CN101348796A - 角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物 - Google Patents
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Abstract
角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物，它涉及一种几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物。本发明解决了chi58在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达的问题。本发明密码子偏爱性突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示。本发明引物Pn1～Pn6的基因序列分别如SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10所示。本发明通过融合PCR法获得密码子偏爱性突变体基因。本发明基因与真核表达载体pPIC9K连接构建重组表达载体，再经甲醇诱导后表达的蛋白质分子量为58kD，等电点pI为4.47，经测序检测氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，证实为角毛壳菌几丁质酶，且几丁质酶的酶活性提高了约3倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物。
背景技术
角毛壳菌几丁质酶基因(命名为chi58)的基因序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列(角毛壳菌几丁质酶)如SEQ ID NO：3所示。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是20世纪90年代发展起来的优秀的真核表达系统，但是在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因；所以角毛壳菌几丁质酶基因(chi58)在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达。
发明内容
本发明的目的是为了解决角毛壳菌几丁质酶基因(chi58)在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达的问题，而提供的一种chi58密码子偏爱性突变体基因及其编码的氨基酸和基因的制备方法及所用引物。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因序列如SEQID NO：2所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn1、1μL浓度为20μmol/L引物Pn2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、56.8℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn2的基因序列为5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn3、1μL浓度为20μmol/L引物Pn4、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.2℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn3的基因序列为5’-GCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATC-3’；下游引物Pn4的基因序列为5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’；
七、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段C：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn5、1μL浓度为20μmol/L引物Pn6、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn5的基因序列为5’-GGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACC-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
八、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、B和C，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段C和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、60℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L引物Pn1和1μL浓度为20μmol/L引物Pn6，再进行94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
本发明用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn1的基因序列如SEQ ID NO：5所示，引物Pn2的基因序列如SEQ ID NO：6所示，引物Pn3的基因序列如SEQ ID NO：7所示，引物Pn4的基因序列如SEQ ID NO：8所示，引物Pn5的基因序列如SEQ ID NO：9所示，引物Pn6的基因序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因与真核表达载体pPIC9K连接构建重组表达载体，再经甲醇诱导后表达的蛋白质分子量为58kD，等电点pI为4.47，经测序检测氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，证实为角毛壳菌几丁质酶，说明本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因是一个具有表达功能的基因。
其它条件均相同的情况下，与原角毛壳菌几丁质酶基因转化巴斯德毕赤酵母相比本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因转化巴斯德毕赤酵母获得的几丁质酶的酶活性提高了约3倍；说明本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因可以在巴斯德毕赤酵母中高效表达。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的拼接，能够高效、快速地实现基因的定点突变，且不引入其它突变，保障了非突变区序列的正确性，所获得的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因片段可用于后续的分子克隆。
角毛壳菌几丁质酶完整的开放读码框基因序列如SEQ ID NO：4所示。本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法对角毛壳菌几丁质酶基因5个位点进行突变，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第868bp～870bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第874bp～876bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第880bp～882bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1108bp～1110bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1168bp～1170bp处序列CGC换成序列AGA；角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体氨基酸序列与角毛壳菌几丁质酶氨基酸序列相同、没有改变。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法步骤八中引物之间都通过重叠搭桥进行扩增反应，因此在最初的8个循环反应中不加引物，模板间自动退火搭桥形成长链，同时适当的延长了退火时间，提高了反应的成功率。
本发明中突变引物的重叠区长，重叠区碱基均在27bp左右，提高了引物与模板结合的特异性。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示。
具体实施方式二：本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn1、1μL浓度为20μmol/L引物Pn2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、56.8℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn2的基因序列为5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn3、1μL浓度为20μmol/L引物Pn4、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.2℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn3的基因序列为5’-GCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATC-3’；下游引物Pn4的基因序列为5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’；
