CN101353652A - 角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物 - Google Patents
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Abstract
角毛壳菌几丁质酶几丁质结合结构域(ChBD)缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物，它涉及一种几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物。本发明为几丁质酶ChBD的研究奠定了物质基础。本发明缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明缺失突变体基因序列如SEQ ID NO：3所示。本发明引物PM1、PM2、PX和PY的基因序列分别如SEQ ID NO：5、6、7和8所示。本发明通过融合PCR法获得缺失突变体基因，再通过转基因克隆技术获得缺失突变体。本发明为几丁质酶ChBD的研究奠定了物质基础，构建了几丁质酶ChBD缺失突变体。
Description
技术领域
本发明涉及一种几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物。
背景技术
角毛壳菌几丁质酶基因(命名为chi58)的基因序列如SEQ ID NO：1所示，属于糖基水解酶家族18；其编码的氨基酸序列(角毛壳菌几丁质酶)如SEQ ID NO：2所示，具有一个保守的几丁质结合结构域(chitin-binding domain，ChBD)位于第105～第124个氨基酸。只有少数的真菌几丁质酶含有ChBD，大部分真菌几丁质酶中不含有ChBD，因此目前对ChBD的功能和作用并不清楚。
发明内容
本发明为几丁质酶ChBD的研究奠定了物质基础，提供了一种角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；
八、将步骤七得到的基因片段与真核表达载体pPIC9K重组构建重组表达质粒pPIC9K-chi58D，然后采用电转化方法转化到真核表达宿主菌毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板培养基在30℃条件下培养2～3天，之后将MD平板培养基上生长的转化菌落分别点种到MM和MD平板培养基的相应位置上在30℃条件下培养2～3天，并根据菌落在MM平板上的生长情况鉴定转化子的表型；
九、选择Mut+型转化子进行诱导表达：挑选Mut+型转化子单菌落置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中在28～30℃、250～300r/min的条件下培养至OD600＝2～6，然后在室温、1500～3000g的条件下离心5min，收集菌体用BMMY重悬菌体使OD600＝0.9～1.1；将BMMY重悬菌液用双层纱布或粗棉布封口放置于28～30℃、250～300r/min的环境中继续生长，每隔24h向培养基中添加浓度为100％的甲醇至菌液中甲醇的终浓度为0.5～1.0％；连续诱导培养120h、并在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到的上清液为含有角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的粗酶液。
本发明用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物PM1的基因序列如SEQ ID NO：5所示，引物PM2的基因序列如SEQ ID NO：6所示，引物PX的基因序列如SEQ ID NO：7所示，引物PY的基因序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明为几丁质酶ChBD的研究奠定了物质基础，构建了几丁质酶ChBD缺失突变体。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体制备方法采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的拼接。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体制备方法仅一步PCR反应就能实现结构域的删除，具有快速且节约成本的特点。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因的制备方法步骤七中引物之间都通过重叠搭桥进行扩增反应，因此在最初的8个循环反应中不加引物，模板间自动退火搭桥形成长链，同时适当的延长了退火时间，提高了反应的成功率。
本发明缺失突变体基因的制备方法具有简捷、快速、高效的优点，而且在扩增过程中未引入其他突变，保障了非突变区序列的正确性，所获得的缺失突变体基因可用于后续的分子克隆。
本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因制备方法中突变位点就在引物上，因此本发明中突变引物的重叠区长，重叠区碱基均在27bp左右，提高了引物与模板结合的特异性，所以本发明目的基因片段的特异性强。本发明制备的缺失突变体基因与真核表达载体pPIC9K连接构建重组表达载体，再经甲醇诱导后表达出角毛壳菌几丁质酶几丁质结合结构域缺失突变体(chi58D)，说明本发明角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因具有表达功能。
本发明用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物间每对引物的退火温度非常接近。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的氨基酸序列序列如SEQ ID NO：4所示。
具体实施方式二：本实施方式角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因序列如SEQ ID NO：3所示。
具体实施方式三：本实施方式角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶基因片段经基因测序如SEQ ID NO：3所示，缺失角毛壳菌几丁质酶几丁质结合结构域。
本实施方式中突变扩增待融合片段A长311bp，突变扩增待融合片段B长1138bp。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤二按以下步骤实施：a、将5μL角毛壳菌总RNA、8μL RNase-free H2O和2μL引物Oligod18T混匀后置于70℃的环境中5min，然后放于冰上；
b、将5μL 5×MLV Buffer、1.25μL dNTPmix、0.6μL铁调节蛋白(IRP)、1μLM-MLV反转录酶和2.5μL ddH2O混合；
c、将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42℃环境中反转录1h；
d、反转录产物cDNA PCR扩增：PCR反应体系为25μL，由2μL 10mMdNTP、2μL 25mM MgCl2、5U E×Taq DNA聚合酶1μL、10pM上游引物PM1、10pM下游引物PM2、2μL步骤c反转录产物和余量的ddH2O组成，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，72℃延伸10min；
