DD264024A1

DD264024A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST STEROID HORMONE ALDOSTERONE

Info

Publication number: DD264024A1
Application number: DD30636987A
Authority: DD
Inventors: Frank Schneider; Fritz Stahl; Wolfgang Rohde; Franz Noll
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1989-01-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern hoher Spezifitaet gegen das Steroidhormon Aldosteron. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die Pharmazeutische Industrie. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit Aldosteron-3-CMO-BSA immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridzellen selektiert, kloniert, weitervermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Der spezifische Hybridzellklon ZIM-A-IH12 wurde im ZIM unter der Nummer DDR-0203 hinterlegt.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies of high specificity against the steroid hormone aldosterone. Field of application of the invention is the medicine and the pharmaceutical industry. The method according to the invention is characterized in that spleen cells of Balb / c mice immunized with aldosterone-3-CMO-BSA are initially fused in a manner known per se with mouse myeloma cells in the cell culture which selects antibody-producing hybrid cells , weitervermehrt and used according to the invention for the production of monoclonal antibodies by culturing or after transplantation. The specific hybrid cell clone ZIM-A-IH12 was deposited in the ZIM under the number DDR-0203.

Description

Characteristic of the known state of the art

Aldosteron gehört zu den C-21-Steroiden und wird in der Nebennierenrinde gebildet. Das Molekulargewicht beträgt 360,44 Dalton. Aldosteron hemmt die Na⁺-Ausscheidung im Harn, in dem es dessen Reabsorption im distalen Nierentubulus steigert. Gleichzeitig erhöht es die Ausscheidung von K^f- und H⁺-Ionen. (Vetter W., Acts Endocrinal. 74: 588,1973).Aldosterone belongs to the C-21 steroids and is formed in the adrenal cortex. The molecular weight is 360.44 daltons. Aldosterone inhibits Na ⁺ excretion in the urine by increasing its reabsorption in the distal renal tubule. At the same time it increases the excretion of K ^f and H ⁺ ions. (Cousin W., Acts Endocrinal. 74: 588, 1973).

Die Bestimmung von Aldosteron erfolgt bisher mittels pAK und hat große klinische Bedeutung, so für die Differentialdiagnose des Bluthochdrucks (Mc Caa R. E., Circ. Res. 40/1:157,1977), für die Einschätzung des Mineralstoffwechsels (Mitchell J. R. et al, Ann. Intern. Med. 87:596,1977) und für die Tumordiagnostik. Monoklonal Antikörper gegen Aldosteron gibt es komerziell seit 1984 von der Firma Bio-Jeda (Israel) und seit 1987 ,'Hanquez, C. et. al., Clinica Chimica Acta, 164:71,1987). Solche monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise für die Grundlagenforschung eingesetzt. Aldosteron weist große strukturelle Ähnlichkeiten zu anderen Steroidhormonen, insbesondere zu Cortisol und Corticosteron auf. Für eine Ablösung von polykionalen Antikörpern bei der immunchemischen Bestimmung von Aldosteron .'sind monoklonal Antikörper mit hoher Spezifität und geeigneter Affinitätskonstante Voraussetzung.The determination of aldosterone has hitherto been carried out by means of PAH and has great clinical significance, as for the differential diagnosis of hypertension (Mc Caa RE, Circ.Res. 40/1: 157,1977), for the assessment of mineral metabolism (Mitchell JR et al, Ann Internal Med. 87: 596, 1977) and for tumor diagnosis. Monoclonal antibodies to aldosterone have been commercially available since 1984 by Bio-Jeda (Israel) and since 1987, 'Hanquez, C. et. al., Clinica Chimica Acta, 164: 71, 1987). Such monoclonal antibodies are preferably used for basic research. Aldosterone has great structural similarities to other steroid hormones, particularly cortisol and corticosterone. For a replacement of polycional antibodies in the immunochemical determination of aldosterone. Monoclonal antibody with high specificity and appropriate affinity constant are prerequisite.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonal Antikörper gegen das Steroidhormon Aldosteron mit geeigneter Affinitätskons'anto und hoher Spezifität herzustellen. Die Antikörper sollen zur Entwicklung rationeller Testbestecks zur selektiven Analytik in der medizinischen Diagnostik sowie für biochemische Untersuchungen eingesetzt werden.The aim of the invention is to produce monoclonal antibodies against the steroid hormone aldosterone with suitable affinity and high specificity. The antibodies are to be used for the development of rational test kits for selective analysis in medical diagnostics as well as for biochemical investigations.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Steroidhormon Aldosteron werden zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit Aldosteron-3-CMO-BSA bis zurr. Erscheinen von Serumantikörpern immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen hybridisiert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotiterplatten kultiviert. Mit einem Immunoassay erfolgt der Nachweis der antikörperproduzierenden Hybridome. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert und ihre Steroidspezifität bestimmt. Die spezifischen anti-Aldosteron Hybridome wurden ausgewählt, weitervsrmehrt und gegebenenfalls nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper eingesetzt. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Monolayer-, Roller-, Suspensionskultur und in Mikrobeads aus modifizierter Zellulose oder in vivo in Ascitesfiüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in Balb/c-Mäusen und/oder deren Hybride. Dor monoklonal Antikörper ZIM-A-IH12 gehört der Immunglobuünklasse IgG 1 an. Er bindet spezifisch an Aldosteron mit einer Affinitätskonstante von 6,3 x 10⁷l/molIn the method according to the invention for the production of monoclonal antibodies against the steroid hormone aldosterone, spleen cells of Balb / c mice which have been previously treated with aldosterone-3-CMO-BSA are prepared in a manner known per se. Appearance of serum antibodies were immunized, hybridized with mouse myeloma cells and cultured the resulting hybridomas in microtiter plates. An immunoassay is used to detect the antibody-producing hybridomas. The antibody-producing hybridomas are cloned and their steroid specificity determined. The specific anti-aldosterone hybridomas were selected, further used and, if appropriate after storage in liquid nitrogen, used according to the invention for the production of the monoclonal antibodies. The production of the monoclonal antibodies takes place either in vitro in cell culture as monolayer, roller, suspension culture and in microbeads of modified cellulose or in vivo in ascites fluid after transplantation of the specific hybridoma cells into Balb / c mice and / or their hybrids. Dor monoclonal antibody ZIM-A-IH12 belongs to immunoglobulin class IgG1. It binds specifically to aldosterone with an affinity constant of 6.3 x 10 ⁷ l / mol