七、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段C：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn5、1μL浓度为20μmol/L引物Pn6、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn5的基因序列为5’-GGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACC-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
八、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、B和C，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段C和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、60℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L引物Pn1和1μL浓度为20μmol/L引物Pn6，再进行94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示，本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法对角毛壳菌几丁质酶基因5个位点进行突变，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第868bp～870bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第874bp～876bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第880bp～882bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1108bp～1110bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1168bp～1170bp处序列CGC换成序列AGA；角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体氨基酸序列与角毛壳菌几丁质酶氨基酸序列相同、没有改变。
将本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因与真核表达载体pPIC9K重组构建重组表达质粒pPIC9K-chi58A，然后采用电转化方法转化到真核表达宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板培养基在30℃条件下培养2～3天，之后将MD平板培养基上生长的转化菌落分别点种到MM和MD平板培养基的相应位置上在30℃条件下培养2～3天，并根据菌落在MM平板上的生长情况鉴定转化子的表型(在MM平板培养基上生长正常的转化子是Mut+型转化子；而在MM平板培养基上生长迟缓的转化子是Muts型转化子)；再选择Mut+型转化子进行诱导表达：挑选Mut+型转化子单菌落置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中在28～30℃、250～300r/min的条件下培养至OD600＝2～6(培养时间为16～18h)，然后在室温、1500～3000g的条件下离心5min，收集菌体用BMMY重悬菌体使OD600＝1.0；将BMMY重悬菌液用双层纱布或粗棉布封口放置于28～30℃、250～300r/min的环境中继续生长，每隔24h向培养基中添加浓度为100％的甲醇至菌液中甲醇的终浓度为0.5～1.0％；连续诱导培养120h(几丁质酶活性最高)、并在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到的上清液为含有角毛壳菌几丁质酶的粗酶液。
采用改良的Schales法测定角毛壳菌几丁质酶粗酶液的酶活性(将OD值换算成氨基葡萄糖产量，以每小时分解胶体几丁质产生1μg氨基葡萄糖为一个酶活力单位，标准曲线方程为：Y＝158.21X+1.5629，其中X为OD值，Y为氨基葡萄糖量μg，直线相关系数R2＝0.9943)，本实施方式角毛壳菌几丁质酶粗酶液的酶活为118U/mL。经测定本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶分子量为58kD，等电点pI为4.47；证明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因片段可用于后续的分子克隆，并在巴斯德毕赤酵母中高效表达。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤二按以下步骤实施：
a、将5μL角毛壳菌总RNA、8μL RNase-free H2O和2μL引物Oligod18T混匀后置于70℃的环境中5min，然后放于冰上；
b、将5μL 5×MLV Buffer、1.25μL dNTPmix、0.6μL铁调节蛋白(IRP)、1μLM-MLV反转录酶和2.5μL ddH2O混合；
c、将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42℃环境中反转录1h；
d、反转录产物cDNA PCR扩增：PCR反应体系为25μL，由2μL 10mMdNTP、2μL 25mM MgCl2、5U E×Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pn1、10pM下游引物Pn6、2μL步骤c反转录产物和余量的ddH2O组成，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，72℃延伸10min；
其中步骤d中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。其它步骤及参数与实施方式二相同。
本实施方式引物Pn1和Pn6中分别引入EcoR I和Not I酶切位点(加下划线处为酶切位点)，两引物之间相距1506bp，扩增产物去除了几丁质酶信号肽序列。
具体实施方式四：本实施方式用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物基因序列为：
Pn1：5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’，
Pn2：5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’，
Pn3：5’-GCTCAAG
CTA
GCG
CTCAACAGCATC-3’，
Pn4：5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’，
Pn5：5’-GG
AACAACATCAACCCCGAG
GTCAACC-3’，
Pn6：5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。
本实施方式引物Pn1和Pn6中分别加入了EcoR I和Not I酶切位点(加下划线部分)，引物Pn3和Pn5中斜体加粗部分为突变位点。
序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120>角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物
<160>10
<210>1
<211>2065
<212>DNA
<213>毛壳菌属(Chaetomium)
<400>1
ctgttttgtg tgccaccgtt ctgctctctg tgccagtctc caaccggcct gtccatcaag 60
attcgacctt ggtcgttgtg actgcctatc atgaagacgt ctctgagctg cgtcttgctc 120
tgggctgggc tggccgtggc cgcgtccagc tatgagtcta gtttcctcgt ccaagcccgc 180
cagagcacga ggcaaaagct ctggacgcga gacgactcag acccgaagtg caccaaggat 240
attccgtgca agatcgggtg ctgtgggcca ttgtaggtct atcgctctca gataaacatc 300
gcgcaatgct gacggccacg acagagacaa agacactggt gtcggcatct gcggcttggg 360
accaaccttc tgcggcgacg ggtgcacctc gtcgtgcgac tacaagagcg agtgcgaccc 420
gggctggggc atgcagtggt ccaacgcatc gacgtgcccc ctcaacgtgt gctgcagtga 480
ctttggtttc tgcggcacga ccgatgagtt ctgcaagggc aaggaggtgt cggtcccgca 540
gtgcgacccg gccgccaaca gctcgcacgc gcgcaccgtc ggctactatg agggctggaa 600
ctggcagcgc ccctgcggca ccatgaagcc gtcgcagatc ccgctcggtt attacagtca 660
cattttcttc gccttctcgt tgctcgaccc caccaccttc cggctgtcgc ccatggatac 720
cgagacaggt accctgtacg gtgacgtctc ggctatcaag aaccgccagc cgggcgtgca 780
agtctggatc gccatcggcg gctgggcgat gaatgacccc ggtccgactc ggccgacgtt 840
ttcaaacctg gccaaggacg aggcggcgca ggacgagttc ttcgaggccc tggtcacttt 900
catgatggcc aacgactacg acggtgtcga tatcgactgg gaatatcccg tcgccgacga 960