其中步骤d中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；
八、将步骤七得到的基因片段与真核表达载体pPIC9K重组构建重组表达质粒pPIC9K-chi58D，然后采用电转化方法转化到真核表达宿主菌毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板培养基在30℃条件下培养2～3天，之后将MD平板培养基上生长的转化菌落分别点种到MM和MD平板培养基的相应位置上在30℃条件下培养2～3天，并根据菌落在MM平板上的生长情况鉴定转化子的表型(在MM平板培养基上生长正常的转化子是Mut+型转化子；而在MM平板培养基上生长迟缓的转化子是Muts型转化子)；
九、选择Mut+型转化子进行诱导表达：挑选Mut+型转化子单菌落置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中在28～30℃、250～300r/min的条件下培养至OD600＝2～6(培养时间为16～18h)，然后在室温、1500～3000g的条件下离心5min，收集菌体用BMMY重悬菌体使OD600＝0.9～1.1；将BMMY重悬菌液用双层纱布或粗棉布封口放置于28～30℃、250～300r/min的环境中继续生长，每隔24h向培养基中添加浓度为100％的甲醇至菌液中甲醇的终浓度为0.5～1.0％；连续诱导培养120h(几丁质酶活性最高)、并在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到的上清液为含有角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的粗酶液。
本实施方式随机选取毕赤酵母GS115转化子提取基因组DNA，并用引物S1(位于chi58序列内部，S1基因序列为：5′-AAAGACACTGGTGTCGGCATCT-3′)与载体引物3’AOX1进行扩增鉴定，扩增反应体系为50μL：由5μL 10×PCR buffer、5μL Genomic DNA(约1μg)、1μL100mM dNTPs、5μL S1引物(0.1μg/μL)、5μL 3’AOX1引物、0.25μL Tagpolymerase(5U/μL)和余量无菌水组成；扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min、63℃退火1min、72℃延伸2min、25个循环，72℃延伸7min；鉴定结果基因序列如SEQ ID NO：3所示，且在粗酶液中分离纯化到与本实施方式所设计的角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体分子量相同的蛋白质，说明本实施方式制备的蛋白质为角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤七得到的DNA片段纯化、回收后5′末端磷酸化，再克隆到pSIMPLE-18EcoR V/BAP载体上，然后转化大肠杆菌JM109得到阳性重组克隆。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二按以下步骤实施：a、将5μL角毛壳菌总RNA、8μL RNase-free H2O和2μL引物Oligod18T混匀后置于70℃的环境中5min，然后放于冰上；
b、将5μL 5×MLV Buffer、1.25μL dNTPmix、0.6μL铁调节蛋白(IRP)、1μLM-MLV反转录酶和2.5μL ddH2O混合；
c、将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42℃环境中反转录1h；
d、反转录产物cDNA PCR扩增：PCR反应体系为25μL，由2μL 10mMdNTP、2μL 25mM MgCl2、5U E×Taq DNA聚合酶、10pM上游引物PM1、10pM下游引物PM2、2μL步骤c反转录产物和余量的ddH2O组成，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，72℃延伸10min；
其中步骤d中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤一中用植物叶小量提取试剂盒提取总RNA：收集角毛壳菌菌丝并用无菌水冲洗，然后干燥、液氮速冻、研磨；取0.2g研磨后的菌丝加入到1mL TRIZOL试剂中静置5min，再加入0.2mL三氯甲烷剧烈振荡15s，然后在12000g、4℃条件下离心15min；取上清，加入沉淀剂离心，沉淀用质量浓度为75％的乙醇洗涤两次、再干燥；将沉淀溶解在50μL用DEPC处理的双蒸水中，即得到角毛壳菌总RNA。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式九：本实施方式用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物的基因序列为：
PM1：5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’，
PM2：5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’，
PX：5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’，
PY：5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3。
本实施方式引物PM1和PM2中分别加入了EcoR I和Not I酶切位点(加下划线部分)。
序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120>角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体及其基因和制备方法及所用引物
<160>9
<210>1
<211>2065
<212>DNA
<213>毛壳菌属(Chaetomium)
<400>1
ctgttttgtg tgccaccgtt ctgctctctg tgccagtctc caaccggcct gtccatcaag 60
attcgacctt ggtcgttgtg actgcctatc atgaagacgt ctctgagctg cgtcttgctc 120
tgggctgggc tggccgtggc cgcgtccagc tatgagtcta gtttcctcgt ccaagcccgc 180
cagagcacga ggcaaaagct ctggacgcga gacgactcag acccgaagtg caccaaggat 240
attccgtgca agatcgggtg ctgtgggcca ttgtaggtct atcgctctca gataaacatc 300
gcgcaatgct gacggccacg acagagacaa agacactggt gtcggcatct gcggcttggg 360
accaaccttc tgcggcgacg ggtgcacctc gtcgtgcgac tacaagagcg agtgcgaccc 420
gggctggggc atgcagtggt ccaacgcatc gacgtgcccc ctcaacgtgt gctgcagtga 480
ctttggtttc tgcggcacga ccgatgagtt ctgcaagggc aaggaggtgt cggtcccgca 540
