KR20110069809A - 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질 및 이를 포함하는 셀룰로스 분해조성물 - Google Patents

Abstract

셀룰로스를 확장시킬 수 있는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 종래의 식물 유래 익스팬신 단백질과 동일한 기능을 수행하면서도 식물 유래 익스팬신 단백질과는 달리 대량생산이 가능하고 생산비용을 현저히 저감시킬 수 있다. 특히 목질계 바이오매스를 셀룰라제로 가수분해하여 포도당을 얻고자 할 때 셀룰라제에 의한 셀룰로스 가수분해 속도를 높여 당 수율을 현저히 향상시킬 수 있다. 이를 통해 실제 바이오에너지 생산에 있어서 원핵생물 유래 익스팬신으로 효소의 양을 줄임으로써 바이오에너지의 생산비용을 저감할 수 있다. 또한, 펄프, 면 섬유(예, 청바지) 등의 조직을 연화시키는 특성이 있어 제지산업에서의 바이오펄핑이나 섬유산업에서의 바이오스토닝과 같은 목적으로 이용될 수 있다.

Description

셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질 및 이를 포함하는 셀룰로스 분해조성물{A prokaryotic expansin protein for activating cellulose expansion and cellulose-degrading composition comprising the same}

본 발명은 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질 및 이를 포함하는 셀룰로스 분해조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 셀룰로스의 확장활성을 가지는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질 및 이를 포함하는 셀룰로스 분해조성물에 관한 것이다.

셀룰로스를 에탄올로 발효될 수 있는 당으로 가수분해함으로써 목질계 바이오매스를 이용하고자 하는 연구개발이 50 년 이상이 진행되고 있지만(Kim et al. 2005; Nguyen et al. 1998; Sherrad and Kressman 1945; Torget et al. 1991), 이러한 기술의 산업화는 여전히 과제로 남아 있다. 이는 헤미셀룰로스와 리그닌의 복합체에 의해 셀룰로스가 화학적 및 생화학적으로부터 단단히 보호를 받고 있어 셀룰로스를 당화하는 것이 쉽지 않은 것이 주요인으로 작용하기 때문이다. 그러므로, 셀룰로스계 바이오매스를 바이오연료나 화학소재로 전환하기 위한 전단계에서 이루어지는 전처리 및 셀룰로스 분해효소를 이용한 당화공정은 에탄올 생산에 있어 높은 비용을 요하는 공정이 된다(Gregg et al. 1998; Lynd et al. 2008; Wingren et al. 2003). 따라서, 경제적인 관점에서 볼 때, 셀룰로스의 가수분해 속도 및 정도를 개선하는 효과적인 셀룰로스 분해효소(셀룰라제)의 개발이 필수적이다.

바이오매스의 가수분해에는 다량의 셀룰라제가 요구되므로, 리그노셀룰로스의 비용효율적인 처리에 있어 셀룰라제 효소의 비용이 가장 큰 걸림돌이 된다. 노보자임스(Novozymes) 사에 의하면, 동일한 양의 에탄올을 리그노셀룰로스로부터 생산하는 경우, 전분에 비해 40 내지 100 배 중량의 효소가 필요하다고 한다(Merino and Cherry 2007). 셀룰로스 분해효소가 성공적으로 작용하려면 몇 가지 장애를 극복해야 한다. 즉, 불용성 기질에 접근할 수 있어야 하고, 고도로 규칙적인 고분자의 정렬을 파괴시켜야 하며, 분리된 고분자 사슬을 효소의 활성부위로 가져와야 한다. 요컨대, 셀룰로스의 가수분해에는 여러 효소에 의한 협동 공격이 요구된다.

셀로비오하이드로라제(CBH) 및 엔도글루카나제(EG)와 같은 셀룰로스 분해효소의 상승효과는 비교적 많이 연구된 반면(Irwin et al. 1993; Medve et al. 1994; Woodward et al. 1988), 셀룰로스 분해 단백질과 비가수분해 단백질 사이의 관계는 분명히 밝혀지지 않았다. 식물 세포벽의 성장과 세포벽 내로의 침입을 촉진하기 위하여, 식물의 익스팬신(Cosgrove 2000a; Cosgrove 2000b; McQueen-Mason and Cosgrove 1994), 진균류의 스월레닌, 그리고 선충류의 익스팬신 유사단백질(Qin et al. 2004)과 같은 일부 비가수분해 단백질은 식물 세포벽과 다당류(예컨대, 셀룰로스나 헤미셀룰로스)의 정렬상태를 느슨하게 하거나 파괴할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 "파괴" 활성은 흔히 인장강도시험기(extensometer)를 사용하여 식물 세포벽 또는 거름종이의 약화 정도를 측정함으로써 측정한다(McQueen-Mason and Cosgrove 1994; Saloheimo et al. 2002). 이러한 익스팬신 및 익스팬신 유사단백질의 파괴활성은 셀룰로스가 효소에 용이하게 접근하도록 함으로써 효소에 의한 셀룰로스의 가수분해를 촉진하는 것으로 생각된다. 익스팬신과 셀룰라제에 의한 이러한 상승효과는 2001년에 처음 발견되었으나(Cosgrove 2001), 순수한 익스팬신의 이종 과발현(heterologous overexpression)을 통해 활성 재조합 단백질을 얻고자 하는 시도는 성공하지 못하였다. 최근에, β-익스팬신과 25~40%의 서열 유사성을 갖는 초본 화분계(grass pollen group)-2/3 알레르겐인 GR2 단백질은 트리코데르마의 엔도글루카나제와 상승작용을 하는 것으로 보고되었다(Cosgrove 2007). 익스팬신과 비교할 때, GR2는 크기가 익스팬신보다 작고(~10 kDa) 대장균에서 활성 상태로 쉽게 발현된다는 장점이 있다. 최근, 옥수수 부산물에서 정제된, 아직 확인되지 않은 비가수분해 단백질(55.78 kDa)이 거름종이의 가수분해에 있어 셀룰라제와 상승작용을 하는 것으로 밝혀졌다(Han and Chen 2007). 그러나, 식물 외의 숙주 생물에서의 활성 익스팬신의 발현은 성공적이지 못하였으며, 따라서 셀룰로스의 가수분해를 촉진하기 위한 익스팬신의 이용에는 어려움이 있다.

결국, 식물 유래 익스팬신 단백질이 셀룰로스의 확장활성을 가져 셀룰로스의 분해를 돕는 것은 이미 알려져 있으나, 이를 숙주 생물에서 발현하기 어려워 대량생산이 극히 곤란한 문제점을 가지고 있으며(미국특허 제6326470호), 상기 익스팬신 단백질을 진균류 등의 진핵생물에서 생산하는 경우 세포벽 확장활성이 극히 미미하여 산업상 이용하기 어려운 문제가 있었다(미국공개특허 제2003-104546호).

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본 발명은 상술한 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 기술적 과제는 식물유래 셀룰로스 확장 단백질인 익스팬신이 숙주 생물에서 발현하기 어려운 문제점을 해결하기 위하여 익스팬신과 기능적, 구조적 유사성을 가지는 단백질을 원핵생물에서 찾아 이를 대량생산할 수 있는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 기술적 과제는 셀룰로스에 대한 셀룰로스 분해효소의 분해능이 향상된 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 포함하는 셀룰로스 분해조성물 및 이를 이용한 셀룰로스 분해방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 기술적 과제는 본 발명의 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 포함하는 셀룰로스 분해조성물의 다양한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 기술적 과제는, 원핵생물 유래 익스팬신 단백질의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.

상술한 첫번째 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 셀룰로스 확장활성을 가지는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 제공한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 원핵생물은 바실러스 서브틸리스, 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis, KCTC 2396), 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum), 네오사르토리야 피쉐리(Neosartorya fischeri), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 에케리첼라 니둘란스(Emericella nidulans, 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea), 피레노포라 트리티시-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 패오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 프란키아(Frankia sp.), 스트렙토마이시스 스비세우스(Streptomyces sviceus), 소란지움 셀룰로줌(Sorangium cellulosum), 스티그마텔라 아우렌티아카(Stigmatella aurantiaca), 플레시오시스티스 나시피카(Plesiocystis pacifica), 믹소코쿠스 잔터스(Myxococcus xanthus), 렙토쓰릭스 콜로드니(Leptothrix cholodnii), 로제이플렉서스(Roseiflexus sp), 로제이플렉서스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 헤르페토시폰 아우란티아쿠스(Herpetosiphon aurantiacus), 에시도보락스 아베네(Acidovorax avenae subsp), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 잔토모나스 캠페스트리스(Xanthomonas campestris pv. campestris), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 잔토모나스 오라이제(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum), 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis), 잘렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 나카무렐라 멀티파리타(Nakamurella multipartite), 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.), 카테눌리스포라 애시디필라(Catenulispora acidiphila) 및 디키야 지(Dickeya zeae)로 구성된 군으로부터 선택된 원핵생물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 원핵생물은 바실러스 서브틸리스, 스티그마텔라 아우렌티아카, 잔토모나스 오라이제 또는 하헬라 제주엔시스일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 익스팬신 단백질은 서열번호 1 내지 47에 기재된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 또는 본 발명의 단백질은 서열번호 1 내지 47의 단백질뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적인 셀룰로스 확장활성을 가지는 모든 변이 단백질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 익스팬신 단백질은 서열번호 20, 22, 30 또는 35에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상술한 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 상술한 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 포함하는 셀룰로스 분해조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 셀룰로스 분해조성물은 셀룰로스 분해효소를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 셀룰로스 분해효소는 셀룰라제, 셀로비오하이드로라제, 엔도글루카나제 및 셀로비아제 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 셀룰로스 분해조성물은 1 g의 셀룰로스에 대하여 셀룰로스 분해효소 0.01~0.05 FPU 및 원핵생물 유래 익스팬신 200~400 ㎍을 포함할 수 있다.

또한, 상술한 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 셀룰로스 분해조성물을 후 40~60 ℃에서 셀룰로스에 첨가하는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, pH 7 이하에서 상기 셀룰로스 분해조성물을 셀룰로스와 반응시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 하헬라 제주엔시스 유래의 익스팬신(EXLX1) 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 가지며 셀룰로스 확장활성을 가지는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 제공한다.

본 발명의 세 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여, 목질계 바이오매스를 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 목질계 바이오매스에 포함된 셀룰로스를 분해하여 환원당을 생산하는 단계를 포함하는 바이오에너지 생산방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 종이 또는 펄프를 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 종이 또는 펄프를 연화시키는 단계를 포함하는 종이 또는 펄프의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 섬유 또는 직물을 연화시키는 단계를 포함하는 섬유 또는 직물의 처리방법을 제공한다.

본 발명의 네 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여 식물 유래 익스팬신과 구조적 유사성을 가지는 원핵생물 유래 단백질을 찾는 단계; 상기 원핵생물 유래 단백질을 클로닝하는 단계; 및 상기 클로닝된 원핵생물 유래 단백질을 균주에서 발현하는 단계를 포함하는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질의 대량생산방법을 제공한다.

본 발명은 셀룰로스 확장능력을 가지는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 제공한다. 상기 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 종래의 식물 유래 익스팬신 단백질과 동일한 기능을 수행한다. 상기 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 식물 유래 익스팬신 단백질과 달리, 산업적 규모로 매우 낮은 비용으로 생산할 수 있다. 특히, 상기 원핵생물 유래 익스팬신 단백질과 셀룰라제를 이용하여 목질계 바이오매스를 포도당으로 가수분해하는 경우, 셀룰라제에 의한 셀룰로스의 가수분해 속도가 현저하게 증가할 수 있으며, 결과적으로 당 수율이 개선된다. 이를 통해 실제 바이오에너지 생산에 있어서 원핵생물 유래 익스팬신으로 효소의 양을 줄임으로써 바이오에너지ββ의 생산비용을 저감할 수 있다. 또한, 상기 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 펄프, 면 섬유(예, 청바지) 등의 조직을 연화시키고 변화시키는 특성이 있어 바이오펄핑이나 바이오스토닝과 같은 목적으로 이용될 수 있다.

도 1은 BsEXLX1(PDB id : 2bh0)와 제아 메이스(Zea mays)로부터 얻은 식물 유래 익스팬신 EXPB(Zea m 1, PDB id : 2hcz)의 구조를 비교한 것이다. 위 : 골격구조를 중첩하여 표시한 입체도. BsEXLX1와 EXPB는 각각 검은색과 회색으로 나타내었다. 아래 : 구조에 기초한 두 단백질의 서열정렬. 두 단백질의 아미노산 잔기가 동일한 부분은 짙은 회색으로 표시하였다. EXPB 구조(2hcz)에 기초한 서열정렬에서, 2차구조는 원기둥(α-나선) 또는 화살표(β-가닥)로 표시하였다.
도 2는 재조합 대장균으로부터 얻은 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. M : 여러 질량값의 단백질 마커; 1 : 불용성 단백질; 2 : 가용성 단백질; 3 : 정제된 BsEXLX1(24 kDa).
도 3은 100% 셀룰로스로 이루어진 거름종이를 거름종이 1 g 당 100 ㎍의 BsEXLX1 또는 소 혈청 알부민(BSA) 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.012 FPU의 셀룰라제로 인큐베이션했을 때, BsEXLX1에 의한 셀룰로스 가수분해의 상승효과를 보여준다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 4는 BsEXLX1의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 0, 100, 200 또는 300 ㎍의 BsEXLX1 또는 BSA 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 5는 StEXLX1의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 0, 100, 200 또는 300 ㎍의 StEXLX1 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 6은 XoEXLX1의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 0, 100, 200, 300 또는 400 ㎍의 XoEXLX1 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 7은 HcEXLX1이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 0 및 360 ㎍의 HcEXLX1 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 8은 셀룰라제의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 0, 100, 200 또는 300 ㎍의 BsEXLX1 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 50 ℃에서 0.012, 0.06, 0.12 또는 0.6 FPU의 셀룰라제로 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 9는 상등액 및 0, 6, 12 또는 24 시간 동안 셀룰라제 및/또는 BsEXLX1의 혼합물로 인큐베이션한 거름종이로부터 얻은 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. 각 인큐베이션 시간에서 밴드 강도를 스캔하였으며, 각 단백질에 대한 결과값은 인큐베이션 시간 0에서의 값으로 표준화하였고, 75 kDa에서의 주된 단백질 밴드 강도는 셀룰라제로 확인되었다. (a) 셀룰라제만으로 처리한 거름종이로부터 얻은 상등액. (b) 셀룰라제와 BsEXLX1으로 처리한 거름종이로부터 얻은 상등액. (c) BsEXLX1만으로 처리한 거름종이로부터 얻은 상등액. (d) BSA만으로 처리한 거름종이로부터 얻은 상등액. (e) 셀룰라제만으로 처리한 거름종이. (f) 셀룰라제와 BsEXLX1으로 처리한 거름종이. (g) BsEXLX1만으로 처리한 거름종이. (h) BSA만으로 처리한 거름종이.
도 10은 반응온도가 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 300 ㎍의 BsEXLX1 존재 하에 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내, 30, 40, 50, 60 또는 70 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 36 시간 동안 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 11은 반응완충액의 pH가 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향을 보여준다. 거름종이를 거름종이 1 g 당 300 ㎍의 BsEXLX1 존재 하에 pH 3, 4, 4.8, 6 또는 7의 시트르산염 완충액 내, 50 ℃에서 0.06 FPU의 셀룰라제로 36 시간 동안 인큐베이션하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 12는 완충액 단독(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8), BsEXLX1 또는 BSA(각각 600 ㎍/mL)를 포함하는 완충액, 또는 8 M 요소(urea) 내에서 인큐베이션한 와트만(Whatman) 거름종이 No. 3의 인장강도를 보여준다. 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 13은 여러 용액 내에서, 30 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 와트만 거름종이 No. 3의 주사전자현미경 사진[(a)~(d): x 300, (e)~(i): x 900]이다. (a)~(e) : BsEXLX1(600 ㎍/mL)을 포함하는 완충액(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)으로 인큐베이션한 거름종이; (b), (f) : 8 M 요소 용액으로 인큐베이션한 거름종이; (c), (h) : BSA(600 ㎍/mL)를 포함하는 완충액(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)으로 인큐베이션한 거름종이; (d), (i) : 완충액(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)만으로 인큐베이션한 거름종이.
도 14a 내지 14n은 다양한 원핵생물의 익스팬신 유사단백질의 서열분석으로부터 얻은 서열정보를 보여준다.
도 15는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 BLAST 검색으로부터 얻은 상위 20개 상동서열에 대한 다중서열정렬의 결과를 보여준다.
도 16은 다중서열정렬을 이용한 분자다양성 트리를 보여준다.
도 17a 및 17b는 다중서열정렬을 이용한 분자다양성 트리를 보여준다.
도 18은 스티그마텔라 아우렌티아카로부터 유래한 StEXLX1의 아미노산 서열이다.
도 19는 잔토모나스 오라이제로부터 유래한 XoEXLX1의 아미노산 서열이다.
도 20은 하헬라 제주엔시스로부터 유래한 HcEXLX1의 아미노산 서열이다.

상술한 바와 같이, 종래의 식물 유래 익스팬신은 셀룰로스를 확장시켜 셀룰로스 분해효소의 분해능을 향상시키는 데 매우 효과적이나, 숙주 생물에서 발현하기 어려워 대량생산이 불가능하였다. 일부 진핵세포에서 식물 유래 익스팬신과 구조적, 기능적으로 유사한 단백질이 발견되었지만, 이 경우 대량생산은 가능해도 셀룰로스 확장활성이 현저하게 떨어지는 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는 셀룰로스를 확장시켜 주는 식물 유래 익스팬신과 구조적 유사성을 갖는 단백질을 원핵생물에서 찾아 셀룰로스의 기질 분해효율을 높였다. 상기 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 식물 유래 익스팬신과 아미노산 서열, 구조, 그리고 기능에 있어 유사성을 가지며 셀룰로스 분해효소(특히 셀룰라제)의 분해효율을 증진시켜준다.

식물은 단단한 세포벽을 가지므로, 새로운 성분의 합성을 위해서는 세포벽을 이완시켜야 한다. '익스팬신'은 원래 세포벽을 확장시켜 세포벽의 합성을 촉진하는 것으로 알려진 식물 단백질이다. 익스팬신이 세포벽 분해활성을 가지는 것은 아니지만, 익스팬신은 불용성 세포벽 성분(예컨대, 셀룰로스)과 결합하여 이완활성을 제공한다. 익스팬신의 작용 메커니즘은 아직 완전히 알려지지 않았지만, 불용성 셀룰로스계 다당류들 사이의 수소결합을 깨는 것으로 생각된다. 식물 유래 익스팬신의 세포벽 이완활성을 다양한 용도에 적용한 특허는 거의 알려져 있지 않다.

익스팬신은 여러 식물들 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 현재까지 서열이 밝혀진 모든 식물 게놈에서 발견된다. 진균류나 선충류와 같은 진핵생물에서는, 서열적, 기능적 상동성이 밝혀졌다. 예컨대, 트리코데르마 레세이(T. reesei)로부터, 식물 유래 익스팬신 단백질과 서열 유사성을 가지는, 익스팬신 유사 도메인을 갖는 스월레닌 단백질이 확인되었다. 그러나, 식물 유래 익스팬신과 유사한 원핵생물 유래 단백질은 아직 발견되지 않았다.

식물 유래 익스팬신(제아 메이스 EXPB, PDB code: 2hcz)의 분자구조가 최근에 밝혀졌다. 또한 PDB에 기탁된 바실러스 서브틸리스의 yoaJ 단백질(YoaJ, PDB code: 1hb0) 역시 익스팬신과 높은 구조적 유사성을 보이지만, 그 기능은 아직 확인되지 않았다. 본 발명자들은 이들 구조를 기반으로 하여 서열 데이터베이스를 검색한 결과, 식물 유래 익스팬신과 서열 유사성을 갖는 몇몇 박테리아 유래 단백질을 확인하였다. 이들은 대부분 기능이 알려지지 않은 단백질이다.

본 발명자들은 이들 박테리아 유래 단백질 중 일부를 클로닝하여 익스팬신의 기능을 가지는지 확인하였다. 이들 박테리아 유래 단백질을 대장균 내에서 과발현시킨 후 정제하여, 본 발명자들은 이들 단백질이 식물 세포벽 성분(예컨대, 불용성 셀룰로스)에 대한 결합 및 이완활성을 가짐을 확인하였다. 본 발명자들은 이러한 활성을 셀룰라제에 의한 셀룰로스계 물질의 분해와 관련하여 시험하였다. 본 발명자들은 식물 유래 익스팬신과 서열적 또는 기능적 유사성을 가지는 이러한 원핵생물 유래 단백질을 바이오매스의 전처리 용도로 이용하고자 하였다.

