DD264024A1

DD264024A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen das steroidhormon aldosteron

Info

Publication number: DD264024A1
Application number: DD30636987A
Authority: DD
Inventors: Frank Schneider; Fritz Stahl; Wolfgang Rohde; Franz Noll
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1989-01-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern hoher Spezifitaet gegen das Steroidhormon Aldosteron. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die Pharmazeutische Industrie. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit Aldosteron-3-CMO-BSA immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridzellen selektiert, kloniert, weitervermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Der spezifische Hybridzellklon ZIM-A-IH12 wurde im ZIM unter der Nummer DDR-0203 hinterlegt.

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Aldosteron gehört zu den C-21-Steroiden und wird in der Nebennierenrinde gebildet. Das Molekulargewicht beträgt 360,44 Dalton. Aldosteron hemmt die Na⁺-Ausscheidung im Harn, in dem es dessen Reabsorption im distalen Nierentubulus steigert. Gleichzeitig erhöht es die Ausscheidung von K^f- und H⁺-Ionen. (Vetter W., Acts Endocrinal. 74: 588,1973).

Die Bestimmung von Aldosteron erfolgt bisher mittels pAK und hat große klinische Bedeutung, so für die Differentialdiagnose des Bluthochdrucks (Mc Caa R. E., Circ. Res. 40/1:157,1977), für die Einschätzung des Mineralstoffwechsels (Mitchell J. R. et al, Ann. Intern. Med. 87:596,1977) und für die Tumordiagnostik. Monoklonal Antikörper gegen Aldosteron gibt es komerziell seit 1984 von der Firma Bio-Jeda (Israel) und seit 1987 ,'Hanquez, C. et. al., Clinica Chimica Acta, 164:71,1987). Solche monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise für die Grundlagenforschung eingesetzt. Aldosteron weist große strukturelle Ähnlichkeiten zu anderen Steroidhormonen, insbesondere zu Cortisol und Corticosteron auf. Für eine Ablösung von polykionalen Antikörpern bei der immunchemischen Bestimmung von Aldosteron .'sind monoklonal Antikörper mit hoher Spezifität und geeigneter Affinitätskonstante Voraussetzung.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonal Antikörper gegen das Steroidhormon Aldosteron mit geeigneter Affinitätskons'anto und hoher Spezifität herzustellen. Die Antikörper sollen zur Entwicklung rationeller Testbestecks zur selektiven Analytik in der medizinischen Diagnostik sowie für biochemische Untersuchungen eingesetzt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Steroidhormon Aldosteron werden zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit Aldosteron-3-CMO-BSA bis zurr. Erscheinen von Serumantikörpern immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen hybridisiert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotiterplatten kultiviert. Mit einem Immunoassay erfolgt der Nachweis der antikörperproduzierenden Hybridome. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert und ihre Steroidspezifität bestimmt. Die spezifischen anti-Aldosteron Hybridome wurden ausgewählt, weitervsrmehrt und gegebenenfalls nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper eingesetzt. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Monolayer-, Roller-, Suspensionskultur und in Mikrobeads aus modifizierter Zellulose oder in vivo in Ascitesfiüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in Balb/c-Mäusen und/oder deren Hybride. Dor monoklonal Antikörper ZIM-A-IH12 gehört der Immunglobuünklasse IgG 1 an. Er bindet spezifisch an Aldosteron mit einer Affinitätskonstante von 6,3 x 10⁷l/mol

Die Kreuzreaktivität zu Cortisol beträgt 0,5% und zu Corticosteron 1 % (Tabelle). Der Zeliklon produziert sowohl in Zellkultur als auch in vivo in Ascietesflüssigkeit nach Transplantation bedeutende Mengen von Antikörpern. Der Antikörper eignet sich zur Bestimmung von Aldosteron.

Tabelle

monoklonaler Immunglobulin- Affinitäts· Kreuzreaktivität

Antikörper klas: e konstante zu

Cortisol Corticosteron

ZIM-A-IH12 IgGI 6,3x10⁷!/mol 0,5% 1%

Das erfindungsgemäß hergestellte Hybridom ZIM-A-IH12 wurde in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr. DDR-0203 hinterlegt.

Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden.

AusfOhrungsbeisplel

1. Herstellung der Hybridome

Balb/c-MSuse werden durch i.p. injektion von 100Mg Aldcsteron-3-CMO-BSA in kompletton Freund'schen Adjuvans immunisiert. Drei Tage vor der Fusion werden 100μς Aldesteron-3-CMO-BSA i. v. appiiziert. Die Fusion der Milzzellen einer immunisierten Maus mit positiven Serumtiter erfolgt mit Maus-Plasmazytomzellen SP 2/0 nach bekannten Verfahren (Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497,1975, Hudson, L and F. C. Hay: Practical Immunology, 2. 'Autlage, Oxfort 1980).

2. Das Screening der Antikörper aus der Kulturflüssigkeit erfolgt mit einem Immonoassay auf einen Flächenträger bzw. in Mikrotitertestpiatten unter Bindung des Aidosteron-Konjugats an die feste Phai ο und Einsatz eines enzym markierten (Enzym: Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörpei und mit einem Immunoassay unter Verwendung von tritiummarkiertem Aldosteron (H^3f-Aldosteron). Die Hybridome werden in Selektionsmedium (HAT oder Azaserin) in 96-well-Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 8-10 Tagen wird der Kulturüberstand auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet.

3. Die Eigenschaften des von dem erhaltenen Hybridomklon produzierten monoklonalen Antikörper sind in der Tabelle aufgeführt (siehe Seite 5).

Claims

Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Steroidhormon Aldosieron durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit Aldosteron-3-CMO-BSA, Fusion ihrer Milzzellen mit Maus-Myelomzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren und Weitervermehrung der Hybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäusen in der Ascitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation der Klon ZIM-A-IH12 eingesetzt wird. (Hinterlegungsnummer DDR-0203)

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Steroidhormon Aldosteron. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die Pharmazeutische Industrie.