tagaggtggc agcgtcgagg actttgataa ctacgtcaac ctgctcaagc gcctacgcgc 1020
gcgcctcaac agcatcggcg tgccgaaggg cctgtctatc acgctgcccg cgtcgtactg 1080
gtatctgaaa gggtttgaca ttgtcaacct cgagccatat gtggactttt tcaatgtcat 1140
gacgtatgat attcgtgagt aacgttagcc catttgctgt tcctcttgct tttaatccct 1200
ctcactgctc atcctctcca tcctttattc cttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
ttttgaaaag aatgtctttc ctcttttctt gactttctgt ttactcatct cattgttctg 1320
tccttgttga gacctggact aactccgtaa aacagacggt gtctgggatt cgacggtcca 1380
aagcctgggg ccctatgccc acgcccacac caacctcacc gagatcgagg aggcactgaa 1440
gctgctttgg cgcaacaaca tcaaccccga gcgcgtcaac ctgggcctgg gtttctacgg 1500
tcgtagcttc accatgaaag acccctcttg catggccgcc ggctgtgagt tcagctctgg 1560
cggtaacggt ggcagctgca cgggtacccc gggagtcctc tcagcccacg agatcgtcca 1620
aatcatcaat aacggcgcga cggtgaccac ggacgaagtg gccgccgtgg agattgtcac 1680
ctgggacacc aaccagtggg tctcatggga cagcaccaag acgctggcca tgaaggtcaa 1740
ctacgccaac gagcgctgcc tgggcggtgt catggtctgg gccatcgacc tcgacgacgg 1800
caccctaatc aagtcacttg ccgacacggg acggcccacc tacaattact tgacggacct 1860
cccctggatg acgggttgtt tcggatccgc gtttgacgac tggtcgagac tgaatgactc 1920
cgacatcgat tcaggaagca gttaatgctt tagtcgtctt gtaatatgtc atattggaat 1980
ggatactcta gggtgaggaa aatatgtcac tttaaacaca tgctacccga atattgcctg 2040
cgataattag gttgtccgtg gccag 2065
<210>2
<211>1602
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1602)
<220>
<223>角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
<400>2
atg aag acg tct ctg agc tgc gtc ttg ctc tgg gct ggg ctg gcc gtg 48
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
gcc gcg tcc agc tat gag tct agt ttc ctc gtc caa gcc cgc cag agc 96
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
acg agg caa aag ctc tgg acg cga gac gac tca gac ccg aag tgc acc 144
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
aag gat att ccg tgc aag atc ggg tgc tgt ggg cca tta gac aaa gac 192
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
act ggt gtc ggc atc tgc ggc ttg gga cca acc ttc tgc ggc gac ggg 240
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
tgc acc tcg tcg tgc gac tac aag agc gag tgc gac ccg ggc tgg ggc 288
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
atg cag tgg tcc aac gca tcg acg tgc ccc ctc aac gtg tgc tgc agt 336
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
100 105 110
gac ttt ggt ttc tgc ggc acg acc gat gag ttc tgc aag ggc aag gag 384
Asp Phe Gly Phe Cys Gly Thr Thr Asp Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu
115 120 125
gtg tcg gtc ccg cag tgc gac ccg gcc gcc aac agc tcg cac gcg cgc 432
Val Ser Val Pro Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg
130 135 140
acc gtc ggc tac tat gag ggc tgg aac tgg cag cgc ccc tgc ggc acc 480
Thr Val Gly Tyr Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr
145 150 155 160
atg aag ccg tcg cag atc ccg ctc ggt tat tac agt cac att ttc ttc 528
Met Lys Pro Ser Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe
165 170 175
gcc ttc tcg ttg ctc gac ccc acc acc ttc cgg ctg tcg ccc atg gat 576
Ala Phe Ser Leu Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp
180 185 190
acc gag aca ggt acc ctg tac ggt gac gtc tcg gct atc aag aac cgc 624
Thr Glu Thr Gly Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg
195 200 205
cag ccg ggc gtg caa gtc tgg atc gcc atc ggc ggc tgg gcg atg aat 672
Gln Pro Gly Val Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn
210 215 220
gac ccc ggt ccg act cgg ccg acg ttt tca aac ctg gcc aag gac gag 720
Asp Pro Gly Pro Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu
225 230 235 240
gcg gcg cag gac gag ttc ttc gag gcc ctg gtc act ttc atg atg gcc 768
Ala Ala Gln Asp Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala
245 250 255
aac gac tac gac ggt gtc gat atc gac tgg gaa tat ccc gtc gcc gac 816
Asn Asp Tyr Asp Gly Val AspIle Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp
260 265 270
gat aga ggt ggc agc gtc gag gac ttt gat aac tac gtc aac ctg ctc 864
Asp Arg Gly Gly Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu
275 280 285
aag aga cta aga gcg aga ctc aac agc atc ggc gtg ccg aag ggc ctg 912
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu
290 295 300
tct atc acg ctg ccc gcg tcg tac tgg tat ctg aaa ggg ttt gac att 960
Ser Ile Thr Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile
305 310 315 320
gtc aac ctc gag cca tat gtg gac ttt ttc aat gtc atg acg tat gat 1008
Val Asn Leu Glu Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp
325 330 335
att cac ggt gtc tgg gat tcg acg gtc caa agc ctg ggg ccc tat gcc 1056