구조에 기초한 서열분석 - 3D 구조정보를 이용한 서열 모델로부터 상동관계가 밝혀지는 경우가 간혹 있다. 본 발명자들은 익스팬신이 '바윈(Barwin) 유사 엔도글루카제'(model #) 도메인과 'PHL 화분 알레르겐'(model #) 도메인을 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 가장 광범위한 도메인 데이터베이스 중 하나인 Pfam으로부터 이에 상응하는 도메인들(DPBB-PF03330 및 화분 알레르겐-PF01357)을 찾아내었다. 따라서, 본 발명자들은 하나의 전사해독 프레임(ORF) 내에 동시에 두 개의 서열 모델을 갖는 단백질을 익스팬신 유사체로 간주하였다.

또한, 본 발명자들은 BLAST의 바실러스 서브틸리스의 yoaJ 서열을 이용하여 공개된 데이터베이스들(예컨대, Genbank)을 검색하였다. P 값이 0.001보다 작은(P < 0.001) 경우를 유사체 선정의 통계적 기준으로 하였다.

본 발명자들은 익스팬신과 기능적, 서열적 또는 구조적으로 유사한, 아직까지 보고된 바 없는 박테리아 유래 단백질을 확인하였다. 먼저, Protein Data Bank(PDB)에 기탁된 Zea m 1의 식물 유래 β-익스팬신(EXPB, PDB id : 2hcz)과 구조적 유사성을 가지는 박테리아 유래 익스팬신을 탐색하였다. 본 발명자들은 Charlier 등이 2006년에 구조를 밝힌(Petrella et al. 2006) 바실러스 서브틸리스의 YoaJ 단백질을 찾아내었으며, 이를 익스팬신 명명법(Kende et al. 2004)에 따라 BsEXLX1으로 명명하고, BsEXLX1의 구조를 공개하였으나, 아직 출판되지는 않았다(PDB id : 2bh0).

박테리아 유래 익스팬신 유사체들의 기능을 최초로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 대장균 내에서 BsEXLX1을 포함하는 박테리아 유래 단백질을 클로닝하고 발현시켰다. 정제된 단백질의 익스팬신 유사 기능을 생체 외에서 시험하였으며 셀룰로스 가수분해에서의 역할을 조사하였다.

본 발명자들은 BsEXLX1과의 상동성을 기초로 하여, 스티그마텔라 아우렌티아카, 잔토모나스 오라이제 및 하헬라 제주엔시스와 같은 다른 박테리아로부터 익스팬신의 기능적 유사체를 찾아내었다. 이들 익스팬신 유사체를 각각 StEXLX1, XoEXLX1 및 HcEXLX1으로 명명하였으며, 셀룰로스 가수분해 과정에서 셀룰라제와의 상승효과를 조사하였다.

이어, 상기 BsEXPX1(바실러스 익스팬신 유사체)를 사용하여, UniProt DB(단백질 데이터베이스)를 검색하여 66개의 단백질 서열을 획득하였다(컷오프 기준 E 값 < 0.001).

이들 단백질 서열 중에서 중복되는 서열을 제거하기 위해, cd-hit이라는 프로그램을 사용하여 90%이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 제거하여(대표서열만 남겨두고) 총 55개의 서열을 얻었다.

얻어진 55개의 서열 중 같은 종에서 유래된 서열을 제거하여 총 47개의 서열을 얻었다.

본 발명에서 사용된 컷오프에 대한 기준은 확률에 기반하는 것이므로 절대적으로 정해진 것은 없고, 컷오프 값이 0.001(즉, 데이터 검색을 통해 얻어진 1,000개의 서열중 진짜 유사체가 아닌 경우가 하나인 경우)이면 일반적으로 유의성이 있는 것으로 간주된다. 이에 대한 자세한 내용은 http://www.jcsg.org/psat/help/document.html을 참고한다.) 상기 사이트의 상단을 보면 '상동 단백질 서열'를 얻기 위한 컷오프 E 값은 0.001로 상정하였다고 기재되어 있다.

상술한 과정을 거쳐 서열번호 1~47의 아미노산 서열을 포함하는 원핵세포 유래 익스팬신 단백질을 발견할 수 있었으며, 후술하는 실험을 통해 서열번호 1~47의 아미노산 서열을 포함하는 상기 원핵세포 유래 익스팬신 단백질이 식물 유래 익스팬신 단백질과 유사한 수준의 셀룰로스 확장활성이 있음을 확인하였다. 하헬라 제주엔시스 유래의 익스팬신(EXLX1)의 아미노산 서열(서열번호 30의 아미노산 서열)과 대략 60% 이상의 상동성을 가지며 셀룰로스 확장활성을 가지는 원핵생물 유래 단백질은 본 발명에 적용될 수 있으며, 서열번호 1 내지 서열번호 47에 기재된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열 또는 본 발명의 단백질은 서열번호 1 내지 47의 단백질뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적인 셀룰로스 분해 촉진활성을 가지는 모든 변이 단백질을 포함할 수 있다.

상기 원핵생물은 바실러스 서브틸리스(SEQ. ID NO : 35), 하헬라 제주엔시스(KCTC 2396. SEQ. ID NO : 30), 딕티오스텔리움 디스코이데움(SEQ. ID NO : 1, 2, 3), 네오사르토리야 피쉐리(SEQ. ID NO : 4), 아스퍼질러스 푸미가투스(SEQ. ID NO : 5), 아스퍼질러스 클라바투스(SEQ. ID NO : 6), 아스퍼질러스 오라이제(SEQ. ID NO : 7), 아스퍼질러스 테레우스(SEQ. ID NO : 8), 페니실리움 크리소제눔(SEQ. ID NO : 9), 아스퍼질러스 나이거(SEQ. ID NO : 10), 에케리첼라 니둘란스(SEQ. ID NO : 11)., 마그나포르테 그리시아(SEQ. ID NO : 12), 피레노포라 트리티시-레펜티스(SEQ. ID NO : 13), 패오스파에리아 노도룸(SEQ. ID NO : 14), 스클레로티니아 스클레로티오룸(SEQ. ID NO : 15), 프란키아(SEQ. ID NO : 16), 스트렙토마이시스 스비세우스(SEQ. ID NO : 17), 소란지움 셀룰로줌(SEQ. ID NO : 18, 19), 스티그마텔라 아우렌티아카(스티그마텔라 아우렌티아카, SEQ. ID NO : 20, 22), 플레시오시스티스 파시피카(SEQ. ID NO : 21), 믹소코쿠스 잔터스(SEQ. ID NO : 23), 렙토쓰릭스 콜로드니(SEQ. ID NO : 24), 로제이플렉서스(SEQ. ID NO : 25), 로제이플렉서스 카스텐홀지(SEQ. ID NO : 26), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(SEQ. ID NO : 27), 헤르페토시폰 아우란티아쿠스(SEQ. ID NO : 28, 29), 에시도보락스 아베네(SEQ. ID NO : 31), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(SEQ. ID NO : 42), 바실러스 리체니포미스(SEQ. ID NO : 43), 잔토모나스 캠페스트리스(SEQ. ID NO : 37), 바실러스 푸밀루스(SEQ. ID NO : 36), 잔토모나스 오라이제(SEQ. ID NO : 38), 랄스토니아 솔라나시아룸(SEQ. ID NO : 39, 40), 클라비박터 미시가넨시스(SEQ. ID NO: 32, 33, 34), 잘렐라 파스티디오사(SEQ. ID NO : 41), 나카무렐라 멀티파리타(SEQ. ID NO : 44), 마이크로모노스포라(SEQ. ID NO : 45), 카테눌리스포라 애시디필라(SEQ. ID NO : 46) 및 디키야 지(SEQ. ID NO : 47)로 구성된 군으로부터 선택된 원핵생물일 수 있으나 이에 한정되지 않으며 식물 유래 익스팬신과 구조적 유사성을 가지면서 셀룰로스를 확장시킬 수 있는 것이면 제한없이 적용될 수 있다.

본 발명의 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 분리 또는 정제될 수 있다. 그러한 분리 또는 정제는 전체 세포, 세포 찌꺼기, 외래 단백질 또는 최종 조성물에서 원하지 않는 단백질을 제거하기 위하여 당업계에 인지된 분리기술 예를 들어 이온 교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 단백질 분해효소 처리, 황산 암모늄 침천, 크기 비제 크로마토그래피, 여과, 겔 전기영동 또는 구배상의 분리에 의하여 성취될 수 있다.

상술한 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 상술한 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 포함하는 셀룰로스 분해조성물을 제공할 수 있다. 셀룰로스를 분해하기 위해서는 셀룰로스 분해효소로 처리하여야 한다. 이들 셀룰로스 분해효소로는 셀룰라제, 셀로비오하이드로라제, 엔도글루카나제 및 셀로비아제 등이 있는데, 이들 분해효소는 그 가격이 너무 비싸 이를 통해 제조된 제품의 가격이 지나치게 높아지는 문제가 발생하였다. 특히 목질계 바이오매스를 구성하는 다당류인 셀룰로스를 분해하여 단당류인 포도당으로 가수분해하기 위해서는 셀룰로스 분해효소(특히 셀룰라제)를 사용하여야 하는데, 상기 셀룰라제의 가격이 너무 비싸 이를 통해 제조되는 최종산물인 바이오에탄올의 가격이 지나치게 상승하는 문제가 발생하였다. 식물 유래 익스팬신 단백질은 셀룰로스를 확장시켜 셀룰라제의 접근성을 용이하게 하여 결국 셀룰라제의 사용량을 저감시킬 수 있으나, 상술한 바와 같이 대량생산이 어려워 상업화되지 못하였다. 이에 본 발명의 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 식물 유래 익스팬신 단백질과 거의 유사한 기능을 가지면서도 숙주 생물 내에서 발현되므로 대량생산이 가능하다.

이를 위하여 상기 셀룰로스 분해조성물은 본 발명의 원핵생물 유래 익스팬신 단백질과 셀룰로스 분해효소를 포함할 수 있다. 이 경우 바람직하게는 셀룰로스 분해조성물은 1 g의 셀룰로스에 대하여 셀룰로스 분해효소 0.01~0.05 FPU 및 원핵생물 유래 익스팬신 200~400 ㎍을 포함할 수 있다(표 1 참조).

또한 바람직하게는, 상기 셀룰로스 분해조성물을 첨가한 후 40~60 ℃, pH 7 이하에서 48 시간 이상 반응시킬 수 있다.

본 발명의 셀룰로스 분해조성물은 본 발명의 목적하는 활성을 향상시키기 위하여 예를 들어 활성화제, 저해제, 바람직한 이온, pH 조절용 화합물 또는 다른 효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 바이오에너지를 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 목질계 바이오매스를 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 목질계 바이오매스에 포함된 셀룰로스를 분해하여 환원당을 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 셀룰로스 분해조성물은 종이 또는 펄프를 생산하는 공정에 사용될 수 있다. 구체적으로 종이 또는 펄프를 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 종이 또는 펄프를 연화시키는 단계를 포함하는, 종이 또는 펄프의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 셀룰로스 분해조성물은 섬유 또는 직물의 처리방법에 사용될 수 있다. 구체적으로 상기 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 섬유 또는 직물을 연화시키는 단계를 포함하는, 섬유 또는 직물의 처리방법을 제공한다.

본 발명의 셀룰로스 분해조성물에 사용되는 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 셀룰로스의 세포벽을 확장시켜주는 익스팬신과 구조적 유사성을 갖는다. 이러한 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 이용하면 셀룰로스 분해효소의 셀룰로스 기질에 대한 분해효율을 높일 수 있다. 상기 원핵생물 유래 단백질은 식물 유래 익스팬신과 아미노산 서열, 구조, 그리고 기능에 있어 유사성을 가지며 셀룰로스 분해효소의 셀룰로스 기질에 대한 분해효율을 증진시켜 줄 뿐만 아니라 산업적 규모로 생산이 가능하다.

이하에서, 하기의 실시예를 참고로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하도록 하겠다. 그러나, 하기 실시예는 설명의 목적을 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

<실시예 1>

생물정보 소프트웨어

DaliLite 프로그램(Holm and Park 2000)을 사용하여 PDB에 대한 구조적 유사성 검색을 실시하였다. 박테리아 유래 익스팬신 유사체를 찾기 위하여, 본 발명자들은 모든 육상식물에서 발견되는 of β-익스팬신(PDB id : 2hcz)(Yennawar et al. 2006)의 일종인, 구조가 알려진 Zea m 1(SEQ. ID NO : 57)을 템플릿으로 사용하였다. DaliLite와 UCSF Chimera(Pettersen et al. 2004)를 사용하여 구조쌍 정렬을 수행하였으며, 역시 UCSF Chimera를 사용하여 단백질의 리본구조도를 얻었다.

<실시예 2-1>

균주, 벡터 및 클로닝

플라스미드 클로닝과 표적 유전자의 증폭에는 대장균 균주 DH5α를 사용하였고, 클로닝된 유전자는 대장균 균주 BL21(DE3)을 사용하여 발현시켰다. 균주들을 루리아-베르타니(LB) 배지(Difco, Sparks, MD, USA)를 사용하여 37 ℃에서 배양한 후, 50 ㎍/mL 암피실린(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 가하여 형질전환체를 선별하였다. 바실러스 서브틸리스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 얻었다. 바실러스 서브틸리스의 게놈 DNA는 버클리 구조게놈센터(BSGC, Berkeley, CA, USA)로부터 입수하였다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 BsEXLX1N(5'-GAAGGAGATATAAGGATGGCATATGACGACCTGCATGAA-3', SEQ. ID NO : 49)과 BsEXLX1C(5'-ATGATGGTAATGGTGTTCAGGAAACTGAACATGGCC-3', SEQ. ID NO : 50)으로, 표적 단백질의 아미노 말단에 존재할 수 있는 신호서열이 제거되도록 설계하였다. 상기 PCR 프라이머를 IDT(Coralville, IA, USA)에 의해 합성하였다. PCR 산물을 비접합 클로닝(LIC) 방법(Aslanidis and Dejong 1990)에 의해 발현벡터 내로 직접 클로닝하였다. LIC 클로닝을 위한 발현벡터로는 BSGC(Graslund et al. 2008)에서 개발한 pET21a를 약간 변형하여 사용하였다. 상기 벡터 역시 카르복실 말단에 발현된 단백질의 친화정제를 위한 6-히스티딘 태그를 가진다.

표적 단백질의 발현 및 정제

재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 형질전환체를 600 nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 1 mM의 이소프로필 티오갈락토시드(IPTG)를 가한 후, 세포를 3 시간 더 배양하여 재조합 단백질이 과발현되도록 하였다. 5,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 후, 세포 펠렛을 용해완충액(20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.4)에 재분산하고 초음파처리하여 분해시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액은 단백질의 가용성 분획으로, 펠렛은 용해완충액에 재분산하여 불용성 분획으로 사용하였다. 두 분획을 15%(w/w) SDS-PAGE로 분석한 후 쿠마시 염색하여 발현수준을 확인하였다. 가용성 분획을 용해완충액으로 평형을 맞춘 His-트랩 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에 로딩하였다. 컬럼을 25 mM 이미다졸을 포함하는 10 컬럼 부피의 완충액으로 세척하고, His-태그된 표적 단백질을 200 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용리하였다. 용리된 단백질을 Amicon Ultra-15 원심분리장치(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 농축한 뒤 20 mM 인산나트륨 완충액으로 탈염하였다. 단백질을 단백질 정량키트(Pierce, USA)를 사용하여 정량하였다. 이와 비슷한 방법으로, 스티그마텔라 아우렌티아카, 잔토모나스 오라이제 및 하헬라 제주엔시스로부터 박테리아 유래 익스팬신 유사체를 대장균 BL21(DE3) 내에서 클로닝하고 발현시켰다.

재조합 BsEXLX1의 과발현

구조적으로 유사한 단백질이 예컨대 식물 세포벽의 이완, 셀룰로스의 파괴(약화) 또는 셀룰라제 활성의 개선과 같은, 식물 유래 익스팬신과 비슷한 분자적 기능을 가지는지 확인하기 위하여 BsEXLX1을 클로닝 및 과발현하였다. 대장균 내에서의 이종 발현이 촉진되도록 BsEXLX1의 아미노 말단에 존재할 수 있는 신호서열을 제거하였다. 재조합 단백질이 대장균 내에서 발현되었으며, 주로 가용성 분획 내에 존재하였다(도 2). 단백질을 단백질의 카르복실 말단에 위치한 6-His 태그로 정제하였다. 단백질의 수율은 배양배지 1 L 당 약 10 mg 정도였다.

또한, 스티그마텔라 아우렌티아카, 잔토모나스 오라이제 및 하헬라 제주엔시스를 EXPB로 사용하였다.

<실시예 2-2>

균주, 벡터 및 클로닝

플라스미드 클로닝과 표적 유전자의 증폭에는 대장균 균주 DH5α를 사용하였고, 클로닝된 유전자는 대장균 균주 BL21(DE3)을 사용하여 발현시켰다. 균주들을 LB 배지(Difco, Sparks, MD, USA)를 사용하여 37 ℃에서 배양한 후, 50 ㎍/mL 암피실린(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 가하여 형질전환체를 선별하였다. 스티그마텔라 아우렌티아카의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 얻었다. 스티그마텔라 아우렌티아카의 게놈 DNA는 BSGC(Berkeley, CA, USA)로부터 입수하였다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 StEXLX1N과 StEXLX1C(5'-CTTTTTCAGGCTAAACTGCTCAGCACCATCG-3', SEQ. ID NO : 51)로, 표적 단백질의 아미노 말단에 존재할 수 있는 발현 억제서열이 제거되도록 설계하였다. 상기 PCR 프라이머를 IDT(Coralville, IA, USA)에 의해 합성하였다. PCR 산물을 LIC 방법(Aslanidis and Dejong 1990)에 의해 발현벡터 내로 직접 클로닝하였다. LIC 클로닝을 위한 발현벡터로는 BSGC(Graslund et al. 2008)에서 개발한 pET21a를 약간 변형하여 사용하였다. 상기 벡터 역시 카르복실 말단에 발현된 단백질의 친화정제를 위한 6-히스티딘 태그를 가진다. StEXLX1이 발현되었으나 가용성은 아니었으므로, 가용성 형태를 얻기 위하여 N-말단 프라이머 서열을 다시 설계하였다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 StEXLX2N (5'-ATGTCTGAACCTGACGACTCCGGCTTTACTAACGATCCTGAAGGCGAGGTTCGTGCTCTGGGTGAATTTC-3', SEQ. ID NO : 52)과 StEXLX1C(위의 서열과 동일)이었다.

표적 단백질의 발현 및 정제

재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 형질전환체를 600 nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 가용성 단백질이 발현되도록 하기 위하여, 최종농도 1 mM의 IPTG를 가한 후 배양온도를 16 ℃로 낮추고 세포를 16 시간 더 배양하여 재조합 단백질이 과발현되도록 하였다. 5,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 후, 세포 펠렛을 용해완충액(20 mM 인산나트륨, 300 mM 염화나트륨, pH 7.4)에 재분산하고 초음파처리하여 분해시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액은 단백질의 가용성 분획으로, 펠렛은 용해완충액에 재분산하여 불용성 분획으로 사용하였다. 두 분획을 15%(w/w) SDS-PAGE로 분석한 후 쿠마시 염색하여 발현수준을 확인하였다. 가용성 분획을 용해완충액으로 평형을 맞춘 His-트랩 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에 로딩하였다. 컬럼을 10 mM 이미다졸과 20 mM 인산나트륨을 포함하는 10 컬럼 부피의 완충액으로 세척하고, His-태그된 표적 단백질을 200 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용리하였다. 용리된 단백질을 Amicon Ultra-15 원심분리장치(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 농축한 뒤 20 mM 인산나트륨 완충액으로 탈염하였다. 단백질을 단백질 정량키트(Pierce, USA)를 사용하여 정량하였다. 단백질의 수율은 배양배지 1 L 당 약 3 mg 정도였다.

