CN106544329A - 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用 - Google Patents

一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106544329A
CN106544329A CN201611055736.4A CN201611055736A CN106544329A CN 106544329 A CN106544329 A CN 106544329A CN 201611055736 A CN201611055736 A CN 201611055736A CN 106544329 A CN106544329 A CN 106544329A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polpmo1
polysaccharide monooxygenase
extracellular polysaccharide
enzyme
cellulose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611055736.4A
Other languages
English (en)
Inventor
曲音波
彭圣娟
刘国栋
李雪芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201611055736.4A priority Critical patent/CN106544329A/zh
Publication of CN106544329A publication Critical patent/CN106544329A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在协同降解纤维素中的应用。该酶比酶活可达到15.625IU/mg。纤维素酶系中添加胞外多糖单加氧酶PoLPMO1后，可与β‑葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶协同作用，提高多种不同预处理的天然木质纤维素底物的降解效果，预示该酶在生物能源和生物基化学品工业中具有很大的应用潜力和经济效益。

Description

一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用
技术领域
本发明涉及一种胞外多糖单加氧酶，尤其涉及一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
木质纤维素生物质是世界上最丰富的可再生资源，可用于生产生物乙醇燃料和其它增值产品。纤维素的降解需要内切葡聚糖酶纤维二糖水解酶协同作用，使其转化成纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。近年来，人们发现一种裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)，能够通过氧化的方式断开纤维素链，从而和其它纤维素水解酶一起协同降解木质纤维素。研究表明，多糖单加氧酶的水解产物包括纤维寡糖、醛糖酸内酯和醛糖酸。而众所周知，醛糖酸内酯对多种糖苷水解酶都有抑制作用，比如β-葡萄糖苷酶受到葡萄糖酸内酯的强烈抑制。多糖单加氧酶能够和β-葡萄糖苷酶协同作用促进纤维素的降解，但是其产物醛糖酸内酯又对β-葡萄糖苷酶有抑制作用。在纤维素酶降解木质纤维素的体系中，能够产生内酯的不止限于多糖单加氧酶，还有纤维二糖脱氢酶和其它氧化还原酶类；受内酯抑制的酶类，不止限于β-葡萄糖苷酶，还有其它多种糖苷水解酶类。
经检索，有关胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其与β-葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶的协同应用还未见报。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用。
本发明所述的胞外多糖单加氧酶PoLPMO1，其特征在于：该胞外多糖单加氧酶PoLPMO1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体的，所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1包括249个氨基酸，N-端21个氨基酸为信号肽，成熟的PoLPMO1的理论分子量为26.2kDa。进一步的，本发明所述的多糖单加氧酶PoLPMO1还涵盖在：所使用的蛋白为表现出多糖单加氧酶活性的PoLPMO1的变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除。
本发明还公开了一种包含上述多糖单加氧酶基因polpmo1的重组载体pPIC-polpmo1。
本发明还公开了一种包含上述重组载体pPIC-polpmo1的重组毕赤酵母工程菌株GS115/polpmo1。
本发明所述的胞外多糖单加氧酶PoLPMO1是由重组毕赤酵母工程菌株GS115/polpmo1发酵培养诱导表达、纯化回收获得。
用Roman Kittl公开的(Biotechnology for Biofuels.2012,5:79)测量多糖单加氧酶活性的方法测定纯化的PoLPMO1比酶活是15.625IU/mg。
本发明所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在与β-葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶协同降解磷酸膨胀纤维素中的应用
具体的，本发明提供了胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在与β-葡萄糖苷酶PoBGL1和醛糖酸内酯酶PoALAC的协同水解磷酸膨胀纤维素中的应用。