Die Kreuzreaktivität zu Cortisol beträgt 0,5% und zu Corticosteron 1 % (Tabelle). Der Zeliklon produziert sowohl in Zellkultur als auch in vivo in Ascietesflüssigkeit nach Transplantation bedeutende Mengen von Antikörpern. Der Antikörper eignet sich zur Bestimmung von Aldosteron.The cross-reactivity to cortisol is 0.5% and to corticosterone 1% (Table). The zeliklon produces significant levels of antibodies both in cell culture and in vivo in ascites fluid after transplantation. The antibody is suitable for the determination of aldosterone.

table

monoklonaler Immunglobulin- Affinitäts· Kreuzreaktivitätmonoclonal immunoglobulin affinity · cross-reactivity

Antikörper klas: e konstante zuAntibody class: e constant too

Cortisol CorticosteronCortisol Corticosterone

ZIM-A-IH12 IgGI 6,3x10⁷!/mol 0,5% 1%ZIM-A-IH12 IgGI 6.3x10 ⁷ ! / Mol 0.5% 1%

Das erfindungsgemäß hergestellte Hybridom ZIM-A-IH12 wurde in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr. DDR-0203 hinterlegt.The hybridoma ZIM-A-IH12 prepared according to the invention was deposited in the ZIM depository under the number DDR-0203.

Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by examples.

AusfOhrungsbeisplel

1. Herstellung der Hybridome1. Preparation of hybridomas

Balb/c-MSuse werden durch i.p. injektion von 100Mg Aldcsteron-3-CMO-BSA in kompletton Freund'schen Adjuvans immunisiert. Drei Tage vor der Fusion werden 100μς Aldesteron-3-CMO-BSA i. v. appiiziert. Die Fusion der Milzzellen einer immunisierten Maus mit positiven Serumtiter erfolgt mit Maus-Plasmazytomzellen SP 2/0 nach bekannten Verfahren (Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497,1975, Hudson, L and F. C. Hay: Practical Immunology, 2. 'Autlage, Oxfort 1980).Balb / c MSuse are replaced by i.p. Injection of 100 μg Aldcsterone-3-CMO-BSA into complete Freund's adjuvant. Three days before the merger, 100 μ? Aldesterone-3-CMO-BSA i. v. appiiziert. The fusion of spleen cells of an immunized mouse with positive serum titer is carried out with mouse plasmacytoma cells SP 2/0 by known methods (Kohler, G. and C. Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Hudson, L and FC Hay: Practical Immunology, 2 Autlage, Oxfort 1980).

2. Das Screening der Antikörper aus der Kulturflüssigkeit erfolgt mit einem Immonoassay auf einen Flächenträger bzw. in Mikrotitertestpiatten unter Bindung des Aidosteron-Konjugats an die feste Phai ο und Einsatz eines enzym markierten (Enzym: Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörpei und mit einem Immunoassay unter Verwendung von tritiummarkiertem Aldosteron (H^3f-Aldosteron). Die Hybridome werden in Selektionsmedium (HAT oder Azaserin) in 96-well-Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 8-10 Tagen wird der Kulturüberstand auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet.2. The screening of the antibodies from the culture fluid is carried out with an immunoassay on a surface carrier or in microtiter test plates with binding of the Aidosteron conjugate to the solid Phai ο and use of an enzyme-labeled (enzyme: peroxidase) anti-mouse IgG Antikörpei and with an immunoassay using tritiated aldosterone (H ^3f aldosterone). The hybridomas are cultured in selection medium (HAT or azaserine) in 96-well microtiter plates. After 8-10 days, the culture supernatant is tested for the presence of antibodies.

3. Die Eigenschaften des von dem erhaltenen Hybridomklon produzierten monoklonalen Antikörper sind in der Tabelle aufgeführt (siehe Seite 5).3. The properties of the monoclonal antibody produced by the hybridoma clone obtained are listed in the table (see page 5).

Claims

Process for the preparation of monoclonal antibodies against the steroid hormone Aldosieron by immunization of Balb / c mice with aldosterone-3-CMO-BSA, fusion of their spleen cells with mouse myeloma cells, selection of the antibody-producing hybrid cells by immunochemical test procedures and propagation of the hybrid cell clones by cultivation or Transplantation to mice in the form of ascites, characterized in that the clone ZIM-A-IH12 is used for the cultivation or transplantation. (Deposit number DDR-0203)

Field of application of the invention

The invention relates to a process for the production of monoclonal antibodies against the steroid hormone aldosterone. Field of application of the invention is the medicine and the pharmaceutical industry.