DD263537A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN GROWTH HORMONE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen Antigendeterminanten des humanen Wachstumshormons (hgH). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie und die medizinische Diagnostik. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit gereinigtem hGH immunisiert wurden, mit X63Ag8.653 Myelomzellen mittels Feldsprungtechnik (Elektrofusion) fusioniert und die erhaltenen Antikoerper-produzierenden Hybridome selektiert. Die mit verschiedenen Antigendeterminanten (Epitopen) reagierenden Antikoerper werden mit einem Antikoerper-Inhibitionstest bestimmt, die spezifischen Hybridome werden ausgewaehlt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper in der Zellkultur eingesetzt oder in der Aszitesform auf Maeuse transplantiert. Einer der Antikoerper A64-D/E3 reagiert mit der als a bezeichneten Antigendeterminante, ein zweiter Antikoerper A64-E/C8 ist gegen die als b bezeichnete Determinante gerichtet. Zwei weitere monoklonale Antikoerper A64-D/F2, A64-E/B12, die ebenfalls durch Elektrofusion erhalten wurden, reagieren gleichfalls mit Determinante a bzw. anderen ueberlappenden Determinanten. Die spezifischen Hybridome wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie am 22. 6. 1987 unter folgenden Registriernummern hinterlegt:DDR-0199 - A64-D/E3DDR-0200 - A64-E/C8DDR-0201 - A64-D/F2DDR-0202 - A64-E/B12The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies against antigenic determinants of human growth hormone (hgH). Field of application of the invention is biotechnology and medical diagnostics. The process according to the invention is characterized in that spleen cells of Balb / c mice which have been immunized with purified hGH are fused with X63Ag8.653 myeloma cells by means of electrophoresis and the resulting antibody-producing hybridomas are selected. The antibodies reacting with different antigenic determinants (epitopes) are determined with an antibody-inhibition test, the specific hybridomas are selected and used according to the invention for the production of the monoclonal antibodies in the cell culture or transplanted in the ascitic form on mice. One of the antibodies A64-D / E3 reacts with the antigenic determinant designated as a, a second antibody A64-E / C8 is directed against the determinant designated b. Two other monoclonal antibodies, A64-D / F2 and A64-E / B12, also obtained by electrofusion, also react with determinant a and other overlapping determinants, respectively. The specific hybridomas were deposited at the Central Institute of Molecular Biology on June 22, 1987 under the following registration numbers: DDR-0199-A64-D / E3DDR-0200-A64-E / C8DDR-0201-A64-D / F2DDR-0202-A64-E / B12
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) gegen Antigendeterminanten (Epitope) des humanen Wachstumshormons (hGH, human Growth Hormone). Anwendungsgebiet sind die Produktbestimmung bei der biotechnologischen Herstellung, die Isolierung und die Reinigung von hGH und die medizinische Diagnostik.The invention relates to a process for the production of monoclonal antibodies (MoAb) against antigenic determinants (epitopes) of human growth hormone (hGH). Areas of application include product identification in biotechnological production, isolation and purification of hGH and medical diagnostics.
hGH ist ein Polypeptid-Hormon, das in der Hypophyse gebildet wird und das Körperwachstum reguliert. Regulationsstörungen in der Bildung des hGH können u.a. zu Minderwuchs führen. hGH besteht aus einer Po Iy peptid kette und hat ein Molekulargewicht um 22000 Dalton. Seit 1980 sind monoklonal Antikörper gegen hGH bekannt. IVANYI, J., P. DAVIES: Molec. immune 17 (1980), 287-290; BUNDESEN, G. et al.: Endocr. Metab. 51 (19801,1472-1474; VITA, N. et al.: Molec. Immun. 23 (1986), 619-624.hGH is a polypeptide hormone that is produced in the pituitary gland and regulates body growth. Regulatory disorders in the formation of hGH may include i.a. lead to short stature. hGH consists of a polypeptide chain and has a molecular weight around 22,000 daltons. Since 1980, monoclonal antibodies to hGH have been known. IVANYI, J., P. DAVIES: Molec. Immune 17 (1980), 287-290; BUNDESEN, G. et al .: Endocr. Metab. 51 (19801, 1472-1474; VITA, N. et al .: Molec. Immun. 23 (1986), 619-624.
