TW202405427A - 改良偵測極限的方法及系統 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於降低樣品中分析物存在之偵測極限的改良方法及系統。特定言之,本發明提供一種用於偵測樣品中是否存在分析物的製品或系統(諸如診斷套組),其包含(i)經親和配位體塗佈之微球體或在表面上表現一或多種蛋白質的芽孢或細菌、(ii)信號產生物質及(iii)結合劑,其中該信號產生物質與該結合劑及對該微球體上之該親和配位體或由芽孢或細菌表現之該蛋白質具特異性之抗體結合,其中該等信號產生物質經由對該親和配位體或該蛋白質具特異性之抗體的結合而與該微球體、芽孢或細菌結合。
Description
本發明係關於用於偵測樣品中是否存在分析物的改良偵測極限之製品、方法及系統,特定言之係使用微球體、芽孢或細菌作為偵測劑。
橫向流動分析(LFA)為用於偵測及定量複雜混合物中之分析物的紙基平台,其中將樣品置放於測試裝置上且結果通常在5-30分鐘內顯示。LFA之低開發成本及易生產性已使得其應用擴展至需要快速測試之多個領域。基於LFA之測試廣泛用於醫院、醫生辦公室及臨床實驗室,以供對特定抗原及抗體進行定性及定量偵測。可使用LFA測試多種生物樣品,包括尿液、唾液、汗液、血清、血漿、全血及其他體液。採用基於LFA之測試的其他行業包括獸醫學、品質管制、食品生產中之產品安全以及環境健康及安全。在此等利用領域中,快速測試尤其用於篩檢動物疾病、病原體、化學物質、毒素及水污染物等。
LFA背後之原理簡單:含有所關注分析物之液體樣品(或其萃取物)在無外力(毛細管作用)幫助下移動通過聚合物條帶之不同區域,該等條帶上附著可與分析物相互作用的分子。典型的橫向流動測試條帶由重疊膜組成,該等膜安裝於背襯卡上,以獲得較好穩定性及操縱。在該條帶之一端將樣品塗覆於吸附性樣品墊上,該吸附性樣品墊浸漬有緩衝鹽及界面活性劑,使樣品適合於與偵測系統相互作用。樣品墊確保存在於樣品中之分析物將能夠與結合物之捕捉試劑及膜結合。經處理之樣品經由結合物釋放墊遷移,該結合物釋放墊含有對目標分析物具有特異性且與彩色或螢光粒子結合的抗體—最常見為膠態金奈米粒子(AuNP)及乳膠微球體。樣品與結合至目標分析物之結合抗體一起,沿條帶遷移至偵測區。此為多孔膜(通常由硝化纖維構成),該膜上之測試線及對照線中固定有特定生物組分(主要為抗體或抗原)。其作用為與結合至結合抗體之分析物反應。對樣品中之分析物的識別在測試線上產生適當反應,而對照線上之反應指示適當液體流動穿過條帶。以不同強度呈現之線所表示的讀出可藉由眼或使用專用讀取器評定。由於條帶材料之毛細管力,因此液體流動越過裝置,且為了維持此移動,吸收墊附接於條帶末端處。吸收墊之作用為芯吸過量試劑且防止液體回流。圖1說明此類習知LFA系統之實例,其中N蛋白表示待偵測之分析物。
在常見實務中,與抗體結合之膠態金或彩色乳膠珠粒通常用作橫向流動免疫層析分析(LFIA)中之標記。即使在臨床診斷中具有>90%之高特異性,免疫層析法亦因其約60%的整體低偵測極限而為名聲糟糕。舉例而言,關於低偵測極限,偵測流感病毒所需之樣品侷限於經由咽喉拭子或血液樣品獲取之高濃度樣品,此舉不方便且會使患者產生身體上的不適。
此外,習知標記具有缺陷,諸如偵測時間慢、難以偵測到低濃度的抗原,及缺乏著色性。具體言之,儘管膠態金奈米粒子(例如,Prorast
TM-流感)產生弱的單一類型之顏色,但其具有深顏色及小表面面積;然而,彩色乳膠珠粒(例如,QuickNavi
TM-流感)無法產生深顏色,但其具有大的表面積。顯然,迫切需要在橫向流動免疫層析分析中所用之標記方面存在進展。隨著標記之開發繼續,較高偵測極限將顯著地增加臨床診斷的價值。
表面呈現需要經由基因工程技術在活細胞之細胞膜表面上表現靶蛋白。為了成功呈現,靶蛋白需要與錨定蛋白融合(Van Bloois等人, 「Decorating microbes: surface display of proteins on
Escherichia coli.」
Trends Biotechnol; 29: 79-86, 2011),以便呈現易位不相容的多聚體蛋白(Kim及Schumann, 「Display of proteins on Bacillus subtilis endospores.」
Cell Mol Life Sci; 66: 3127-3136, 2009)。第一表面呈現系統由George P. Smith等人在1985年開發,其中使用絲狀噬菌體M13使抗體在噬菌體之表面上表現。該系統提供一種用於抗原產生之新技術(「Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.」
Science, 228 (4705), 第1315-1317頁, 1985)。表面呈現技術由此應用於其他生物體,諸如細菌、酵母及芽孢。
已對革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)中之表面呈現系統進行廣泛研究。其中,已廣泛研究大腸桿菌(
E. coli),且發現其在細胞表面上呈現異源蛋白(Francisco等人, 「Transport and anchoring of 8-lactamase to the external surface of
Escherichia coli.」
Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 第89卷, 第2713-2717頁, 1992年4月; Georgiou等人, 「Display of pMactamase on the
Escherichia colisurface: outer membrane phenotypes conferred by Lpp'-OmpA'-β- lactamase fusions.」
Protein Engineering第9卷, 第2號, 第239-247頁, 1996)。George Georgiou教授之小組構建融合蛋白,其含有(i)成熟脂蛋白(大腸桿菌之外膜蛋白)的信號序列及前九個N端胺基酸、(ii) OmpA (大腸桿菌之另一外膜蛋白)之胺基酸46-159及(iii)完整β-內醯胺酶。證實此融合蛋白在大腸桿菌外部表現且展現β-內醯胺酶活性(Francisco等人, 1992, Georgiou等人, 1996)。大腸桿菌之表面呈現具有多種不同應用,諸如全細胞生物催化劑、生物吸附劑、肽篩檢、疫苗生產及抗體生產(Nguyen及Schumann, 「Use of IPTG-inducible promoters for anchoring recombinant proteins on the
Bacillus subtilisspore surface.」