<실시예 2-3>

균주, 벡터 및 클로닝

플라스미드 클로닝과 표적 유전자의 증폭에는 대장균 균주 DH5α를 사용하였고, 클로닝된 유전자는 대장균 균주 BL21(DE3)을 사용하여 발현시켰다. 균주들을 LB 배지(Difco, Sparks, MD, USA)를 사용하여 37 ℃에서 배양한 후, 50 ㎍/mL 암피실린(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 가하여 형질전환체를 선별하였다. 잔토모나스 캠페스트리스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 얻었다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 XoEXLX1N(5'-ATGCAGGTCAGTACGCAAGC-3', SEQ. ID NO : 53)과 XoEXLX1C(5'-GGGAAACTGTACGTGGCCG-3', SEQ. ID NO : 54)으로, 표적 단백질의 아미노 말단에 존재할 수 있는 신호서열이 제거되도록 설계하였다. 상기 PCR 프라이머를 IDT(Coralville, IA, USA)에 의해 합성하였다. PCR 산물을 LIC 방법(Aslanidis and Dejong 1990)에 의해 발현벡터 내로 직접 클로닝하였다. LIC 클로닝을 위한 발현벡터로는 BSGC(Graslund et al. 2008)에서 개발한 pET21a를 약간 변형하여 사용하였다. 상기 벡터 역시 카르복실 말단에 발현된 단백질의 친화정제를 위한 6-히스티딘 태그를 가진다.

표적 단백질의 발현 및 정제

재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 형질전환체를 600 nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 가용성 단백질이 발현되도록 하기 위하여, 최종농도 1 mM의 IPTG를 가한 후 배양온도를 16 ℃로 낮추고 세포를 12 시간(다른 경우에 비해 짧은 시간) 더 배양하여, 단백질 분해효소에 의한 절단 없이 재조합 단백질이 과발현되도록 하였다. 5,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 후, 세포 펠렛을 용해완충액(20 mM 인산나트륨, 300 mM 염화나트륨, pH 7.4)에 재분산하고, 1 mM IPTG 및 단백질 분해효소 억제제 칵테일(Roche, USA)을 사용, 초음파처리하여 분해시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액은 단백질의 가용성 분획으로, 펠렛은 용해완충액에 재분산하여 불용성 분획으로 사용하였다. 두 분획을 15%(w/w) SDS-PAGE로 분석한 후 쿠마시 염색하여 발현수준을 확인하였다. 가용성 분획을 용해완충액으로 평형을 맞춘 His-트랩 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에 로딩하였다. 컬럼을 10 mM 이미다졸과 20mM 인산나트륨을 포함하는 10 컬럼 부피의 완충액으로 세척하고, His-태그된 표적 단백질을 200 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용리하였다. 용리된 단백질을 Amicon Ultra-15 원심분리장치(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 농축한 뒤 20 mM 인산나트륨 완충액으로 탈염하였다. 단백질을 단백질 정량키트(Pierce, USA)를 사용하여 정량하였다. 단백질의 수율은 배양배지 1 L 당 약 5 mg 정도였다.

<실시예 2-4>

균주, 벡터 및 클로닝

플라스미드 클로닝과 표적 유전자의 증폭에는 대장균 균주 DH5α를 사용하였고, 클로닝된 유전자는 대장균 균주 BL21(DE3)을 사용하여 발현시켰다. 균주들을 LB 배지(Difco, Sparks, MD, USA)를 사용하여 37 ℃에서 배양한 후, 50 ㎍/mL 암피실린(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 가하여 형질전환체를 선별하였다. 하헬라 제주엔시스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 얻었다. 하헬라 제주엔시스의 게놈 DNA는 한국생명공학연구원(KRIBB)의 J. F. Kim으로부터 입수하였다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 HcEXLX1N (5'-GAAAATCGAGTTTCTGCGACTC-3', SEQ. ID NO : 55)과 HcEXLX1C (5'-TTTGTCTGCCTGATTAATAACGCC-3', SEQ. ID NO : 56)으로, 표적 단백질의 아미노 말단에 존재할 수 있는 신호서열이 제거되도록 설계하였다. 상기 PCR 프라이머를 IDT(Coralville, IA, USA)에 의해 합성하였다. PCR 산물을 LIC 방법(Aslanidis and Dejong 1990)에 의해 발현벡터 내로 직접 클로닝하였다. LIC 클로닝을 위한 발현벡터로는 BSGC(Graslund et al. 2008)에서 개발한 pET21a를 약간 변형하여 사용하였다. 상기 벡터 역시 카르복실 말단에 발현된 단백질의 친화정제를 위한 6-히스티딘 태그를 가진다.

표적 단백질의 발현 및 정제

재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 형질전환체를 600 nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 암피실린(100 ㎍/L)을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 가용성 단백질이 발현되도록 하기 위하여, 최종농도 1 mM의 IPTG를 가한 후 배양온도를 16 ℃로 낮추고 세포를 16 시간 더 배양하여 재조합 단백질이 과발현되도록 하였다. 5,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 후, 세포 펠렛을 용해완충액(20 mM Tris-Cl 및 300 mM 염화나트륨, pH 8.0)에 재분산하고, 초음파처리하여 분해시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액은 단백질의 가용성 분획으로, 펠렛은 용해완충액에 재분산하여 불용성 분획으로 사용하였다. 두 분획을 15%(w/w) SDS-PAGE로 분석한 후 쿠마시 염색하여 발현수준을 확인하였다. 가용성 분획을 용해완충액으로 평형을 맞춘 His-트랩 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에 로딩하였다. 컬럼을 10 mM 이미다졸과 20 mM Tris-Cl을 포함하는 10 컬럼 부피의 완충액으로 세척하고, His-태그된 표적 단백질을 200 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용리하였다. 용리된 단백질을 Amicon Ultra-15 원심분리장치(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 농축한 뒤 20 mM 인산나트륨 완충액으로 탈염하였다. 단백질을 단백질 정량키트(Pierce, USA)를 사용하여 정량하였다. 단백질의 수율은 배양배지 1 L 당 약 20 mg 정도였다.

도 17a 및 17b는 박테리아 유래 익스팬신 간의 유사성과 계통을 나타낸 뿌리 없는 계통도를 보여준다. 알려진 바와 같이, 식물 유래 익스팬신과 박테리아 유래 익스팬신은 서로 대척점에 위치하는데, 도 16에서 그 구분이 용이한 것은 BsEXLX1은 StEXLX1과 유사하기 때문이고, HcEXLX1의 경우 이들과는 달리 해양미생물에서 유래된 것(제주 마라도)으로 다른 계통에 속한다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로 XoEXLX1의 경우 다른 익스팬신들의 크기가 25 kDa인 것과는 달리 64 kDa의 크기를 가진다. 이는 XoEXLX1이 셀룰라제 도메인을 포함하고 있기 때문이다. 또한 ProtParam을 사용하여 아미노산 서열특성을 비교한 도 18~20을 보면, StEXLX1과 HcEXLX1의 등전점(pI)은 약산성 영역에 있고 XoEXLX1과 BsEXLX1의 등전점은 염기성 영역에 있다. 이로 인해, 정제를 하는 데 필요한 조건이 약간 달라진다. 무엇보다, 효소와의 상승효과를 얻기 위해서는 익스팬신과 효소의 최적 조건이 거의 동일해야 할 것이다. 일반적으로 염기성 익스팬신은 약산성에서도 안정적인 형태를 갖지만, 약산성 익스팬신은 침전이 발생할 수 있는 위험이 있다. 즉, 효소를 사용하는 버퍼의 pH에 따라 적절한 익스팬신의 사용이 보다 효율적이다. 또한 각각의 익스팬신의 기원이 되는 균주의 특성(가혹한 조건에서의 안정성)을 고려하여, 효소와의 상승효과가 겹치는 익스팬신을 사용하는 것이 유리할 것이다.

식물 유래 익스팬신은 그 계통에 따라 α형태, β형태, Lα형태 및 Lβ형태로 크게 나뉘며, 이들 형태는 더 세분화된다(Sampedro, et al. 2006). 박테리아 유래 익스팬신 또한 그 계통에 따라 여러 형태로 나뉘며, 이들의 계통도 밝혀지기 시작하고 있다(BsEXLX1과 HcEXLX1이 상승효과를 나타내는 기질과 효소는 서로 다를 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 또한, 산업적으로 이를 적용하고자 하는 바이오매스의 유형에 따라 최적의 익스팬신 역시 달라질 수 있다.).

<실시예 3>

박테리아로부터 유래한, 옥수수 식물 유래 익스팬신과의 구조적 유사체

식물과 진균류에서는 다수의 익스팬신 도메인이 알려져 있지만, 박테리아에서는 익스팬신 유사 도메인이 확인되지 않았다(Kende et al. 2004; Sampedro and Cosgrove 2005). Zea m 1 EXPB의 서열을 이용한 비중복(nr) 단백질 데이터베이스에 대한 BLAST 검색 결과, 기준(P 값 < 0.001)에 맞는 박테리아 유래 단백질은 검색되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 서열 불일치(예컨대, 원격 상동성)로 인해 일반적인 서열분석으로는 쉽게 검색되지 않는 구조적 유사체가 박테리아 내에 존재할 수 있다고 판단하였다. 이를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 최근에 구조가 밝혀진 Zea m 1 EXPB(PDB id : 2hcz)의 구조적 유사체를 PDB(Yennawar et al. 2006)에서 검색하였다. PDB 검색 결과, 바실러스 서브틸리스 유래 BsEXLX1 단백질(PDB id : 2bh0)의 구조가 식물 유래 익스팬신과 유사한 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 구조적 데이터베이스 검색프로그램인 DaliLite를 이용하여, BsEXLX1가 Zea m 1과 높은 구조적 유사성을 가지는 것을 확인하였다. 유사성을 나타내는 Z 값이 20.7로, 일반적인 구조적 유사체 선별기준(Z = 2)에 비해 통계적으로 유의하였다. 그러나, 두 단백질 사이의 서열 동일성은 21%에 불과하였다. 식물 유래 익스팬신인 Zea m 1 EXPB(2hcz)과 BsEXLX1(2bh0)의 구조에 대한 평균 제곱근편차(r.m.s.d.)는 2.4 Å으로 두 구조는 거의 동일한 접힘 구조를 가지는 것으로 확인되었다. 구조비교 결과와 서열정렬을 도 1에 제시하였다.

도 1은 옥수수의 β 익스팬신(Zea m1, PBD id : 2hcz)과 BsEXLX1(PBD id : 2hb0)의 구조적 유사성과 아미노산 서열을 비교한 그림이다. 도 1의 아래 부분을 보면 옥수수에서 분리된 베타 익스팬신의 아미노산 서열은 BsEXLX1과의 유사성이 20% 미만임에도 불구하고, 위의 입체도를 보면 구조적으로 매우 유사함을 알 수 있다. 따라서 BsEXLX1은 옥수수 베타 익스팬신과 다른 서열을 가지지만 구조적 상동성을 가지는 익스팬신 유사체라 할 수 있다.

염기서열 정보를 도 14a 내지 17b에 나타내었다. 도 14a~14n은 식물 유래 익스팬신과 같은 작용을 할 것으로 예측되는 도메인을 찾아 비교하기 위하여, 박테리아 유래 익스팬신들 사이에서 유사성을 보이는 특정 도메인을 다중서열정렬(CLUSTALW)을 이용하여 나타낸 것이다.

도 15는 CLUSTALW를 이용하여 분석한 FASTA 파일을 그래픽화하여 JAVA로 표현한 것이다. 아미노산이 유사한 도메인들을 다른 색으로 표시하여 구조가 유사한 도메인을 파악하기 쉽게 하였다.

도 16, 17a 및 17b는 파악된 구조를 비교하기 위한 다른 방법으로서, 뿌리 없는 계통도를 그린 것이다.

이러한 방법을 이용하여 위에서 설명한, 각 익스팬신의 유사성과 차이점을 확인할 수 있다.

<실시예 4>

효소에 의한 셀룰로스의 가수분해

공지된 고속 마이크로어세이(Berlin et al. 2006)를 약간 변형하여, 마이크로플레이트 상에서 셀룰로스를 가수분해하였다. 순수한 셀룰로스로 구성된 와트만 No. 1 거름종이(Whatman, Florham Park, NJ, USA)를 6 mm 직경의 디스크 형태(각 2.5 mg)로 잘라 셀룰로스 가수분해의 기질로 사용하였다. 거름종이 디스크를 96 웰 PCR 플레이트(Axygen, Union City, CA, USA)에 올려놓았다. 셀룰라제(Celluclast 1.5L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)와 0.05 M 시트르산염 완충액(pH 4.8) 내 박테리아 유래 익스팬신 단백질의 최종농도는 셀룰로스 1 g을 기준으로 각각 0~0.6 FPU와 0~300 ㎍이었으며, 전체 반응혼합물의 부피는 120 μL이었다. 96 웰 플레이트를 덮고, 50 ℃에서 48 시간 동안 PCR 기기(Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 내에서 인큐베이션하였다. 12 시간 간격으로 3 개의 샘플을 취한 후, 디니트로살리실산(DNS) 시약(Adney and Baker 1996; Xiao et al. 2004)을 사용하여 환원당의 농도를 결정하였다. 환원당과 DNS 시약에 의한 540 nm에서의 흡광도를, 포도당 보정곡선을 이용하여 환원당 농도로 환산하였다. 얻어진 세 데이터를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

Bs EXLX1 에 의한 셀룰로스 가수분해의 상승효과

식물 유래 익스팬신은 가수분해 활성 없이 식물 세포벽 다당류를 파괴하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 다당류와 결합하여 셀룰로스 미세섬유들 사이의 수소결합을 깨는 것으로 생각된다(Cosgrove 2000a; Cosgrove 2000b; McQueen-Mason and Cosgrove 1994). 셀룰로스에 대한 파괴효과는 흔히 신장계(McQueen-Mason and Cosgrove 1994; Yennawar et al. 2006)를 이용, 셀룰로스의 신장 또는 약화 정도를 측정하여 정량화한다. 아직까지 식물 이외의 생명체에서 활성 익스팬신의 이종 발현은 보고된 바 없다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 β-익스팬신과 유사한 선충류 단백질이 식물에서 발현된 바 있으며, 밀 초엽(coleoptile)과 오이 배축(hypocotyl)에 대해 셀룰로스 파괴활성을 가지는 것으로 확인되었다(Qin et al. 2004).

BsEXLX1이 Zea m1 EXPB과 구조적으로 유사하다는 것은 이미 확인된 바 있으나, 박테리아 유래 익스팬신으로서의 기능과 잠재적인 용도에 대해서는 아직 연구된 바 없다. 본 발명자들은 BsEXLX1의 박테리아 유래 익스팬신으로서의 분자적 기능을 생체 외에서 시험하였다. 도 3은 셀룰라제 단독, BsEXLX1 단독 또는 셀룰라제와 BsEXLX1에 의한, 시간에 따른 거름종이 가수분해의 결과를 보여준다. 식물 유래 익스팬신은 가수분해 활성을 가지지 않는다는 기존의 보고(Cosgrove 2000a; Cosgrove 2000b; McQueen-Mason and Cosgrove 1994)와 유사하게, 거름종이를 BsEXLX1으로 인큐베이션한 경우에는 환원당이 거의 생성되지 않았다. 거름종이에 셀룰라제만 가한 경우, 시간에 따른 당 생산은 반응혼합물 내 셀룰라제의 양이 적어(예컨대, 0.012 FPU/g 셀룰로스) 낮게 나타났다. 그러나, BsEXLX1(셀룰로스 1 g 당 100 ㎍)를 셀룰라제와 함께 효소 반응혼합물에 가하고 36 시간 인큐베이션한 경우, 거름종이로부터의 환원당 수율이 셀룰라제 단독(대조군)의 경우에 비해 2.6 배 증가하였다. 다른 단백질도 BsEXLX1처럼 셀룰로스 가수분해에 영향을 미칠 수 있는 지 확인학 위하여, 음성 대조군으로서 BSA를 셀룰라제와 함께 거름종이에 가하였다. 그러나, BSA를 셀룰라제와 함께 가한 경우, 당 수율은 BSA를 가하지 않은 대조군에 비해 별다른 변화를 보이지 않았다.

<실시예 5>

Bs EXLX1 의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향

BsEXLX1의 양과 셀룰로스 가수분해의 상승효과 사이의 관계를 도 4에 도시하였다. 반응혼합물은 거름종이 1 g을 기준으로 여러 농도의 BsEXLX1(0, 100, 200 또는 300 ㎍)과 0.06 FPU의 셀룰라제로 구성되었다. 셀룰로스 1 g 당 100 ㎍의 BsEXLX1을 셀룰라제와 함께 가한 경우, 36 시간 후의 환원당 생성량은 BsEXLX1이 없는 경우에 비해 1.7 배 많았다. BsEXLX1의 농도가 증가함에 따라 상승효과 역시 증가하였다. 그러나, BsEXLX1의 양이 100 ㎍에서 200 ㎍으로, 또는 200 ㎍에서 300 ㎍으로 증가한 경우, 환원당 생산량의 증가는 BsEXLX1의 양이 0에서 100 ㎍으로 증가한 경우에 비해 낮았다. 즉, BsEXLX1에 의한 상승효과가 낮아졌는데, BsEXLX1의 첨가량이 증가함에 따라 포화되는 것으로 보였다. 도 5, 6 및 7에서 보듯이, 다른 박테리아로부터 유래한 EXPB 계열 익스팬신의 상승효과 역시 EXLX1의 경우와 비슷하였다.

도 5는 스티그마텔라 아우렌티아카에서 유래된 익스팬신인 StEXLX1과 거름종이 1 g 당 0.06 FPU의 Novozymes Celluclast 1.5L 셀룰라제 복합제 혼합물을 셀룰로스 기질인 거름종이에 가하여 가수분해한 후, 생성되는 환원당을 측정한 결과이다. 도 5에서 보는 바와 같이, StEXLX의 양이 증가함에 따라(거름종이 1 g 당 100, 200, 300 ㎍) 환원당의 생성량이 StEXLX1이 포함되지 않은 대조군에 비해 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 결는 StEXLX1의 셀룰라제와의 상승효과를 확인시켜 준다.

도 6은 잔토모나스 캠페스트리스에서 유래된 익스팬신인 XoEXLX1과 거름종이 1 g 당 0.06 FPU의 Novozymes Celluclast 1.5L 혼합물을 셀룰로스 기질인 거름종이에 가하여 가수분해한 후, 생성되는 환원당을 측정한 결과이다. 도 6에서 보는 바와 같이, XoEXLX1의 양이 증가함에 따라(거름종이 1 g 당 100, 200, 300 ㎍) 환원당의 생성량이 XoEXLX1이 포함되지 않은 대조군에 비해 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 결는 XoEXLX1의 셀룰라제와의 상승효과를 확인시켜 준다.

도 7은 하헬라 제주엔시스(KCTC 2396)에서 유래된 익스팬신인 HcEXLX1과 거름종이 1 g 당 0.06 FPU의 Novozymes Celluclast 1.5L 혼합물을 셀룰로스 기질인 거름종이에 가하여 가수분해한 후, 생성되는 환원당을 측정한 결과이다. 도 7에서 보는 바와 같이, 거름종이 1 g 당 360 ㎍의 HcEXLX1을 가하였을 때의 환원당 생성량이 HcEXLX1이 포함되지 않은 대조군에 비해 많았다. 이러한 결과는 XoEXLX1의 셀룰라제와의 상승효과를 확인시켜 준다.

<실시예 6>

셀룰라제의 양이 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향

셀룰라제에 의한 셀룰로스 가수분해는 전형적인 효소 반응속도를 나타낸다. 즉, 기질의 양이 고정된 경우 셀룰라제의 농도가 증가함에 따라 반응속도 역시 증가한다(Baker et al. 2000; Berlin et al. 2006). 도 8에서 보듯이, 셀룰로스의 가수분해에 의한 환원당의 생성량은 효소의 양이 거름종이 1 g 당 0.012 FPU에서 0.6 FPU로 증가함에 따라 크게 증가하였다. 이처럼 셀룰라제의 양이 0.012 또는 0.06 FPU로 작은 경우에는, 거름종이와 셀룰라제를 포함하는 반응혼합물 내에 BsEXLX1이 존재하는지 여부에 따라 환원당의 생산이 큰 차이를 보였다. 셀룰라제의 양을 거름종이 1 g 당 0.12 또는 0.6 FPU로 증가시키자, 상승효과가 낮게 나타났다. 이처럼 효소의 양이 많은 경우에는, 거름종이 1 g 당 300 ㎍의 BsEXLX1과 함께 인큐베이션한 경우 BsEXLX1이 없는 대조군에 비해 약간 낮은 환원당 수율이 얻어졌다.

