴性对照为含5％马血清PBS溶液，其制备方法为：称取Na2HPO4 1.42g，KCl0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.27g，马血清50ml，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.4，定容至1000ml。
(3)所述牛IFN-γ夹心ELISA评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，按照以下步骤进行：
1)样品处理：布病活疫苗免疫后2～6周，无菌采集牛颈静脉血放于抗凝采血管，轻轻颠倒混匀后，分装至24孔细胞培养，每份抗凝全血分装至2个细胞培养孔，每孔1.5ml。在第1孔中加入布鲁氏菌特异性刺激抗原，100μl/孔；在第2孔中加入无菌0.01M PBS，100μl/孔。轻轻振荡混匀，细胞板置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时。收集上清，备用。
2)加样：取1D4单抗包被板，每孔先加入50μl含1％BSA的PBS，再分别加入50μl检测样品(包括布鲁氏菌特异性抗原刺激和PBS刺激上清)，同时加入阴、阳性对照各1孔，50μl/孔。充分混匀，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl PBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。
3)加入酶标抗体：用含1％BSA的PBS将辣根过氧化物酶标记的4B5单克隆抗体稀释100倍，100μl/孔，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl PBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。
4)显色与终止：加入TMB显色液，100μl/孔，室温(22～26℃)避光反应30分钟。随后加入50μl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
5)判定标准：当阳性对照ODPOS≥2.0；阴性对照ODNEG＜0.1，试验成立。待检样本经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值不低于0.2(即ODBRU-ODPBS≥0.2)为布病阳性；待检样品经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值低于0.2(即ODBRU-ODPBS＜0.2)为布病阴性。计算布病个体阳性率(即布病阳性个体数/牛群总数)，当待评估牛群布病个体阳性率≥80％判为免疫了布病疫苗，个体阳性率＜80％判为未免疫布病疫苗或免疫不合格。
(4)本发明还提供了一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括上述方法中用到的试剂。
2.本发明的检测原理
布鲁氏菌为胞内菌，布病活疫苗免疫动物后以细胞免疫为主，免疫动物抗体水平低，采用传统抗体监测方法不能有效评估动物群体的免疫实施状况。动物免疫疫苗后，体内的淋巴细胞被布鲁氏菌抗原致敏，再次接触该抗原时会引发动物体内出现迟发型超敏反应(DTH)，被致敏的淋巴细胞相对于未致敏的牛淋巴细胞会释放相对大剂量的IFN-γ，通过检测IFN-γ评估动物群体的布病疫苗免疫实施状况使监测时间更早，检测敏感性与特异性更高。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——牛IFN-γ重组杆状病毒表达与纯化
1.根据GenBank中牛IFN-γ的mRNA序列，利用primer5设计特异性引物，采用Primer5软件设计一对特异性引物，引物序列：F：5’-CGGggatccAGCCACCATGCAGGGCCAATTTTTTAGAGA-3’；R：5’-GCCtctagaTTACGTTGATGCTCTCCGG-3’。上游引物引入BamH I限制性酶切位点，下游引物引入Xba I限制性酶切位点。为提高重组牛IFN-γ的表达量，在上游引物中加入Kozak序列
2.从成年牛颈静脉无菌采集抗凝血，分离外周血淋巴细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增牛IFN-γ基因片段432bp。将其将克隆至pFastBacHTA中构建重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ，将重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒Bacmid-B-IFN-γ。
