DD244565A1 - Verfahren zur herstellung eines hcg-spezifischen monoklonalen antikoerpers - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers gegen humanes Choriogonadotropin (HCG). Ziel der Erfindung ist dis Herstellung von Antikörpern hoher Spezifität und starker Bindungsfähigkeit gegen HCG, nicht aber gegen die verwandten Hormone. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit HCG immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die Hybride mit HCG-spezifischen Antikörpern selektiert, in der Zellkultur weiterzüchtet und auf Mäusen in der Aszitesform weitertransplantiert. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

HCG ist funktionell ein Hormon und auf Grund der biochemischen Charakterisierung ein Glykoprotein, das aus zwei Untereinheiten, der a- und der /3-Kette, aufgebaut ist. HCG wird während der Schwangerschaft von der Plazenta synthetisiert, seine Anwesenheit im Urin und Serum ist deshalb ein ausgezeichneter Schwangerschaftsindikator. HCG wird ebenfalls von Trophoblastentumoren sowie einigen Tumoren anderen Ursprungs gebildet. Der HCG-Nachweis hat deshalb ebenfalls für die Tumordiagnostik sowie für die Therapieüberwachung Bedeutung.

Der einfachste und schnellste HCG-Nachweis erfolgt durch Immuntests mit spezifischen Antikörpern. Die Hersteilung spezifischer Antikörper gegen HCG wird jedoch durch die Anwesenheit kreuzreagierender Determinanten auf ähnlich aufgebauten Hormonen (luteinisierendes Hormon — LH, Follikel-stimulierendes Hormon — FSH, thyreotropes Hormon — TSH) erheblich erschwert.

Monoklonale Antikörper, die durch Zellfusion und Selektion antikörperproduzierender Hybridomklone gewonnen wurden, bieten sich für einen spezifischen HCG-Nachweis an. Im internationalen Bereich sind einige monoklonale Antikörper gegen HCG beschrieben worden (R. KOFLER, P. BERGER, G. WICK, Amer. J. Reprod. Immunol. 2,212,1982; H. G. WADA, R. J. DANISCH, S. R. BAXTER et al., din. Chem. 28,1862,1982; W. R. MOYLE, P. H. EHRLICH, R. E. CANFIELD, Proc. Nat. Acad. Sei.79,2245,1982). Die Kombination einer hohen Spezifität, Bindungsintensität und Antikörperproduktion war jedoch nicht in allen Fällen gegeben, so daß in zahlreichen Laboratorien die Suche nach idealen Antikörpern intensiv weiterbetrieben wird.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität gegen humanes Choriogonadotropin (HCG), nicht aber gegen die anderen Hormone, und starker Bindungsfähigkeit in großen Ausbeuten herzustellen. Diese Antikörper sollen zum Aufbau eines Testsystems geeignet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit HCG reagieren, ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit HCG immunisiert wurden, mit X63-Ag 8.653 Myelomzellen in derZellkulturfusioniert und die erhaltenen Hybride in Mikrotestplatten aussät. Die antikörperproduzierenden Klone wurden mit einem Festphasen-Radioimmuntest nachgewiesen und selektioniert.

Für den Test wird Anti-Maus-Immunglobulin an PVC (Tablettenfolie) gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hybridklone und anschließend mit radioaktiv markiertem (¹²⁵J) HCG, LH, FSH bzw. TSH. Zur weiteren Spezifitätsüberprüfung wird mit radioaktiv markierter /3-Kette (/3-HCG) getestet. Die spezifischen Hybridklone wurden ausgewählt, weiter vermehrt und danach in flüssigem Stickstoff gelagert, in bekannter Weise kultiviert und auf Mäusen in der Aszitesform transplantiert.

Die beschriebene Versuchsdurchführung führte zur Herstellung des unikalen Hybridklons (B9-BA8) in mehreren Subklonen.

Der produzierte Antikörper reagiert hoch spezifisch mit HCG, zeigt eine hohe Bindungsintensität, ist in großen ausbeuten gewinnbar und adsorbiert passiv an Plastmaterialien.

Mit dem durch den Hybridklon B9-BA8 produzierten monoklonalen Antikörper besteht die Möglichkeit, einen Immuntest aufzubauen, der HCG spezifisch von. ähnlichen Hormonen unterscheidet. Der Einsatz für die Schwangerschaftsdiagnose erscheint möglich, ebenso der Einsatz zum Nachweis von Tumoren, die HCG und/oder ß-HCG synthetisieren.

Der Hybridklon B9-BA8 wurde unter der Nummer 0104 im Zentralinstitut für Molekularbiologie hinterlegt.

Ausführungsbeispiel

1) Herstellung der Hybride aus Milzzellen von mit HCG immunisierten Balb/c-Mäusen und Y63-Ag 8.653 Myelomzellen; Fusion, Kultivierung, Klonierung etc. nach der Originalarbeit: KÖHLER, G. u. C. MILSTEIN, Nature 1975,256,495-497.

Die Myelomlinie X63-Ag8.653 wurde von KEARNY, J. F. et al., J. Immunol. 1979,123,1547-1557 hergestellt.

2) Die Selektion antikörperproduzierender Hybridome wurde nach MICHEEL, B. et al., J. Immunol. Meth. 1981,46,41-46 durchgeführt. Dabei wurde ein spezifischer Klon isoliert, der mit B9-BA8 bezeichnet wurde.

3) Spezifitätsüberprüfung des monoklonalen Antikörpers B9-BA8.

radioaktiv markiertes Intensität der

Hormon Bindung

HCG + +

/S-HCG + + +

LH* FSH TSH

4) Produzierte Antikörpermengen

Der Hybridklon B9-BA8 produziert den entsprechenden Antikörper in hoher Quantität. Wird er in der konventionellen Zellkultur gehalten, ist der Antikörper noch bei einer Verdünnung von 1:10³ nachweisbar. In der AszitesflüssigkeitHybridomtragender Mäuse sind noch bei Verdünnungen von 1:10^e Antikörper nachweisbar.

Damit entspricht der Klon B9-BA8den stark produzierenden Hybridzellen.

Der produzierte Antikörper läßt sich sehr gut an Plaste (Polyvenylchlorid, Polystyrol) adsorbieren, wodurch eine Grundvoraussetzung zum Aufbau von Festphasen-Immuntests gegeben ist.

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines HCG-spezifischen monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit HCG immunisiert wurden, mit X63-Ag 8.653 Myelomzellen in derZellkulturfusioniert, die antikörperproduzierenden Hybride bestimmt, die Hybride mit HCG-spezifischen Antikörpern selektiert und in bekannter Weise kultiviert und auf Mäusen in der Aszitesform weitertransplantiert.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch mit humanem Choriogonadotropin (HCG) reagiert. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.