gtgcgacccg gccgccaaca gctcgcacgc gcgcaccgtc ggctactatg agggctggaa 600
ctggcagcgc ccctgcggca ccatgaagcc gtcgcagatc ccgctcggtt attacagtca 660
cattttcttc gccttctcgt tgctcgaccc caccaccttc cggctgtcgc ccatggatac 720
cgagacaggt accctgtacg gtgacgtctc ggctatcaag aaccgccagc cgggcgtgca 780
agtctggatc gccatcggcg gctgggcgat gaatgacccc ggtccgactc ggccgacgtt 840
ttcaaacctg gccaaggacg aggcggcgca ggacgagttc ttcgaggccc tggtcacttt 900
catgatggcc aacgactacg acggtgtcga tatcgactgg gaatatcccg tcgccgacga 960
tagaggtggc agcgtcgagg actttgataa ctacgtcaac ctgctcaagc gcctacgcgc 1020
gcgcctcaac agcatcggcg tgccgaaggg cctgtctatc acgctgcccg cgtcgtactg 1080
gtatctgaaa gggtttgaca ttgtcaacct cgagccatat gtggactttt tcaatgtcat 1140
gacgtatgat attcgtgagt aacgttagcc catttgctgt tcctcttgct tttaatccct 1200
ctcactgctc atcctctcca tcctttattc cttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
ttttgaaaag aatgtctttc ctcttttctt gactttctgt ttactcatct cattgttctg 1320
tccttgttga gacctggact aactccgtaa aacagacggt gtctgggatt cgacggtcca 1380
aagcctgggg ccctatgccc acgcccacac caacctcacc gagatcgagg aggcactgaa 1440
gctgctttgg cgcaacaaca tcaaccccga gcgcgtcaac ctgggcctgg gtttctacgg 1500
tcgtagcttc accatgaaag acccctcttg catggccgcc ggctgtgagt tcagctctgg 1560
cggtaacggt ggcagctgca cgggtacccc gggagtcctc tcagcccacg agatcgtcca 1620
aatcatcaat aacggcgcga cggtgaccac ggacgaagtg gccgccgtgg agattgtcac 1680
ctgggacacc aaccagtggg tctcatggga cagcaccaag acgctggcca tgaaggtcaa 1740
ctacgccaac gagcgctgcc tgggcggtgt catggtctgg gccatcgacc tcgacgacgg 1800
caccctaatc aagtcacttg ccgacacggg acggcccacc tacaattact tgacggacct 1860
cccctggatg acgggttgtt tcggatccgc gtttgacgac tggtcgagac tgaatgactc 1920
cgacatcgat tcaggaagca gttaatgctt tagtcgtctt gtaatatgtc atattggaat 1980
ggatactcta gggtgaggaa aatatgtcac tttaaacaca tgctacccga atattgcctg 2040
cgataattag gttgtccgtg gccag 2065
<210>2
<211>533
<212>PRT
<213>毛壳菌属(Chaetomium)
<400>2
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
100 105 110
Asp Phe Gly Phe Cys Gly Thr Thr Asp Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu
115 120 125
Val Ser Val Pro Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg
130 135 140
Thr Val Gly Tyr Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr
145 150 155 160
Met Lys Pro Ser Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe
165 170 175
Ala Phe Ser Leu Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp
180 185 190
Thr Glu Thr Gly Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg
195 200 205
Gln Pro Gly Val Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn
210 215 220
Asp Pro Gly Pro Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gln Asp Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala
245 250 255
Asn Asp Tyr Asp Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp
260 265 270
Asp Arg Gly Gly Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu
275 280 285
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu
290 295 300
Ser Ile Thr Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile
305 310 315 320
Val Asn Leu Glu Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp
325 330 335
Ile His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
His Ala His Thr Asn Leu Thr Glu Ile Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu
355 360 365
Trp Arg Asn Asn Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly
385 390 395 400
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
Gly Val Leu Ser Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala
420 425 430
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp
435 440 445
Thr Asn Gln Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala
465 470 475 480
Ile Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser
530
<210>3
<211>1542
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1542)
<220>
<223>角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因。
<400>3
atg aag acg tct ctg agc tgc gtc ttg ctc tgg gct ggg ctg gcc gtg 48
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
gcc gcg tcc agc tat gag tct agt ttc ctc gtc caa gcc cgc cag agc 96
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
acg agg caa aag ctc tgg acg cga gac gac tca gac ccg aag tgc acc 144
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
aag gat att ccg tgc aag atc ggg tgc tgt ggg cca tta gac aaa gac 192
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
act ggt gtc ggc atc tgc ggc ttg gga cca acc ttc tgc ggc gac ggg 240
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
tgc acc tcg tcg tgc gac tac aag agc gag tgc gac ccg ggc tgg ggc 288
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
atg cag tgg tcc aac gca tcg acg aag ggc aag gag gtg tcg gtc ccg 336
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Lys Gly Lys Glu Val Ser Val Pro
100 105 110
cag tgc gac ccg gcc gcc aac agc tcg cac gcg cgc acc gtc ggc tac 384
Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg Thr Val Gly Tyr
115 120 125
tat gag ggc tgg aac tgg cag cgc ccc tgc ggc acc atg aag ccg tcg 432
Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr Met Lys Pro Ser
130 135 140
cag atc ccg ctc ggt tat tac agt cac att ttc ttc gcc ttc tcg ttg 480
Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe Ala Phe Ser Leu
145 150 155 160
ctc gac ccc acc acc ttc cgg ctg tcg ccc atg gat acc gag aca ggt 528
Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp Thr Glu Thr Gly
165 170 175
acc ctg tac ggt gac gtc tcg gct atc aag aac cgc cag ccg ggc gtg 576
Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg Gln Pro Gly Val
180 185 190
caa gtc tgg atc gcc atc ggc ggc tgg gcg atg aat gac ccc ggt ccg 624
Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn Asp Pro Gly Pro
195 200 205
act cgg ccg acg ttt tca aac ctg gcc aag gac gag gcg gcg cag gac 672
Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Gln Asp
210 215 220
gag ttc ttc gag gcc ctg gtc act ttc atg atg gcc aac gac tac gac 720
Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala Asn Asp Tyr Asp
225 230 235 240
ggt gtc gat atc gac tgg gaa tat ccc gtc agc cga cga tga ggt ggc 768
Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp Asp Arg Gly Gly
245 250 255
agc gtc gag gac ttt gat aac tac gtc aac ctg ctc aag cgc cta cgc 816
Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu Lys Arg Leu Arg
260 265 270
gcg cgc ctc aac agc atc ggc gtg ccg aag ggc ctg tct atc acg ctg 864
Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser Ile Thr Leu
275 280 285
ccc gcg tcg tac tgg tat ctg aaa ggg ttt gac att gtc aac ctc gag 912
Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile Val Asn Leu Glu
290 295 300
cca tat gtg gac ttt ttc aat gtc atg acg tat gat att cac ggt gtc 960
Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp Ile His Gly Val
305 310 315 320
tgg gat tcg acg gtc caa agc ctg ggg ccc tat gcc cac gcc cac acc 1008
Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala His Ala His Thr
325 330 335
aac ctc acc gag atc gag gag gca ctg aag ctg ctt tgg cgc aac aac 1056
Asn Leu Thr Glu Ile Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu Trp Arg Asn Asn
340 345 350
atc aac ccc gag cgc gtc aac ctg ggc ctg ggt ttc tac ggt cgt agc 1104
Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
ttc acc atg aaa gac ccc tct tgc atg gcc gcc ggc tgt gag ttc agc 1152
Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly Cys Glu Phe Ser
370 375 380
tct ggc ggt aac ggt ggc agc tgc acg ggt acc ccg gga gtc ctc tca 1200
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro Gly Val Leu Ser
385 390 395 400
gcc cac gag atc gtc caa atc atc aat aac ggc gcg acg gtg acc acg 1248
Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala Thr Val Thr Thr
405 410 415
gac gaa gtg gcc gcc gtg gag att gtc acc tgg gac acc aac cag tgg 1296
Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp Thr Asn Gln Trp
420 425 430
gtc tca tgg gac agc acc aag acg ctg gcc atg aag gtc aac tac gcc 1344
Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys Val Asn Tyr Ala
435 440 445
aac gag cgc tgc ctg ggc ggt gtc atg gtc tgg gcc atc gac ctc gac 1392
Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala Ile Asp Leu Asp
450 455 460
gac ggc acc cta atc aag tca ctt gcc gac acg gga cgg ccc acc tac 1440
Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly Arg Pro Thr Tyr
465 470 475 480
aat tac ttg acg gac ctc ccc tgg atg acg ggt tgt ttc gga tcc gcg 1488
Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys Phe Gly Ser Ala
485 490 495
ttt gac gac tgg tcg aga ctg aat gac tcc gac atc gat tca gga agc 1536
Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile Asp Ser Gly Ser
500 505 510
agt taa 1542
Ser
<210>4
<211>513
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体。
<400>4
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gln Ala Arg Gln Ser
20 25 30
Thr Arg Gln Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
Lys Asp Ile Pro Cys Lys Ile Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
Thr Gly Val Gly Ile Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
65 70 75 80
Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
Met Gln Trp Ser Asn Ala Ser Thr Lys Gly Lys Glu Val Ser Val Pro
100 105 110
Gln Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg Thr Val Gly Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gln Arg Pro Cys Gly Thr Met Lys Pro Ser
130 135 140
Gln Ile Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His Ile Phe Phe Ala Phe Ser Leu
145 150 155 160
Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp Thr Glu Thr Gly
165 170 175
Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala Ile Lys Asn Arg Gln Pro Gly Val
180 185 190
Gln Val Trp Ile Ala Ile Gly Gly Trp Ala Met Asn Asp Pro Gly Pro
195 200 205
Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Gln Asp
210 215 220
Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala Asn Asp Tyr Asp
225 230 235 240
Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp Asp Arg Gly Gly
245 250 255
Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu Lys Arg Leu Arg