실험에서 사용한 셀룰라제의 양은 셀룰로스 1 g 당 0.012~0.6 FPU로, 전처리된 리그노셀룰로스의 효소에 의한 분해정도를 시험하는 데 일반적으로 사용되는 양(일반적으로 셀룰로스 1 g 당 5 FPU 이상)(Rudolf et al. 2008; Yang et al. 2006)보다 낮았다. 거름종이 1 g 당 셀룰라제의 양이 0.012 및 0.06 FPU인 경우, 2.5 mg의 거름종이로부터 최대 150 ㎍의 환원당이 생산되었으며, 이때 당 수율은 이론적 최대값의 5.5%에 해당하였다. 셀룰라제의 양이 0.12~0.6 FPU인 경우, 2.5 mg의 거름종이로부터 이론적 최대값의 21.8%에 해당하는 최대 600 ㎍의 환원당이 생산되었으나, 상승효과는 크지 않았다. 셀룰라제의 양이 작을 때 상승효과가 나타나기는 하지만, 이 경우 전환율이 매우 낮으므로, 현 단계에서 BsEXLX1에 의한 상승효과를 셀룰로스 가수분해에 산업적으로 적용하기에는 무리가 있다.

이처럼 셀룰라제의 양이 작을 때 당 수율이 낮은 경우는 탄수화물 결합모듈(CBM) 또는 셀룰로스 결합도메인(CBD)을 가지는 셀룰라제의 상승효과 연구에서 흔히 발견된다. 예컨대, 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca)의 CBM인 E7과 E8을 이 미생물의 엑소글루카나제인 Cel6B에 가하여 거름종이를 50 ℃에서 168 시간 동안 가수분해한 후의 셀로비오스 수율은 각각 이론적 최대값의 5.0%와 5.1%에 불과하였다(Moser et al. 2008). 트리코데르마 레세이의 CBH I 및 II에 대한 상승효과 연구에서, 48 시간 반응 후 아비셀의 전환수율은 5~15% 범위였다(Medve et al. 1994). 바실러스 종의 Cel5A에 포함된 CBM의 역할에 관한 연구에서, 37 ℃에서 48 시간 및 96 시간 동안 가수분해한 후 재생된 셀룰로스의 환원당 수율은 최대 7.4% 및 16.4%이었다(Boraston et al. 2003). 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 CBD와 CelD의 하이브리드를 사용하여 아비셀과 BMCC를 45 ℃에서 48 시간 동안 가수분해하였을 때, 환원당의 최대 생산량은 각각 이론적 최대값의 8.0%와 0.2%이었다(Carrard et al. 2000).

표 1은 셀룰라제와 셀룰로스의 다양한 조합 및 다양한 반응시간에 따른 BsEXLX1의 상승효과를 요약한 것이다.

고정된 거름종이 양에 대하여, BsEXLX1와 셀룰라제의 조성비에 따른 BsEXLX1에 의한 셀룰로스 가수분해의 상승효과(%)

BsEXLX1 (㎍/g 셀룰로스)	셀룰라제 (FPU/g 셀룰로스)	a 상승효과 (%)
		반응시간(시간) 24 36 48
100	0.012 0.06 0.12 0.6	9.4 55.0 20.3 6.8	72.6 60.0 17.4 5.9	153.6 66.6 30.9 2.5
200	0.012 0.06 0.12 0.6	37.3 67.7 27.7 9.5	129.0 73.9 22.0 8.6	205.4 87.5 34.7 6.3
300	0.012 0.06 0.12 0.6	47.1 70.7 24.4 2.8	139.4 78.9 17.8 6.4	240.1 98.3 25.0 -9.8

^a 상승효과(%) = [{(BsEXLX1와 셀룰라제에 의해 생산된 환원당) / (셀룰라제 단독에 의해 생산된 환원당 + BsEXLX1 단독에 의해 생산된 환원당)} - 1] × 100

BsEXLX1와 셀룰라제의 조성비가 상승효과에 결정적인 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 상승효과는 BsEXLX1과 셀룰라제로 인큐베이션한 경우의 환원당 수율을 셀룰라제 단독 또는 BsEXLX1 단독으로 인큐베이션한 경우의 수율의 합으로 나누어 계산하였다. 표 1에 제시한 여러 시험조건 중에서, 셀룰로스 1 g 당 셀룰라제의 양이 0.012 FPU이고 BsEXLX1의 양이 300 ㎍인 경우 반응시간이 48 시간이었을 때 상승효과가 240%로 가장 높았다. 이러한 상승효과는 셀룰라제와 BsEXLX1을 함께 가한 경우의 당 수율이 BsEXLX1 단독 및 셀룰라제 단독의 경우를 합친 수율에 비해 2.4 배 높고, 셀룰라제 단독에 의한 당 수율에 비해 5.9 배 높음을 의미한다.

동일한 미생물 균주로부터 얻은 셀룰라제, 예컨대 CBH와 EG의 상승효과(Medve et al. 1994; Woodward et al. 1988)와, 서로 다른 생물들로부터 얻은 셀룰라제의 상승효과(Irwin et al. 1993)는 연구된 바 있다. 그러나, 비가수분해 단백질에 의한 상승효과에 대해서는 알려진 바가 많지 않다. 식물 유래 β-익스팬신을 셀룰라제와 함께 셀룰로스에 가한 경우, 48 시간 후에 당 전환율이 익스팬신이 없는 경우에 비해 13% 증가하였다(Baker et al. 2000).

초본 화분에서 유래한 GR2의 재조합 단백질을 CBH I 및 EG II와 함께 거름종이를 18 시간 동안 인큐베이션하여, 효소만을 사용하여 거름종이를 인큐베이션한 경우에 비해 8.3 배의 당 수율이 얻어졌다(Cosgrove 2007). GR2와 함께 사용한 셀룰라제의 양이 특정되지 않았으나, 18 시간 후의 최종 당 수율이 이론적 최대값의 0.6%와 4.8%이므로 매우 낮았을 것으로 생각된다. 셀룰라제와 써모비피다 푸스카에서 유래한 CBM의 상승효과에 대한 연구에서, 셀룰라제 Cel6A 및 Cel6B를 E7와 혼합한 경우의 셀로비오스 수율 증가는 셀룰라제만을 사용하여 168 시간 동안 반응한 경우에 비해 각각 12.9%와 7.5%에 불과하였다(Moser et al. 2008). 이 연구에서, Cel6B를 E7 및 E8와 혼합한 경우의 상승효과 역시 각각 이론적 최대값의 5.0%와 5.1%에 불과하였다.

옥수수 부산물에서 정제된 미지의 비가수분해 단백질을 셀룰로스 1 g 당 0.84 FPU의 셀룰라제와 함께 인큐베이션하였을 때, 거름종이로부터의 포도당 수율은 셀룰라제만으로 인큐베이션하였을 때에 비해 3.2 배 증가하였다(Han and Chen 2007). 이 실험의 경우 셀룰라제의 양이 적었으므로, 포도당 수율의 증가(이론적 최대값의 2.7%에서 8.2%로)는 낮은 셀룰로스 전환율에서 얻어진 것이다.

<실시예 7>

BsEXLX1의 셀룰로스 결합활성 분석

셀룰로스 결합활성을 측정하기 위하여, 6 mm 디스크 형태의 거름종이를 사용하여 PCR 플레이트 상에서 단백질과 거름종이를 인큐베이션하였다. 단백질 대조군으로서 15 ㎍의 BSA(Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 ㎍의 BsEXLX1 또는 0.5 FPU의 셀룰라제(54 ㎍의 BSA에 상응하는 양)를 포함하는 각 반응혼합물 100 μL를 40 ℃에서 인큐베이션하였다. 0, 6, 12 및 24 시간 인큐베이션 후 샘플들(상등액 및 거름종이 디스크)을 취하였다. 거름종이를 20 μL의 완충액으로 2 회 세척하여 얻은 거름종이 용리액과 상등액을 15% SDS-PAGE로 분석한 후 쿠마시 염색하였다.

표 1에서 보듯이, 예컨대 셀룰로스 1 g 당 0.6 FPU의 경우와 같이 셀룰라제의 양이 많은 경우에는, BsEXLX1의 양을 300 ㎍으로 증가시킨 경우 상승효과가 다소 감소하였으며 음의(negative) 상승효과가 나타나기도 하였다. 이와 같은 음의 상승효과는 CBH I와 EG II 또는 EG I와 EG II의 상호작용에서도 보고된 바 있다(Woodward et al. 1988). 두 경우 모두 EG는 포화상태였으며 음의 상승효과는 기질의 결합부위에 대한 경쟁에 의한 것으로 생각된다. 셀룰라제와 BsEXLX1는 셀룰라제와 BsEXLX1의 농도가 높은 경우 거름종이의 결합부위를 놓고 경쟁하는 것일 수 있다. 셀룰로스 파괴활성 또는 식물 세포벽 이완활성을 갖는 익스팬신 역시 셀룰로스 또른 다른 다당류에 대한 결합활성을 가지므로(Yennawar et al. 2006), BsEXLX1의 상승효과는 셀룰로스 기질과의 결합에 의해 시작되는 것일 수 있다. 셀룰라제와 BsEXLX1이 결합부위를 공유하는 경우, BsEXLX1와 셀룰라제가 셀룰로스와의 결합을 놓고 경쟁할 가능성이 있다. 결과적으로, 셀룰라제와 BsEXLX1의 양이 많은 경우에는 상승효과가 완화되는 것이다.

옥수수로부터 유래한 b-익스팬신이 다양한 다당류(셀룰로스, 크실란, 갈락탄 등)에 대해 결합활성을 가지므로(Yennawar et al. 2006), 본 발명자들은 BsEXLX1 또한 셀룰로스에 대한 결합활성을 가지는지 확인하였다. 도 9에서 보듯이, BsEXLX1와 셀룰라제, BSA를 독립적으로 사용하여 거름종이를 0, 6, 12 또는 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 혼합물의 상등액(유리된 단백질) 또는 거름종이(결합된 단백질)로부터 얻은 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다. 거름종이를 셀룰라제만으로 인큐베이션한 경우, 75 kDa에서의 상등액의 주된 단백질 밴드가 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 크게 감소하였다(도 9의 (a)). 셀룰라제 밴드가 약화된 것은 셀룰라제 용액에 포함되었을 수 있는 단백질 분해효소에 의해 셀룰라제가 분해되었기 때문일 수 있다. 그러나, 도 9의 (e) 및 (f)에서 보듯이, 75 kDa에서의, 결합된 셀룰라제에 의한 밴드는 시간에 따라 확연하게 증가하였다. 따라서, 셀룰라제 용액에 포함되었을 수 있는 단백질 분해효소에 의한 단백질의 분해에 의한 영향은 미미한 것으로 생각된다. 이와 대조적으로, 거름종이로부터 얻은 셀룰라제의 밴드 강도는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 증가하였다(도 9의 (e)). 이러한 결과는 셀룰라제가 거름종이와 결합한다는 것을 강하게 확인시켜 준다. 대조 단백질인 BSA로 거름종이를 인큐베이션한 경우, 상등액과 거름종이 모두 셀룰라제의 밴드 강도는 크게 변하지 않았다(도 9의 (d)와 (h)). 이는 이미 보고된 바와 같이(Rudolf et al. 2008; Yang et al. 2006), BSA는 순수한 셀룰로스에 잘 결합하지 않는다는 것을 확인시켜 준다. 셀룰라제의 거름종이에 대한 결합특성은 셀룰라제를 BsEXLX1와 함께 인큐베이션하한 경우에도 확인된다(도 9의 (b) 및 (f)).

BsEXLX1은 단독으로 또는 셀룰라제와 함께 인큐베이션하였을 때 거름종이에 대하여 강한 결합활성을 보였다. 상등액으로부터 얻은 BsEXLX1의 밴드 강도는 시간에 따라 약해졌으나(도 9의 (b)와 (c)), 거름종이로부터 얻은 BsEXLX1의 밴드 강도는 시간에 따라 증가하였다(도 9의 (f)와 (g)). 따라서, 위에서 언급한 바와 같이, 셀룰라제와 BsEXLX1의 농도가 일정 수준 이상으로 증가하였을 때 관찰되는 BsEXLX1에 의한 상승효과의 감소는 셀룰로스 기질의 한정된 결합부위에 대한 두 단백질의 경쟁에 기인하는 것으로 생각된다.

<실시예 8>

온도가 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향

앞선 실험에서는 셀룰로스 가수분해의 반응온도를 제조업체에서 권장하는 셀룰라제의 적정 온도인 50 ℃로 고정하였다. 셀룰라제만을 또는 셀룰라제와 BsEXLX1를 함께 사용하여 인큐베이션한 거름종이로부터의 당 수율은 50 ℃에서 가장 높았으며(도 10), 반응온도가 더 높아지면 감소하였다. 반응온도가 70 ℃인 경우에는 반응수율이 다른 온도에 비해 매우 낮아졌는데, 이것은 효소가 열에 의해 변성되었기 때문으로 생각된다. 반응온도에 따른 BsEXLX1에 의한 셀룰라제 활성의 증가는 셀룰라제 단독의 경우와 같은 양상을 보였다.

<실시예 9>

pH가 셀룰로스 가수분해의 상승효과에 미치는 영향

앞선 실험에서는 모두 제조업체에서 권장하는 셀룰라제의 적정 pH인 pH 4.8에서 가수분해 반응을 실시하였다. 본 발명자들은 최대 가수분해 수율을 위한 적정 pH가 BsEXLX1를 첨가하는 경우에도 유지되는지 조사하였다. pH 3~7의 범위에 대해 실험한 결과, 셀룰라제의 활성(BsEXLX1을 가하지 않은 경우) pH 4, 4.8 및 5에서 거의 일정하였는데(도 11), 이는 셀룰라제의 활성이 pH 4~6 범위에서 크게 변하지 않음을 의미한다. 그러나, BsEXLX1을 가한 경우, 셀룰라제의 활성은 pH에 더 민감하게 반응하였다. 이것은 BsEXLX1이 셀룰라제보다 pH에 민감한 것과 관련이 있을 것으로 생각된다.

<실시예 10>

Bs EXLX1 로 처리한 거름종이의 인장강도

BsEXLX1에 의한 거름종이의 약화 정도를 확인하기 위하여, BsEXLX1으로 처리한 거름종이의 인장강도를 인장강도시험기(UTM; Instron, Norwood, MA, USA)로 측정하였다. 와트만 No. 3 거름종이를 2 × 5.5 cm의 띠 모양으로 잘라 UTM의 클램프 사이에 장착하였다. 클램핑된 거름종이 띠를 600 g/mL의 BsEXLX1 또는 대조용 단백질로서 BSA를 포함하는 10 mL의 아세트산나트륨 완충액(50 mM, pH 4.8) 내에서 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, BsEXLX1과 같은 농도의 BSA를 포함하는 완충액 또는 완충액만을 사용하여 거름종이를 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 8 M 요소 용액을 사용하였다. 아래쪽 클램프에 0.5 mm/분의 크로스헤드 속도로 5 g의 하중을 10 분간 가하여 인큐베이션한 거름종이 띠를 잡아당겼다. 최대 힘 값(F _max)을 측정하고, 식 r _max = F _max/A(A = 단면적, F _max = 최대하중(kg))로부터 인장강도(r _max)를 계산하였다. 실험은 3회 실시하였으며, 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

BsEXLX1이 셀룰로스의 파괴에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 정제된 BsEXLX1을 포함하는 완충액, BSA(음성 대조군), 완충액 단독(음성 대조군) 또는 8 M 요소 용액(양성 대조군) 내에서 거름종이 띠를 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 도 12에서 보듯이, 완충액과 BSA를 포함하는 완충액에서 인큐베이션한 거름종이 띠의 인장강도는 별다른 차이가 없었다. 8 M 요소 용액을 이용한 양성 대조군 실험의 경우, 완충액 단독의 경우에 비해 인장강도가 50% 감소하였다. BsEXLX1을 포함하는 완충액에서 인큐베이션한 거름종이 띠의 인장강도는 완충액 단독의 경우에 비해 29% 감소하였다. 이와 같이, 거름종이의 약화 정도를 확인하기 위한 인장시험으로부터 BsEXLX1 역시 스월레닌(Baker et al. 2000; Saloheimo et al. 2002)이나 익스팬신(Cosgrove 2000a; Cosgrove 2000b; McQueen-Mason and Cosgrove 1994)과 유사하게 셀룰로스에 대한 파괴활성을 가짐을 알 수 있었다.

<실시예 11>

박테리아 유래 익스팬신 Bs EXLX1 으로 처리한 거름종이의 SEM

BsEXLX1으로 처리한 거름종이의 미세구조 변화를 주사전자현미경법(SEM)으로 분석하였다. 3 개의 다른 거름종이 샘플, 즉 완충액만으로 인큐베이션한 거름종이, BsEXLX1으로 인큐베이션한 거름종이, 그리고 8 M 요소 용액으로 인큐베이션한 거름종이를 거름종이의 인장강도 측정실험에서와 동일한 조건에서 준비하였다. SEM 분석에 앞서, 거름종이 샘플을 45 ℃에서 1 일 동안 진공 건조오븐에서 건조한 후 금-팔라듐으로 코팅하였다. 주사전자현미경(Hitachi S-4700, Tokyo, Japan)을 사용하여 10 kV의 전압에서 샘플의 현미경사진을 촬영하였다.

SEM에 의해 촬영된 거름종이 샘플의 현미경사진을 도 13에 도시하였다. SEM 분석 결과, 다른 물질을 함유하는 완충액으로 인큐베이션한 거름종이 샘플들 간에 미세구조의 차이가 확인되었다. 양성 대조군으로서 8 M 요소 용액으로 인큐베이션한 거름종이는, 도 13의 (b)와 (f)에서 보듯이, 거름종이의 미세섬유 간의 상호연결과 중첩이 완화된 형태를 보였는데, 이는 요소의 파괴활성 때문으로 생각된다. 따라서, 도 12에서 확인된 8 M 요소 내에서의 인큐베이션에 따른 인장강도의 감소와 SEM 분석으로 확인된 구조적 변화가 잘 일치한다. 도 13의 (a)와 (e)에서 보듯이, BsEXLX1을 포함하는 완충액에서 인큐베이션한 거름종이도 이와 비슷한 구조적 변화를 보였다. 이것 역시 도 12의 BsEXLX1으로 처리한 거름종이의 인장강도 감소와 일치하는 결과이다. 한편, 완충액만으로(도 13의 (c)와 (h)) 또는 BSA를 포함하는 완충액(도 13의 (d)와 (i))으로 인큐베이션한 음성 대조군의 거름종이 샘플들은 미세섬유가 더 조밀하였으며 상호연결과 중첩 역시 강하였다. 그러므로, 완충액만으로 또는 BSA를 포함하는 완충액으로 인큐베이션한 거름종이 샘플의 SEM 분석결과 역시 도 12의 인장강도 데이터와 잘 일치한다.

본 발명자들은 옥수수로부터 유래된 β-익스팬신과 구조적 유사성을 가지는, 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 24 kDa 단백질인 BsEXLX1의 분자적 기능을 조사, 확인하였다. 얻어진 재조합 단백질은 식물 유래 익스팬신과 기능적 유사성을 갖는 것으로 확인되었다. BsEXLX1은 식물 유래 익스팬신과 유사하게, 거름종이에 대하여 셀룰로스 결합활성 및 셀룰로스 약화활성을 보였다. 또한, BsEXLX1은 반응완충액 내에 낮은 함량의 셀룰라제와 거름종이를 포함하는 셀룰로스 가수분해 반응혼합물에 가하였을 때 상당한 상승효과를 보였다. 셀룰라제의 양이 0.012 FPU이고 BsEXLX1의 양이 300 ㎍이었을 때, BsEXLX1의 상승효과로 인해 당 수율이 셀룰라제 단독의 경우에 비해 5.7 배 증가하였다. BsEXLX1에 의한 거름종이의 약화 정도를 인장강도 측정을 통해 정량하였으며, 이를 SEM 분석에 의해 시각적으로 확인할 수 있었다.

결국 본 발명의 원핵생물 유래 익스팬신 단백질은 종래의 식물 유래 익스팬신 단백질과 동일한 기능(셀룰로스 확장활성)을 수행하면서도 식물 유래 익스팬신 단백질과는 달리 대량생산이 가능하고 생산비용을 현저히 저감시킬 수 있다. 특히 목질계 바이오매스를 셀룰라제로 가수분해하여 포도당을 얻고자 할 때 셀룰라제에 의한 셀룰로스 가수분해 속도를 높여 당 수율을 현저히 향상시킬 수 있다. 따라서, 실제 바이오에너지 생산에 있어 원핵생물 유래 익스팬신을 사용함으로써, 효소의 사용량을 줄여 바이오에너지의 생산비용을 저감할 수 있다. 또한, 펄프, 면 섬유(예, 청바지) 등의 조직을 연화시키고 질감을 개선하는 특성이 있어 바이오펄핑이나 바이오스토닝과 같은 목적으로 이용될 수 있다.