3.将sf21昆虫细胞调整到对数生长期，细胞计数后按2×106个/孔的密度将sf21细胞铺于6孔板中，每孔加入总体积为2ml的SF 900ⅡSFM培养基，置于28℃昆虫细胞培养箱中2小时，待细胞贴壁后进行转染。将2μg Bacmid-B-IFN-γ转染sf21细胞中，28℃培养5小时后弃去转染混合液，每孔加入2ml的SF 900ⅡSFM培养基，28℃培养48～72小时，收集上清中的重组杆状病毒Bac-B-IFN-γ。
4.将悬浮培养的sf21昆虫细胞，状态调整到对数生长期后用于重组杆状病毒的表达；按MOI值＝5接入重组杆状病毒Bac-B-IFN-γ，置于28℃摇床中，120r/min，培养48～72小时；分别于48、72小时收集细胞，5000r/min，4℃离心10分钟，收集细胞沉淀。向收集的细胞沉淀中加入细胞裂解液，4℃作用30分钟，200w超声破碎5分钟，4℃、10000r/min，离心10分钟，收集上清，沉淀用相同体积的PBS重悬。将接毒后收集的上清、沉淀处理后进行SDS-PAGE分析，结果在20kDa左右出现了明显蛋白条带，为可溶性表达。应用sf21昆虫细胞悬浮培养技术表达大量目的蛋白，经HisTrap FF crude亲和层析柱纯化后得到纯度较高的重组牛IFN-γ，采用BCA蛋白定量分析制作标准曲线，以此计算出纯化的重组牛IFN-γ为1.0mg/ml。
实施例2——重组牛IFN-γ抗病毒活性鉴定
1.将MDBK细胞消化后细胞计数，将细胞密度稀释至1×105个/ml，充分混匀后100μl/孔铺到96孔细胞培养板里，37℃、5％CO2培养箱中培养12～14小时后细胞长成单层。弃掉培养基，用无血清的DMEM培养基冲洗细胞两次。
2.用含4％FBS的DMEM培养基分别将纯化后的牛IFN-γ(0.2mg/ml)作10倍梯度稀释，充分混匀后，接100μl/孔到细胞孔中，每个稀释度6孔。37℃、5％CO2培养箱中培养18小时，弃掉含牛IFN-γ的培养基，用无血清的DMEM培养基冲洗细胞两次。
3.每孔再加入100μl含100TCID50的VSV病毒(用2％FBS的DMEM培养基稀释)，37℃、5％CO2培养箱中培养。同时设立阴性对照(不加重组牛IFN-γ，不加VSV病毒)；阳性对照(不加重组牛IFN-γ，只加VSV病毒)；蛋白对照(只加重组牛IFN-γ)。
4.每隔24小时显微镜下观察细胞生长状况，待阳性对照孔细胞75％以上发生明显的细胞病变时，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位(IU)。按Reed-Muench法进行计算，即距离比＝(高于50％细胞病变抑制百分数-50％/(高于50％细胞病变抑制百分数-低于50％细胞病变抑制百分数)，再将高于50％细胞病变抑制率的稀释度的对数与距离比相加，即为该干扰素的50％细胞病变抑制率的最高稀释度对数。换算成干扰素的活性单位后，再除以其浓度，即为重组干扰素的比活性IU/mg。
5.表1结果表明在MDBK/VSV系统上测定重组牛IFN-γ的抗病毒活性，按Reed-Muench法计算重组牛IFN-γ的抗病毒活性，结果显示重组牛IFN-γ具有较高的抗病毒活性，重组牛IFN-γ抗病毒活性为1.96×105IU/mg。
表1重组牛IFN-γ抗病毒活性鉴定结果
Figure BDA0003778435240000101
实施例3——单克隆抗体制备、鉴定与筛选
1.单克隆抗体制备与鉴定方法。
(1)小鼠免疫取纯化后的重组牛IFN-γ，按30μg/只的量与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹部皮下多点注射4～6周龄雌性BALB/c小鼠，之后每隔2周用相同剂量的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫4次，细胞融合前3日，腹腔加强免疫1次。
(2)细胞融合与筛选加强免疫72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，采用重组牛IFN-γ作为包被抗原作间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆后，获得6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12。
(3)腹水制备与纯化将计数为1×106阳性杂交瘤细胞稀释于不含血清的DMEM中，腹腔注射0.3ml于10周龄的BALB/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水。制备的小鼠腹水使用ProteinA亲和层析柱进行纯化。