Protein Expression and Purification, 95, 第67-76頁, 2014)。
與其他生物體中之系統相比,芽孢上之表面呈現在高穩定性、易於純化及回收以及表現大分子之能力方面具有優勢。由於胞內產生,鑒於異源性錨定蛋白不可穿過任何膜,因此芽孢比非芽孢產生者有利。此外,歸因於剛性芽孢外被,芽孢上所呈現之蛋白質及酶在工業程序期間變得對諸如高溫、化學物質及輻射之惡劣條件具有抗性;其亦可在室溫下長時間儲存(Kim及Schumann, 2009)。
枯草芽孢桿菌為好氧性、革蘭氏陽性細菌。其廣泛存在於土壤、湖泊、海洋、動物及植物中。雖然枯草芽孢桿菌已發現於人類腸中,但其為非病原性的。實驗室中最常用的枯草芽孢桿菌菌株為菌株168、PY79、W23及NCIB3610,其中菌株168之基因體已完全測序。枯草芽孢桿菌之尺寸為約0.7至0.8×3 μm;其不具有莢膜,在整個表面上具有鞭毛,且可移動。
在極端條件下,枯草芽孢桿菌能夠在惡劣之環境條件下進入孢子化且長時間存活。首先,細胞分裂以產生較小前芽孢及較大母體細胞,其間藉由膜分隔開。在下一階段中,母體細胞吞噬前芽孢,且前芽孢之表面產生肽聚糖皮質及芽孢外被。隨後前芽孢在成熟之後自母體細胞釋放(Al-Hinai等人, 「The Clostridium Sporulation Programs: Diversity and Preservation of Endospore Differentiation.」
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 79 (1), 第19-37頁, 2015)。芽孢具有複雜多層結構,其主要由四個層組成:含有重要基因物質DNA之最內部核心,其由內膜包圍;具有肽聚糖作為主要成分之肽聚糖皮質;由包括以下之若干蛋白層構成之芽孢外被:基底層、內被、外被及外皮;及芽孢外壁(Setlow, 「Germination of Spores of Bacillus Species: What We Know and Do Not Know.」
Journal of Bacteriology ,196 (7), 第1297-1305頁, 2014; Henriques等人, Functional architecture and assembly of the spore coat; in Ricca E, Henriques AO, Cutting SM (編): Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. London, Horizon Science Press, 第34-52頁, 2004)。
枯草芽孢桿菌芽孢含有至少70種不同芽孢外被蛋白,包括CotA、CotB、CotC、CotD、CotE、CotF、CotG、CotH、CotJA、CotJC、CotM、CotS、CotSA、CotT、CotX、CotY、CotZ、SpoIVA、SpoVID、YabG及YrbA
(McKenney等人, 「The
Bacillus subtilisendospore: assembly and functions of the multilayered coat」 (2013)
Nature Reviews Microbiology, 11, 第33-44頁; Takamatsu及Watabe, Assembly and genetics of spore protective structures.
Cell Mol Life Sci2002; 59: 434-444),但最佳錨定蛋白為外被蛋白。
許多因素影響枯草芽孢桿菌芽孢表面呈現系統之功效,包括錨定蛋白、靶蛋白、連接子、表現載體及其他實驗參數。近年來,已報導許多錨定蛋白用於枯草芽孢桿菌芽孢表面呈現,包括CotB、CotC、CotG、CotZ、CotX、CotY、CotA、OxdD、CotE、CotZ、CgeA及其他外被蛋白。其中,已深度研究CotB、CotC及CotG。CotB為用於芽孢表面呈現技術之第一種芽孢外被蛋白,且不同長度之CotB已用作錨定蛋白以成功地將外源性蛋白定位於芽孢表面上(Isticato等人, 「Surface display of recombinant proteins on
Bacillus subtilisspores.」
J. Bacteriol.183: 6294-6301, 2001)。連接子肽可形成穩定螺旋結構以解決在錨定蛋白與靶蛋白之間具有剛性結構之問題。大量研究已展示,在構築重組型載體時包括柔性連接子肽為調節融合酶之功能的有效方式。外源蛋白與錨定蛋白之融合可藉由使蛋白質之N端、C端及夾心結構密切關聯在一起來實現。該融合方法係在孢子化過程期間經由錨定方向來決定,從而使靶蛋白與錨定蛋白一起定位於芽孢表面上進行表現。枯草芽孢桿菌芽孢表面呈現可藉由重組及非重組融合方法進行(Isticato, 「Spore Surface Display.」
Microbiol. Spectr.2(5), 2014)。重組方法主要基於使用整合型或游離型質體將編碼外來蛋白及錨定蛋白之基因融合。在誘導芽孢形成過程的同時,外來蛋白成功地呈現於芽孢表面上而不影響芽孢之結構及功能。
基於全細胞之生物感測器廉價且易於操作,且充當快速篩檢之替代方案(Bereza-Malcolm等人, 2015; Mehta等人, 2016)。在該方法中,將合成基因併入細胞中,其中靶向特定化合物,且產生易於偵測之信號(Liu等人, 「Cell-based biosensors and their application in biomedicine.」
Chem. Rev., 114, 6423-6461, 2014; Tian等人, 「Construction and comparison of yeast whole-cell biosensors regulated by two RAD54 promoters capable of detecting genotoxic compounds.」
Toxicol. Mech. Methods, 27, 第115-120頁, 2017)。舉例而言,可使用化學活化螢光素酶基因表現(calux)偵測特定化學物質(Sany等人, 「An overview of detection techniques for monitoring dioxin-like compounds: latest technique trends and their applications.」