원핵생물 유래 익스팬신을 이용하면 바이오에너지 생산에 있어 효소의 사용량을 줄여 생산비용을 저감할 수 있다. 또한, 펄프, 면 섬유(예, 청바지) 등의 조직을 연화시키고 질감을 개선하는 변화시키는 특성이 있어 제지산업에서의 바이오펄핑이나 섬유산업에서의 바이오스토닝과 같은 목적으로 이용될 수 있다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> PROKARYOTIC EXPANSIN PROTEIN FOR ACTVATION CELLULOSE EXPANSION AND CELLULOSE-DEGRADING COMPOSING THE SAME <150> US61/096,666 <151> 2008-09-12 <160> 57 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Q86AV4: (Expansin-like protein 5 from Dictyostelium discoideum) <400> 1 Met Arg Ile Asn Phe Lys Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Ser Phe Tyr 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Cys Gln Ser Thr Cys Pro Tyr Ser Lys Thr Val Ile 20 25 30 Asn Gly Ala Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Ala Met Asp Asn Gly Asn Cys 35 40 45 Gly Phe Gly Lys Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gly Asn Tyr Met Ile 50 55 60 Ala Ala Leu Gly Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Gln Cys Gly Gln 65 70 75 80 Cys Phe Lys Ile Ser Asn Ser Lys Asn Ala Ser Val Thr Val Met Ala 85 90 95 Thr Asp Ser Cys Asn Asp Ala Gly Tyr Cys Gln Arg Asp Asn His Phe 100 105 110 Asp Leu Ser Pro Thr Ala Phe Ser Ile Leu Gly Ala Gln Ser Gln Gly 115 120 125 Val Leu Asp Gly Leu Ser Tyr Val Lys Val Pro Cys Arg Val Ser Gly 130 135 140 Asn Val Lys Val Met Leu Lys Asp Gly Ser Asn Ala Tyr Trp Thr Ser 145 150 155 160 Phe Leu Val Phe Asn Asn Ala Ile Asp Val Lys Gln Val Ser Ile Lys 165 170 175 Leu Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr Gln Thr Thr Tyr Asn 180 185 190 Tyr Trp Pro Ser Ser Ile Thr Ala Gly Ser Phe Gln Val Arg Ile Glu 195 200 205 Ser Ile Gly Gly Glu Phe Ile Tyr Val Thr Ile Pro Ser Val Val Ser 210 215 220 Ser Lys Ile Tyr Asp Thr Gly Ser Gln Phe Ser Ser Ser Cys 225 230 235 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Q7KWS2: (Expansin-like protein 3 from Dictyostelium discoideum) <400> 2 Met Lys Phe Asn Thr Ile Phe Leu Val Leu Ser Ile Val Lys Phe Ile 1 5 10 15 Leu Ile Ser Ala Gln Ser Cys Pro Phe Ser Gln Ser Ile Ile Asn Gly 20 25 30 Ala Ser Ala Thr Phe Tyr Thr Ala Ile Asp Ala Gly Asn Cys Gly Phe 35 40 45 Glu Lys Leu Asn Gly Pro Leu Gly Pro Gly Asn Tyr Met Ile Ala Ala 50 55 60 Leu Gly Ser Lys Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Gln Cys Gly Gln Cys Phe 65 70 75 80 Lys Ile Ser Asn Ser Lys Asn Ala Ser Val Thr Val Met Ala Thr Asp 85 90 95 Ser Cys His Asp Ala Gly Tyr Cys Gln Arg Asp Asn His Phe Asp Leu 100 105 110 Ser Pro Ala Ala Phe Ser Ile Leu Gly Pro Gln Ser Gln Gly Val Leu 115 120 125 Asp Gly Leu Ser Tyr Val Lys Val Pro Cys Glu Val Ser Gly Asn Val 130 135 140 Lys Ile Met Met Lys Asp Gly Ser Asn Asp Phe Trp Thr Ser Phe Phe 145 150 155 160 Val Phe Asn Ser Lys Val Ile Ile Lys Gln Val Ser Ile Lys Leu Ser 165 170 175 Asn Ser Asn Gln Phe Val Pro Leu Ser Gln Thr Thr Tyr Asn Tyr Trp 180 185 190 Pro Thr Ser Ile Thr Gly Gly Gln Phe His Val Arg Ile Glu Ser Ile 195 200 205 Gly Gly Glu Phe Ile Tyr Val Thr Ile Pro Lys Val Glu Ser Arg Lys 210 215 220 Val Tyr Glu Thr Ser Gly Gln Phe Ser Thr Ser Cys Ser Asn Leu Asn 225 230 235 240 Glu Asn Asn Pro Ile Asn Tyr Lys Pro Gln Thr Phe Asn Ser Gln Gln 245 250 255 Thr Ser Asn Asn Gln Asn Ser Asn Thr Gln Thr Pro Thr Lys Gln Pro 260 265 270 Ser Pro Asn Ser Gln Asn Phe Ile Pro Ser Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile 275 280 285 Gln Lys Pro Asn Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Ser Lys Glu Met Leu Val 290 295 300 Leu Asn Glu Asn Glu Asn Ile Glu Ser Asn Ser Leu Lys Leu Leu Pro 305 310 315 320 Asn Phe Leu Leu Leu Ile Leu Ile Ile Leu Leu Asn Ile Asn Phe 325 330 335 <210> 3 <211> 286 <212> PRT <213> Q55G31: (Expansin-like protein 1 from Dictyostelium discoideum) <400> 3 Met Lys Thr Phe Val Leu Phe Val Ile Leu Leu Cys Leu Thr Phe Leu 1 5 10 15 Ser Ile Ser Lys Ser Glu Thr Cys Pro Phe Ser Gln Ser Leu Val Ser 20 25 30 Gly Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Pro Asn Ala Gly Asn Cys Gly 35 40 45 Tyr Glu Asn Leu Met Gly Pro Leu Gly Pro Gly Asn Leu Phe Ile Ala 50 55 60 Ala Leu Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Asn Gly Lys Asn Cys Gly Gln Cys 65 70 75 80 Phe Asn Ile Ser Ser Pro Tyr Thr Asn Arg Ser Val Val Ile Met Ala 85 90 95 Thr Asp Ser Cys Pro Asp Ser Gly Tyr Cys Gln Arg Ser Ser His Phe 100 105 110 Asp Leu Ser Thr Gln Ala Phe Asp Val Leu Gly Ala Gln Ser Ile Gly 115 120 125 Val Leu Glu Gly Leu Thr Tyr Tyr Lys Val Pro Cys Gly Val Asn Gly 130 135 140 Asn Val Lys Ile Met Met Lys Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Trp Thr Ala 145 150 155 160 Phe Leu Ile Tyr Asn Ser Lys Val Thr Ile Lys Asp Val Ser Val Lys 165 170 175 Ile Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Thr Ser Leu Thr Gln Ser Ser Tyr Asn 180 185 190 Tyr Trp Ile Ser Pro Asn Met Val Pro Gly Ser Phe Asp Val Arg Ile 195 200 205 Glu Ser Val Gly Gly Glu Phe Ile Tyr Ile Thr Ile Pro Lys Val Glu 210 215 220 Ser Arg Lys Gln Tyr Glu Thr Ser Ser Gln Phe Ser Val Asp Gly Cys 225 230 235 240 Val Gly Thr Pro Ser Gly Pro Ser Gly Gly Leu Gly Ser Pro Ser Thr 245 250 255 Gly Ala Ser Ile Gly Thr Pro Ser Asp Ala Ser Ser Leu Thr Leu Tyr 260 265 270 Ala Leu Phe Ser Leu Thr Ile Leu Phe Leu Val Met Leu Asn 275 280 285 <210> 4 <211> 352 <212> PRT <213> A1DF29: (Extracellular cellulase CelA, putative from Neosartorya fischeri) <400> 4 Met Leu Tyr Gln Arg Leu Thr Thr Leu Gly Val Ala Ala Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ser Val Ser Ala Ser Pro Met Val Gly Gly Ala Lys Ser Arg 20 25 30 Cys Arg Ala Gly Tyr Asn Lys Ala Val Ser His Val Pro Thr Thr His 35 40 45 Glu Ala Thr Pro Ser Ile Asn Pro Pro Val Glu Leu Ser Glu Ala Pro 50 55 60 Ser Gln Ser Pro Trp Pro Thr Val Asp Ser Pro Ser Ala Ala Ser Ile 65 70 75 80 Ile Pro Thr Val Asp Glu Ile Thr His Val Lys Lys Pro Gln Ala Asp 85 90 95 Glu Asp Pro Asp Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser 100 105 110 Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Thr Gln Gln Gln Asp Thr Val Pro Ala 115 120 125 Ala Pro Ala Glu Pro Ala Thr Ala Ala Ser Gln Thr Asn Asn Lys Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr His Ser Gly Lys Ala 145 150 155 160 Thr Phe Tyr Gly Gly Asn Ile Ser Gly Gly Thr Cys Ser Phe Thr Gly 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Ser Gly Leu Phe Gly Thr Ala Tyr Ser Gly Ala Ala 180 185 190 Trp Asn Asn Ala Ala Glu Cys Gly Ala Cys Val Ser Val Lys Gly Pro 195 200 205 Asn Gly Lys Thr Ile Lys Ala Met Ile Val Asp Gln Cys Pro Glu Cys 210 215 220 Glu Gln Asp His Leu Asp Leu Phe Gln Asp Ala Phe Thr Gln Leu Ala 225 230 235 240 Asp Val Ser Lys Gly Ile Ile Pro Ile Thr Trp Ser Phe Val Pro Cys 245 250 255 Gly Ile Thr Ser Pro Val Val Leu Lys Asn Lys Glu Gly Thr Ser Arg 260 265 270 Tyr Trp Phe Ser Met Gln Val Met Asn Ala Asn Glu Pro Val Ala Lys 275 280 285 Leu Glu Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Gln Gly Thr Thr Arg 290 295 300 Thr Ser Tyr Asn Phe Phe Glu Glu Ser Ser Gly Phe Gly Gln Asp Thr 305 310 315 320 Val Asp Val Arg Val Thr Gly Gln Ser Gly Ala Thr Leu Thr Val Lys 325 330 335 Asn Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser Val Thr Ala Lys Ser Asn Leu 340 345 350 <210> 5 <211> 344 <212> PRT <213> Q4WUD1: (Extracellular cellulase CelA/allergen Asp F7-like from Aspergillus fumigatus) <400> 5 Met Leu Tyr Gln Arg Leu Thr Ala Leu Gly Val Ala Ala Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ser Val Ser Ala Ser Pro Met Ala Arg Gly Val Lys Gly Arg 20 25 30 Cys Arg Ala Lys Tyr Asn Lys Ala Val Ser His Val Pro Thr Thr His 35 40 45 Glu Ala Thr Pro Thr Ile Asn Leu Pro Val Glu Leu Pro Glu Thr Gln 50 55 60 Ser Gln Ser Pro Trp Pro Thr Val Asp Glu Ile Val Pro Val Lys Lys 65 70 75 80 Pro Gln Ala Asp Glu Asp Pro Asn Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Thr 100 105 110 Gln Glu Gln Asp Thr Val Ser Ala Ala Pro Ala Glu Pro Thr Thr Ala 115 120 125 Ala Pro Glu Thr Val Asn Lys Ala Ala Thr Thr Ala Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Ser Thr Thr His Ser Gly Lys Ala Thr Phe Tyr Gly Gly Asn Val Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Cys Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Leu Pro Ser Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Thr Ala Tyr Ser Gly Ala Ala Trp Asn Asn Ala Ala Glu Cys Gly 180 185 190 Ala Cys Val Ser Val Thr Gly Pro Asn Gly Lys Thr Ile Lys Ala Met 195 200 205 Ile Val Asp Gln Cys Pro Glu Cys Glu Gln Asp His Leu Asp Leu Phe 210 215 220 Gln Asn Ala Phe Thr Gln Leu Ala Asp Val Ser Lys Gly Ile Ile Pro 225 230 235 240 Ile Thr Trp Ser Phe Val Pro Cys Gly Ile Thr Thr Pro Leu Val Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Gly Thr Ser Pro Tyr Trp Phe Ser Met Gln Val Met 260 265 270 Asn Ala Asn Glu Pro Val Ala Lys Leu Glu Val Ser Thr Asp Gly Gly 275 280 285 Lys Thr Trp Gln Gly Thr Thr Arg Thr Ser Tyr Asn Phe Phe Glu Lys 290 295 300 Ser Ser Gly Phe Gly Lys Asp Thr Val Asp Val Arg Val Thr Gly Gln 305 310 315 320 Ser Gly Ala Thr Leu Thr Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Thr Ala Lys Ser Asn Leu 340 <210> 6 <211> 428 <212> PRT <213> A1CAQ3: (Cellulase, putative from Aspergillus clavatus) <400> 6 Met Arg Tyr Gln Arg Leu Thr Thr Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ala Glu Asn Gln 20 25 30 Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Met Ser Val Tyr Tyr Val Thr Val Thr Ala 35 40 45 Ser Pro Thr Pro Ser Ile Glu Pro Val Thr Thr Leu Ser Ser Ser Ser 50 55 60 Thr Thr Thr Val Thr Thr Thr Val Thr Pro Glu Ala Pro Ala Lys Thr 65 70 75 80 Ser Ser Ser Leu Asp Val Glu Ser Ser Val Pro Glu Arg Thr Pro Val 85 90 95 Glu Thr Pro Val Ala Ser Glu Pro Pro Val Val Pro Ser Ser Ser Ser 100 105 110 Thr Lys Gln Ile Val Val Pro Thr Ala Glu Pro Val Pro Val Pro Val 115 120 125 Pro Glu Pro Ile Glu Pro Ala Pro Ser Ser Thr Lys Thr Thr Val Ala 130 135 140 Thr Glu Pro His Thr Thr Ala Ala Pro Pro Val Val Pro Ser Ser Ser 145 150 155 160 Ser Thr Lys Gln Ile Val Ile Pro Thr Ala Glu Pro Val Pro Val Pro 165 170 175 Val Arg Glu Pro Ile Glu Pro Ala Pro Ser Ser Thr Arg Thr Thr Val 180 185 190 Ala Thr Glu Pro His Thr Thr Ala Ala Pro Pro Val Ala Val Pro Pro 195 200 205 Ala Thr Ala Pro Leu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro Pro Pro Pro 210 215 220 Ala Ser Arg Pro Ala Gly Ser Asn Ser Gly Lys Ala Thr Phe Tyr Gly 225 230 235 240 Gly Asn Val Ser Gly Gly Thr Cys Ser Phe Ser Gly Tyr Lys Leu Pro 245 250 255 Ala Gly Leu Phe Gly Thr Ala Leu Ser Lys Ala Arg Trp Ser Asp Ala 260 265 270 Ala Glu Cys Gly Ala Cys Val Ser Val Thr Gly Pro Asn Gly Asn Ser 275 280 285 Ile Lys Ala Met Ile Val Asp Gln Cys Pro Glu Cys Glu Ser Asn His 290 295 300 Leu Asp Leu Phe Gln Asp Ala Phe Ala Glu Leu Ala Asp Ile Ser Lys 305 310 315 320 Gly Ile Ile Gly Ile Asp Trp Ser Tyr Val Pro Cys Glu Ile Asp Ser 325 330 335 Pro Leu Val Leu Lys Asn Lys Glu Gly Thr Ser Arg Tyr Trp Phe Ser 340 345 350 Met Gln Val Val Asn Ala Asn Glu Pro Val Ala Ser Leu Glu Val Ser 355 360 365 Thr Asn Gly Gly Ser Thr Trp Gln Pro Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Asn 370 375 380 Phe Phe Glu Asn Ala Ser Gly Phe Gly Ala Asp Thr Val Asp Val Arg 385 390 395 400 Val Thr Gly Val Ser Gly Lys Ser Leu Thr Val Lys Asn Val Gly Val 405 410 415 Gly Ser Ser Ser Ser Val Thr Ala Ser Ser Asn Leu 420 425 <210> 7 <211> 420 <212> PRT <213> Q2U7S7: (Predicted protein from Aspergillus oryzae) <400> 7 Met Lys Tyr Gln Arg Leu Ala Ser Leu Gly Leu Ala Ala Leu Ser Val 1 5 10 15 Thr Gly Ser Val Ser Ala Ser Pro Leu Ile Arg His Glu Gly Glu Ser 20 25 30 Val Cys Pro Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Val Tyr Tyr Val Thr Val Thr 35 40 45 Ala Ser Ser Thr Pro Ala Ser Thr Ser Ser Val Glu Pro Thr Thr Thr 50 55 60 Ile Glu Ser Thr Ser Thr Val Thr Glu Thr Thr Val Ile Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ile Pro Ala Gln Ser Pro Thr Ser Thr Pro Val Glu Ile Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Thr Pro Ala Pro Val Glu Thr Pro Ser Pro Ala Glu Thr Pro 100 105 110 Ala Pro Val Glu Thr Asn Thr Pro Val Glu Pro Thr Thr Ser Ser Ser 115 120 125 Thr Thr Glu Thr Pro Val Val Ala Pro Thr Ile Ala Thr Pro Ser Thr 130 135 140 Ala Asp Val Gln Pro Thr Glu Val Val Ala Glu Pro Ser Thr Ser Ser 145 150 155 160 Ser Ser Thr Glu Glu Pro Thr Ala Thr Pro Ile Ala Ala Glu Thr Pro 165 170 175 Ser Thr Thr Val Asp Ala Gln Pro Thr Thr Ala Ala Ala Ala Pro Thr 180 185 190 Thr Lys Gln Leu Lys Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ala Pro Ala Ala 195 200 205 Ser Val Thr Ser Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 210 215 220 Ser Glu Ser Asn Ser Gly Glu Ala Thr Phe Tyr Gly Gly Asn Leu Ser 225 230 235 240 Gly Gly Ala Cys Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Leu Pro Ser Asn Leu Phe 245 250 255 Gly Thr Ala Leu Gly Ser Pro Arg Trp Asp Asn Ala Ala Glu Cys Gly 260 265 270 Ala Cys Val Ala Val Thr Gly Pro Asn Gly Asn Thr Ile Lys Ala Met 275 280 285 Ile Val Asp Lys Cys Pro Glu Cys Asp Ser Asn His Leu Asp Leu Phe 290 295 300 Gln Ser Ala Phe Thr Glu Leu Ala Asp Ile Ser Lys Gly Val Ile Asp 305 310 315 320 Ile Thr Trp Asn Tyr Val Ser Cys Asp Ile Asp Thr Pro Leu Lys Leu 325 330 335 Lys Asn Lys Glu Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Phe Ser Met Gln Val Val 340 345 350 Asn Ala Asn Glu Ala Val Thr Ser Leu Glu Val Ser Thr Asp Gly Gly 355 360 365 Ser Thr Trp Gln Ser Thr Thr Arg Ser Asp Tyr Asn Tyr Phe Glu Asn 370 375 380 Ser Ser Gly Phe Gly Thr Ala Thr Val Asp Val Arg Val Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ser Gly Lys Val Val Thr Val Asn Asn Val Ser Val Ser Ser Gly Val 405 410 415 Glu Val Thr Ala 420 <210> 8 <211> 341 <212> PRT <213> Q0CDB1: (Putative uncharacterized protein from Aspergillus terreus) <400> 8 Met Ser Val Tyr Tyr Lys Thr Ile Thr Leu Glu Pro Thr Pro Ser Val 1 5 10 15 Glu Pro Thr Thr Thr Ile Gln Ala Thr Ser Thr Val Thr Glu Thr Val 20 25 30 Thr Ala Ile Pro Glu Ser Thr Leu Thr Ser Val Ser Val Pro Met Glu 35 40 45 Thr Pro Thr Thr Gly Ala Asn Val Ala Pro Thr Glu Ser Pro Val Asp 50 55 60 Ala Ile Glu Thr Ser Val Ser Val Gly Leu Pro Pro Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ser Ala Thr Val His Gln Lys Val Ile Val Pro Ala Glu Ser 85 90 95 Thr Thr Thr Val Ala Pro Gln Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Val Ser 100 105 110 Thr Ser Gln Ala Gln Gln Pro Thr Thr Thr Ala Ala Ala Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Lys Ser Glu Thr 130 135 140 Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Phe Tyr Gly Gly Asn Val Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Cys Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Leu Pro Ser Gly Leu Phe Gly Thr Ala 165 170 175 Tyr Ser Gly Ala Gln Trp Asn Asp Ala Ala Gln Cys Gly Ala Cys Val 180 185 190 Gln Val Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ser Ile Lys Ala Met Ile Val Asp 195 200 205 Gln Cys Pro Glu Cys Glu Ala Thr His Leu Asp Leu Phe Gln Asn Gly 210 215 220 Phe Ser Glu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Ile Ile Ser Ile Asp Trp 225 230 235 240 Ser Phe Val Ser Cys Asp Ile Asp Thr Pro Leu Val Leu Lys Asn Lys 245 250 255 Glu Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Phe Ser Met Gln Val Val Asn Ser Asn 260 265 270 Glu Pro Val Thr Ala Leu Glu Val Ser Thr Asp Gly Gly Ser Thr Trp 275 280 285 His Ala Thr Thr Arg Ser Phe Tyr Asn Tyr Phe Glu Asn Asp Ser Gly 290 295 300 Phe Gly Thr Asp Thr Val Asp Val Arg Ile Thr Gly Gln Ser Gly Lys 305 310 315 320 Thr Val Arg Val Asn Asn Val Gly Cys Ser Ser Gly Ser Ser Thr Thr 325 330 335 Ala Ser Thr Asn Phe 340 <210> 9 <211> 378 <212> PRT <213> B6HQC7: (Pc22g15890 protein from Penicillium chrysogenum) <400> 9 Met Lys Tyr Leu Arg Leu Ala Ser Val Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala 1 5 10 15 Thr Val Ser Ala Gly Pro Leu Gly Ala Arg Glu His Asp Gly Tyr Cys 20 25 30 Pro Lys Gly Tyr Thr Met Ser Val Tyr Tyr Lys Thr Ile Thr Val Glu 35 40 45 Ser Tyr Pro Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Thr Pro Ala Ile Val Glu 50 55 60 Ser Gln Pro Pro Ala Glu Pro Thr Leu Ala Ser Ser Ser Pro Ala Ile 65 70 75 80 Ala Val Glu Ser Thr Thr Pro Val Ala Val Ile Gln Val Glu Thr Thr 85 90 95 Ser Ser Ser Ala Pro Ala Ala Glu Thr Glu Val Ala Glu Thr Ala Ala 100 105 110 Pro Lys Thr Asp Ala Val Val Ala Pro Leu Pro Thr Ala Ser Ala Glu 115 120 125 Thr Ala Ala Val Ile Glu Thr Ile Ala Ala Pro Ala Val Lys Thr Pro 130 135 140 Val Val Gln Pro Ser Thr Thr Glu Ala Pro Ala Glu Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 Ser Thr Lys Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Lys Ser Ala Ser Thr 165 170 175 Gly Ser Ser Asn Gly Thr Pro Gly Lys Ala Thr Phe Tyr Gly Gly Asn 180 185 190 Val Gly Gly Gly Thr Cys Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Leu Pro Ser His 195 200 205 Leu Phe Gly Thr Ala Leu Ser Leu Gln Arg Trp Asp Asp Ala Ala Asn 210 215 220 Cys Gly Ala Cys Val Ser Val Thr Gly Pro Lys Gly Asn Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ala Met Ile Val Asp Gln Cys Pro Glu Cys Glu Ser Asn His Leu Asp 245 250 255 Leu Phe Gln Glu Ala Phe Ala Glu Leu Ser Asp Ile Ser Ala Gly Ile 260 265 270 Ile Gln Thr Thr Trp Ser Tyr Val Pro Cys Asp Leu Asp Gly Pro Leu 275 280 285 Lys Leu Lys Asn Lys Glu Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Phe Ser Met Gln 290 295 300 Val Val Asn Ala Asn Glu Ala Val Thr Ala Leu Glu Val Ser Thr Asp 305 310 315 320 Gly Gly Ser Ser Trp Gln Ser Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Asn Tyr Phe 325 330 335 Glu Asn Thr Ala Gly Phe Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Arg Ile Thr 340 345 350 Gly Ala Ser Gly Ser Thr Val Val Val Lys Asp Val Gly Val Ser Ser 355 360 365 Gly Ser Glu Val Thr Ala Gly Ser Asn Leu 370 375 <210> 10 <211> 524 <212> PRT <213> A2QGR1: Xanthomonas campestris from Aspergillus niger) <400> 10 Met Lys Tyr Arg Cys Leu Ala Ser Leu Gly Ile Ala Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Val Ser Ala Asn Pro Leu Leu Asn Arg Glu Ala Glu Gly 20 25 30 Gln Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gln Ser Val Tyr Tyr Lys Thr Ile Thr 35 40 45 Leu Gln Pro Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ala Pro Thr Ser Thr Leu Ala 50 55 60 Ser Ala Gly Glu Gly Gln Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gln Ser Val Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Thr Ile Pro Leu Gln Pro Thr Ser Thr Ala Ser Val Glu Pro 85 90 95 Thr Ser Ala Pro Ala Val Glu Pro Thr Ser Thr Pro Ala Val Glu Ser 100 105 110 Ser Ser Thr Ser Ile Asp Gln Val Thr Thr Leu His Ser Ser Ser Thr 115 120 125 Val Ile Val Thr Glu Val Val Thr Ala Thr Pro Ala Val Ala Thr Thr 130 135 140 Ser Ser Ala Val Glu Ser Ala Ala Pro Val Ala Thr Thr Pro Ser Ala 145 150 155 160 Ala Glu Ala Ser Pro Ala Ala Glu Thr Ser Thr Ala Val Glu Ala Thr 165 170 175 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Val Glu Val Thr Thr Asn Ala Ala Ala 180 185 190 Asn Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gln Pro Thr Pro Glu Ala Val 195 200 205 Thr Thr Glu Val Ala Thr Thr Glu Ala Ala Ala Thr Thr Glu Ala Ala 210 215 220 Ala Gln Pro Ser Pro Glu Ala Ala Thr Thr Glu Ala Val Thr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Glu Ala Ala Thr Thr Gln Glu Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Thr Thr Glu Ala Val Val Gln Ser Thr Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Thr Thr Glu Ala Ala Thr Thr Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gln Ala 275 280 285 Ala Ala Thr Thr Val Glu Ser Lys Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ala 290 295 300 Ala Ser Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser 305 310 315 320 Ser Ala Leu Ser Ser Glu Tyr Ser Gly Glu Ala Thr Phe Tyr Gly Gly 325 330 335 Asn Val Ser Gly Gly Thr Cys Ser Phe Thr Glu Tyr Thr Ile Pro Ser 340 345 350 Gly Leu Phe Gly Thr Ala Leu Ser Ser Gln Arg Trp Asp Asn Ala Ala 355 360 365 Glu Cys Gly Ala Cys Val Glu Val Thr Gly Pro Ser Gly Thr Lys Ile 370 375 380 Lys Ala Met Val Val Asp Glu Cys Pro Glu Cys Asp Ser Asn His Leu 385 390 395 400 Asp Leu Phe Glu Ser Ala Phe Ser Glu Leu Ala Asp Ile Ser Lys Gly 405 410 415 Val Ile Ser Ile Asp Trp Glu Tyr Val Ala Cys Gly Ile Thr Ser Pro 420 425 430 Ile Glu Leu Val Asn Lys Ser Gly Thr Ser Ala Tyr Trp Phe Ala Met 435 440 445 Gln Val Val Asn Ser Asn Leu Pro Val Thr Lys Leu Glu Val Ser Thr 450 455 460 Asp Ser Gly Ser Thr Trp Gln Ser Thr Thr Arg Ser Ser Tyr Asn Tyr 465 470 475 480 Phe Glu Asn Gln Ser Gly Phe Gly Thr Asp Thr Val Asp Val Arg Val 485 490 495 Thr Ala Glu Gly Gly Ser Gln Ile Thr Val Lys Asn Val Ser Val Ser 500 505 510 Ser Gly Ser Ser Val Thr Ala Ser Ser Asn Phe Glu 515 520 <210> 11 <211> 366 <212> PRT <213> Q5AVE5: (Putative uncharacterized protein from Emericella nidulans) <400> 11 Met Lys Tyr Gln His Phe Ser Ser Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ser Thr Phe Val Ser Ala Ala Pro Leu Ala Pro Glu Glu Asn Gly Ser 20 25 30 Cys Pro Ala Gly Tyr Ser Pro Ser Val Tyr Tyr Ile Thr Val Thr Ala 35 40 45 Glu Pro Ser Ser Thr Val Arg Pro Thr Ser Ser Ala Pro Ile Ser Ser 50 55 60 Thr Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Glu Thr Ser Leu 65 70 75 80 Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Thr Gly Asp Val Thr Val Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Leu Ile Glu Thr Ile Pro Ala Val Val Val Asn Ala 100 105 110 Ala Thr Ser Thr Thr Ser Glu Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ala Leu Ser 115 120 125 Ile Ser Glu Thr Ala Pro Thr Gln Val Ala Val Ala Arg Pro Ser Thr 130 135 140 Thr Thr Ala Ala Glu Lys Thr Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser 145 150 155 160 Ser Ser Thr Ser Thr Asn Ser Gly Ala Thr Thr Gly Glu Ala Thr Phe 165 170 175 Tyr Gly Gly Asn Leu Ser Gly Gly Thr Cys Ser Phe Thr Asp Tyr Thr 180 185 190 Leu Pro Ser His Leu Ser Gly Val Ala Phe Ser Gly Gln Ala Trp Asp 195 200 205 Asn Ala Ala Glu Cys Gly Ala Cys Ile Ala Val Thr Gly Pro Asn Gly 210 215 220 Asn Thr Val Lys Val Met Val Val Asp Lys Cys Pro Glu Cys Ala Gln 225 230 235 240 Thr His Leu Asp Leu Phe Glu Ser Ala Phe Thr Thr Leu Ala Ser Ala 245 250 255 Ser Glu Gly Gln Ile Pro Ile Ser Tyr Ser Ile Thr Pro Cys Gly Ile 260 265 270 Thr Ser Pro Leu Ile Leu Arg Asn Lys Ser Gly Thr Ser Ala Tyr Trp 275 280 285 Phe Ser Met Gln Val Val Asn Ala Asn Gly Ala Val Lys Ser Leu Glu 290 295 300 Val Ser Thr Asp Asn Gly Ser Thr Trp Gln Glu Thr Thr Arg Ser Asp 305 310 315 320 Tyr Asn Phe Phe Glu Asn Ser Ser Gly Phe Gly Thr Asp Thr Val Asp 325 330 335 Val Arg Val Thr Gly Val Asp Gly Gly Val Ile Thr Val Lys Asn Val 340 345 350 Ser Val Ala Ser Gly Glu Ser Val Thr Ala Asp Gly Asn Phe 355 360 365 <210> 12 <211> 223 <212> PRT <213> A4RA67: (Putative uncharacterized protein from Magnaporthe grisea) <400> 12 Met Ala Ser His Ser Ala Ile Ile Thr Arg Leu Leu Val Leu Ile Leu 1 5 10 15 Ala Ile Thr Val Arg Gln Thr Ala Ala Val Asn Gly Lys Ala Ser His 20 25 30 Tyr Gly Gly Asn Leu Ser Gly Gly Asn Cys Met Leu Thr Ser Tyr Thr 35 40 45 Ile Pro Ala Gly Thr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ile Ser Asn Tyr Asp 50 55 60 Asn Ser Asn Met Cys Gly Val Cys Leu Asn Val Lys Gly Pro Ser Gly 65 70 75 80 Ser Met Lys Val Met Val Val Asp Ser Cys Pro Asp Cys Pro Pro Asn 85 90 95 Lys Leu Asp Leu Phe Glu Asn Gly Phe Ser Asn Ile Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Ala Gly Ile Val Asp Val Asp Trp Glu Val Thr Pro Cys Asp Ile Thr 115 120 125 Glu Pro Leu Gln Val Arg Asn Lys Asp Gly Thr Ser Lys Tyr Trp Phe 130 135 140 Ser Met Gln Val Leu Asn Ser Asn Gln Gln Val Gln Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Ser Thr Asp Gly Gly Ala Thr Trp Gln Gly Thr Thr Arg Arg Pro Tyr 165 170 175 Asn Phe Phe Glu Lys Thr Ser Gly Gly Gly Phe Gly Ala Asp Ser Leu 180 185 190 Thr Val Arg Val Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gln Val Thr Met Gln Asn 195 200 205 Val Gly Val Ala Gly Gly Ser Ser Phe Thr Ala Ser Gly Asn Cys 210 215 220 <210> 13 <211> 397 <212> PRT <213> B2VVM5: (Putative uncharacterized protein from Pyrenophora tritici-repentis) <400> 13 Met Lys Gly Ala Ile Phe Ser Ile Leu Pro Phe Val Gly Leu Ala Phe 1 5 10 15 Ala Gln Glu Ser Ala Cys Pro Ala Glu Pro Asp Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Thr Glu Val Glu Thr Val Tyr Lys Thr Ala Thr Pro Thr Pro Ala Leu 35 40 45 Val Ala Asp Ala Thr Thr Ser Pro Gly 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Ser Ser Cys Ser Arg Arg Thr Val 50 55 60 Thr Ala Thr Lys Val Glu Lys Val Thr Val Thr Val Gly Ala Ser Asn 65 70 75 80 Thr Asp Pro Gly Thr Ile Asp Val Thr Ser Ile Ser Tyr Lys Thr Val 85 90 95 Lys Thr Thr Val Thr Val Arg Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ala Ala Ser 100 105 110 His Ala Ser Ser Ser Leu Gln Trp Gly Asn Tyr Pro Asn Ala Thr Tyr 115 120 125 His Ala Ser Ser Ser Ala Arg Ser Thr Phe Leu Thr Ser Ser Ser Ala 130 135 140 Pro Ala Thr Pro Thr Ser Asp Leu Pro Ser Phe Ser Val Ile Gly Gln 145 150 155 160 Ala Ile Pro Thr Ser Glu Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Lys 165 170 175 Val Ala Ala Ala Ala Pro Gln Glu Ala Pro Glu Thr Val Pro Gly Thr 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Lys Arg Gly Glu Ala Thr Phe Tyr Gly 195 200 205 Gly Asn Thr Ala Gly Gly Met Cys Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Ile Pro 210 215 220 Ala Gly Leu Phe Gly Thr Ala Leu Thr Asp Ser Asp Trp Asp Ser Gly 225 230 235 240 Asn Ala Cys Gly Gln Cys Val Ser Val Thr Gly Pro Asp Gly Lys Thr 245 250 255 Lys Ile Thr Ala Met Val Val Asp Gln Cys 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Leu Gly Thr Ala Leu Ser Asp Ser Asn 50 55 60 Trp Ala Thr Ala Ala Asn Cys Gly Arg Cys Val Ser Val Thr Gly Pro 65 70 75 80 Ser Gly Asn Asn Ile Thr Ala Met Ile Thr Asp Glu Cys Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Thr Asn His Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Ala Phe Thr Lys Leu Ala 100 105 110 Ala Leu Ser Val Gly Ile Ile Asp Ile Thr Trp Asp Tyr Val Pro Cys 115 120 125 Pro Ile Thr Thr Pro Leu Gln Val His Leu Lys Glu Gly Val Ser Ala 130 135 140 Tyr Trp Phe Ser Met Gln Val Val Asn Ala Ala Glu Gly Val Ser Lys 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Thr Asp Gly Ser Lys Thr Trp Lys Ser Thr Thr Arg 165 170 175 Thr Thr Tyr Asn Phe Phe Glu Asn Ser Ser Gly Phe Gly Thr Thr Ser 180 185 190 Val Asp Val Arg Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Thr Val Ile Ile Lys 195 200 205 Asn Val Ala Val Thr Pro Gly Leu Val Val Thr Ala Ser Gly Asn Leu 210 215 220 Lys Ser Gly Ser Thr Gly Ser Ala Lys Thr Val Val Pro Ala Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Thr Ser Ser Glu Val Asp Thr Val Glu Pro Val Val Ala Ala 245 250 255 Asp Ala Val Ala Thr Pro Ser Ala Ser 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(Putative uncharacterized protein from Sorangium cellulosum) <400> 19 Met Arg Leu Gly Ala Tyr Arg Ser Ala Val Ala Leu Ser Phe Leu Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Ala Cys Thr Val Ala Thr Gly Gly Glu Glu Glu Ala 20 25 30 Asp Ala Leu Tyr Gly Ala Val Val Thr Thr Asp Gly Leu Thr Pro Ala 35 40 45 Ala Leu Thr Met Pro Ser Asp Trp Gly Ser Gly Tyr Cys Ala Asn Val 50 55 60 Ile Val Ala Asn Asp Gly Thr Ala Pro Val Thr Ser Trp Thr Val Val 65 70 75 80 Ile Asn Leu Asn Gln Ala Ala Val Ser Ser Trp Trp Asn Ala Ala Ser 85 90 95 Ser Gln Ser Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Pro Arg Ser Gly Ser Pro 100 105 110 Ser Ile Pro Val Gly Ser Ser Val Ser Phe Gly Phe Cys Ala Asn Ala 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Tyr Arg Pro Thr Leu Val Ser Val Thr Lys Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Gly Ser Thr Gly Ser 165 170 175 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Thr Gly Ala Gly Gly Ser Ser Ala Thr Cys Ser Ile Pro 195 200 205 Leu Pro Ser Tyr Thr Ser Gly Asn Gly Ser Ala Thr Trp Tyr Ser Leu 210 215 220 Asp Gln Gly Thr Ala Gln Val Asn Cys Ser Leu Pro Ile Gln Gln Arg 225 230 235 240 Asn Pro Asp Ser Ile Gly His Val Ala Thr Gly Gly Gly Arg Tyr Phe 245 250 255 Ala Ala Leu Asn Thr Ala Asp Tyr Asn Thr Ala Ala Ala Cys Gly Ala 260 265 270 Cys Val Glu Val Ser Arg Asp Asp Gly Arg Lys Val Val Ala Thr Val 275 280 285 Val Asp Gln Cys Pro Thr Ala Ser Asn Pro Lys Cys Lys Ala Gly His 290 295 300 Ile Asp Leu Ser Lys Glu Ala Phe Ala Gln Ile Gly Ala Leu Asp Glu 305 310 315 320 Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Asn Gly Gly Val Arg Gly Lys Ile Ser Trp 325 330 335 Lys Tyr Val Pro Cys Pro Val Glu Glu Asn Val Ser Ile Val Leu Lys 340 345 350 Glu Pro Gly Asn Ala Trp Trp Asn Glu Leu Arg Val Gln Gly His Arg 355 360 365 Thr Pro Val Arg Lys Leu Glu Val Tyr Val Gly Gly Arg Trp Thr Glu 370 375 380 Ala Thr Arg Gln Pro Tyr Asn Tyr Trp Arg Val Gly Ser Gly Asn Met 385 390 395 400 Gly Gln Gly Pro Trp Arg Val 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<400> 22 Met Arg Ala Leu Pro Leu Val Ser Leu Arg His Leu Thr Ala Val Gly 1 5 10 15 Met Leu Gly Leu Thr Ala Cys Ser Ser Ser Glu Pro Asp Asp Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Asn Asp Pro Glu Gly Glu Val