Ile His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
CAC GCC CAC ACC AAC CTC ACC GAG ATC GAG GAG GCA CTG AAG CTG CTT 1104
his ala his thr asn leu thr glu ile glu glu ala leu lys leu leu
355 360 365
tgg aga aac aac atc aac ccc gag aga gtc aac ctg ggc ctg ggt ttc 1152
Trp Arg Asn Asn Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
tac ggt cgt agc ttc acc atg aaa gac ccc tct tgc atg gcc gcc ggc 1200
Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly
385 390 395 400
tgt gag ttc agc tct ggc ggt aac ggt ggc agc tgc acg ggt acc ccg 1248
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
gga gtc ctc tca gcc cac gag atc gtc caa atc atc aat aac ggc gcg 1296
Gly Val Leu Ser Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala
420 425 430
acg gtg acc acg gac gaa gtg gcc gcc gtg gag att gtc acc tgg gac 1344
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp
435 440 445
acc aac cag tgg gtc tca tgg gac agc acc aag acg ctg gcc atg aag 1392
Thr Asn Gln Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
gtc aac tac gcc aac gag cgc tgc ctg ggc ggt gtc atg gtc tgg gcc 1440
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala
465 470 475 480
atc gac ctc gac gac ggc acc cta atc aag tca ctt gcc gac acg gga 1488
Ile Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
cgg ccc acc tac aat tac ttg acg gac ctc ccc tgg atg acg ggt tgt 1536
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
ttc gga tcc gcg ttt gac gac tgg tcg aga ctg aat gac tcc gac atc 1584
Phe Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile
515 520 525
gat tca gga agc agt taa 1602
Asp Ser Gly Ser Ser
530
<210>3
<211>533
<212>PRT
<213>毛壳菌属(Chaetomium)
<400>3
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
100 105 110
Asp Phe Gly Phe Cys Gly Thr Thr Asp Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu
115 120 125
Val Ser Val Pro Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg
130 135 140
Thr Val Gly Tyr Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr
145 150 155 160
Met Lys Pro Ser Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe
165 170 175
Ala Phe Ser Leu Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp
180 185 190
Thr Glu Thr Gly Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg
195 200 205
Gln Pro Gly Val Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn
210 215 220
Asp Pro Gly Pro Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gln Asp Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala
245 250 255
Asn Asp Tyr Asp Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp
260 265 270
Asp Arg Gly Gly Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu
275 280 285
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu
290 295 300
Ser Ile Thr Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile
305 310 315 320
Val Asn Leu Glu Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp
325 330 335
Ile His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
His Ala His Thr Asn Leu Thr Glu Ile Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu
355 360 365
Trp Arg Asn Asn Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly
385 390 395 400
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
Gly Val Leu Ser Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala
420 425 430
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp
435 440 445
Thr Asn Gln Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala
465 470 475 480
Ile Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser
530
<210>4
<211>1602
<212>DNA
<213>毛壳菌属(Chaetomium)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1602)
<400>4
atg aag acg tct ctg agc tgc gtc ttg ctc tgg gct ggg ctg gcc gtg 48
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
gcc gcg tcc agc tat gag tct agt ttc ctc gtc caa gcc cgc cag agc 96
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
acg agg caa aag ctc tgg acg cga gac gac tca gac ccg aag tgc acc 144
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
aag gat att ccg tgc aag atc ggg tgc tgt ggg cca tta gac aaa gac 192
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
act ggt gtc ggc atc tgc ggc ttg gga cca acc ttc tgc ggc gac ggg 240
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
tgc acc tcg tcg tgc gac tac aag agc gag tgc gac ccg ggc tgg ggc 288
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
atg cag tgg tcc aac gca tcg acg tgc ccc ctc aac gtg tgc tgc agt 336
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
100 105 110
gac ttt ggt ttc tgc ggc acg acc gat gag ttc tgc aag ggc aag gag 384