260 265 270
Ala Arg Leu Asn Ser Ile Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser Ile Thr Leu
275 280 285
Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Ile Val Asn Leu Glu
290 295 300
Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp Ile His Gly Val
305 310 315 320
Trp Asp Ser Thr Val Gln Ser Leu Gly Pro Tyr Ala His Ala His Thr
325 330 335
Asn Leu Thr Glu Ile Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu Trp Arg Asn Asn
340 345 350
Ile Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly Cys Glu Phe Ser
370 375 380
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro Gly Val Leu Ser
385 390 395 400
Ala His Glu Ile Val Gln Ile Ile Asn Asn Gly Ala Thr Val Thr Thr
405 410 415
Asp Glu Val Ala Ala Val Glu Ile Val Thr Trp Asp Thr Asn Gln Trp
420 425 430
Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys Val Asn Tyr Ala
435 440 445
Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala Ile Asp Leu Asp
450 455 460
Asp Gly Thr Leu Ile Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly Arg Pro Thr Tyr
465 470 475 480
Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys Phe Gly Ser Ala
485 490 495
Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp Ile Asp Ser Gly Ser
500 505 510
Ser
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物PM1。
<400>5
gaccggaatt cagcacgagg caaaagctct 30
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物PM2。
<400>6
ccagcggccg cttaactgct tcctgaatcg atgt 34
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物PX。
<400>7
tgccgcaggg gcgctcgcac tgcgggaccg 30
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物PY。
<400>8
ccgcagtgcg agcgcccctg cggc 24
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于鉴定角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物S1。
<400>9
aaagacactg gtgtcggcat ct 22
Claims (7)
1、角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体，其特征在于角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的氨基酸序列如下所示：
MKTSLSCVLLWAGLAVAASSYESSFLVQARQSTRQKLWTRDDSDPKCTKDIPCKIGCCGPLDKDTGVGICGLGPTFCGDGCTSSCDYKSECDPGWGMQWSNASTKGKEVSVPQCDPAANSSHARTVGYYEGWNWQRPCGTMKPSQIPLGYYSHIFFAFSLLDPTTFRLSPMDTETGTLYGDVSAIKNRQPGVQVWIAIGGWAMNDPGPTRPTFSNLAKDEAAQDEFFEALVTFMMANDYDGVDIDWEYPVADDRGGSVEDFDNYVNLLKRLRARLNSIGVPKGLSITLPASYWYLKGFDIVNLEPYVDFFNVMTYDIHGVWDSTVQSLGPYAHAHTNLTEIEEALKLLWRNNINPERVNLGLGFYGRSFTMKDPSCMAAGCEFSSGGNGGSCTGTPGVLSAHEIVQIINNGATVTTDEVAAVEIVTWDTNQWVSWDSTKTLAMKVNYANERCLGGVMVWAIDLDDGTLIKSLADTGRPTYNYLTDLPWMTGCFGSAFDDWSRLNDSDIDSGSS。
2、角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因，其特征在于角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因序列如下所示：
ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCGTGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCACGAGGCAAAAGCTCTGGACGCGAGACGACTCAGACCCGAAGTGCACCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTAGACAAAGACACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCACCTCGTCGTGCGACTACAAGAGCGAGTGCGACCCGGGCTGGGGCATGCAGTGGTCCAACGCATCGACGAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGACTCGGCCGACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCAGCCGACGATGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGCGCCTACGCGCGCGCCTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTATCTGAAAGGGTTTGACATTGTCAACCTCGAGCCATATGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCACGGTGTCTGGGATTCGACGGTCCAAAGCCTGGGGCCCTATGCCCACGCCCACACCAACCTCACCGAGATCGAGGAGGCACTGAAGCTGCTTTGGCGCAACAACATCAACCCCGAGCGCGTCAACCTGGGCCTGGGTTTCTACGGTCGTAGCTTCACCATGAAAGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCCCCTGGATGACGGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