Bisherige Testsysteme zum hGH-Nachweis beruhen in erster Linie auf konventionellen polyklonalen Antiseren z. B. hGH-RIA (Radioimmunoassay zur Bestimmung von Wachstumshormon in Plasma und Serum).Previous test systems for hGH detection are based primarily on conventional polyclonal antisera z. B. hGH-RIA (radioimmunoassay for determination of growth hormone in plasma and serum).
Polyklonale Antikörper haben den Nachteil, daß ihre Herstellung zu Antikörpergemischen unterschiedlicher Quantität und Qualität führt (verschiedene Immungiobuline mit unterschiedlicher antigener Spezifität und funktioneller Aktivität, dabei variieren die Zusammensetzung spezieller Antikörpertypen von Tier zu Tier).Polyclonal antibodies have the disadvantage that their production leads to antibody mixtures of different quantity and quality (different immuno-levulins with different antigenic specificity and functional activity, the composition of specific antibody types vary from animal to animal).
Es gibt bisher nur ein kommerziell vertriebenes Testbesteck zur quantitativen Bestimmung von hGH auf der Basis monoklonaler Antikörper. Es handelt sich um einen Immunradiometrischen Assay (IRMA) entsprechend WRIGHT, J. F., W. M. HUNTER (1983). In: „Immunassays for Clinical Chemistry" (Hunter, W. M., J.E.T.Corrie eds. Churcili Livingstone, Edinburgh, pp. 170—177). Boots-Celltech Diagnostics entwickelte daraus den SUCROSEP™ gegen Wachstumshormon in Human Serum (Produkt-Information 1985), der dadurch gekennzeichnet ist, daß er komplett mit Ausrüstung gekauft werden muß und Firmenabhängigkeit schafft in bezug auf den Kauf radioaktiv markierter Antikörper mit raschem zeitlichen Zerfall.To date, there is only one commercially available test kit for the quantitative determination of hGH on the basis of monoclonal antibodies. It is an immunoradiometric assay (IRMA) according to WRIGHT, J.F., W. M. Hunter (1983). In: "Immunoassays for Clinical Chemistry" (Hunter, WM, JETCorrie eds., Churcili Livingstone, Edinburgh, pp. 170-177), Boots-Celltech Diagnostics developed the SUCROSEP ™ against Growth Hormone in Human Serum (Product Information 1985), characterized in that it must be purchased complete with equipment and creates company dependence with respect to the purchase of radiolabelled antibodies with rapid temporal decay.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper mit hoher Spezifität gegen mindestens 2 verschiedene Antigendeterminanten des hGH und geeigneter Bindungsfähigkeit in guten Ausbeuten herzustellen. Die Antikörper sollen zum Aufbau von Testbestecks für die biotechnologische Prozeßkontrolle, Produktisolierung und -reinigung und medizinische Diagnostik geeignet sein.The invention aims to produce monoclonal antibodies with high specificity against at least 2 different antigenic determinants of hGH and suitable binding ability in good yields. The antibodies should be suitable for setting up test kits for biotechnological process control, product isolation and purification and medical diagnostics.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des hGH ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigtem hGH immunisiert wurden, mit X63 Ag 8.653 Myelomzellen mittels Feldsprungtechnik (Elektrofusion) fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten aussät. Die Antikörper produzierenden Hybridome werden mit einem Festphasen-Radioimmuntest nachgewiesen. Bei diesem Test befindet sich Anti-Maus-Immunglobulin an PVC-Folie (Tabletten-Blister) fixiert. Es folgt die Inkubation mit dem vermutlich Antikörper enthaltenden Kulturüberstand der Hybridome. Als Nachweis für Antikörper wird dann die Bindung von radioaktiv markiertem hGH (mit 125J markiert) gemessen. Hybridome mit Antikörperaktivität werden kloniert. Die Reaktion der Antikörper mit verschiedenen Antigendeterminanten wird in einem Antikörperinhibitionstest bestimmt. Drei der erhaltenen Antikörper (A64-D/E3, A64-D/F2 und A64-E/B12) reagieren mit einer als a bezeichneten Determinante, ein weiterer (A64-E/C8) mit