DD242750A1 - PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN GLYCOPY PHOSPHORY LASE ISOENZYME - Google Patents

PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN GLYCOPY PHOSPHORY LASE ISOENZYME Download PDF

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DD242750A1
DD242750A1 DD28299285A DD28299285A DD242750A1 DD 242750 A1 DD242750 A1 DD 242750A1 DD 28299285 A DD28299285 A DD 28299285A DD 28299285 A DD28299285 A DD 28299285A DD 242750 A1 DD242750 A1 DD 242750A1
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German Democratic Republic
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isoenzymes
enzyme
monoclonal antibodies
mice
glycogen phosphorylase
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DD28299285A
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Inventor
Wilhelm Handschack
Frank Schneider
Franz Noll
Ernst-Georg Krause
Georg Rabitzsch
Werner Schoessler
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Akad Wissenschaften Ddr
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen Isoenzyme der menschlichen Glykogenphosphorylase (E.C.2.4.1.1.). Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikoerper gegen menschliche Isoenzyme (BB, MM, LL, LL-like) der Glykogenphosphorylase mit hohen Affinitaetskonstanten und hoechster Spezifitaet herzustellen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Maeusen, die mit dem Enzym immunisiert wurden, mit Plasmatytomzellen fusioniert und die Hybridomzellen in Zellkultur mittels immunchemischer Testverfahren selektioniert und kloniert, die Eigenschaften der gebildeten monoklonalen Antikoerper hinsichtlich ihrer Reaktivitaet mit dem Enzym bzw. seinen Isoenzymen bestimmt und die Produktion der Antikoerper durch die Hybridomklone entweder in vitro mit biotechnologischen Verfahren der Zellkultur oder in vivo in Ascitesform in Maeusen durchfuehrt. Anwendungsgebiet sind die medizinische Diagnostik und Enzymtechnik.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies against isoenzymes of human glycogen phosphorylase (E.C.2.4.1.1.). The invention aims to produce monoclonal antibodies to human isoenzymes (BB, MM, LL, LL-like) of glycogen phosphorylase with high affinity constants and highest specificity. The process is characterized in that spleen cells of mice which have been immunized with the enzyme are fused with plasmatytoma cells and the hybridoma cells are selected and cloned in cell culture by immunochemical assay and the properties of the monoclonal antibodies formed with regard to their reactivity with the enzyme or its isoenzymes determined and carried out the production of antibodies by the hybridoma clones either in vitro with biotechnological methods of cell culture or in vivo in ascites form in mice. Areas of application are medical diagnostics and enzyme technology.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Isoenzyme der menschlichen Glykogenphosphorylase (E.C.2.4.1.1.) und enzymatisch inaktiver Monomeren. Anwendungsgebiet sind die medizinische Diagnostik und Enzymtechnik.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies against isoenzymes of human glycogen phosphorylase (E.C.2.4.1.1.) And enzymatically inactive monomers. Areas of application are medical diagnostics and enzyme technology.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Humane Glykogenphosphorylase besitzt auf der Basis relativer Organspezifität seiner Isoenzymspezies BB, MM und LL (sowie „LL-Iike") und deren funktioneller und struktureller Integration in solche sauerstoffmangelsensitiver Mechanismus wie den intrazellulären Glykogenabbau (Glykolyse) eine diagnostisch relevante Indikatorfunktion bei der serologischen Erkennung krankhafter Prozesse, wie Herzinfarkt, Muskeldystrophie u.a. (Krause etal.Clin.Chim.Acta58,145-154/1975/, Krause et al.Ztschr.Med. Labordiagnostik 20,127-135/1979/, Michael et al. Am. J. Physiol.248, H350-H359/1985/).Human glycogen phosphorylase, based on the relative organ specificity of its isoenzyme species BB, MM and LL (as well as "LL-Iike") and its functional and structural integration into such oxygen deficiency sensitive mechanisms as intracellular glycogen degradation (glycolysis), has a diagnostically relevant indicator function in the serological recognition of pathological processes , such as myocardial infarction, muscular dystrophy, inter alia (Krause et al. Clin. Chim. Acta 58, 1445-154 / 1975 /, Krause et al., Ztschr.Med., Laboratory Diagnostics 20, 127-135 / 1979 /, Michael et al., Am., J. Physiol , H350-H359 / 1985 /).

Die serologische Analytik humaner Isophosphorylase erfolgt bisher (a) durch elektrophoretische Methoden (qualitativ) und (b) mittels polyklonaler Antiseren durch Immuninhibition der Isoenzymaktivität oder EIA.The serological analysis of human isophosphorylase has hitherto been carried out (a) by electrophoretic methods (qualitative) and (b) by means of polyclonal antisera by immunoinhibition of the isoenzyme activity or EIA.