RSC Adv., 6, 第55415-55429頁, 2016)。細胞含有螢光素酶基因及其調節DNA。在待測試之化學物質結合於其對應受體蛋白之後,複合物連接至調節DNA且誘導螢光素酶表現。Calux已用於偵測戴奧辛(dioxin)(Sany等人, 2016; Xu等人, 「A rapid and reagent-free bioassay for the detection of dioxin-like compounds and other aryl hydrocarbon receptor (AhR) agonists using autobioluminescent yeast」
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 410, 第1247-1256頁, 2018)、雙酚A
(Dusserre等人, 「Using bisphenol A and its analogs to address the feasibility and usefulness of the CALUX-PPARγ assay to identify chemicals with obesogenic potential」
Toxicology in Vitro, 53, 第208-221頁, 2018)、雜環芳族胺(Steinberg等人, 「Screening of molecular cell targets for carcinogenic heterocyclic aromatic amines by using calux reporter gene assays.」
Cell Biology and Toxicology, 33, 第283-293頁, 2017)及其他化合物。對於戴奧辛而言,偵測耗時大約24小時(不包括樣品製備時間),且偵測極限為1 pM
(Sany等人, 2016)。
抗生物素蛋白係一種蛋白質,其來源於對生物素(在多種真核生物過程中起作用之輔因子)展現相當大親和力之禽類及兩棲動物。抗生物素蛋白及其他生物素結合蛋白(包括鏈黴抗生物素蛋白及中性抗生物素蛋白)能夠結合至多四個生物素分子。抗生物素蛋白-生物素複合物為蛋白質與配位體之間已知最強的非共價相互作用(Kd=10
-15M)。生物素與抗生物素蛋白之間極快地形成鍵,且一旦形成,則不受pH、溫度、有機溶劑或其他變性劑之極值影響。生物素及抗生物素蛋白之此等特徵—鏈黴抗生物素蛋白及中性抗生物素蛋白共有之特徵—可用於純化或偵測與相互作用之任一組分結合之蛋白質。
US 11,275,082揭示使用芽孢或細菌之表面上表現重組蛋白之重組芽孢或細菌及使用此類重組芽孢或細菌之偵測系統來偵測樣品中是否存在分析物的方法。該等方法藉由使用信號產生物質偵測重組蛋白與分析物之結合來偵測分析物之存在。使用LFA之方法之一實例展示於圖2中。改良以上方法之偵測極限為合乎需要的。
在本發明中,將包含與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之微球體、芽孢或細菌的製品用作LFA中的偵測試劑。此改良之偵測方法具有若干優點,諸如較易操縱、較低成本、較高可視性、較快偵測時間、較易多工處理及較低偵測極限/較高偵測極限。
因此,本發明提供用於偵測樣品中是否存在分析物的製品、系統及方法,其具有改良之偵測極限(LOD)。特定言之,本發明提供一種用於偵測樣品中是否存在分析物的製品,該製品用於諸如診斷套組之系統中。該製品包含與高負載量之信號產生物質結合的微球體、芽孢或細菌,該信號產生物質進一步與至少一種能夠特異性結合至分析物的結合劑結合。
在一個態樣中,信號產生物質包含染料、螢光染料、螢光蛋白、膠態金奈米粒子(AuNP)、具有顏色之奈米粒子或能夠將不提供信號之基質轉化為提供信號之基質的酶。舉例而言,具有顏色之奈米粒子為染料結合之纖維素奈米粒子。
在一個態樣中,使用本發明之製品、系統或方法之分析物之偵測極限(LOD)在10
-13至10
-15mol範圍內。較佳地,LOD為10
-14或10
-15mol。
在一個態樣中,微球體包含聚合物微球體、二氧化矽微球體或磁性微球體。較佳地,聚合物微球體為聚苯乙烯微球體。
在一個態樣中,分析物為蛋白質,例如抗原或抗體。舉例而言,若分析物為蛋白質或抗原,則能夠特異性結合於分析物之試劑可為對蛋白質或抗原具有特異性之抗體或對待偵測之蛋白質或抗原具有親和力之蛋白質。
在一個態樣中,表現於芽孢或細菌之表面上的蛋白質特異性結合於信號產生物質,該信號產生物質又特異性結合於分析物。在一個實施例中,表現於芽孢或細菌表面上之微球體或蛋白質的一或多種親和配位體包含選自以下之蛋白質:鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G,較佳為鏈黴抗生物素蛋白。
在另一實施例中,表現於芽孢或細菌之表面上的蛋白質為融合蛋白,其中該融合蛋白較佳包含芽孢之外被蛋白及細菌之外源性蛋白或膜蛋白(或人造膜蛋白)以及外源性蛋白,其中該外源性蛋白較佳為鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L或/及蛋白A/G。
在另一實施例中,芽孢由芽孢桿菌種、較佳枯草芽孢桿菌、更佳選自菌株168、PY79、W23及NCIB3610之枯草芽孢桿菌菌株產生。在一較佳實施例中,由芽孢表現之融合蛋白包含選自CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ之外被蛋白。
在一個態樣中,該等細菌來源於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉質葡萄球菌、淋病奈瑟氏菌(
Neisseria gonorrhoeae)、腸沙門氏菌(
Salmonella enterica)、乳酸乳球菌或格氏鏈球菌(
Streptococcus gordonii),較佳為大腸桿菌。
在又一態樣中,該系統進一步包含具有測試區及對照區之膜,其中對分析物具有特異性之抗體或抗原固定於測試區及/或對照區中以用於偵測樣品中是否存在或不存在分析物。較佳地,該膜為LFA中常用之硝化纖維素膜。
在一較佳態樣中,微球體或在芽孢或細菌之表面上表現之蛋白質與分析物之結合係藉由LFA偵測。
本發明進一步提供一種使用上述製品及/或系統偵測樣品中之分析物的方法。
定義
除非另外定義,否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。
熟習此項技術者將能識別應認識到,類似或等效於本文所描述之彼等之多種方法及材料,其可用於本發明之實踐實施中的許多方法及材料。實際上,本發明決不受限於所描述之方法及材料。出於本發明之目的,以下術語定義如下。
如本文所用之術語「分析物」係指樣品中待偵測存在或不存在之物質,其可為化合物或蛋白質,諸如抗原或抗體。