Asp Phe Gly Phe Cys Gly Thr Thr Asp Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu
115 120 125
gtg tcg gtc ccg cag tgc gac ccg gcc gcc aac agc tcg cac gcg cgc 432
Val Ser Val Pro Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg
130 135 140
acc gtc ggc tac tat gag ggc tgg aac tgg cag cgc ccc tgc ggc acc 480
Thr Val Gly Tyr Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr
145 150 155 160
atg aag ccg tcg cag atc ccg ctc ggt tat tac agt cac att ttc ttc 528
Met Lys Pro Ser Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe
165 170 175
gcc ttc tcg ttg ctc gac ccc acc acc ttc cgg ctg tcg ccc atg gat 576
Ala Phe Ser Leu Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp
180 185 190
acc gag aca ggt acc ctg tac ggt gac gtc tcg gct atc aag aac cgc 624
Thr Glu Thr Gly Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg
195 200 205
cag ccg ggc gtg caa gtc tgg atc gcc atc ggc ggc tgg gcg atg aat 672
Gln Pro Gly Val Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn
210 215 220
gac ccc ggt ccg act cgg ccg acg ttt tca aac ctg gcc aag gac gag 720
Asp Pro Gly Pro Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu
225 230 235 240
gcg gcg cag gac gag ttc ttc gag gcc ctg gtc act ttc atg atg gcc 768
Ala Ala Gln Asp Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala
245 250 255
aac gac tac gac ggt gtc gat atc gac tgg gaa tat ccc gtc gcc gac 816
Asn Asp Tyr Asp Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp
260 265 270
gat aga ggt ggc agc gtc gag gac ttt gat aac tac gtc aac ctg ctc 864
Asp Arg Gly Gly Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu
275 280 285
aag cgc cta cgc gcg cgc ctc aac agc atc ggc gtg ccg aag ggc ctg 912
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu
290 295 300
tct atc acg ctg ccc gcg tcg tac tgg tat ctg aaa ggg ttt gac att 960
Ser Ile Thr Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile
305 310 315 320
gtc aac ctc gag cca tat gtg gac ttt ttc aat gtc atg acg tat gat 1008
Val Asn Leu Glu Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp
325 330 335
att cac ggt gtc tgg gat tcg acg gtc caa agc ctg ggg ccc tat gcc 1056
Ile His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
cac gcc cac acc aac ctc acc gag atc gag gag gca ctg aag ctg ctt 1104
His Ala His Thr Asn Leu Thr Glu Ile Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu
355 360 365
tgg cgc aac aac atc aac ccc gag cgc gtc aac ctg ggc ctg ggt ttc 1152
Trp Arg Asn Asn Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
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Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly
385 390 395 400
tgt gag ttc agc tct ggc ggt aac ggt ggc agc tgc acg ggt acc ccg 1248
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
gga gtc ctc tca gcc cac gag atc gtc caa atc atc aat aac ggc gcg 1296
Gly Val Leu Ser Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala
420 425 430
acg gtg acc acg gac gaa gtg gcc gcc gtg gag att gtc acc tgg gac 1344
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp
435 440 445
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Thr Asn Gln Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
gtc aac tac gcc aac gag cgc tgc ctg ggc ggt gtc atg gtc tgg gcc 1440
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala
465 470 475 480
atc gac ctc gac gac ggc acc cta atc aag tca ctt gcc gac acg gga 1488
Ile Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
cgg ccc acc tac aat tac ttg acg gac ctc ccc tgg atg acg ggt tgt 1536
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
ttc gga tcc gcg ttt gac gac tgg tcg aga ctg aat gac tcc gac atc 1584
Phe Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile
515 520 525
gat tca gga agc agt taa 1602
Asp Ser Gly Ser Ser
530
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn1。
<400>5
gaccggaatt cagcacgagg caaaagctct 30
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn2。
<400>6
ttgagtctcg ctcttagtct cttgagcagg ttgacg 36
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn3。
<400>7
gctcaagaga ctaagagcga gactcaacag catc 34
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn4。
<400>8
actctctcgg ggttgatgtt gtttctccaa agcagc 36
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn5。
<400>9
ggagaaacaa catcaacccc gagagagtca acc 33
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn6。
<400>10
ccagcggccg cttaactgct tcctgaatcg atgt 34
Claims (4)
1、角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因，其特征在于角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因序列如下所示：
ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCGTGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCACGAGGCAAAAGCTCTGGACGCGAGACGACTCAGACCCGAAGTGCACCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTAGACAAAGACACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCACCTCGTCGTGCGACTACAAGAGCGAGTGCGACCCGGGCTGGGGCATGCAGTGGTCCAACGCATCGACGTGCCCCCTCAACGTGTGCTGCAGTGACTTTGGTTTCTGCGGCACGACCGATGAGTTCTGCAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGACTCGGCCGACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCGCCGACGATAGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTATCTGAAAGGGTTTGACATTGTCAACCTCGAGCCATATGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCACGGTGTCTGGGATTCGACGGTCCAAAGCCTGGGGCCCTATGCCCACGCCCACACCAACCTCACCGAGATCGAGGAGGCACTGAAGCTGCTTTGGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACCTGGGCCTGGGTTTCTACGGTCGTAGCTTCACCATGAAAGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCCCCTGGATGACGGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
2、角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因的制备方法，其特征在于角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn1、1μL浓度为20μmol/L引物Pn2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、56.8℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn2的基因序列为5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn3、1μL浓度为20μmol/L引物Pn4、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.2℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn3的基因序列为5’-GCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATC-3’；下游引物Pn4的基因序列为5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’；
七、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段C：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn5、1μL浓度为20μmol/L引物Pn6、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn5的基因序列为5’-GGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACC-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
八、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、B和C，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段C和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、60℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L引物Pn1和1μL浓度为20μmol/L引物Pn6，再进行94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
3、根据权利要求2所述的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法，其特征在于步骤二按以下步骤实施：
a、将5μL角毛壳菌总RNA、8μL RNase-free H2O和2μL引物Oligod18T混匀后置于70℃的环境中5min，然后放于冰上；
b、将5μL 5×MLV Buffer、1.25μL dNTPmix、0.6μL铁调节蛋白、1μLM-MLV反转录酶和2.5μL ddH2O混合；
c、将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42℃环境中反转录1h；
d、反转录产物cDNA PCR扩增：PCR反应体系为25μL，由2μL 10mMdNTP、2μL 25mM MgCl2、5UE×Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pn1、10pM下游引物Pn6、2μL步骤c反转录产物和余量的ddH2O组成，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，72℃延伸10min；
其中步骤d中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。
4、用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物，其特征在于引物的基因序列为：
Pn1：5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’，
Pn2：5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’，
Pn3：5’-GCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATC-3’，
Pn4：5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’，
Pn5：5’-GGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACC-3’，
Pn6：5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。
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| CNA200810137115XA CN101348796A (zh) | 2008-09-12 | 2008-09-12 | 角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物 |
Publications (1)
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103014041A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-03 | 中山大学 | 一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因及其重组蛋白的制备与应用 |
| WO2014140167A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Cell wall deconstruction enzymes of malbranchea cinnamomea and uses thereof |
| CN106399335A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-02-15 | 大连理工大学 | 高效几丁质酶突变体的制备方法及应用 |
| CN107488650A (zh) * | 2017-08-28 | 2017-12-19 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用 |
| CN109576249A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-05 | 大连大学 | 一种耐低温几丁质酶的耐酸突变体及其应用 |
-
2008
- 2008-09-12 CN CNA200810137115XA patent/CN101348796A/zh active Pending
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| CN106399335B (zh) * | 2016-10-19 | 2019-05-21 | 大连理工大学 | 高效几丁质酶突变体的制备方法及应用 |
| CN107488650A (zh) * | 2017-08-28 | 2017-12-19 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用 |
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| CN109576249A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-05 | 大连大学 | 一种耐低温几丁质酶的耐酸突变体及其应用 |
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