(4)单抗的抗原表位鉴定采用相加指数法初步检测单克隆抗体识别抗原表位的能力，经计算6株单克隆抗体识别重组牛IFN-γ的2个不同抗原表位，1D4和4F12识别一个抗原表位，1A4、3C3、3B11、4B5识别另一个抗原表位(表2)。
表2单克隆抗体的识别抗原表位分析结果
Figure BDA0003778435240000111
注：按照公式AI＝(A(1+2)-A1)/A2×100％计算两种单克隆抗体叠加后的重叠率。其中A1表示第1株单克隆抗体的OD450nm值；A2表示第2株单克隆抗体的OD450nm值；A(1+2)表示2株单克隆抗体叠加后的OD450nm值。若当两抗体叠加之后的AI值大于30％时判定两株单抗识别不同位点。
(5)单抗的配对筛选采用EZ-连接激活过氧化物酶抗体标记试剂盒标记1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12单克隆抗体。以纯化后的1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12作为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记后的1A4H、1D4H、3C3H、3B11H、4B5H、4F12H作为检测抗体，进行配对ELISA，结果如表3，以1D4作为捕获抗体，4B5H作为检测抗体，其OD450nm值最高(表3)，是夹心ELISA的最佳组合抗体。
表3夹心ELISA单克隆抗体配对检测OD450nm结果
Figure BDA0003778435240000112
实施例4——重组牛IFN-γ的ELISA效价测定与阳性对照浓度的选择
1.用PBS将纯化后的牛IFN-γ用PBS(pH值为7.2～7.4)稀释至60ng/ml作为母液，再连续倍比稀释8个梯度，即牛IFN-γ浓度为30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.4688、0.2344ng/ml，以PBS为空白对照。
2.用碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH值9.6)稀释1D4单克隆抗体至1μg/ml，100μl/孔，包被酶标板，2～8℃孵育16小时。倾去ELISA板中液体，加入PBST洗涤液，300μl/孔，振荡洗涤30s，倾去液体，重复洗涤6次，最后一次轻轻拍干ELISA板。
3.加入含有3％BSA的PBS溶液，200μl/孔，2～8℃作用12小时。再倾去ELISA板中液体，加入PBST洗涤液，300μl/孔，振荡洗涤30s，倾去液体，重复洗涤6次，最后一次轻轻拍干ELISA板。
4.每孔先加入50μl含1％BSA的PBS；再分别加入50μl不同浓度牛IFN-γ，同时加入50μl含5％马血清PBS作为阴性对照，充分混匀，封板，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。倾去ELISA板中液体，加入PBST洗涤液，300μl/孔，振荡洗涤30s，倾去液体，重复洗涤6次，最后一次轻轻拍干ELISA板。
5.用含1％BSA的PBS(pH值7.2～7.4)将酶标抗体(4B5)稀释100倍，依次加入各孔，100μl/孔，室温(22～26℃)避光反应60分钟。倾去ELISA板中液体，加入PBST洗涤液，300μl/孔，振荡洗涤30s，倾去液体，重复洗涤6次，最后一次轻轻拍干ELISA板。
6.加入TMB显色液，100μl/孔，从加入第1孔即开始计时，室温(22～26℃)避光反应30分钟。按TMB加入顺序，向各孔依次加入终止液，50μl/孔，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
7.计算各孔P/N(样品孔OD450nm/阴性对照孔OD450nm)值，牛IFN-γ浓度为0.4688ng/ml和0.2344ng/ml时，其P/N(样品孔OD450nm/阴性对照孔OD450nm)值均＜2；当牛IFN-γ浓度在0.9375～60ng/ml时，其P/N(样品孔OD450nm/阴性对照孔OD450nm)值均≥2(表4)。以牛IFN-γ浓度为横坐标，OD450nm为纵坐标作散点图(图4)，60ng/ml和30ng/ml的IFN-γ对应OD450nm值已经处于曲线的平台期，且其对应的OD450nm值均高于3.0，表明该浓度的IFN-γ对于反应体系已几近饱和，不适于作为阳性对照的浓度，而0.2344ng/ml～15ng/ml的IFN-γ对应的OD450nm值具有线性关系，由于蛋白浓度越高则越容易保存，且配制时误差小，因此选择15ng/ml的IFN-γ用于配制阳性对照。
表4牛IFN-γELISA效价测定结果
Figure BDA0003778435240000121