PoBGL1单独不能降解磷酸膨胀纤维素，PoLPMO1和PoBGL1协同作用可以降解磷酸膨胀纤维素产生葡萄糖。PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC三者协同作用与PoLPMO1和PoBGL1二者协同作用相比，内酯浓度降低、β-葡萄糖苷酶比酶活升高、产生的葡萄糖浓度升高。说明PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC三者协同作用，能进一步提高磷酸膨胀纤维素的降解效果。
本发明所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在降解木质纤维素中的应用。
具体的，本发明提供了多糖单加氧酶PoLPMO1与β-葡萄糖苷酶PoBGL1和胞外醛糖酸内酯酶PoALAC协同作用促进多种木质纤维素降解的应用。
实验证实：无论是水解微晶纤维素还是不同方法预处理的天然底物，向来源于草酸青霉的混合纤维素酶SP或来源于里氏木霉的混合纤维素酶ST2中分别添加PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC都能提高水解效果；添加量减半后两种酶同时添加，比单独添加效果要好，说明PoLPMO1和PoBGL1，PoLPMO1和PoALAC，PoALAC和PoBGL1两者间有协同作用；添加量减少三分之二后三种酶同时添加，比两两添加效果更好，说明PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC三者间有强烈的协同作用。
多糖单加氧酶能够与葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶协同作用降解木质纤维素，其原因在于多糖单加氧酶能够通过氧化作用断开纤维素链，从而促进葡萄糖苷酶的水解，醛糖酸内酯酶能够水解多糖单加氧酶产生的内酯，解除内酯对葡萄糖苷酶的抑制作用，从而进一步增强协同作用。事实上，能产生内酯的氧化还原酶不限于多糖单加氧酶，来源不限于草酸青霉；能被内酯抑制的糖苷水解酶不限于β-葡萄糖苷酶，来源不限于草酸青霉；适用这个协同效果的醛糖酸内酯酶的来源不限于草酸青霉；能被三者协同促进水解效果的纤维素酶酶系来源不限于草酸青霉和里氏木霉；用于协同促进水解的底物不限于微晶纤维素、水热预处理玉米秸秆、稀酸预处理玉米秸秆、木糖渣和脱木素木糖渣。
本发明公开了一种来源于草酸青霉114-2的胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用，该酶能够通过氧化作用断开纤维素链，与葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶协同作用高效促进水解效果。将该多糖单加氧酶加入已添加β-葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶的纤维素酶系中，不仅能够进一步提高微晶纤维素的降解效果，还能进一步提高多种不同预处理的天然木质纤维素底物的降解效果，在生物能源和生物基化学品工业应用中具有很大的潜力。
因此，本多糖单加氧酶可用于能源工业，促进纤维素生物质转化成可酵解糖。
附图说明
图1：纯化的PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC的SDS-PAGE。
其中：1、PoBGL1，2、PoALAC，3、PoLPMO1。
图2：PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC协同水解0.5％(wt/vol)磷酸膨胀纤维素。三种酶的添加量分别为4mg/g纤维素，单独或共同作用于磷酸膨胀纤维素。50℃，200rpm，水解60h后测定葡萄糖浓度、内酯浓度和β-葡萄糖苷酶酶活。
其中：1、对照，2、PoBGL1，3、PoALAC，4、PoLPMO1，5、PoBGL1+PoALAC，6、PoLPMO1+PoALAC，7、PoLPMO1+PoBGL1，8、PoBGL1+PoALAC+PoLPMO1。
图3：PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC协同促进1％(wt/vol)微晶纤维素的降解。总蛋白量包含97％的纤维素酶SP和3％的添加蛋白。其中纤维素酶SP的用量是16FPU/g纤维素。在3％的添加蛋白中，各组分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作为对照。50℃，200rpm，水解24h后测定葡萄糖浓度。
其中：1、3％BSA，2、3％SP，3、3％PoLPMO1，4、3％PoBGL1，5、3％PoALAC，6、1.5％PoLPMO1+1.5％PoBGL1，7、1.5％PoLPMO1+1.5％PoALAC，8、1.5％PoALAC+1.5％PoBGL1，9、1％PoLPMO1+1％PoBGL1+1％PoALAC。
图4：PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC协同促进多种预处理天然底物的降解。总蛋白量包含97％的纤维素酶和3％的添加蛋白。其中纤维素酶(A)SP，(B)ST2的用量是16FPU/g纤维素。在3％的添加蛋白中，各组分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作为对照。50℃，200rpm，水解24h后测定葡萄糖浓度。底物包括5％(wt/vol)水热预处理玉米秸秆，稀酸预处理玉米秸秆，脱木素木糖渣和木糖渣。
其中：1、水热预处理玉米秸秆，2、稀酸预处理玉米秸秆，3、脱木素木糖渣，4、木糖渣。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：胞外多糖单加氧酶PoLPMO1的制备
1、微生物来源和载体
原始出发菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)野生菌株114-2，该菌株是申请人先前专利申请时保藏的菌株。该菌株于2011年9月28日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号是CGMCC No.5302。