3、角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因的制备方法，其特征在于角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因。
4、根据权利要求3所述的角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体基因的制备方法，其特征在于步骤二按以下步骤实施：
a、将5μL角毛壳菌总RNA、8μL RNase-free H2O和2μL引物Oligod18T混匀后置于70℃的环境中5min，然后放于冰上；
b、将5μL 5×MLV Buffer、1.25μL dNTPmix、0.6μL铁调节蛋白、1μLM-MLV反转录酶和2.5μL ddH2O混合；
c、将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42℃环境中反转录1h；
d、反转录产物cDNA PCR扩增：PCR反应体系为25μL，由2μL 10mMdNTP、2μL 25mM MgCl2、5U E×Taq DNA聚合酶1μL、10pM上游引物PM1、10pM下游引物PM2、2μL步骤c反转录产物和余量的ddH2O组成，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，72℃延伸10min；
其中步骤d中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’。
5、角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的制备方法，其特征在于角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体按以下步骤制备：
一、提取角毛壳菌总RNA：
二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；
五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1、1μL浓度为20μmol/L下游引物PX、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PM1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物PX的基因序列为5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’；
六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L上游引物PY、1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH2O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.7℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物PY的基因序列为5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’；下游引物PM2的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；
七、用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A和B，然后进行融合PCR：由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、0.25μL高信度扩增酶PyrobestDNA polymerase、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段A、1μL浓度为10ng/μL的突变扩增待融合片段B和余量的ddH2O组成的体积为50μL的融合PCR反应体系先进行94℃变性30s、57℃退火2min、72℃延伸3min，8个循环；然后加入1μL浓度为20μmol/L上游引物PM1和1μL浓度为20μmol/L下游引物PM2，再进行94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸5min，20个循环；
八、将步骤七得到的基因片段与真核表达载体pPIC9K重组构建重组表达质粒pPIC9K-chi58D，然后采用电转化方法转化到真核表达宿主菌毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板培养基在30℃条件下培养2～3天，之后将MD平板培养基上生长的转化菌落分别点种到MM和MD平板培养基的相应位置上在30℃条件下培养2～3天，并根据菌落在MM平板上的生长情况鉴定转化子的表型；
九、选择Mut+型转化子进行诱导表达：挑选Mut+型转化子单菌落置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中在28～30℃、250～300r/min的条件下培养至OD600＝2～6，然后在室温、1500～3000g的条件下离心5min，收集菌体用BMMY重悬菌体使OD600＝0.9～1.1；将BMMY重悬菌液用双层纱布或粗棉布封口放置于28～30℃、250～300r/min的环境中继续生长，每隔24h向培养基中添加浓度为100％的甲醇至菌液中甲醇的终浓度为0.5～1.0％；连续诱导培养120h、并在4℃、8000r/min条件下离心10min，得到的上清液为含有角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的粗酶液。
6、根据权利要求5所述的角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的制备方法，其特征在于步骤七得到的DNA片段纯化、回收后5′末端磷酸化，再克隆到pSIMPLE-18 EcoRV/BAP载体上，然后转化大肠杆菌JM109得到阳性重组克隆。
7、用于制备角毛壳菌几丁质酶ChBD缺失突变体的引物，其特征在于引物的基因序列为：
PM1：5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’，
PM2：5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’，
PX：5’-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3’，
PY：5’-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3’。
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