Figure BDA0003778435240000131
实施例5——布鲁氏菌特异性刺激抗原的制备及优化
1.取100μl布鲁氏菌S2株、A19株分别接种到50ml TSB培养基中，37℃振荡培养48小时。
2.将菌液经80℃水浴2小时后进行灭活。8000rpm/min离心15分钟。
3.菌体用0.01M无菌PBS重悬后离心，连续洗涤3次，最后重悬于PBS中。
4.吸取100μl将重悬后的菌液到无菌血清稀释板中，连续做2倍稀释至第11孔，第12孔作为空白对照。
5.用酶标仪测量其OD600nm值，按照OD600nm为0.1时，菌液浓度为2.5×109CFU，计算原菌液浓度。
6.将S2株、A19株菌液稀释至1.0×109CFU/ml，在200W(超声5S，间歇5S)超声条件下分别超声5min、10min和20min。
7.分别吸取超声后的S2株、A19株菌液对已知布病阳性牛抗凝全血(5份，P1-P5)和布病阴性牛抗凝全血(5份，N1-N5)进行刺激，每份样本同时设立PBS刺激对照组。刺激后置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时。收集上清作为样品进行牛IFN-γ夹心ELISA试验,比较各检测孔的OD450nm值。
8.表5结果表明将S2株、A19株灭活菌液按照上述超声条件超声10min制备的抗原，其对阳性样本的刺激效果明显提高，且刺激孔与PBS对照孔的差值与超声20min的结果无明显差异。但是超声20min时，抗原刺激阴性样本后，刺激孔与PBS对照孔的差值明显升高。相比S2株抗原刺激组，A19株抗原刺激阳性样本后，刺激孔与PBS对照孔的差值略高(图5)。因此选择将布鲁氏菌A19株灭活菌液(1.0×109CFU/ml)以200W超声10min作为最佳的体外刺激抗原。
表5抗原不同超声时间对布病阴、阳性样本检测结果分析(OD450nm值)
Figure BDA0003778435240000132
Figure BDA0003778435240000141
注：BRU代表布鲁氏菌抗原刺激孔OD450nm值；PBS代表PBS刺激对照孔OD450nm值；B-P代表布鲁氏菌抗原刺激孔OD450nm值与PBS刺激对照孔OD450nm值的差值。
实施例6——布鲁氏菌特异性刺激抗原体外刺激最佳时间的确定
1.用制备好的布鲁氏菌特异性刺激抗原(A19株)对已知布病阳性牛抗凝全血(50份)和布病阴性牛抗凝全血(30份)进行刺激，每份样本同时设立PBS刺激对照组。刺激后置37℃，5％CO2培养箱中孵育中分别刺激12小时、16小时、24小时和30小时。收集不同刺激时间上清作为样品进行牛IFN-γ夹心ELISA试验,比较各抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值。
2.表6结果表明抗原刺激12小时，82％的已知阳性样本抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值不小于0.2。当抗原刺激16～24小时，100％已知阳性样本抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值不小于0.2，100％已知阴性样本抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值小于0.1。当抗原刺激30小时，虽然100％已知阳性样本抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值不小于0.2，但是6.67％的已知阴性样本抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值大于0.1。因此确定抗原最佳刺激时间为16～24小时。
表6不同刺激时间对布病阴、阳性样本检测结果
Figure BDA0003778435240000151
实施例7——牛IFN-γ夹心ELISA用于评估牛群布病疫苗免疫的临界值确定
1.用布病活疫苗S2(口服免疫)、A19(注射免疫)分别免疫肉牛与奶牛，在免疫后的2周、4周、6周分别采集凝集血与抗凝血。
2.凝集血分离血清，采用竞争ELISA(CELISA)、间接ELISA(IELISA)和补体结合试验(CFT)分别进行检测。抗凝血分别用抗原与PBS刺激16～24小时，吸取上清，待检。
3.将竞争ELISA(CELISA)、间接ELISA(IELISA)和补体结合试验(CFT)均检测为阳性的样本确定为阳性样本。选取对应的待检刺激样本进行牛IFN-γ夹心ELISA检测。其中A19注射免疫肉牛群、S2口服免疫肉牛群、A19注射免疫奶牛群和S2口服免疫奶牛群各选取阳性样本30份。
