DD263537A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen humanes wachstumshormon - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen Antigendeterminanten des humanen Wachstumshormons (hgH). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie und die medizinische Diagnostik. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit gereinigtem hGH immunisiert wurden, mit X63Ag8.653 Myelomzellen mittels Feldsprungtechnik (Elektrofusion) fusioniert und die erhaltenen Antikoerper-produzierenden Hybridome selektiert. Die mit verschiedenen Antigendeterminanten (Epitopen) reagierenden Antikoerper werden mit einem Antikoerper-Inhibitionstest bestimmt, die spezifischen Hybridome werden ausgewaehlt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper in der Zellkultur eingesetzt oder in der Aszitesform auf Maeuse transplantiert. Einer der Antikoerper A64-D/E3 reagiert mit der als a bezeichneten Antigendeterminante, ein zweiter Antikoerper A64-E/C8 ist gegen die als b bezeichnete Determinante gerichtet. Zwei weitere monoklonale Antikoerper A64-D/F2, A64-E/B12, die ebenfalls durch Elektrofusion erhalten wurden, reagieren gleichfalls mit Determinante a bzw. anderen ueberlappenden Determinanten. Die spezifischen Hybridome wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie am 22. 6. 1987 unter folgenden Registriernummern hinterlegt:DDR-0199 - A64-D/E3DDR-0200 - A64-E/C8DDR-0201 - A64-D/F2DDR-0202 - A64-E/B12

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) gegen Antigendeterminanten (Epitope) des humanen Wachstumshormons (hGH, human Growth Hormone). Anwendungsgebiet sind die Produktbestimmung bei der biotechnologischen Herstellung, die Isolierung und die Reinigung von hGH und die medizinische Diagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

hGH ist ein Polypeptid-Hormon, das in der Hypophyse gebildet wird und das Körperwachstum reguliert. Regulationsstörungen in der Bildung des hGH können u.a. zu Minderwuchs führen. hGH besteht aus einer Po Iy peptid kette und hat ein Molekulargewicht um 22000 Dalton. Seit 1980 sind monoklonal Antikörper gegen hGH bekannt. IVANYI, J., P. DAVIES: Molec. immune 17 (1980), 287-290; BUNDESEN, G. et al.: Endocr. Metab. 51 (19801,1472-1474; VITA, N. et al.: Molec. Immun. 23 (1986), 619-624.

Bisherige Testsysteme zum hGH-Nachweis beruhen in erster Linie auf konventionellen polyklonalen Antiseren z. B. hGH-RIA (Radioimmunoassay zur Bestimmung von Wachstumshormon in Plasma und Serum).

Polyklonale Antikörper haben den Nachteil, daß ihre Herstellung zu Antikörpergemischen unterschiedlicher Quantität und Qualität führt (verschiedene Immungiobuline mit unterschiedlicher antigener Spezifität und funktioneller Aktivität, dabei variieren die Zusammensetzung spezieller Antikörpertypen von Tier zu Tier).