Monoklonale Antikörper gegen humane Glykogenphosphorylase und ihre Isoenzyme sind bisher nicht bekannt und somit als hochspezifische Reaktanten nicht einsetzbar.Monoclonal antibodies to human glycogen phosphorylase and their isoenzymes are not yet known and thus can not be used as highly specific reactants.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen menschliche Isoenzyme (BB, MM, LL, LL-Iike) der Glykogenphosphorylase mit geeigneter Affinitätskonstante und hoher Spezifität herzustellen. Die Antikörper sollen zur Entwicklung rationeller Testbestecks zur selektiven Isoenzymanalytik in der medizinischen Diagnostik sowie für biochemische Untersuchungen einschließlich der Herstellung von effektiven Immunosorbentien zur Immunaffinitätschromatographie von Enzympräparaten eingesetzt werden.The invention aims to produce monoclonal antibodies against human isoenzymes (BB, MM, LL, LL-Iike) of glycogen phosphorylase with appropriate affinity constant and high specificity. The antibodies will be used for the development of rational test kits for selective isoenzyme analysis in medical diagnostics as well as for biochemical investigations including the production of effective immunosorbents for immunoaffinity chromatography of enzyme preparations.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humane Glykogenphosphorylase ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb-c-Mäusen, die mit gereinigtem Enzym bis zum Erscheinen von Serumantikörpern immunisiert werden, mit Maus-Myelomzellen hybridisiert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotiterplatten kultiviert. Die antikörperproduzierenden Hybridomklone werden zunächst mit einem Immunodotassay nachgewiesen. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert und erfindungsgemäß auf die Verwendungsfähigkeit für den vorgesehenen Einsatz (s. o.) geprüft. Die spezifischen Hybridomklone werden vermehrt, und Anteile von ihnen werden als Zellkonserven in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Monolayer-, Roller-, Suspensionskultur und in Mikrobeads aus modifizierter Zellulose oder in vivo in Ascitesflüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in Balb-c-Mäusen.The process according to the invention for the production of monoclonal antibodies against human glycogen phosphorylase is characterized in that spleen cells of Balb c mice, which are immunized with purified enzyme until the appearance of serum antibodies, are hybridized with mouse myeloma cells and the resulting hybridomas are cultured in microtiter plates. The antibody-producing hybridoma clones are first detected by immunodotassay. The antibody-producing hybridomas are cloned and tested according to the invention for their usability for the intended use (see above). The specific hybridoma clones are propagated and portions of them are stored as cell canned in liquid nitrogen. The monoclonal antibodies are produced either in vitro in cell culture as a monolayer, roller, suspension culture and in modified cellulose microbeads or in vivo in ascites fluid after transplantation of the specific hybridoma cells into Balb-c mice.

Die Antikörper gehören den Immunglobulinsubklassen IgG und IgM an. Die Zeilklone produzieren sowohl in Zellkultur als auch in Mäusen bedeutende Mengen von Antikörpern mit einer hohen Affinität. Die Antikörper eignen sich zur Bestimmung der Isoenzyme der Glykogenphosphorylase in der medizinischen Diagnostik und zur Hochreinigung der Enzyme bzw. der Isoenzyme.The antibodies belong to the immunoglobulin subclasses IgG and IgM. The cell clones produce significant levels of high affinity antibody in both cell culture and mice. The antibodies are suitable for the determination of isoenzymes of glycogen phosphorylase in medical diagnostics and for the high purification of enzymes or isoenzymes.

Die erfindungsgemäß hergestellten Hybridome werden nach Aufforderung in derRGW-Referenzsammlung des FLI Riems unter Hinterlegungs-Nr. hinterlegt.The hybridomas prepared according to the invention are available as requested in the RGW reference collection of the FLI Riem under accession no. deposited.

Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by examples.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Herstellung der Hybridome1. Preparation of hybridomas

Balb-c-Mäuse werden zweimal in mehrwöchentlichem Abstand mit20pg GPb-BB mit komplettem Freund'chen Adjuvant i.p. immunisiert. Drei Tage vor der Fusion werden 10pg GPb-BB i.v. appliziert. Die Fusion der Milzzellen einer immunisierten Maus mit positivem Serumtiter mit Maus-Plasma-Cytomzellen PS/XeS-AgS-e.ö.S. erfolgt nach bekanntem VerfahrenBalb-c mice are challenged twice weekly with 20pg GPb-BB complete Freund's Adjuvant i.p. immunized. Three days before the merger, 10pg GPb-BB i.v. applied. Fusion of spleen cells of a positive-titered immunized mouse with mouse plasma cytomic cells PS / XeS-AgS-e.o.S. done by known method

-2- CM. /OU-2- CM. / OU

(Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497/1975/, Hudson, L and F. C. Hay: Practical Immunology, 2. Auflage, Oxford(Kohler, G. and C. Milstein, Nature 256: 4595-497 / 1975 /, Hudson, L and F.C. Hay: Practical Immunology, 2nd ed., Oxford

Die Hybridome werden in Selektivmedium (HAT oder Azaserin) in 96well-Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 8-10 Tagen wird der Kulturüberstand auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet.The hybridomas are cultured in selective medium (HAT or azaserine) in 96-well microtiter plates. After 8-10 days, the culture supernatant is tested for the presence of antibodies.