4.同时采用竞争ELISA(CELISA)、间接ELISA(IELISA)和补体结合试验(CFT)对未免疫布病活疫苗的肉牛群与奶牛群进行检测，将3种方法均检测为阴性的样本确定为阴性样本。采集对应的阴性肉牛、奶牛抗凝血各30份，用抗原与PBS刺激16～24小时，吸取上清进行牛IFN-γ夹心ELISA检测。
5.将抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值分别设为不小于0.5、0.3、0.25、0.2、0.15，比较阳性样本的阳性符合率，结果见表7。不论肉牛还是奶牛阴性样本对应抗原刺激孔与PBS对照孔的OD450nm差值均小于0.1。当OD450nm差值≥0.5时，阳性样本符合率在55％～85％之间；当OD450nm差值≥0.3时，阳性样本符合率在75％～95％之间；当OD450nm差值≥0.25时，阳性样本符合率在90％～100％之间；当OD450nm差值≥0.2时，无论肉牛、奶牛阳性样本(包括A19注射与S2口服免疫)均可达到100％阳性率。因此将牛IFN-γ夹心ELISA用于评估牛群布病疫苗免疫的临界值确定为OD450nm差值不小于0.2。
表7牛IFN-γ夹心ELISA用于评估牛群布病疫苗免疫的临界值结果
Figure BDA0003778435240000161
实施例8——牛IFN-γ夹心ELISA方法用于评估牛群是否免疫布病疫苗的临床应用分析
1.选取布病活疫苗S2口服免疫肉牛场、奶牛场各1个；选取布病活疫苗A19注射免疫肉牛场2个、奶牛场各1个。
2.在疫苗免疫后的1周、2周、4周、6周、8周分别在每个场群随机采集50头牛的凝集血与抗凝血。抗凝血于采集当天分别用抗原与PBS刺激16～24小时，吸取上清待检。凝集血分离血清待检。
3.血清采用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、竞争ELISA(CELISA)、间接ELISA(IELISA)分别检测，刺激上清采用牛IFN-γ夹心ELISA检测，比较各种检测方法的阳性率。
4.临床检测结果表明(表8)与虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、竞争ELISA(CELISA)、间接ELISA(IELISA)等5种血清学检测方法相比，牛IFN-γ夹心ELISA方法检测免疫布病疫苗的牛群敏感性更高。在疫苗免疫后的2～6周内，布病活疫苗S2口服免疫和A19注射免疫的肉牛和奶牛群检测阳性率均能达到80％以上，而血清学检测方法中阳性率最高的竞争ELISA(CELISA)也只能到达30％～100％的阳性率，进一步说明本方法可用于评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗。
表8各方法检测结果阳性率比较
Figure BDA0003778435240000171
由上述实施例可知，本发明通过构建检测牛伽马干扰素(IFN-γ)的方法，经布鲁氏菌特异性抗原刺激后，从细胞免疫水平监测布病疫苗免疫后牛群的整体免疫状况，克服了传统血清学抗体监测方法敏感性低、监测期短的技术难题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于免疫了布病疫苗的牛群，在其免疫后的2～6周内采集抗凝全血，按本方法经布鲁氏菌特异性抗原刺激和牛IFN-γ夹心ELISA检测，根据检测结果计算待检牛群中布病个体阳性率即可判定该牛群是否免疫了布病疫苗。
2.如权利要求1所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述方法分两步实现，第一步对采集的抗凝全血用布鲁氏菌特异性抗原刺激；第二步采用夹心ELISA方法检测抗原刺激后血浆中牛IFN-γ含量差异。
3.如权利要求2所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述布鲁氏菌特异性刺激抗原的制备与刺激方法为：
(1)将牛种布鲁氏菌A19株菌悬液，80℃热灭活2小时后，用无菌0.01MPBS洗涤3次后重悬，调节菌液浊度，使其浊度约为1×109CFU/ml，以200W超声10分钟(超声5S，间歇5S)后即为特异性刺激抗原；
(2)无菌采集布病疫苗免疫后2～6周内牛抗凝全血，转移至24孔细胞板内，每孔1.5ml，每个样品转移2孔；第1孔中加入布鲁氏菌特异性刺激抗原，100μl/孔；第2孔中加入无菌0.01MPBS，100μl/孔；细胞板置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时，孵育后吸取上清为待检样品。
4.如权利要求2所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于所述牛IFN-γ夹心ELISA检测方法按如下步骤建立：