Es gibt bisher nur ein kommerziell vertriebenes Testbesteck zur quantitativen Bestimmung von hGH auf der Basis monoklonaler Antikörper. Es handelt sich um einen Immunradiometrischen Assay (IRMA) entsprechend WRIGHT, J. F., W. M. HUNTER (1983). In: „Immunassays for Clinical Chemistry" (Hunter, W. M., J.E.T.Corrie eds. Churcili Livingstone, Edinburgh, pp. 170—177). Boots-Celltech Diagnostics entwickelte daraus den SUCROSEP™ gegen Wachstumshormon in Human Serum (Produkt-Information 1985), der dadurch gekennzeichnet ist, daß er komplett mit Ausrüstung gekauft werden muß und Firmenabhängigkeit schafft in bezug auf den Kauf radioaktiv markierter Antikörper mit raschem zeitlichen Zerfall.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper mit hoher Spezifität gegen mindestens 2 verschiedene Antigendeterminanten des hGH und geeigneter Bindungsfähigkeit in guten Ausbeuten herzustellen. Die Antikörper sollen zum Aufbau von Testbestecks für die biotechnologische Prozeßkontrolle, Produktisolierung und -reinigung und medizinische Diagnostik geeignet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des hGH ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigtem hGH immunisiert wurden, mit X63 Ag 8.653 Myelomzellen mittels Feldsprungtechnik (Elektrofusion) fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten aussät. Die Antikörper produzierenden Hybridome werden mit einem Festphasen-Radioimmuntest nachgewiesen. Bei diesem Test befindet sich Anti-Maus-Immunglobulin an PVC-Folie (Tabletten-Blister) fixiert. Es folgt die Inkubation mit dem vermutlich Antikörper enthaltenden Kulturüberstand der Hybridome. Als Nachweis für Antikörper wird dann die Bindung von radioaktiv markiertem hGH (mit ¹²⁵J markiert) gemessen. Hybridome mit Antikörperaktivität werden kloniert. Die Reaktion der Antikörper mit verschiedenen Antigendeterminanten wird in einem Antikörperinhibitionstest bestimmt. Drei der erhaltenen Antikörper (A64-D/E3, A64-D/F2 und A64-E/B12) reagieren mit einer als a bezeichneten Determinante, ein weiterer (A64-E/C8) mit einer Determinante b. Die spezifischen Hybridome A64-D/E3 bzw. A64-E/C8, die gegen die zwei

distinkten Determinanten a und b reagieren, werden ausgewählt, weitervermehrt und ggf. nach Lagerung in flüssigen Stickstoff zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung und nach Transplantation eingesetzt.

Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden im ZIM am 22.6.1987 unter folgenden Nummern

DDR-0199 A64-D/E3

DDR-0200 A64-E/C8

DDR-0201 A64-D/F2

DDR-0202 A64-E/B12

registriert.

Durch die Erfindung wird die Herstellung des Paares monoklonaler Antikörper der Hybridome A64-D/E3 und A64-E/C8 gegen die zwei verschiedenen Antigendeterminanten (Epitope) a und b des Wachstumshormons zu dessen quantitativer Bestimmung in einem Zweiseitenbindungstest ermöglicht. Ein derartiger durch Elektrofusion von Zellen hergestelltes Paar monoklonaler Antikörper wurde bisher noch nicht beschrieben. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper sind auf Grund der Reaktion mit unterschiedlichen Antigendeterminanten für den Aufbau von Testbestecks zur biotechnoiogischen Prozeßkontrolle und zur medizinischen Diagnostik geeignet. Die Antikörper eignen sich zur Adsorption an Polystyrol, deshalb sind sie potentiell für Tests geeignet. Der Antikörper A64-E/C8 ist ohne Spezifitätsverlust mit Meerrettich-Peroxydase konjugier bar. Die Bestimmung der monoklonalen Anti körper erg ab, daß A 64-D/E3 und A64-E/B 12 der IgG 2a-Klasse, A64-D/F2 und A64-E/C8der IgG 1-Klasse angehören.

Alle vier Hybridome besitzen gute Stabilität in vitro. Nach Transplantation in Balb/c-Mäusen lassen sich die Antikörper in guter Ausbeute gewinnen.

Für die Antikörper der Hybridome A64-D/E3, A64-E/C8, A64-E/B 12 ist eine Anreicherung mittels Hydroxylapatitchromatographie erzielt worden.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt werden:

Ausführungsbeispiel

1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen hGH-immunisierter Balb/c-Mäuse und X 63 Ag 8.653 Myelomzellen.

a) Fusionierung der Zellen durch Feldsprungtechnik entsprechend KARSTEN, U., G. PAPSDORF, G. ROLOFF, A. STOLLEY, H.ABEL, I. WALTHER und H. WEISS: Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 733 (1985).

b) Kultivierung, Klonierung der Hybridzellen usw. nach PETERS, J. H. et al.: „Monoklonal Antikörper— Herstellung und Charakterisierung", Springer-Verlag 1985.

c) Die Daten zur verwendeten Myelomlinie X63-Ag8.653 bei KEARNEY, Y. F. et al.: Immunol. 123, 1 548-1 550(1979).