如本文所用之術語「微球體」係指用於診斷或研究之微珠粒,其選自(但不限於)聚合物微球體、二氧化矽微球體或磁性微球體。舉例而言,聚合物微球體為聚苯乙烯微球體。聚苯乙烯微球體包含非官能化聚苯乙烯、官能化聚苯乙烯、染色聚苯乙烯及親和配位體塗佈之聚苯乙烯。舉例而言,官能化聚苯乙烯包含用於特定蛋白質、肽及核酸共價固定化之經羧酸酯修飾之聚苯乙烯、胺聚苯乙烯或其他聚苯乙烯。染色聚苯乙烯浸漬有活性染料以用於最佳可視化,其經常用於橫向流動分析中。經親和配位體塗佈之聚苯乙烯可塗佈識別分子,包括(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G。
術語「細菌(bacterium/bacteria)」係指所有革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌,包括(但不限於)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉質葡萄球菌、淋病奈瑟氏菌、腸沙門氏菌、乳酸乳球菌及格氏鏈球菌。
術語「芽孢」包括常用於監測滅菌過程之任何芽孢及內生孢子。舉例而言,來自枯草芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、生孢梭菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌之芽孢適用。枯草芽孢桿菌菌株168、PY79、W23及NCIB3610之芽孢尤其適用。芽孢可未經純化或經純化。舉例而言,枯草芽孢桿菌芽孢可藉由水性懸浮液之差速離心而分離成重芽孢及輕芽孢。在以2,000 x g離心12至15分鐘後,重芽孢集結,而輕芽孢保留於懸浮液中。可藉由以2,000 x g離心30分鐘而使來自第一次離心之上清液中的輕芽孢集結。可藉由將重芽孢之稀釋懸浮液通過WhatmanGF/D玻璃纖維過濾器過濾來進一步純化重芽孢,以將少量的瓊脂、變性核蛋白及在第一次離心中與芽孢一起沈積之其他碎屑移除。
如本文所用之術語「外源性」意謂來源於宿主菌株外部,且術語「外源性蛋白」包括蛋白質、肽及多肽。
經親和配位體塗佈之聚苯乙烯之「親和配位體」或本發明之細菌或芽孢所表現之「蛋白質」包含選自(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G之蛋白質。
術語「外被蛋白」在本文中以最廣泛意義使用且包括存在於芽孢外被之外層中且暴露於芽孢表面上之任何原生蛋白質,及此類原生蛋白質之功能性片段及功能性胺基酸序列變異體。該術語包括任何形成芽孢之屬種及芽孢桿菌屬之亞種的原生外被蛋白序列,及此類原生外被蛋白序列之功能性片段及功能性胺基酸序列變異體。在此上下文中,術語「原生」用於指原生序列多肽,而非指其來源或製備模式。因此,原生外被蛋白可自其原生來源分離,但亦可藉由其他方式製備,例如合成及/或重組方法。功能性胺基酸序列變異體包括嵌合變異體,其包含兩個或更多個外部暴露之原生芽孢外被蛋白序列或其片段之融合物。較佳外被蛋白包括CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ。
術語「芽孢外被蛋白B」及「CotB蛋白」可互換使用,且係指外部暴露之芽孢外被蛋白,其特徵為C端處之高度疏水區,且基於序列同源性歸類為CotB,諸如CotBl或CotB2蛋白。較佳地,本文中之CotB蛋白展示彼此及與外被層締合之枯草芽孢桿菌芽孢外被之42.9-kDa組分的胺基端三分之二的顯著胺基酸序列一致性。本文中代表性CotB蛋白之序列展示於SEQ ID NO: 1中,其具體包括於本文中之芽孢外被蛋白B (CotB)之定義內。
術語「變異體」及「胺基酸序列變異體」可互換使用,且包括原生序列之取代、缺失及/或插入變異體。在一較佳實施例中,蛋白質變異體與原生序列具有至少約80%胺基酸序列一致性、或至少約85%胺基酸序列一致性、或至少約90%胺基酸序列一致性、或至少約92%胺基酸序列一致性、或至少約95%胺基酸序列一致性、或至少約98%胺基酸序列一致性。
「功能性」片段或變異體保留傳播及穩定地呈現於芽孢(諸如芽孢桿菌芽孢)之表面上的能力。
術語「表面上之蛋白質表現」在本文中以最廣泛意義使用且包括蛋白質(諸如芽孢外被蛋白或重組蛋白)之完全及部分暴露。
術語「融合」在本文中用於指不同來源之胺基酸序列依據其編碼核苷酸序列之同框組合而組合成的一條多肽鏈。術語「融合」明確涵蓋內部融合,亦即除與其一個末端融合之外,亦涵蓋在多肽鏈內插入不同來源序列。
術語「化合物」係指化學上的化合物,諸如生物素、戴奧辛、地高辛(digoxin)及其他蛋白質結合或抗體結合化學物質。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用,且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物,其中一或多個胺基酸殘基為天然存在之相應胺基酸之人造化學類似物,且適用於天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸在本文中可由其通常已知三個字母符號或由命名委員會推薦之術語指代。同樣,核苷酸可由公認的其單字母代碼指代,亦即IUPAC-IUB所推薦之單字母符號。
「聚核苷酸」及「核酸」係指一種聚合物,其由核苷酸單元(核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、天然存在之相關結構變異體及非天然存在之其合成類似物)經由磷酸二酯鍵、天然存在之相關結構變異體及非天然存在之其合成類似物連接而構成。因此,該等術語包括核苷酸聚合物,其中核苷酸及其間的鍵聯包括非天然存在之合成類似物。應理解,在上下文需要時,當核苷酸序列係以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時,此亦包括其中「U」替換「T」之RNA序列(亦即A、U、G、C)。
如本文所用,「抗體」係指包含一或多種多肽的蛋白質,該一或多種多肽基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼。術語抗體用於意謂完整抗體及其結合片段。所識別之免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及多種免疫球蛋白可變區基因。輕鏈係歸類為κ或λ。重鏈係歸類為γ、μ、α、δ或ε,其又界定免疫球蛋白種類,分別為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型免疫球蛋白(例如抗體)結構單元包含四聚體。各四聚體由兩對相同多肽鏈組成,各對具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之N端界定約100至110個或更多個胺基酸的可變區,其主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)分別指此等輕鏈及重鏈。在本申請案中,術語「抗體」尤其涵蓋(但不限於)單株抗體、多株抗體及抗體片段。