(1)根据GenBank(FJ263670)中牛IFN-γ的基因序列设计一对特异性引物，利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的IFN-γ基因片段，大小为432bp；将其将克隆至pFastBacHTA中构建重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ，将重组质粒pFastBacHTA-B-IFN-γ转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒Bacmid-B-IFN-γ，转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒Bac-B-IFN-γ；应用sf21昆虫细胞悬浮培养技术表达大量目的蛋白，经纯化后得到纯度较高的重组牛IFN-γ；
(2)以纯化的牛IFN-γ免疫小鼠，采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，通过间接ELISA方法筛选分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行多次亚克隆，获得6株能稳定分泌特异性抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A4、1D4、3C3、3B11、4B5、4F12；采用腹水诱生法大量制备单克隆抗体，并运用亲和层析法进行纯化，采用测相加指数法检测该6株单抗针对2个不同的抗原表位；经过配对ELISA建立以1D4单克隆抗体为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的4B5单克隆抗体为检测抗体的牛IFN-γ夹心ELISA方法；
(3)将纯化重组牛IFN-γ用含5％马血清的PBS稀释至15ng/ml作为牛IFN-γ夹心ELISA检测方法的阳性对照；将含5％马血清的PBS溶液作为牛IFN-γ夹心ELISA检测方法的阴性对照。
5.应用权利要求1所述一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品处理：布病活疫苗免疫后2～6周，无菌采集牛颈静脉血放于抗凝采血管，轻轻颠倒混匀后，分装至24孔细胞培养，每份抗凝全血分装至2个细胞培养孔，每孔1.5ml；在第1孔中加入布鲁氏菌特异性刺激抗原，100μl/孔；在第2孔中加入无菌0.01MPBS，100μl/孔；轻轻振荡混匀，细胞板置37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时；收集上清，备用；
(2)加样：取1D4单抗包被板，每孔先加入50μl含1％BSA的PBS，再分别加入50μl检测样品(包括布鲁氏菌特异性抗原刺激和PBS刺激上清)，同时加入阴、阳性对照各1孔，50μl/孔；充分混匀，室温下(22～26℃)避光反应60分钟；取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μlPBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干；
(3)加入酶标抗体：用含1％BSA的PBS将辣根过氧化物酶标记的4B5单克隆抗体稀释100倍，100μl/孔，室温下(22～26℃)避光反应60分钟；取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μlPBST，洗涤6次，最后1次轻轻拍干；
(4)显色与终止：加入TMB显色液，100μl/孔，室温(22～26℃)避光反应30分钟；随后加入50μl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值；
(5)判定标准：当阳性对照ODPOS≥2.0；阴性对照ODNEG＜0.1，试验成立；待检样本经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值不低于0.2(即ODBRU-ODPBS≥0.2)为布病阳性；待检样品经布鲁氏菌特异性抗原刺激后OD450nm读值与PBS刺激的OD450nm读值的差值低于0.2(即ODBRU-ODPBS＜0.2)为布病阴性；计算布病个体阳性率(即布病阳性个体数/牛群总数)，当待评估牛群布病个体阳性率≥80％判为免疫了布病疫苗，个体阳性率＜80％判为未免疫布病疫苗或免疫不合格。
6.一种评估牛群是否免疫布鲁氏菌病疫苗的试剂盒，其特征在于包括权利要求1～5任意一项所述方法中用到的试剂。
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