2) Die Selektion Antikörper-produzierende Hybridome wurde im Radioimmunoassay nach MICHEEL, B. et al.: Biomed. Biochem. Acta 43 (1983) 1 317-1 323 durchgeführt.

Es wurden folgende vier Klone erhalten:

A64-D/E3 A64-E/C8 A64-D/F2 A64-E/B12

3) Test zur Bestimmung von Antikörpern, die mit unterschiedlichen Antigendeterminanten reagieren. Zur Bestimmung wurde ein Antikörper-Inhibitionstest verwendet entsprechend Patentschrift DD241 823.

50 μΙ eines 1:160 bzw. 1:320 verdünnten Antikörperhaitigen Aszites vom Klon A64-D/E3 wurden in jede Vertiefung einer PVC-Plate (Tablettenblister) eingegeben und bei Zimmertemperatur in der feuchten Kammer über Nacht inkubiert. In einem unabhängigen Testansatz wurden 50 μΙ Antikörperüberstand aus der Gewebekultur des Klons A64-D/E3 bzw. Überstand aus der Gewebekultur des Klons A64-E/C8 mit 50 μΙ radioaktiv markiertem hGH gemischt. Nach Waschung der Blister mit Leitungswasser werden 50 μΙ der Mischung aufgebracht. Anschließend wurde 1 Std. bei 37°C inkubiert. Nach erneuter Waschung wurden die Vertiefungen getrocknet und ausgeschnitten und in einem γ-Strahienzählgerät die gebundene Radioaktivität gemessen. Die Bindung von ¹²⁵J-markiertem hGH findet nicht statt oder ist stark herabgesetzt, wenn der im Gemisch vorliegende Antikörper mit demselben bzw. einem eng benachbarten Epitop (sterische Behinderung) reagiert. Im Vergleich dazu zeigt die Versuchsreihe mit den Antikörpern des Klons A64-E/C8 höhere Radioaktivität. Die Bindung des radioaktiven hGH ist ein Indikator für das Vorhandensein einer anderen Determinante. Der reziproke Versuch: Bindung von Antikörpern des Klons A64-E/C8 an die feste Phase bestätigt das Vorliegen monokionaler Antikörper gegen zwei verschiedene Antigendeterminanten des hGH.

Antikörper Antikörper Radioaktivität

fixiert an Blister im Gemisch mithGH gebunden an Blister

A64-D/E3 A64-D/E3

A64-D/E3 A64-E/C8 +

A64-E/C8 A64-D/E3 +

A64-E/C8 A64-E/C8

Gewinnung der Antikörper

Die ausgewählten spezifischen Hybridome werden zur Herstellung der Antikörper gemäß üblicher Techniken (PETERS, J. H. et al. „Monoklonale Antikörper — Herstellung und Charakterisierung", Springer-Verlag 1985) durch Kultivierung der Hybridome in vitro bzw. aus der Aszitesflüssigkeit von Hybridom-tragenden Mäusen gewonnen.

Claims (2)

1. Patentanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Wachstumshormon (hGH) durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit hGH, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen mittels Feldsprungtechnik (Elektrofusion), Selektion der erhaltenen Hybridome, und ihre Kultivierung bzw. ihre Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen hGH die durch Elektrofusion erhaltenen Hybridzellklone

   A64-D/E3,
   A64-E/C8,
   A64-D/F2,
   A64-E/B12
   eingesetzt werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß die durch die Hybridzellklone A64-D/E3, A64-E/C8 erzeugten Antikörper gegen 2 unterschiedliche Antigendeterminanten reagieren, die willkürlich als a und b bezeichnet werden.