「抗原」一般係指能夠引發抗體在宿主中形成或產生與該物質具有反應性之特定淋巴球群體的物質。抗原可包含宿主之外來大分子(例如多肽、蛋白質及多糖)。
術語「結合劑」係指與信號產生物質結合且特異性結合至分析物的試劑。舉例而言,結合劑可為針對分析物之抗體或分析物之結合搭配物。
當用於抗體與蛋白質或肽之相互作用時,術語「特異性結合(specific binding/specifically binds)」意謂該相互作用視蛋白質上存在的特定結構(亦即,例如抗原決定子或抗原決定基)而定;換言之,抗體識別且結合至特定蛋白質結構而非一般蛋白質。舉例而言,若抗體對抗原決定基「A」具有特異性,則含有抗原決定基A (或未標記的自由A)之蛋白質存在於含有經標記「A」及抗體之反應物中將減少結合於抗體之經標記A的量。
術語「偵測劑」係指可結合分析物且產生偵測信號的試劑。較佳地,偵測劑為芽孢、細菌或微球體,其結合以修飾包含分析物之結合搭配物的AuNP。更佳地,偵測劑包括對待偵測之分析物具有特異性的初級抗體及對該初級抗體具有特異性的二級抗體。在一個實施例中,偵測劑包含信號產生物質。此類偵測可用此項技術中通常已知之技術進行,包括(但不限於)流式細胞量測術、橫向流動分析及ELISA。
術語「信號產生物質」係指提供可由眼或偵測器(諸如螢光顯微鏡)偵測到之信號的物質。此類信號產生物質包括(但不限於)染料、螢光染料、螢光蛋白質、膠態金奈米粒子、具有顏色之奈米粒子、纖維素奈米粒子或能夠將不提供信號之基質轉化為提供信號之基質的酶。信號產生物質可為用於偵測蛋白質或結合劑與分析物之結合的偵測劑。
術語「標記」或「用……標記」在本文中用於指可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方式偵測之任何組合物。此類標記包括用於將經標記之鏈黴抗生物素蛋白結合物染色的生物素、磁性珠粒(例如戴諾磁珠(Dynabeads))、螢光染料(例如螢光素、德克薩斯紅(Texas Red)、若丹明(rhodamine)、綠色螢光蛋白及其類似物)、輻射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶及ELISA中通常使用之其他酶)、量熱標記(諸如膠態金奈米粒子或彩色玻璃或塑膠(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠粒),及比色標記,諸如具有顏色之奈米粒子或纖維素奈米粒子。教示此類標記之使用的專利包括(但不限於)美國專利第3,817,837號;第3,850,752號;第3,939,350號;第3,996,345號;第4,277,437號;第4,275,149號;及第4,366,241號(皆以引用之方式併入本文中)。本發明中涵蓋之標記可藉由許多方法偵測。舉例而言,輻射性標記可使用照相軟片或閃爍計數器偵測,且螢光標記可使用偵測發光的光偵測器偵測。通常藉由提供酶與基質且偵測酶作用於基質而產生之反應產物來偵測酶標記,並且藉由簡單地目測有色標記來偵測量熱標記。
術語「橫向流動分析」係指基於抗原與抗體之間的特異性及免疫親和力、使用膠態金作為顯色劑進行偵測的分析。在此類分析之實例中,首先將針對目標物質之抗體固定於硝化纖維素膜上之測試線中,且將針對以上抗體(針對目標物質)的二級抗體固定於膜上之對照線中;接著使膠態金粒子與針對目標物質之另一抗體結合且固定於結合釋放墊上。當樣品含有目標物質時,針對結合釋放墊上之目標物質結合物之膠態金抗體將結合目標物質,且一旦複合物到達測試線,則測試線中針對目標物質之抗體將結合上述複合物且引起顯色。對照線中固定之二級抗體可結合針對目標物質結合物之膠態金抗體且充當陽性對照。在本發明中,抗體、抗原或競爭試劑可固定於陽性區域及/或陰性區域中以用於偵測樣品中是否存在或不存在分析物。舉例而言,選自以下之一或多種物質可固定於膜上之陽性或陰性區域中:針對分析物、載體蛋白、芽孢、芽孢上之蛋白質或結合劑的抗體;競爭試劑;及被分析物識別之抗原。
術語「N蛋白」係指包含全長SARS-CoV-2核衣殼蛋白之核蛋白。較佳地,N蛋白為商業化產品HyTest目錄號8COV3。N蛋白為用於偵測抗(SARS-CoV-2核衣殼蛋白)抗體之抗原。
藉由橫向流動分析進行偵測
本發明之偵測系統可用於經由橫向流動分析、使用經染料、螢光染料、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、具有顏色之奈米粒子、纖維素奈米粒子或酶標記之偵測劑偵測樣品中是否存在分析物,該偵測劑可將不提供信號之物質轉化為提供信號之物質。
較佳地,用金奈米粒子標記偵測劑。在一個實施例中,金奈米粒子與抗芽孢抗體及對分析物具有特異性之抗體結合以形成AuNP-Ab複合物。在一個實施例中,金奈米粒子與抗大腸桿菌抗體及對分析物具有特異性之抗體結合以形成AuNP-Ab複合物。在另一實施例中,金奈米粒子與抗鏈黴抗生物素蛋白抗體及對分析物具有特異性之抗體結合以形成AuNP-Ab複合物。在另一實施例中,金奈米粒子與抗鏈黴抗生物素蛋白抗體及對分析物具有特異性之親和配位體結合以形成AuNP-配位體複合物。在一個實施例中,偵測劑係與AuNP-Ab複合物或AuNP-配位體複合物結合之芽孢。在另一實施例中,偵測劑為與AuN-Ab複合物或AuN-配位體複合物結合之大腸桿菌。較佳地,芽孢或大腸桿菌表現重組融合蛋白,其中該融合蛋白較佳包含芽孢之外被蛋白及重組細菌之外源性蛋白或膜蛋白(或人造膜蛋白)及外源性蛋白,其中該外源性蛋白較佳為鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L或/及蛋白A/G。在另一實施例中,芽孢由芽孢桿菌種、較佳枯草芽孢桿菌、更佳選自菌株168、PY79、W23及NCIB3610之枯草芽孢桿菌菌株產生。在一較佳實施例中,由芽孢表現之融合蛋白包含選自CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ之外被蛋白。
舉例而言,請參照如下實施例,其中偵測劑為與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之芽孢,如圖3中所示。在此實施例中,分析物係N蛋白,且用於偵測N蛋白存在之製品係芽孢,其經由對芽孢表面上表現之蛋白質具有特異性之抗體,在其表面上表現與高負載量之信號產生物質(亦即AuNP)結合之一或多種蛋白質。在此實施例中,結合劑為與AuNP結合之抗N蛋白抗體,且在芽孢表面上表現之蛋白質為鏈黴抗生物素蛋白。