毕赤酵母表达载体pPIC9K及毕赤酵母菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、培养基
菌丝生长培养基：葡萄糖20.0g/L，KH2PO4 3.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，MgSO4﹒7H2O0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4﹒7H2O 0.0075g/L，MnSO4﹒H2O 0.0025g/L，ZnSO4﹒7H2O0.0036g/L，CoCl2﹒6H2O 0.0037g/L。
诱导培养基：将菌丝生长培养基中的20.0g/L葡萄糖替换成1％纤维素和1％葡萄糖。
大肠杆菌培养基LB：10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10.0g/L NaCl，pH 7.0。
酵母培养基YPD：10.0g/L酵母粉，20.0g/L蛋白胨，10.0g/L葡萄糖。
重组转化子筛选培养基MD：3.4g/L不含硫酸铵的酵母氮碱，10.0g/L硫酸铵，10.0g/L葡萄糖，灭菌后加入2mL 500×生物素贮存液(制备方法：20mg生物素溶于100ml去离子水，过滤除菌)。MD固体培养基含1.8％琼脂粉。
BMGY培养基：不含硫酸铵的酵母氮碱3.4g/L，KH2PO4 11.8g/L，K2HPO4﹒3H2O 3g/L，硫酸铵10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，1％(vol/vol)甘油，pH 6.0，灭菌后加入2mL 500×生物素贮存液。
BMMY培养基：与BMGY培养基配方相同，但不含甘油。灭菌后除了加入生物素贮存液外，再加入1％(vol/vol)甲醇。
3、草酸青霉重组多糖单加氧酶PoLPMO1基因克隆、表达和纯化
草酸青霉114-2的RNA提取和cDNA合成：
接种新鲜的孢子悬液至菌丝生长液体培养基，30℃，200rpm，24h过夜培养，向诱导培养基里接入约0.5g的湿的菌丝体。将培养好的菌体抽滤洗涤后，放入-20℃预冷的研钵中,加入液氮迅速研磨成均勾粉末。适量粉末迅速转入预冷无RNAase的离心管中，待液氮挥发后加入1mL RNAiso试剂，祸旋振荡混合。室温静置5mim，12000rpm，4℃离心l0min，上清液移至新离心管中,弃沉淀。加入0.2mL氯仿，震荡15s后室温静置5min,12000rpm，4℃离心l5min，取约400μL上层水样至新的离心管。加入2倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1mL预冷的用DEPC处理的双蒸水配置的浓度为75％的乙醇洗涤沉淀2次，温和震荡离心管，4℃不超过7500rpm，离心5min，尽量弃去上清。室温放置瞭干5-10min。加入适量(30-50μL)DEPC处理的双蒸水溶解RNA。
cDNA的合成使用反转录试剂盒，TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser(Perfect Real Time)，根据说明书进行操作。
使用以下引物来扩增polpmo1：
polpmo1限制性内切酶：EcoRI和NotI
polpmo1-正向：GACGAATTCCATGGTTTCGTTTCCAGCATTATGG(SEQ ID NO.3)
polpmo1-反向：ATAGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGCGCGCTGTACAGAGCTGGACC(SEQ ID NO.4)
PCR产物纯化，将表达载体pPIC9K和上述编码基因分别进行双酶切，切出的基因片段与pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC-polpmo1用MssI酶切线性化，转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/polpmo1。
重组毕赤酵母菌株接种于50mL BMGY培养液中，30℃，200rpm振荡培养18h，离心收集菌体，并于100mL BMMY培养基重悬，用1％甲醇诱导5天后，离心收集上清。
培养液经0.22μm聚醚砜膜过滤后，上样经结合缓冲液再生后的1ml HisTrapTM柱(GE Healthcare，Lot.#17-5319-01)，再用结合缓冲液冲洗一遍，用洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。重组蛋白过夜透析，将缓冲液换成50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.8)。经纯化的蛋白质的SDS-PAGE显示于图1(其中：1、PoBGL1，2、PoALAC，3、PoLPMO1)。
其中：0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)：分别配制0.1M柠檬酸(C6H8O7﹒H2O)溶液(21.01g/L)和0.1M柠檬酸钠((Na3C6H5O7﹒2H2O))溶液(29.41g/L)，往0.1M柠檬酸溶液中加入0.1M柠檬酸钠溶液至pH 4.8。
0.5M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)：分别配制0.5M磷酸氢二钾(K2HPO4﹒3H2O)溶液(114.11g/L)和0.5M磷酸二氢钾(KH2PO4)溶液(680.45g/L)，往0.5M磷酸氢二钾溶液中加入0.5M磷酸二氢钾溶液至pH 7.4。
2M咪唑母液(300ml)：称40.848g咪唑，定容至275ml，浓盐酸调pH至7.4，4℃保存。
结合缓冲液(1L)：10ml 2M咪唑，40ml 0.5M磷酸钾缓冲液，29.22g NaCl。