einer Determinante b. Die spezifischen Hybridome A64-D/E3 bzw. A64-E/C8, die gegen die zweiThe process according to the invention for the production of monoclonal antibodies against various antigenic determinants of hGH is characterized in that spleen cells of Balb / c mice immunized with purified hGH are fused with X63 Ag 8.653 myeloma cells by means of electrophoretic fusion and the hybridomas obtained in Sowing out microplates. The antibody producing hybridomas are detected by a solid phase radioimmunoassay. In this test, anti-mouse immunoglobulin is fixed to PVC film (tablet blister). This is followed by incubation with the suspected antibody-containing culture supernatant of the hybridomas. As evidence for antibody, the binding of radioactively labeled hGH (labeled with 125 J) is then measured. Hybridomas with antibody activity are cloned. The reaction of the antibodies with various antigenic determinants is determined in an antibody inhibition assay. Three of the antibodies obtained (A64-D / E3, A64-D / F2 and A64-E / B12) react with a determinant designated as a, another (A64-E / C8) with a determinant b. The specific hybridomas A64-D / E3 and A64-E / C8, which are resistant to the two
distinkten Determinanten a und b reagieren, werden ausgewählt, weitervermehrt und ggf. nach Lagerung in flüssigen Stickstoff zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung und nach Transplantation eingesetzt.distinct determinants a and b are selected, further amplified and optionally used after storage in liquid nitrogen for the production of monoclonal antibodies by culture and after transplantation.
Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden im ZIM am 22.6.1987 unter folgenden NummernThe hybridomas used for antibody production according to the invention were in the ZIM on 22.6.1987 under the following numbers
DDR-0199 A64-D/E3DDR-0199 A64-D / E3
DDR-0200 A64-E/C8DDR-0200 A64-E / C8
DDR-0201 A64-D/F2DDR-0201 A64-D / F2
DDR-0202 A64-E/B12DDR-0202 A64-E / B12
registriert.registered.
Durch die Erfindung wird die Herstellung des Paares monoklonaler Antikörper der Hybridome A64-D/E3 und A64-E/C8 gegen die zwei verschiedenen Antigendeterminanten (Epitope) a und b des Wachstumshormons zu dessen quantitativer Bestimmung in einem Zweiseitenbindungstest ermöglicht. Ein derartiger durch Elektrofusion von Zellen hergestelltes Paar monoklonaler Antikörper wurde bisher noch nicht beschrieben. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper sind auf Grund der Reaktion mit unterschiedlichen Antigendeterminanten für den Aufbau von Testbestecks zur biotechnoiogischen Prozeßkontrolle und zur medizinischen Diagnostik geeignet. Die Antikörper eignen sich zur Adsorption an Polystyrol, deshalb sind sie potentiell für Tests geeignet. Der Antikörper A64-E/C8 ist ohne Spezifitätsverlust mit Meerrettich-Peroxydase konjugier bar. Die Bestimmung der monoklonalen Anti körper erg ab, daß A 64-D/E3 und A64-E/B 12 der IgG 2a-Klasse, A64-D/F2 und A64-E/C8der IgG 1-Klasse angehören.The invention enables the production of the pair of monoclonal antibodies of the hybridomas A64-D / E3 and A64-E / C8 against the two different antigenic determinants (epitopes) a and b of the growth hormone for its quantitative determination in a two-site binding assay. Such a pair of monoclonal antibodies produced by electrofusion of cells has not yet been described. Due to the reaction with different antigenic determinants, the monoclonal antibodies prepared according to the invention are suitable for the construction of test instruments for biotechnological process control and medical diagnostics. The antibodies are suitable for adsorption on polystyrene, therefore they are potentially suitable for testing. The antibody A64-E / C8 is konjugier bar without specificity loss with horseradish peroxidase bar. The determination of the monoclonal antibodies supplements that A 64-D / E3 and A64-E / B 12 belong to the IgG 2a class, A64-D / F2 and A64-E / C8 of the IgG 1 class.