在以上實施例中,LFA系統之膜在此包含施配有抗小鼠IgG二級抗體之對照線及施配有抗N蛋白抗體之測試線。當樣品包括N蛋白時,膜將展示兩條陽性線(對照線及測試線)。在此情境下,樣品中之N蛋白將同時結合於與AuNP結合之抗N蛋白抗體及固定在膜上之抗N蛋白抗體。因此,在測試線處所示之由偵測劑產生之信號(亦即,與芽孢結合之AuNP-Ab複合物)指示測試樣品中存在N蛋白。另一方面,當樣品缺乏N蛋白時,膜將僅展示一條線對照線。
在一個實施例中,偵測劑為與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之細菌。較佳地,該等細菌來源於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉質葡萄球菌、淋病奈瑟氏菌、腸沙門氏菌、乳酸乳球菌或格氏鏈球菌,較佳為大腸桿菌。
舉例而言,請參照如下實施例,其中偵測劑係與AuNP結合之細菌,如圖4中所示。在此實施例中,分析物為N蛋白且用於偵測N蛋白存在之製品係大腸桿菌,其經由對大腸桿菌表面上表現之蛋白質具有特異性之抗體,在其表面上表現與高負載量之AuNP結合之一或多種蛋白質。在此實施例中,結合劑為與AuNP結合之抗N蛋白抗體,且在細菌表面上表現之蛋白質為鏈黴抗生物素蛋白。LFA系統之膜在此包含施配有抗小鼠IgG二級抗體之對照線及施配有抗N蛋白抗體之測試線。當樣品包括N蛋白時,膜將展示兩條線(對照線及測試線)。在此情境下,樣品中之N蛋白將同時結合於與AuNP結合之抗N蛋白抗體及固定在膜上之抗N蛋白抗體。因此,在測試線處之由偵測劑產生之信號(亦即,與大腸桿菌結合之AuNP-Ab複合物)指示測試樣品中存在N蛋白。另一方面,當樣品缺乏N蛋白時,膜將僅展示一條線對照線。
在一個實施例中,偵測劑為與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之微球體。較佳地,微球體為聚苯乙烯微球體。特定言之,聚苯乙烯微球體塗有親和配位體以與AuN-Ab複合物結合。
舉例而言,請參照如下實施例,其中偵測劑係與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之微球體,如圖5中所示。在此實施例中,分析物為N蛋白,且用於偵測N蛋白存在的製品為塗有鏈黴抗生物素蛋白的微球體,該鏈黴抗生物素蛋白經由抗鏈黴抗生物素蛋白抗體與AuNP結合。在此實施例中,結合劑為與AuNP結合之抗N蛋白質抗體。LFA系統之膜在此包含施配有抗小鼠IgG二級抗體之對照線及施配有抗N蛋白抗體之測試線。當樣品包括N蛋白時,膜將展示兩條陽性線(對照線及測試線)。在此情境下,樣品中之N蛋白將同時結合於與AuNP結合之抗N蛋白抗體及固定在膜上之抗N蛋白抗體。因此,在測試線處之由偵測劑產生之信號(亦即,與微球體結合之AuNP-Ab複合物)指示測試樣品中存在N蛋白。另一方面,當樣品缺乏N蛋白時,膜將僅展示一條線對照線。
舉例而言,請參照如下實施例,其中偵測劑係與膠態金奈米粒子(AuNP)結合之微球體,如圖6中所示。在此實施例中,分析物為小鼠β-gal抗體且用於偵測小鼠抗β-gal抗體存在的製品為經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體。在此實施例中,結合劑為與AuNP結合之β-gal蛋白。此處LFA系統之膜包含施配有兔抗β-gal抗體之對照線及施配有抗小鼠IgG抗體之測試線。當樣品包括小鼠抗β-gal抗體時,該膜會展示兩條陽性線(對照線及測試線)。在此情境下,與先前實施例不同,此類分析物(亦即小鼠抗β-gal抗體)會同時結合於與AuNP結合之β-gal蛋白及固定在膜上之抗小鼠IgG Ab。因此,偵測劑在測試線處產生之信號(亦即,與微球體結合之AuNP-β-gal蛋白複合物)指示測試樣品中存在抗β-gal抗體。另一方面,當樣品缺乏抗β-gal抗體時,膜僅會展示一條線(對照線)。
根據本發明,與僅使用膠態金奈米粒子相比,使用本發明偵測劑之偵測極限(LOD)減少10至1000倍。在一個實施例中,分析物之LOD為10
-14mol。在另一實施例中,分析物之LOD為10
-15mol。由於纖維素奈米粒子具有優良可見度,故其能夠比習知標記更好地偵測低抗原濃度。由於抗原濃度低於LOD,較高偵測極限意謂較少偽陰性。相應地,可建立早期診斷。此外,較高偵測極限能夠經由使用唾液或其他低濃度樣品(例如鼻拭子或自吹鼻涕樣本)而非咽喉拭子或血液樣品來減少患者的身體不適。
本發明之其他細節藉由以下非限制性實例說明。
實例 1 : 如圖 3 中所示使用芽孢及金奈米粒子 (AuNP) 、 藉由 LFA 偵測 N 蛋白 1.1 AuNP 修飾及使用經修飾之 AuNP 塗佈芽孢
將濃度為26 mM之16 μl碳酸鉀溶液添加至100 μl AuNP溶液(臺灣先進奈米技術(Taiwan Advanced Nanotech)/奈米金-40)中。將濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗N蛋白Ab (HyTest目錄號3CV4/C524)及濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗芽孢抗體(Mybiosource/mbs612878)添加至AuNP溶液中且使混合物在4℃下反應16小時,隨後添加16 μl之10% BSA且等待30分鐘。隨後在4℃下在4000 xg下離心混合物40分鐘,且移除上清液。將沈澱物再懸浮於100 μl PBS中。使實例1之1-4中獲得之OD
600=1的1 ml芽孢(枯草芽孢桿菌168/BCRC編號:17890)在4℃下、在12000 xg下離心3分鐘,且移除上清液。將沈澱物與PBS中再懸浮之AuNP充分混合以使得經修飾之AuNP與芽孢結合,且將混合物(AuNP-芽孢結合物)在4℃下儲存以供使用。
1.2 條帶製備
將1 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 mg/ml抗N蛋白抗體(HyTest目錄號3CV4/C706)分別施配至膜(Millipore/HF1200)上之對照線及測試線(膜上2 μl/cm),隨後在室溫下進行乾燥步驟2小時。隨後使膜浸沒於1% PVA (聚乙烯醇)溶液中30分鐘,接著在室溫下進行乾燥步驟2小時。在乾燥之後,將膜切割成寬度為0.5 cm之條帶且儲存於4℃下。
1.3 偵測
將以上2-1中製備之100 μl AuNP-芽孢結合物與1 μl N蛋白(HyTest目錄號8COV3)在不同濃度下充分混合。隨後,將條帶立即置放於上述溶液混合物中,且在乾燥約20分鐘之後拍攝相片以記錄結果。
1.4 結果
發現當N蛋白之量為10
-15mol時,測試線示出信號,且抗體量愈大,信號愈強(參見圖7)。