洗脱缓冲液(250ml)：62.5ml 2M咪唑，10ml 0.5M磷酸钾缓冲液，7.305g NaCl。
4、多糖单加氧酶PoLPMO1的酶活测定
多糖单加氧酶的酶活测定按照Roman Kittl等人所述文献(Biotechnology forBiofuels.2012,5:79)。在25℃下，在96微孔板上操作。将20μL多糖单加氧酶与180μL预混液混合。预混液中包含30μM抗坏血酸作为还原剂，50μM Amplex Red(10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪，索莱宝，CAS No.119171-73-2)和7.14U/mL辣根过氧化物酶。用多标记分析仪测定485-535nm处的荧光吸收值，不同浓度的过氧化氢做标准曲线。
蛋白质的浓度采用Bradford法测定。在室温下，在96微孔板上操作。取20μL适量稀释的蛋白质溶液，加入200μL Bradford试剂(生工，Lot.:BC18DB0008)，静置10min后，测定595nm吸光值。
实施例2：胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在协同降解纤维素中的应用。
1、多糖单加氧酶PoLPMO1与β-葡萄糖苷酶PoBGL1和醛糖酸内酯酶PoALAC的协同实验
磷酸膨胀纤维素的制备方法：在50mL的离心管中加入2g微晶纤维素和6mL双蒸水，充分搅拌使纤维素粉末成均匀的浆状物。加入10mL冰冷的86％磷酸充分搅拌，使纤维素充分溶解，混合物变澄清。冰中放置1h，期间不断搅拌，最后加入冰水强烈搅拌，至磷酸的终浓度达到83.2％(wt/vol)，此时有大量白色胶状物质沉淀析出，于5000rpm，4℃离心20min。用冰冷的双蒸水洗涤胶状物3次，最后使用2M Na2CO3中和残余的磷酸。制备的胶状物4℃保存。
协同实验方法：水解底物为0.5％(wt/vol)磷酸膨胀纤维素。纯化的PoLPMO1、PoBGL1和PoALAC三种酶的添加量分别为4mg/g纤维素，单独或共同作用于磷酸膨胀纤维素。50℃，200rpm，水解60h后测定葡萄糖浓度、内酯浓度和β-葡萄糖苷酶酶活。
实验结果见图2。
葡萄糖浓度测定用生物传感仪SBA-40C(Shandong Academy ofSciences.China)。内酯浓度测定参照William和Beeson等人所述文献(Applied andEnvironmental Microbiology.2011,77:650-656)。
2、多糖单加氧酶PoLPMO1与β-葡萄糖苷酶PoBGL1和醛糖酸内酯酶PoALAC与纤维素酶系的协同作用
降解1％(wt/vol)微晶纤维素的添加实验：总蛋白量包含97％的纤维素酶SP和3％的添加蛋白。其中纤维素酶SP的用量是16FPU/g纤维素。在3％的添加蛋白中，各组分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作为对照。50℃，200rpm，水解24h后测定葡萄糖浓度。
实验结果见图3。
降解5％(wt/vol)预处理天然底物的糖化实验：总蛋白量包含97％的纤维素酶和3％的添加蛋白。其中纤维素酶SP或ST2的用量是16FPU/g纤维素。在3％的添加蛋白中，各组分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作为对照。50℃，200rpm，水解24h后测定葡萄糖浓度。底物包括水热预处理玉米秸秆，稀酸预处理玉米秸秆，脱木素木糖渣和木糖渣。
实验结果见图4。
水热预处理玉米秸秆的成分：59.72％纤维素、0.78％半纤维素、14.77％木素、5.93％灰分、15.7％抽出物。
稀酸预处理玉米秸秆的成分：49.48％纤维素、半纤维素低于检测水平、25.32％木素、3.9％灰分、12.88％抽出物。
脱木素木糖渣的成分：65.74％纤维素、1.79％半纤维素、3.15％木素、5.83％灰分、23.39％抽出物。
未脱木素的木糖渣的成分：62.58％纤维素、2.38％半纤维素、17.69％木素、6.84％灰分、10.52％抽出物。
滤纸酶活(FPA)测定方法：称取50mg Waterman定量滤纸片(Cat No1001125，Whatman)，加入1ml 50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.8)和500μl适当稀释的酶液，混匀后50℃水浴1h，加入2ml DNS终止反应，煮沸5min，冷却后加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测OD值。
DNS试剂的制备：将104g NaOH溶于1.3L蒸馏水中，加入30g 3，5-二硝基水杨酸混匀，加热溶解。称取910g酒石酸钾钠溶于2.5L蒸馏水中，再加入25g重蒸酚和25g无水亚硫酸钠。将以上各步骤的溶液混合，加入1.2L蒸馏水(使得总体积5.0L)，保存于棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。
序列表
<110>山东大学
<120>一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用
<141> 2016-11-24
<160> 4
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<221>胞外多糖单加氧酶PoLPMO1的氨基酸序列
<222>（1）…（249）
<400> 1
MVSSKATTLS AMLACVSMVA GHGFVSSIMA GGKNYTGYLA NSYPYMSNPP QSVGWATTAT 60
DLGFEDGTEY QSANIICHRD GKNAALSAPV TAGSKVEIQW TSWPDSHHGP VITYLASCGG 120
DCSTVDKTTL KFFKIDEAGL IDDSNPPGTW ATDQLIAAGN RWTVTIPKSI ASGNYVMRHE 180
IIALHSSGSK DGAQNYPQCL NLQVTGGGSA KPQGTLGEAL YKDTDPGILI NIYQSLKSYV 240