Alle vier Hybridome besitzen gute Stabilität in vitro. Nach Transplantation in Balb/c-Mäusen lassen sich die Antikörper in guter Ausbeute gewinnen.All four hybridomas have good stability in vitro. After transplantation into Balb / c mice, the antibodies can be obtained in good yield.
Für die Antikörper der Hybridome A64-D/E3, A64-E/C8, A64-E/B 12 ist eine Anreicherung mittels Hydroxylapatitchromatographie erzielt worden.For the antibodies of the hybridomas A64-D / E3, A64-E / C8, A64-E / B 12 an enrichment by means of hydroxylapatite chromatography has been achieved.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt werden:The invention will be illustrated below with reference to an embodiment:
1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen hGH-immunisierter Balb/c-Mäuse und X 63 Ag 8.653 Myelomzellen.1) Preparation of hybridomas from spleen cells of hGH-immunized Balb / c mice and X 63 Ag 8,653 myeloma cells.
a) Fusionierung der Zellen durch Feldsprungtechnik entsprechend KARSTEN, U., G. PAPSDORF, G. ROLOFF, A. STOLLEY, H.ABEL, I. WALTHER und H. WEISS: Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 733 (1985).a) Cell fusion by cell-hopping according to KARSTEN, U., G. PAPSDORF, G. ROLOFF, A. STOLLEY, H. BAREL, I. WALTHER and H. WEISS: Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 733 (1985).
b) Kultivierung, Klonierung der Hybridzellen usw. nach PETERS, J. H. et al.: „Monoklonal Antikörper— Herstellung und Charakterisierung", Springer-Verlag 1985.b) Cultivation, Cloning of the Hybrid Cells, etc., according to PETERS, J.H. et al .: "Monoclonal Antibody Production and Characterization", Springer-Verlag 1985.
c) Die Daten zur verwendeten Myelomlinie X63-Ag8.653 bei KEARNEY, Y. F. et al.: Immunol. 123, 1 548-1 550(1979).c) The data on the myeloma line X63-Ag8.653 used in KEARNEY, Y.F. et al .: Immunol. 123, 1 548-1 550 (1979).
2) Die Selektion Antikörper-produzierende Hybridome wurde im Radioimmunoassay nach MICHEEL, B. et al.: Biomed. Biochem. Acta 43 (1983) 1 317-1 323 durchgeführt.2) The selection antibody-producing hybridomas was in radioimmunoassay MICHEEL, B. et al .: Biomed. Biochem. Acta 43 (1983) 1 317-1 323.
Es wurden folgende vier Klone erhalten:The following four clones were obtained:
A64-D/E3 A64-E/C8 A64-D/F2 A64-E/B12A64-D / E3 A64-E / C8 A64-D / F2 A64-E / B12
3) Test zur Bestimmung von Antikörpern, die mit unterschiedlichen Antigendeterminanten reagieren. Zur Bestimmung wurde ein Antikörper-Inhibitionstest verwendet entsprechend Patentschrift DD241 823.3) Assay for the determination of antibodies that react with different antigenic determinants. For the determination, an antibody inhibition test according to the patent DD241,823 was used.