實例 2 : 如圖 4 中所示使用 大腸桿菌 及金奈米粒子 (AuNP) 、 藉由 LFA 偵測 N 蛋白 2.1 AuNP 修飾及使用經修飾之 AuNP 塗佈 大腸桿菌
將100 μl AuNP溶液(臺灣先進奈米技術/奈米金-40)添加至濃度為26 mM之16 μl碳酸鉀溶液中。將濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗N蛋白Ab (HyTest目錄號3CV4/C524)及濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗大腸桿菌抗體(abcam/ab137967)(來自兔)添加至AuNP溶液中且使混合物在4℃、450 rpm下反應16小時,隨後添加16 μl之10% BSA且在4℃、450 rpm下等待30分鐘。隨後在4℃下、在4000 xg下離心混合物40分鐘,且移除上清液。將沈澱物再懸浮於100 μl PBS中。將1 ml經培養之大腸桿菌(大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655/BCRC編號:51956)在12000 xg下、在4℃下離心3分鐘,且移除上清液。將沈澱物添加至先前混合物中且與PBS中再懸浮之AuNP充分混合,使得經修飾之AuNP與大腸桿菌結合,且將混合物(AuNP-大腸桿菌結合物)在4℃下儲存以供使用。
2.2 條帶製備
在背襯卡上安裝硝化纖維素膜(MILLIPORE目錄號SHF1200425)。將2 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 mg/ml抗N蛋白抗體(HyTest目錄號3CV4/C706)分別施配至膜(MILLIPORE目錄號SHF1200425)上之對照線及測試線(膜上2 μl/cm),隨後在室溫下進行乾燥步驟2小時。隨後使膜浸沒於1% PVA (聚乙烯醇)溶液中30分鐘,接著在室溫下進行乾燥步驟2小時。在乾燥之後,將膜切割成寬度為0.5 cm之條帶且儲存於4℃下。
2.3 偵測
將以上3-1中製備之100 μl AuNP-大腸桿菌結合物與1 μl N蛋白(HyTest目錄號8COV3)在不同濃度下充分混合。隨後,將條帶立即置放於上述溶液混合物中,且在乾燥約20分鐘之後拍攝相片以記錄結果。
2.4 結果
發現當N蛋白之量為10
-14mol時,測試線示出信號,且抗體量愈大,信號愈強(參見圖8)。
實例 3 : 如圖 5 中所示使用經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體及金奈米粒子 (AuNP) 、 藉由 LFA 偵測 N 蛋白 3.1 AuNP 修飾及使用經修飾之 AuNP 塗佈聚苯乙烯微球體
將100 μl AuNP溶液(臺灣先進奈米技術/奈米金-40)添加至濃度為26 mM之16 μl碳酸鉀溶液中。將濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗N蛋白Ab (HyTest目錄號3CV4/C524)及濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗鏈黴抗生物素蛋白Ab (abcam/ab191338)添加至AuNP溶液中且使混合物在4℃下反應16小時,隨後添加16 μl之10% BSA且等待30分鐘。隨後在4℃下在4000 xg下離心混合物40分鐘,且移除上清液。將沈澱物再懸浮於100 μl PBS中且與2 μl經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體(Bangs Laboratories目錄號CP01004/CP01N,1.557x10
10個微球體/ml)充分混合。隨後在4℃下儲存混合物(AuNP-微球體結合物)以供使用。
3.2 條帶製備
將1 μL之2 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 μL之1 mg/ml抗N蛋白Ab (HyTest目錄號3CV4/C706)分別施配至膜(Millipore/HF1200)上之對照線及測試線(膜上2 μl/cm),隨後在乾燥箱中進行乾燥步驟2小時。隨後使膜浸沒於1% PVA中30分鐘,隨後在乾燥箱中進行乾燥步驟2小時。在乾燥之後,將膜切割成寬度為0.5之條帶且儲存於4℃下。
3.3 偵測
將以上3-1中製備之100 μl AuNP-微球體結合物與1 μl N蛋白(HyTest目錄號8COV3)在不同濃度下充分混合。隨後,將條帶立即置放於上述溶液混合物中,且在乾燥約20分鐘之後拍攝相片以記錄結果。
3.4 結果
發現當N蛋白之量為10
-14mol時,陽性線示出信號,且抗體量愈大,信號愈強(參見圖9)。
實例 4 : 如圖 6 中所示使用鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體及金奈米粒子 (AuNP) 、 藉由 LFA 偵測抗 β -gal 蛋白抗體 4.1 AuNP 修飾及使用經修飾之 AuNP 塗佈聚苯乙烯微球體
將100 μl AuNP溶液(臺灣先進奈米技術/奈米金-40)添加至濃度為26 mM之16 μl碳酸鉀溶液中。將濃度為1 mg/ml之0.5 μl β-gal蛋白(Novusbio/NBP2-62407)及濃度為1 mg/ml之0.5 μl抗鏈黴抗生物素蛋白Ab (abcam/ab191338)添加至AuNP溶液中且使混合物在4℃下、在450 rpm下反應16小時,隨後添加16 μl之10% BSA且等待30分鐘。隨後在4℃下、在4000 xg下離心混合物40分鐘,且移除上清液。將沈澱物再懸浮於100 μl PBS中且與2 μl經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體(Bangs Laboratories目錄號CP01004/CP01N,1.557x10
10個微球體/ml)充分混合,且在4℃下儲存混合物(AuNP-微球體結合物)以供使用。
4.2 條帶製備
將1 μL之2 mg/ml抗小鼠IgG二級抗體(SIGMA/M8890)及1 μL之1 mg/ml兔抗β-gal Ab (abcam/ab616)分別施配至膜(Millipore/HF1200)上之對照線及測試線(膜上2 μl/cm),隨後在乾燥箱中進行乾燥步驟2小時。隨後使膜浸沒於1% PVA中30分鐘,隨後在乾燥箱中進行乾燥步驟2小時。在乾燥之後,將膜切割成寬度為0.5之條帶且儲存於4℃下。
4.3 偵測
將以上4.1中製備之100 μl AuNP-微球體結合物與1 μl小鼠抗β-gal Ab (Novusbio/NBP2-52702)在不同濃度下充分混合。隨後,將膜立即置放於上述溶液混合物中,且在乾燥約20分鐘之後拍攝相片以記錄結果。