2. Das Screening der Kulturüberstände erfolgt mit einem Immunodotassay auf einem Flächenträger bzw. in Mikrotiterplatten unter Bindung des Enzyms an die feste Phase und Einsatzeines enzymmarkierten (Enzym: Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörper.2. Screen the culture supernatants with an immunodotassay on a surface support or in microtiter plates with binding of the enzyme to the solid phase and use of an enzyme-labeled (enzyme: peroxidase) anti-mouse IgG antibody.

3. Die Eigenschaften der von den erhaltenen Hybridomklonen produzierten monoklonalen Antikörper sind in Tabelle 1 · aufgeführt.3. The properties of the monoclonal antibodies produced by the obtained hybridoma clones are listed in Table 1.

Monoklonalmonoclonal Eigenschaftenproperties Bindung an GPbBinding to GPb Epitopepitope Antikörperantibody GlobulinklasseGlobulinklasse Isoenzymeisoenzymes aktivesactive BB MMBB MM Zentrumcenter

anderer Epitopanother epitope

ZZ-IIGB IgM + + - n.b.ZZ-IIGB IgM + + - n.b.

ZZ-IVD3 IgGI ' + - - n.b.ZZ-IVD3 IgGI '+ - - n.b.

ZZ = Zentralinstitut für MolekularbiologieZZ = Central Institute of Molecular Biology

Zentralinstitut für Herz-Kreislauf-ForschungCentral Institute for Cardiovascular Research

Claims (3)

Erfindungsanspruch: Invention claim: 1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Isoenzyme der menschlichen Glykogenphosphorylase (E.C.2.4.1.1.), dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Mäusen, die mit dem Enzym im-munisiert wurden, mit Plasmazytomzellen fusioniert und die Hybridomzellen in Zellkultur mittels immunchemischer Testverfahren selektioniert und kloniert, die Eigenschaften der gebildeten monoklonalen Antikörper hinsichtlich ihrer Reaktivität mit dem Enzym bzw. seinen Isoenzymen bestimmt und die Produktion der Antikörper durch die Hybridomklone entweder in vitro mit biotechnologischen Verfahren der Zellkultur oder in vivo in Ascitesform in Mäusen durchführt.1. A process for the preparation of monoclonal antibodies against isoenzymes of human glycogen phosphorylase (EC2.4.1.1.), Which comprises splicing spleen cells of mice which have been immunized with the enzyme, with Plasmazytomzellen and the hybridoma cells in cell culture by immunochemical test method selected and cloned, determines the properties of the monoclonal antibodies formed in terms of their reactivity with the enzyme or its isoenzymes and performs the production of antibodies by the hybridoma clones either in vitro with biotechnological methods of cell culture or in vivo in ascites form in mice. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die monoklonalen Antikörper in einem spezifischen Immunoassay zum Nachweis von Glykogenphosphorylase bzw. deren Isoenzymen oder aktiven/inaktiven Untereinheiten im biologischen Material verwendet.2. The method according to item 1, characterized in that one uses the monoclonal antibodies in a specific immunoassay for the detection of glycogen phosphorylase or their isoenzymes or active / inactive subunits in the biological material. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die monoklonalen Antikörper an Träger fixiert und zur Hochreinigung des Enzyms bzw. der Isoenzyme verwendet.3. The method according to item 1, characterized in that fixed the monoclonal antibody to the carrier and used for the high purification of the enzyme or the isoenzymes.
DD28299285A 1985-11-19 1985-11-19 PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN GLYCOPY PHOSPHORY LASE ISOENZYME DD242750A1 (en)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2008064903A3 (en) * 2006-12-01 2008-07-17 Diagenics Internat Corp Antibody to the epitope grwirtqqhyyerdpkriyylslefymgrtlqntm or ifnqkivngwqveeaddwlrygnpwekarp or glgdvaevrksfnrhlhftlvkdrnvatprdyffa or dsmatlglaaygygiryefg

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WO2008064903A3 (en) * 2006-12-01 2008-07-17 Diagenics Internat Corp Antibody to the epitope grwirtqqhyyerdpkriyylslefymgrtlqntm or ifnqkivngwqveeaddwlrygnpwekarp or glgdvaevrksfnrhlhftlvkdrnvatprdyffa or dsmatlglaaygygiryefg

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