50 μΙ eines 1:160 bzw. 1:320 verdünnten Antikörperhaitigen Aszites vom Klon A64-D/E3 wurden in jede Vertiefung einer PVC-Plate (Tablettenblister) eingegeben und bei Zimmertemperatur in der feuchten Kammer über Nacht inkubiert. In einem unabhängigen Testansatz wurden 50 μΙ Antikörperüberstand aus der Gewebekultur des Klons A64-D/E3 bzw. Überstand aus der Gewebekultur des Klons A64-E/C8 mit 50 μΙ radioaktiv markiertem hGH gemischt. Nach Waschung der Blister mit Leitungswasser werden 50 μΙ der Mischung aufgebracht. Anschließend wurde 1 Std. bei 37°C inkubiert. Nach erneuter Waschung wurden die Vertiefungen getrocknet und ausgeschnitten und in einem γ-Strahienzählgerät die gebundene Radioaktivität gemessen. Die Bindung von 125J-markiertem hGH findet nicht statt oder ist stark herabgesetzt, wenn der im Gemisch vorliegende Antikörper mit demselben bzw. einem eng benachbarten Epitop (sterische Behinderung) reagiert. Im Vergleich dazu zeigt die Versuchsreihe mit den Antikörpern des Klons A64-E/C8 höhere Radioaktivität. Die Bindung des radioaktiven hGH ist ein Indikator für das Vorhandensein einer anderen Determinante. Der reziproke Versuch: Bindung von Antikörpern des Klons A64-E/C8 an die feste Phase bestätigt das Vorliegen monokionaler Antikörper gegen zwei verschiedene Antigendeterminanten des hGH.50 μΙ of 1: 160 and 1: 320 diluted antibody-containing ascites from clone A64-D / E3 were added to each well of a PVC plate (tablet blister) and incubated at room temperature in the humid chamber overnight. In an independent assay, 50 μΙ antibody supernatant from the tissue culture of clone A64-D / E3 or supernatant from the tissue culture of clone A64-E / C8 was mixed with 50 μΙ radiolabeled hGH. After washing the blisters with tap water 50 μΙ of the mixture are applied. The mixture was then incubated for 1 h at 37 ° C. After washing again, the wells were dried and cut out, and the bound radioactivity was measured in a γ-ray counting apparatus. The binding of 125 I-labeled hGH does not occur or is greatly reduced when the mixed antibody reacts with the same or a closely adjacent epitope (steric hindrance). In comparison, the test series with the antibodies of the clone A64-E / C8 shows higher radioactivity. The binding of radioactive hGH is an indicator of the presence of another determinant. The reciprocal experiment: Binding of antibodies of clone A64-E / C8 to the solid phase confirms the presence of monoclonal antibodies to two different antigenic determinants of hGH.
Antikörper Antikörper RadioaktivitätAntibody Antibody Radioactivity
fixiert an Blister im Gemisch mithGH gebunden an Blisterfixed to blister mixed with hGH bound to blister
A64-D/E3 A64-D/E3A64-D / E3 A64-D / E3
A64-D/E3 A64-E/C8 +A64-D / E3 A64-E / C8 +
A64-E/C8 A64-D/E3 +A64-E / C8 A64-D / E3 +
A64-E/C8 A64-E/C8A64-E / C8 A64-E / C8
Die ausgewählten spezifischen Hybridome werden zur Herstellung der Antikörper gemäß üblicher Techniken (PETERS, J. H. et al. „Monoklonale Antikörper — Herstellung und Charakterisierung", Springer-Verlag 1985) durch Kultivierung der Hybridome in vitro bzw. aus der Aszitesflüssigkeit von Hybridom-tragenden Mäusen gewonnen.The selected specific hybridomas are obtained for the preparation of the antibodies according to conventional techniques (PETERS, JH et al., "Monoclonal Antibodies - Preparation and Characterization", Springer-Verlag 1985) by culturing the hybridomas in vitro and ascites fluid of hybridoma-bearing mice, respectively ,
Claims (2)
A64-E/C8,
A64-D/F2,
A64-E/B12
eingesetzt werden.A64-D / E3,
A64-E / C8,
A64-D / F2,
A64-E / B12
be used.
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| DD30651987A DD263537A1 (en) | 1987-09-01 | 1987-09-01 | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN GROWTH HORMONE |
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| DD263537A1 true DD263537A1 (en) | 1989-01-04 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992008985A2 (en) * | 1990-11-19 | 1992-05-29 | Genentech, Inc. | Ligand-mediated immunofunctional hormone binding protein assay method |
-
1987
- 1987-09-01 DD DD30651987A patent/DD263537A1/en not_active IP Right Cessation
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| WO1992008985A3 (en) * | 1990-11-19 | 1992-10-29 | Genentech Inc | Ligand-mediated immunofunctional hormone binding protein assay method |
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