Arg Ala Leu Gly Glu Phe Arg 35 40 45 Gln Gly Ile Ala Thr Trp Tyr Asn Ala Thr Gly Glu Gly His Cys Gly 50 55 60 Tyr Asp Ala Ser Pro Lys Asp Met Asp Val Ala Ala Met Asn Ala Pro 65 70 75 80 Gln Phe Ala Asn Ser Ala Val Cys Gly Ser Cys Ala Glu Val Glu Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Thr Val Arg Val Arg Ile Val Asp Ser Cys Pro Glu Cys 100 105 110 Gly Pro Gly His Leu Asp Leu Ser Glu Gln Ala Phe Ala Lys Ile Ala 115 120 125 Ala Val Ala Asp Gly Arg Val Gln Thr Arg Trp Arg Pro Val Thr Cys 130 135 140 Ala Val Ser Gly Pro Val Arg Tyr Arg Phe Lys Glu Gly Ser Ser Gln 145 150 155 160 Trp Trp Thr Ala Ile Gln Val Arg Asn His Arg Leu Pro Ile Gln Lys 165 170 175 Leu Glu Trp Gln Arg Glu Asn Gly Ala Trp Val Asp Met Gln Arg Gln 180 185 190 Asp Tyr Asn Tyr Phe Leu Ala Ser Pro Gly Val Asp Thr Ala Thr Thr 195 200 205 Lys Leu Arg Val Thr Ala Ser Asp Gly Gln Val Leu Glu Asp Thr Leu 210 215 220 Pro Arg Val Glu Glu Lys Lys Val Phe Asp Gly Ala Glu Gln Phe Ser 225 230 235 240 Leu Lys Lys <210> 23 <211> 233 <212> PRT <213> Q1D6G0: (Putative lipoprotein from Myxococcus xanthus) <400> 23 Met Ala Met His Pro Leu Arg Ser Lys Ser Arg Arg Phe Leu Leu Pro 1 5 10 15 Val Ala Ala Val Phe Val Ala Cys Gly Gly Cys Ser Asp Asp Pro Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ala Pro Leu Gly Glu Glu Gln Gln Gly Ile Ala Thr Phe 35 40 45 Tyr Asn Ala Thr Gly Ser Gly Asn Cys Ser Tyr Glu Pro Thr Gly Asp 50 55 60 Leu Met Val Ala Ala Met Asn Thr Pro Gln Tyr Ala Asn Ser Ala Ala 65 70 75 80 Cys Gly Gln Cys Val Asp Ile Thr Gly Pro Lys Gly Ser Val Arg Val 85 90 95 Arg Ile Val Asp Arg Cys Pro Glu Cys Glu Ser Gly His Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Arg Glu Ala Phe Ala Arg Ile Ala Glu Met Gln Gln Gly Arg Val 115 120 125 Asn Ile Thr Trp Thr Pro Val Ser Cys Asp Val Ala Gly Asn Ile Glu 130 135 140 Tyr His Phe Lys Asn Gly Ser Asn Pro Trp Trp Thr Ala Ile Gln Val 145 150 155 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Ala Gly Thr Pro Pro Ser 500 505 510 Gln Ala Thr Pro Pro Ser Gln Ala Thr Pro Pro Ser Gln Ala Thr Thr 515 520 525 His Gly Arg Ala Thr His Tyr Ser Leu Gly Thr Gly Asn Thr Ile Ala 530 535 540 Asn Gly Asn Cys Ser Met Pro Ala Val Pro Ala Asp Arg Met Tyr Val 545 550 555 560 Ala Val Ser Ser Pro Glu Tyr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Gly Ser His 565 570 575 Leu Leu Val Thr Gly Pro Lys Gly Thr Val Arg Val Gln Ile Val Asp 580 585 590 Gln Cys His Glu Cys Glu Ile Gly His Leu Asp Leu Ser Glu Glu Ala 595 600 605 Phe Arg Ala Ile Gly Asp Phe Asp Ala Gly Ile Ile Pro Ile Ser Tyr 610 615 620 Thr Thr Val Arg Asp Pro Ser Val Pro Ala Val Ala Val Arg Val Lys 625 630 635 640 Glu Gly Ser Ser Arg Trp Trp Ala Gly Leu Gln Ile Leu Asn Ala Gly 645 650 655 Asn Arg Ile Asp Arg Val Glu Val Arg Ala Gly Gly Gln Trp Leu Pro 660 665 670 Leu Ser Arg Thr Asp Tyr Gly Tyr Trp Val Thr Pro Ser Pro Ile Pro 675 680 685 Asp Gly Pro Met Thr Val Arg Val Thr Asp Gln Tyr Gly Arg Ser Val 690 695 700 Val Leu Pro Gly Ile Arg Ile Ala Pro Gly Glu Thr Gln Ser Thr Ala 705 710 715 720 Arg Arg Ile Tyr Gln Met His 725 <210> 33 <211> 746 <212> PRT <213> A5CLK3: (Cellulase from Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) <400> 33 Met Arg Lys Ala Ser Val Glu Val Val Phe Ser Ala Ala Gly Trp Leu 1 5 10 15 Pro Tyr Asp Pro Tyr Met Thr Phe Arg Gln Val Arg Ala Ser Leu Val 20 25 30 Leu Arg Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Val Gly Thr Thr Ser Ala 35 40 45 Ala Phe Ala Ala Pro Val Ser Ala Ala Thr Val Ala Gly Pro Val Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Gly Gly Lys Ile Val 65 70 75 80 Thr Ala Ser Gly Ala Pro Tyr Thr Ile Arg Gly Ile Ala Trp Phe Gly 85 90 95 Met Glu Thr Ser Ser Cys Ala Pro His Gly Leu Asp Thr Ile Thr Leu 100 105 110 Ala Gly Gly Met Gln His Ile Lys Gln Met Gly Phe Thr Thr Val Arg 115 120 125 Leu Pro Phe Ser Asn Gln Cys Leu Ala Ala Ser Gly Val Thr Gly Val 130 135 140 Ser Ala Asp Pro Ser Leu Ala Gly Leu Thr Pro Leu Gln Val Met Asp 145 150 155 160 His Val Val Ala Ser Ala Lys Ser Ala Gly Leu Asp Val Ile Leu Asp 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235 240 Asp Pro Met Arg Leu Gln His Thr Ala Ser Arg Leu Arg 245 250 <210> 35 <211> 232 <212> PRT <213> O34918: (BsEXLX1=Expansin-yoaJ from Bacillus subtilis) <400> 35 Met Lys Lys Ile Met Ser Ala Phe Val Gly Met Val Leu Leu Thr Ile 1 5 10 15 Phe Cys Phe Ser Pro Gln Ala Ser Ala Ala Tyr Asp Asp Leu His Glu 20 25 30 Gly Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Phe Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Ile Pro Ser Asp Met Glu Ile Thr Ala Ile Asn Pro Ala 50 55 60 Asp Leu Asn Tyr Gly Gly Val Lys Ala Ala Leu Ala Gly Ser Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Val Glu Gly Pro Lys Gly Lys Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu 85 90 95 Tyr Pro Glu Gly Ala Arg Gly Ala Leu Asp Leu Ser Pro Asn Ala Phe 100 105 110 Arg Lys Ile Gly Asn Met Lys Asp Gly Lys Ile Asn Ile Lys Trp Arg 115 120 125 Val Val Lys Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Thr Tyr Arg Ile Lys Glu 130 135 140 Gly Ser Ser Arg Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr 145 150 155 160 Pro Val Met Lys Met Glu Tyr Glu Lys Asp Gly Lys Trp Ile Asn Met 165 170 175 Glu Lys 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130 135 140 Asn His Lys Tyr Pro Ile Met Lys Met Glu Tyr Tyr Lys Asp Gly Gln 145 150 155 160 Trp Val Asn Met Glu Lys Thr Asp Tyr Asn His Phe Leu Gly Phe Asn 165 170 175 Met Gly Ser Lys Ser Leu Pro Val Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Val 180 185 190 Ile Val Lys Asp Lys Leu Pro Ala Leu Pro Ser Thr Ala Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Tyr Thr Val Lys Gly Asn Val Gln Leu Pro Asn 210 215 220 <210> 37 <211> 666 <212> PRT <213> B0RNG4: (Glycosidase from Xanthomonas campestris) <400> 37 Met Thr Ser Glu Gln Met Pro Ser Leu Ala Glu Arg Ala Leu His Gly 1 5 10 15 Thr Gly Ser Val Ala Pro Arg Gln Ala Ala Gln Arg Pro Leu Arg Ala 20 25 30 Ala Asp Gly Gln Pro Gly Leu Trp His Ala Gly Thr Ala Ser Arg Ala 35 40 45 Leu Pro Gly Ser Cys Ala Leu Leu Ser Pro Pro Ala Gln Ala Ala Ser 50 55 60 His Ala Thr Val His Asn Thr Leu Gln Lys Thr Ser Met Pro Ser His 65 70 75 80 Ile His Phe Leu Ile Ala Leu Ala Thr Leu Ile Pro Val Thr Ala Pro 85 90 95 Ala Met Gln Val Ser Thr Gln Ala Pro Leu Val Asp Ala Thr Gly Gln 100 105 110 Thr Leu His Ile Arg Gly Val Thr Trp Pro Gly Phe Asp Arg Ala Gly 115 120 125 Leu Ala Ala Val Gly Met Arg Asn Asn Thr Leu Ala Gln Leu Leu Asp 130 135 140 Arg Met Gln Ala Ser Asp Ile Asn Ala Val Arg Val Pro Val Cys Ala 145 150 155 160 Ala Val Leu Gln Arg Ala Pro Val Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Asp 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Gly Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu Asp Ala Val Val 180 185 190 His Ala Ala Ser Gln Arg Gly Met Gln Val Met Phe Ala Phe Ala Asp 195 200 205 Gly Gly Cys Asp Asp Arg Ala Pro Leu Leu Gly Ala Gln Gln Gln Ala 210 215 220 Trp Thr Arg Gly Leu Val Thr Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Asn Ala 225 230 235 240 Asn Val Leu Gly Ile Asp Leu Gly Ser Ser Gly Tyr Arg Asn Ala Ser 245 250 255 Trp Ala Gly Asn Ala Ala Asp Gln Asp Trp Asn Arg Val Ala Ser Arg 260 265 270 Ala Val Ala Arg Val Leu Ala Gln Ala Pro Arg Trp Val Val Gly Val 275 280 285 Glu Gly Val Gly Ser Asn Ala Val Cys Ser Asp Pro Glu Arg Lys Ala 290 295 300 Pro Gly Ser Asn Leu Gln Pro Phe Ala Cys Val Pro Leu Asp Ile Ala 305 310 315 320 Arg Arg His Leu Val Leu Met Pro Lys Leu Ala Gly Pro Asp Arg Asp 325 330 335 Thr Thr Asp Ala Phe Ala Ala Pro Gly Phe Ala Gln Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Met Trp Gln Arg Asp Phe Gly Gln Phe Ala Ile Asp His Ala Val Val 355 360 365 Pro Val Ser Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asp Gly Asp Pro Arg Asp Pro 370 375 380 Ala Trp Gln Thr Ala Leu Ser Gly Tyr Leu Ala Asn Ala Gly Ile Arg 385 390 395 400 Ser Ala Phe Leu Gly Ser Trp Glu Thr Gly Asn Ala Asn Asn Gly Gly 405 410 415 Leu Leu Ala Pro Asp Gly Ser Pro Arg Ala Asp Lys Leu Leu Ile Leu 420 425 430 Arg His Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Met Pro Ala Ile Ala Thr Ala 435 440 445 Thr Gly Asp Ser Thr Lys Asn Ala Ser Gly Lys Lys Pro Trp Asn Ser 450 455 460 Thr Phe Thr Gly Thr Ala Thr Val Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly 465 470 475 480 Ala Leu Leu Leu Asp Pro Ile Pro Ser Asp Ala Phe Ile Thr Ala Leu 485 490 495 Asn Pro Val Gln Leu Asn Phe Gly Gly Val Lys Ala Ala Leu Ala Gly 500 505 510 Ala Tyr Leu Gln Val Asn Gly Pro Lys Gly Thr Thr Thr Val Tyr Val 515 520 525 Thr Asp Leu Tyr Pro Glu Gly Ala Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser His 530 535 540 Asn Ala Phe Ala Ala Ile Gly Asp Met Val Gln Gly Arg Ile Pro Ile 545 550 555 560 Ser Trp Lys Val Val Arg Ala Pro Val Thr Gly Asn Leu Gln Tyr Arg 565 570 575 Ile Lys Glu Gly Ser Ser Arg Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn 580 585 590 His Ala Tyr Pro Val Val Lys Leu Glu Val Lys Gln Gly Ser Thr Trp 595 600 605 Lys Asn Leu Gln Lys Met Asp Tyr Asn His Phe Leu Gly Glu Gln Leu 610 615 620 Gly Asn Gln Pro Leu Thr Leu Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val 625 630 635 640 Leu Thr Asp Thr Leu Pro Arg Leu Pro Glu Asp Gly Ser Lys Pro Ala 645 650 655 Tyr Phe Glu Pro Gly His Val Gln Phe Pro 660 665 <210> 38 <211> 590 <212> PRT <213> Q2NYR6: (Cellulase from Xanthomonas oryzae) <400> 38 Met Leu Ser His Ile His Phe Leu Ile Ala Leu Ala Thr Leu Val Pro 1 5 10 15 Val Thr Ala Pro Ala Met Gln Val Ser Thr Gln Ala Pro Leu Val Asp 20 25 30 Ala Thr Gly Gln Thr Leu His Ile Arg Gly Val Thr Trp Pro Gly Phe 35 40 45 Asp Arg Ala Gly Leu Thr Ala Val Gly Met 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Gly Phe Ala Gln 260 265 270 Ala Leu Pro Ala Met Trp Gln Arg Asp Phe Gly Gln Phe Ala Ile Asp 275 280 285 His Thr Val Val Pro Val Ser Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asp Gly Asp 290 295 300 Pro Arg Asp Pro Ala Trp Gln Thr Ala Leu Ser Gly Tyr Leu Ala Asn 305 310 315 320 Thr Gly Met Arg Ser Ala Phe Leu Gly Ser Trp Glu Thr Ser Asn Ala 325 330 335 Asn Asn Gly Gly Leu Leu Ala Pro Asp Gly Ser Pro Arg Ala Asp Lys 340 345 350 Leu Leu Ile Leu Arg His Ala Trp Gly Met Leu Pro Val Met Pro Ala 355 360 365 Ile Ala Thr Ala Thr Gly Asp Ser Thr Glu Pro Ala Ile Gly Lys Asn 370 375 380 Ala Trp Asn Ser Thr Phe Thr Gly Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Ser Gly Gly Ala Val Leu Leu Asp Pro Ile Pro Ser Asp Ala Phe 405 410 415 Ile Thr Ala Leu Asn Ser Thr Gln Met Asn Phe Gly Gly Ile Lys Ala 420 425 430 Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Leu Glu Val Thr Gly Pro Lys Gly Lys Thr 435 440 445 Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu Tyr Pro Asp Gly Ala Ser Gly Gly Leu 450 455 460 Asp Leu Ser Tyr Asn Ala Phe Ala Ala Ile Gly Asn Leu 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Ala Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Leu Asp Pro Ile Ala Lys Asp Ala Glu Ile Thr Ala Leu Asn Pro Val 85 90 95 Gln Ala Asn Leu Gly Gly Ile Arg Ala Ala Met Ala Gly Ala Tyr Leu 100 105 110 Arg Val Gln Gly Pro Lys Gly Cys Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu 115 120 125 Tyr Pro Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Ala Phe 130 135 140 Ser Lys Ile Gly Asp Leu Gln Gln Gly Arg Ile Pro Ile Arg Trp Lys 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Pro Val Thr Gly Asn Val Val Tyr Arg Ile Lys Glu 165 170 175 Gly Ser Thr Met Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn His Thr Tyr 180 185 190 Pro Val Val Lys Leu Glu Val Phe Gln Gly Lys Ala Trp Val Ser Leu 195 200 205 Pro Lys Ala Asp Tyr Asn His Phe Val Gly Thr Gln Leu Gly Asp Lys 210 215 220 Pro Leu Val Ile Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Arg Ile Leu Val Asp 225 230 235 240 Lys Leu Pro Pro Leu Leu Lys Asp Cys Thr Pro Lys Ser Ala Asn Gln 245 250 255 Pro Ser Pro Cys Ser Lys Pro Tyr Phe Val Gln Gly Asn Val Gln Phe 260 265 270 Pro Glu <210> 40 <211> 256 <212> PRT <213> Q8Y172:endoglucanase c-terminal domain harboring protein from Ralstonia solanacearum) <400> 40 Met Leu Leu Ser Leu Ser Val Trp Ser Leu His Ala Asn Gly Gln Val 1 5 10 15 Val Ala Ala Asp Asn Ala Thr Ala Ala Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr 20 25 30 Gly Thr Thr Ala Pro Ala Asn Thr Trp Gly Ser Thr Phe Thr Gly Ile 35 40 45 Ala Thr Ala Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Phe Leu Leu Asp 50 55 60 Pro Ile Thr Lys Asp Arg Glu Ile Thr Ala Leu Asn Pro Ala Gln Ala 65 70 75 80 Asn Leu Gly Gly Ile Pro Ala Ala Met Ala Gly Ala Tyr Leu Arg Val 85 90 95 Gln Gly Pro Lys Gly Cys Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu Tyr Pro 100 105 110 Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Ala Phe Ala Lys 115 120 125 Ile Gly Asp Leu Gln Gln Gly Arg Ile Pro Val Gln Trp Arg Leu Ile 130 135 140 Pro Gly Pro Val Thr Gly Asn Val Val Tyr Arg Ile Lys Glu Gly Ser 145 150 155 160 Thr Met Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn His Thr Phe Pro Val 165 170 175 Val Lys Leu Glu Val Phe Gln Gly Lys Ala Trp Val Ser Leu Pro Lys 180 185 190 Ala Asp Tyr Asn His Phe Val Gly Thr Gln Leu Gly Asp Lys Pro Leu 195 200 205 Val Ile Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Arg Ile Leu Val Asp Lys Leu 210 215 220 Pro Pro Leu Leu Lys Asp Cys Thr Pro Gln Lys Ala Gly Glu Ala Ser 225 230 235 240 Pro Cys Ser Lys Pro Tyr Phe Val Gln Gly Lys Val Gln Phe Ser Glu 245 250 255 <210> 41 <211> 584 <212> PRT <213> B0U4Y6: (Extracellular endoglucanase from Xylella fastidiosa) <400> 41 Met Arg Arg Leu Ala Ile Leu Phe Trp Leu Ala Thr Ser Gly Cys Val 1 5 10 15 Ala Ser Ala Met Tyr Gly Gly Thr Val Asp Ala Gln Asn Ala Val Ser 20 25 30 Asp Thr His Phe Val Glu Pro Leu Arg Gly Val Asn Trp Arg Gly Leu 35 40 45 Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gln Gly Leu Asp Gln Arg Pro Trp Arg 50 55 60 Glu Val Leu Asp Gln Met Gln Ser Leu Gly Ile Asn Ala Ile Arg Leu 65 70 75 80 Pro Leu Cys Ser Asp Thr Leu His Gly Ala Met Pro Thr Asn Leu Asp 85 90 95 Leu Val Arg Asn Pro Asp Leu Lys Gly Arg Thr Ala Leu Gln Ile Ala 100 105 110 Asp Ala Ile Met Asp Glu Ala Gly Lys Arg Gly Met Arg Val Leu Leu 115 120 125 Ala Tyr His Gly Val Glu Cys Pro Thr Asp Gly Asn Pro Leu Leu Arg 130 135 140 Ser Val Asp Glu Ser Glu His Gln Trp Ile Ser Asp Met Gln Phe Ile 145 150 155 160 Thr Ser His Tyr Arg Ala Gln Gln Lys Val Val Ile Gly Val Asp Leu 165 170 175 Ala Asp Met Ala Tyr His Arg Pro Phe Gln Ser Gly Gly Asp Ser Thr 180 185 190 Pro Asp Trp Asn Arg Val Val Glu Arg Ala Ala Ala Ala Ile Leu Ala 195 200 205 Met Asn Pro Asp Trp Leu Ile Gly Val Gln Pro Val Gly Leu Asn Pro 210 215 220 Pro Cys Leu Asp Ala Ser Ala Pro Ile Ser Asp Asp Asn Ile Lys Ser 225 230 235 240 Gln His Cys Val Gln Leu Arg Ile Pro Ala Arg Asn Leu Leu Leu Met 245 250 255 Pro Arg Phe Ala Gly Thr Asp Met Asp Thr Glu Ala Ala Leu Gly Ala 260 265 270 Phe Ser Gly Lys Gln Thr Val Leu Pro Asn Ser Leu Asp Ala Thr Asp 275 280 285 Ala Glu Gln Leu Ala His Arg Ile Asp Ala Leu Leu Ala Phe Gly Ile 290 295 300 Arg Gln Gly Phe Tyr Gly Ser Trp Met Thr Ser Ala Gln Met Pro Phe 305 310 315 320 Gly Leu Leu Asp Asn Asp Gly Arg Thr Pro Arg Thr Ala Leu Ile Ala 325 330 335 Gln Leu His Arg Trp Trp Gly Val Ser Arg Val Asp Val Ala Ser Glu 340 345 350 Asn Ala Ala Thr Lys Asn Gln Thr Thr Thr Asp Thr Asn Gly Cys Val 355 360 365 Thr Gly Asp Ser Ser Val Pro Leu Asn Gly Trp Asp Thr Ser Phe Ser 370 375 380 Gly Val Ala Thr Tyr Thr Tyr Thr Gly Tyr Lys Gly Gly Ala Leu Met 385 390 395 400 Leu Asp Pro Ile Gln Ser His Val Gln Ile Thr Ala Leu Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Leu Asn Leu Gly Gly Ile Pro Ala Ala Met Ala Gly Ala Tyr Leu 420 425 430 Arg Val Gln Gly Pro Lys Gly Ser Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu 435 440 445 Tyr Pro Thr Gly Ser Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser Pro Asn Ala Phe 450 455 460 Ala Ser Ile Gly Asn Met Ala Gln Gly Arg Ile Pro Val Gln Trp Lys 465 470 475 480 Val Val Ser Ala Pro Val Ser Gly Asn Leu Ile Tyr Arg Val Lys Lys 485 490 495 Gly Ser Ser Gly Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Glu His Arg Tyr 500 505 510 Pro Val Leu Lys Leu Glu Ile Cys Gln Asp Gly Thr Trp Leu Asn Leu 515 520 525 Pro Lys Arg Asn Tyr Asn Tyr Phe Val Gly Thr Arg Leu Gly Asn Gln 530 535 540 Pro Leu Ser Met Arg Met Thr Asp Ile Arg Gly Gln Thr Leu Ile Asp 545 550 555 560 Thr Leu Pro Ala Leu Pro Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ala Tyr Ser Val 565 570 575 Asn Gly Asn Val Gln Phe Ser Glu 580 <210> 42 <211> 229 <212> PRT <213> Pectobacterium atrosepticum <400> 42 Met Asn Lys Ile Thr Ser Leu Ala Leu Ser Ala Leu Cys Val Ile Pro 1 5 10 15 Leu Ile Asn Thr Ala His Ala Gln Trp Glu Leu Asp Asp Ile Cys Tyr 20 25 30 Gly Tyr Ala Thr Ala Thr Gly Ser Gly Tyr Gln Gly Gly Ala Leu Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Ile Pro Gln Asn Met Glu Ile Thr Ala Leu Asn Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Asp Tyr Arg Gly Val Lys Ala Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Lys Val Asn Gly Pro Lys Gly Ser Thr Val Val Tyr Val Thr Asp Leu 85 90 95 Tyr Pro Glu Gly Gly Asp Cys Ala Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala Phe 100 105 110 Glu Lys Ile Gly Asp Leu Arg Asp Gly Lys Ile Asn Ile Asp Trp Thr 115 120 125 Leu Ile Glu Ala Pro Val Asn Gly Asn Val Ile Tyr Arg Ile Lys Glu 130 135 140 Gly Ser Asn Pro Tyr Trp Ala Ala Val Gln Phe Arg Asn Val Lys Tyr 145 150 155 160 Pro Val Ile Glu Met Lys Tyr Met Arg Asp Asn Gln Trp Val Ala Ala 165 170 175 Gln Lys Thr Asp Tyr Asn His Phe Ile Val Glu His Val Gly Met Asn 180 185 190 Asp Ile Pro Ile Glu Phe Thr Asp Val Lys Gly Asn Val Leu Ser Asp 195 200 205 Thr Leu Pro Pro Met Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ala Tyr Leu Ile Thr 210 215 220 Gly Asn Val Gln Leu 225 <210> 43 <211> 232 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 43 Met Lys Lys Lys Ile Ser Ile Leu Ile Thr Ala Met Phe Leu Thr Ile 1 5 10 15 Leu Cys Phe Ser Pro Gln Ala Ser Ala Ala Tyr Asn Ser Leu His Thr 20 25 30 Gly Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Leu Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Ile Pro Ser Asn Met Lys Ile Thr Ala Leu Asn Pro Thr 50 55 60 Asp Met Asn Tyr Arg Gly Val Lys Ala Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Arg Val Glu Gly Pro Lys Gly Lys Thr Thr Val Tyr Val Thr Asp Leu 85 90 95 Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Asp Leu Ser Pro Asn Ala Phe 100 105 110 Arg Glu Ile Gly Asp Met Lys Asp Gly Lys Ile Asp Ile Lys Trp Arg 115 120 125 Ile Val Lys Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Thr Tyr Arg Ile Lys Glu 130 135 140 Gly Ser Ser Gln Trp Trp Ala Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr 145 150 155 160 Pro Val Met Lys Met Glu Tyr Tyr Lys Asp Gly Lys Trp Ile Asn Met 165 170 175 Glu Lys Thr Asp Tyr Asn His Phe Val Ser Thr Asn Leu Gly Thr Ser 180 185 190 Pro Leu Lys Val Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val Val Lys Asp 195 200 205 Thr Ile Lys Lys Leu Pro Glu Asn Gly Thr Ser Ser Ala Tyr Thr Val 210 215 220 Pro Gly Lys Val Gln Phe Pro Asp 225 230 <210> 44 <211> 251 <212> PRT <213> Nakamurella multipartita <400> 44 Met Ala Thr Gly Val Glu Pro Ile Asn Pro Glu Phe Ser Leu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Ser Thr Thr Pro Leu Ala Gly Ala Arg Arg Pro Arg Arg Arg Thr 20 25 30 Ala Val Ala Leu Leu Ile Gly Ala Val Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala 35 40 45 Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ser Gly Lys Ala Thr His Tyr Glu 50 55 60 Ala Thr Gly Gly Ser Thr Thr Asn Gly Asn Cys Ser Phe Pro Ala Leu 65 70 75 80 Pro Ala Asp Lys Leu Tyr Val Ala Val Ser Pro Thr Glu Tyr Ala Lys 85 90 95 Gly Ala Ala Cys Gly Thr Tyr Leu Asp Val Thr Gly Pro Arg Gly Thr 100 105 110 Val Arg Val Val Val Met Asp Lys Cys Pro Glu Cys Ala Thr Gly His 115 120 125 Ile Asp Leu Ser Lys Thr Ala Phe Ala Lys Ile Gly Ala Leu Ser Asp 130 135 140 Gly Ile Ile Pro Val Thr Tyr Ser Thr Val Lys Asn Pro Thr Val Pro 145 150 155 160 Ala Leu Asn Phe Arg Phe Lys Asn Gly Ser Ser Arg Trp Trp Phe Ala 165 170 175 Leu Gln Val Leu Asn His Gly Asn Arg Leu Gln Ser Val Ser Val Gln 180 185 190 Val Asn Gly Lys Trp Val Ala Ala Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Tyr Trp 195 200 205 Ile Tyr Gln Pro Gly Ala Gly Pro Gly Pro Tyr Thr Leu Leu Val Lys 210 215 220 Asp Ile Tyr Gly Gln Gln Ala Ile Val Ser Gly Val Thr Met Ser Pro 225 230 235 240 Thr Leu Val Gln Thr Thr Thr Ala Arg Leu Lys 245 250 <210> 45 <211> 303 <212> PRT <213> Micromonospora sp. <400> 45 Met Lys Glu Asn Ala Asp Met Pro Pro Leu His Pro Arg Arg Pro Trp 1 5 10 15 Arg Ile Ala Phe Ala Ser Ala Val Ser Ala Val Val Leu Ala Ser Val 20 25 30 Ala Gly Cys Gly Gly Pro Ser Pro Ala Trp His Ala Ala Pro Thr Pro 35 40 45 Ala Ala Gly Thr Ser Thr Pro Ala Val Gly Lys Ser Gly Pro Gly Phe 50 55 60 Pro Thr Ala Ala Ala Asp Ala Thr Thr Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ser Ala Thr Gly Ser Pro Ser Pro Lys Ser Ser Gly Val 85 90 95 Ala Pro Leu Ala Gly Arg Ile Arg Pro Asn Val Thr Tyr Arg Gly Lys 100 105 110 Ala Thr Phe Tyr Asp Ala Gly Asp Gly Gly Gly Ala Cys Leu Phe Gly 115 120 125 Pro Ala Ser Asp Leu Met Ile Gly Ala Met Asn Gln Thr Asp Tyr Glu 130 135 140 Ser Ala Lys Ala Cys Gly Ala Tyr Val Leu Val Lys Ala Ala Asn Gly 145 150 155 160 Asn Ser Val Thr Val Arg Ile Thr Asn Leu Cys Pro Leu Pro Cys Ala 165 170 175 Pro Gly Gln Ile Asp Leu Ser Pro Gln Ala Phe Ala Lys Leu Ala Asn 180 185 190 Arg Ser Leu Gly Glu Val Pro Ile Thr Trp Lys Leu Leu Ser Pro Ser 195 200 205 Met Ser Asp Thr Ile Ser Ile Arg Tyr Lys Val Gly Ser Ser Gln Trp 210 215 220 Trp Cys Gly Ile Gln Ala Ile Gly His Arg Asn Pro Val Ala Leu Leu 225 230 235 240 Glu Val Arg Thr Ser Ser Gly Trp Arg Gln Leu Pro Arg Pro Glu Tyr 245 250 255 Asn Tyr Phe Ile Ser Ala Asn Gly Ser Gly Cys Gly Gly Pro Ile Arg 260 265 270 Ile Thr Asp Ile Tyr Gly Glu Lys Leu Thr Ile Ser Gly Ile Lys Leu 275 280 285 Lys Pro Asp Val Val Gln Pro Thr Arg Val Gln Phe Ala Arg His 290 295 300 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Catenulispora acidiphila <400> 46 Met Lys Ala Thr His Pro Thr Thr His Arg Ser Arg Trp Leu Pro Ile 1 5 10 15 Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu Val Val Ala Gly Leu Ile Ala Gly Leu 20 25 30 Ala Met Gly Ser Ser Ser Arg His Thr Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ala 35 40 45 Thr Gly Phe Ala Thr Thr Gly Ser Gly Met Thr Ala Thr Pro Asn Ser 50 55 60 Ala Pro Thr Ser Ala Glu Pro Ser Ala Pro Ala Val Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Val Ala Ala Ala His Lys Thr Pro 85 90 95 Gly Lys Thr Ser Thr Thr Ser Gln Thr Ser Ala Thr Pro Thr His Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Ser Pro Thr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Arg Val Gln Pro 115 120 125 Gly Val Thr Tyr Gln Gly Val Ala Thr Glu Tyr Ser Ala Ala Asp Gly 130 135 140 Asp Gly Ala Cys Leu Phe Gly Pro Ala Ala Asp Met Met Ile Ala Ala 145 150 155 160 Met Asn Glu Leu Asp Tyr Gln Asn Ser Glu Ala Cys Gly Ala His Val 165 170 175 Leu Val Arg Ala Ala Asn Gly Ala Thr Ile Thr Val Leu Ile Thr Asn 180 185 190 Glu Cys Pro Tyr Pro Cys Ala Pro Gly Gln Leu Asp Leu Ser Gln Gln 195 200 205 Ala Phe Ala Lys Leu Ala Asp Pro Lys Ala Gly Arg Ile Ser Val Thr 210 215 220 Trp Gln Leu Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Asn Val Ser Ile Arg Tyr 225 230 235 240 Lys Val Gly Ser Ser Gln Tyr Trp Cys Gly Ile Gln Val Ile Gly Glu 245 250 255 Arg Asn Pro Val Ala Arg Leu Glu Val Ala Ala Gly Ser Gly Trp Gln 260 265 270 Gln Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Asn Tyr Phe Leu Ser Ala Asn Gly Ala 275 280 285 Gly Cys Gly Lys Ala Val Arg Ile Thr Asp Ile Phe Gly Gln Gln Val 290 295 300 Thr Thr Ala Ala Leu Pro Val Glu Pro Asp Val Ile Gln Pro Ala Gly 305 310 315 320 Val Gln Phe Ser Arg His 325 <210> 47 <211> 230 <212> PRT <213> Dickeya zeae <400> 47 Met Met Lys Leu Lys Ser Val Leu Leu Ala Ser Ser Val Leu Phe Leu 1 5 10 15 Pro Leu Thr Gln Gln Ala Gln Ala Ala Trp Glu Leu Gly Asp Ile Cys 20 25 30 Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Thr Gly Ser Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Leu 35 40 45 Leu Leu Asp Pro Ile Pro Ser Asn Met Glu Ile Thr Ala Leu Asn Arg 50 55 60 Ala Gln Leu Asp Tyr Lys Gly Val Lys Ala Ala Leu Ala Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Lys Val Thr Gly Pro Lys Gly Ser Thr Ile Val Tyr Val Thr Asp 85 90 95 Leu Tyr Pro Glu Gly Gly Asp Cys Ala Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala 100 105 110 Phe Glu Lys Ile Gly Asn Leu Gln Asp Gly Lys Ile Asn Ile Gln Trp 115 120 125 Glu Leu Val Lys Ala Pro Val Ser Gly Asn Val Val Tyr Arg Val Lys 130 135 140 Glu Gly Ser Asn Pro Tyr Trp Ala Ala Val Gln Phe Arg Asn Val Lys 145 150 155 160 Tyr Pro Ile Ile Glu Met Lys Tyr Leu Arg Gly Thr Gln Trp Val Ser 165 170 175 Ala Pro Lys Thr Asp Tyr Asn His Phe Ile Leu Glu Phe Val Gly Lys 180 185 190 Asn Asp Ile Pro Ile Glu Phe Thr Asp Ile Lys Gly Asn Ile Leu Ser 195 200 205 Asp Thr Leu Pro Pro Met Ser Asp Ser Thr Ser Ser Ala Tyr Leu Ile 210 215 220 Thr Gly Lys Val Gln Leu 225 230 <210> 48 <211> 267 <212> PRT <213> ExpB1, Q40638 from Oryza sativa subsp. japonica (Rice) <400> 48 Met Ala Ser Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Val Val Val Ala Ala Met 1 5 10 15 Val Ser Ala Val Ser Cys Gly Pro Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn 20 25 30 Ile Thr Thr Ser Tyr Gly Asp Lys Trp Leu Glu Ala Lys Ala Thr Trp 35 40 45 Tyr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys 50 55 60 Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys Ala Pro Phe Leu Gly Met Asn Ser Cys 65 70 75 80 Gly Asn Asp Pro Ile Phe Lys Asp Gly Lys Gly Cys Gly Ser Cys Phe 85 90 95 Glu Ile Lys Cys Ser Lys Pro Glu Ala Cys Ser Asp Lys Pro Ala Leu 100 105 110 Ile His Val Thr Asp Met Asn Asp Glu Pro Ile Ala Ala Tyr His Phe 115 120 125 Asp Leu Ser Gly Leu Ala Phe Gly Ala Met Ala Lys Asp Gly Lys Asp 130 135 140 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Gly Ile Ile Asp Thr Gln Phe Arg Arg Val 145 150 155 160 Lys Cys Lys Tyr Pro Ala Asp Thr Lys Ile Thr Phe His Ile Glu Lys 165 170 175 Ala Ser Asn Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Leu Val Lys Tyr Val Ala Gly 180 185 190 Asp Gly Asp Val Val Glu Val Glu Ile Lys Glu Lys Gly Ser Glu Glu 195 200 205 Trp Lys Ala Leu Lys Glu Ser Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr 210 215 220 Pro Lys Pro Leu Lys Gly Pro Phe Ser Val Arg Val Thr Thr Glu Gly 225 230 235 240 Gly Glu Lys Ile Ile Ala Glu Asp Ala Ile Pro Asp Gly Trp Lys Ala 245 250 255 Asp Ser Val Tyr Lys Ser Asn Val Gln Ala Lys 260 265 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gaaggagata taaggatggc atatgacgac ctgcatgaa 39 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 atgatggtaa tggtgttcag gaaactgaac atggcc 36 <210> 51 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Ala Ala Cys 1 5 10 15 Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly 20 25 30 <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 atgtctgaac ctgacgactc cggctttact aacgatcctg aaggcgaggt tcgtgctctg 60 ggtgaatttc 70 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 atgcaggtca gtacgcaagc 20 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gggaaactgt acgtggccg 19 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gaaaatcgag tttctgcgac tc 22 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tttgtctgcc tgattaataa cgcc 24 <210> 57 <211> 242 <212> PRT <213> zea m1 from Zea mays(Zea mays EXP B4, PBD code:2hcz) <400> 57 Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Leu Thr Ala Arg Ala Thr Trp Tyr Gly Gln Pro Asn Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Pro Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Ile Lys Asn Val Asn Leu Pro Pro 35 40 45 Tyr Ser Gly Met Thr Ala Cys Gly Asn Val Pro Ile Phe Lys Asp Gly 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Ser Cys Tyr Glu Val Arg Cys Lys Glu Lys Pro Glu 65 70 75 80 Cys Ser Gly Asn Pro Val Thr Val Tyr Ile Thr Asp Met Asn Tyr Glu 85 90 95 Pro Ile Ala Pro Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly Lys Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Leu Ala Lys Pro Gly Leu Asn Asp Lys Ile Arg His Cys Gly Ile Met 115 120 125 Asp Val Glu Phe Arg Arg Val Arg Cys Lys Tyr Pro Ala Gly Gln Lys 130 135 140 Ile Val Phe His Ile Glu Lys Gly Cys Asn Pro Asn Tyr Leu Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Lys Tyr Val Ala Asp Asp Gly Asp Ile Val Leu Met Glu Ile 165 170 175 Gln Asp Lys Leu Ser Ala Glu Trp Lys Pro Met Lys Leu Ser Trp Gly 180 185 190 Ala Ile Trp Arg Met Asp Thr Ala Lys Ala Leu Lys Gly Pro Phe Ser 195 200 205 Ile Arg Leu Thr Ser Glu Ser Gly Lys Lys Val Ile Ala Lys Asp Val 210 215 220 Ile Pro Ala Asn Trp Arg Pro Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asn Val Gln 225 230 235 240 Phe Tyr