實例 5 : 如圖 1 中所示使用金奈米粒子 (AuNP) 、 藉由習知 LFA 偵測 N 蛋白 5.1 AuNP修飾
將100 μl AuNP溶液(臺灣先進奈米技術/奈米金-40)添加至濃度為26 mM之16 μl碳酸鉀溶液中。將濃度為1 mg/ml之1 μl抗N蛋白抗體(HyTest目錄號3CV4/C524)添加至AuNP溶液中且使混合物在4℃下反應16小時,隨後添加16 μl之10% BSA且等待30分鐘。隨後在4℃下、在4000 xg下離心混合物40分鐘。隨後,移除上清液,且將沈澱物再懸浮於100 μl PBS中且在4℃下儲存以供使用。
5.2 條帶製備
將1 mg/ml抗N蛋白抗體(HyTest目錄號3CV4/C706)及2 mg/ml抗小鼠IgG Ab (SIGMA/M8890)分別施配至膜(Millipore/HF1200)上之對照線及測試線(膜上2 μl/cm),隨後在室溫下進行乾燥步驟2小時。隨後使膜浸沒於1% PVA中30分鐘,隨後在室溫下進行乾燥步驟2小時。隨後,將膜浸沒於5%蔗糖溶液中30秒。在乾燥之後,將膜切割成寬度為0.5 cm之條帶且儲存於4℃下。
5.3 偵測
將經修飾之AuNP與1 μl N蛋白在不同濃度下充分混合。隨後,將條帶立即置放於上述溶液混合物中,且在乾燥約10分鐘之後拍攝相片以記錄結果。
5.4 結果
發現當N蛋白的量為10
-12時,陽性線顯示微弱信號,且N蛋白濃度愈高,信號愈強(參見圖10)。此外,含有10
-13mol、10
-14mol或10
-15mol之N蛋白的樣品在陽性線中不存在信號。
顯然,與習知LFA方法相比,本發明之偵測系統使用如實例1至4中所展現之結合物、藉由LFA偵測N蛋白之偵測極限提高1,000倍。
圖1展示的圖說明習知LFA系統之實例。
圖2展示的圖說明US 11,285,082中所揭示之LFA系統之一實例。
圖3展示的圖說明使用芽孢及金奈米粒子(AuNP)、藉由LFA偵測N蛋白之本發明之一實施例。
圖4展示的圖說明使用大腸桿菌及AuNP、藉由LFA偵測N蛋白之本發明之一實施例。
圖5展示的圖說明使用鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體及AuNP、藉由LFA偵測N蛋白之本發明之一實施例。
圖6展示的圖說明使用鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體及AuNP、藉由LFA偵測抗β-gal蛋白抗體的本發明之另一實施例。
圖7展示使用芽孢及金奈米粒子、藉由LFA偵測N蛋白之結果。
圖8展示使用大腸桿菌及金奈米粒子、藉由LFA偵測N蛋白之結果。
圖9展示使用鏈黴抗生物素蛋白塗佈之聚苯乙烯微球體及金奈米粒子、藉由LFA偵測N蛋白之結果。
圖10展示使用AuNP、藉由習知LFA偵測N蛋白之結果。
Claims (22)
- 一種用於偵測樣品中是否存在分析物之製品,該製品包含(i)經親和配位體塗佈之微球體或在表面上表現一或多種蛋白質的芽孢或細菌、(ii)信號產生物質及(iii)結合劑,其中該信號產生物質與該結合劑及對該微球體上之該親和配位體或由該芽孢或細菌所表現之該蛋白質具特異性之抗體結合,其中該等信號產生物質經由對該親和配位體或該蛋白質具特異性之該等抗體的結合而與該微球體、芽孢或細菌結合。
- 如請求項1之製品,其中該芽孢係由芽孢桿菌種產生。
- 如請求項2之製品,其中該芽孢係由選自菌株BH60、168、PY79、W23及NCIB3610之枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)菌株產生。
- 如請求項1之製品,其中該細菌來源於大腸桿菌( Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcal aureus)、木糖葡萄球菌( Staphylococcal xylosus)、肉質葡萄球菌( Staphylococcal carnosus)、淋病奈瑟氏菌( Neisseria gonorrhoeae)、腸沙門氏菌( Salmonella enterica)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)或格氏鏈球菌( Streptococcus gordonii)。
- 如請求項4之製品,其中該細菌來源於大腸桿菌。
- 如請求項1至5中任一項之製品,其中表現於該芽孢或細菌之表面上的該蛋白質為融合蛋白。
- 如請求項6之製品,其中該融合蛋白包含(i)該芽孢之外被蛋白及外源性蛋白或(ii)該細菌之膜蛋白及外源性蛋白。
- 如請求項7之製品,其中該外源性蛋白為鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L及/或蛋白A/G。
- 如請求項6之製品,其中該融合蛋白由該芽孢表現且包含選自CotA、CotB、CotC、CotE、CotG、CotW、CotX、CotY及CotZ之外被蛋白。
- 如請求項1之製品,其中該微球體包含聚合物微球體、二氧化矽微球體或磁性微球體。
- 如請求項10之製品,其中該聚合物微球體為聚苯乙烯微球體。
- 如請求項11之製品,其中該聚苯乙烯微球體包含非官能化聚苯乙烯、官能化聚苯乙烯、染色聚苯乙烯及經親和配位體塗佈之聚苯乙烯。
- 如請求項12之製品,其中親和配位體為選自鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L及蛋白A/G之蛋白質。
- 如請求項13之製品,其中該親和配位體為鏈黴抗生物素蛋白。
- 如請求項1之製品,其中該結合劑為針對該分析物之抗體。
- 如請求項1之製品,其中該信號產生物質包含染料、螢光染料、螢光蛋白、膠態金奈米粒子、具有顏色之奈米粒子或能夠將不提供信號之基質轉化為提供信號之基質的酶。
- 一種用於偵測樣品中是否存在分析物之系統,該系統包含如請求項1至16中任一項之製品。
- 如請求項17之系統,其用於LFA。
- 如請求項18之系統,其中該系統進一步包含具有測試區及對照區之膜,其中(a)當該分析物係抗原時,對該分析物具有特異性之抗體固定於該測試區中,且針對對該分析物具有特異性之抗體的二級抗體固定於該對照區中,或(b)當該分析物係抗體時,針對該分析物之二級抗體固定於該測試區中,且對該分析物所識別之抗原具有特異性之抗體固定於該對照區中。
- 如請求項16至18中任一項之系統,其係診斷套組。
- 如請求項19之系統,其中該膜為硝化纖維素膜。
- 一種使用如請求項17至21中任一項之系統偵測樣品中是否存在分析物的方法。
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