Claims (17)

1. 셀룰로스 확장활성을 가지는, 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물은 바실러스 서브틸리스, 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis, KCTC 2396), 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum), 네오사르토리야 피쉐리(Neosartorya fischeri), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 에케리첼라 니둘란스(Emericella nidulans, 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea), 피레노포라 트리티시-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 패오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 프란키아(Frankia sp.), 스트렙토마이시스 스비세우스(Streptomyces sviceus), 소란지움 셀룰로줌(Sorangium cellulosum), 스티그마텔라 아우렌티아카(Stigmatella aurantiaca), 플레시오시스티스 나시피카(Plesiocystis pacifica), 믹소코쿠스 잔터스(Myxococcus xanthus), 렙토쓰릭스 콜로드니(Leptothrix cholodnii), 로제이플렉서스(Roseiflexus sp.), 로제이플렉서스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 헤르페토시폰 아우란티아쿠스(Herpetosiphon aurantiacus), 에시도보락스 아베네(Acidovorax avenae subsp.), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 잔토모나스 캠페스트리스(Xanthomonas campestris pv. campestris), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 잔토모나스 오라이제(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum), 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis), 잘렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 나카무렐라 멀티파리타(Nakamurella multipartite), 마이크로모노스포라 (Micromonospora sp.), 카테눌리스포라 애시디필라(Catenulispora acidiphila) 및 디키야 지(Dickeya zeae)로 구성된 군으로부터 선택된 원핵생물인 것을 특징으로 하는, 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 원핵생물은 바실러스 서브틸리스, 스티그마텔라 아우렌티아카, 잔토모나스 오라이제 또는 하헬라 제주엔시스인 것을 특징으로 하는, 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 익스팬신 단백질은 서열번호 1 내지 47에 기재된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 익스팬신 단백질은 서열번호 20, 22, 30 또는 35에 기재된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 셀룰로스 확장활성용 원핵생물 유래 익스팬신 단백질을 포함하는 셀룰로스 분해조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 셀룰로스 분해조성물은 셀룰로스 분해효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스 분해조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 셀룰로스 분해효소는 셀룰라제, 셀로비오하이드로라제, 엔도글루카나제 및 셀로비아제 으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 셀룰로스 분해조성물.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 셀룰로스 분해조성물은 1 g의 셀룰로스에 대하여 셀룰로스 분해효소 0.01~0.05 FPU 및 원핵생물 유래 익스팬신 200~400 ㎍을 포함하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스 분해조성물.
   
10. 셀룰로스에 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 셀룰로스 분해조성물을 첨가한 후 40~60 ℃에서 반응시키는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해방법.
    
11. 셀룰로스에 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 셀룰로스 분해조성물을 첨가한 후 pH 7 이하에서 반응시키는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해방법.
    
12. 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) 유래의 익스팬신(EXLX1) 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 가지며 셀룰로스 확장활성을 가지는, 원핵생물 유래 익스팬신 단백질.
    
13. 목질계 바이오매스를 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 목질계 바이오매스에 포함된 셀룰로스를 분해하여 환원당을 생산하는 단계를 포함하는 바이오에너지 생산방법.
    
14. 종이 또는 펄프를 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 종이 또는 펄프를 연화시키는 단계를 포함하는 종이 또는 펄프의 생산방법.
    
15. 섬유 또는 직물을 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 셀룰로스 분해조성물로 처리하여 상기 섬유 또는 직물을 연화시키는 단계를 포함하는 섬유 또는 직물의 처리방법.
    
16. a) 식물 유래 익스팬신과 구조적 유사성을 가지는 원핵생물 유래 단백질을 찾는 단계;
    b) 상기 원핵생물 유래 단백질을 클로닝하는 단계; 및
    c) 상기 클로닝된 원핵생물 유래 단백질을 균주에서 발현하는 단계를 포함하는, 원핵생물 유래 익스팬신 단백질의 대량생산방법.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 식물 유래 익스팬신은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 원핵생물 유래 익스팬신 단백질의 대량생산방법.
    
    

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