IPGPALYSA 249
<210> 2
<211> 750
<212> cDNA
<213>人工序列
<221>胞外多糖单加氧酶PoLPMO1的核苷酸序列
<222>（1）…（750）
<400> 2
atggtatctt caaaagccac caccctatct gccatgttgg catgtgtctc tatggtcgca 60
ggccatggtt tcgtttccag cattatggca ggtggcaaaa actacactgg ctatctcgcc 120
aactcctacc catacatgag caatccaccc cagagcgtcg gctgggccac cacagctacc 180
gatctaggct ttgaagacgg caccgaatat caatcggcca acatcatctg ccaccgagat 240
ggcaagaatg ccgcactctc tgcacccgtc accgcaggct ccaaggtgga aatccaatgg 300
acctcatggc cagacagcca ccatggtccc gtcatcacat accttgcctc ctgtggtgga 360
gactgcagca cagtcgacaa gaccacgctc aagttcttca agatcgatga ggccggtctg 420
attgatgact ctaaccctcc cggaacgtgg gccacggatc agctcattgc agctggaaac 480
cgatggacgg tgactatccc caagagcatt gcatcgggga actatgtcat gcgtcacgag 540
atcatcgctc ttcattcttc gggttccaag gatggtgcac agaactatcc ccagtgtttg 600
aatctgcagg tcaccggtgg agggagcgct aagcctcagg gtactttggg tgaggctctg 660
tacaaggaca ctgatcctgg cattttgatc aatatctacc agtccttgaa gagctacgtg 720
attcccggtc cagctctgta cagcgcgtga 750
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<221> polpmo1-正向引物序列
<222>（1）…（34）
<400>3
gacgaattcc atggtttcgt ttccagcatt atgg 34
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213>人工序列
<221> polpmo1-反向引物序列
<222>（1）…（53）
<400>4
atagcggccg ctcaatgatg atgatgatga tgcgcgctgt acagagctgg acc 53

Claims (5)

1.一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1，其特征在于：所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种包含权利要求1所述多糖单加氧酶基因polpmo1的重组载体pPIC-polpmo1。
3.一种包含权利要求2所述重组载体pPIC-polpmo1的重组毕赤酵母工程菌株GS115/polpmo1。
4.权利要求1所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在与β-葡萄糖苷酶和醛糖酸内酯酶的协同降解磷酸膨胀纤维素中的应用。
5.权利要求1所述胞外多糖单加氧酶PoLPMO1在降解木质纤维素中的应用。
CN201611055736.4A 2016-11-25 2016-11-25 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用 Pending CN106544329A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611055736.4A CN106544329A (zh) 2016-11-25 2016-11-25 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611055736.4A CN106544329A (zh) 2016-11-25 2016-11-25 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106544329A true CN106544329A (zh) 2017-03-29

Family

ID=58395333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611055736.4A Pending CN106544329A (zh) 2016-11-25 2016-11-25 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106544329A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753741A (zh) * 2018-03-28 2018-11-06 天津科技大学 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用
CN110093326A (zh) * 2019-05-06 2019-08-06 南京林业大学 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105238704A (zh) * 2015-11-18 2016-01-13 中国农业科学院饲料研究所 一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
CN105274011A (zh) * 2015-11-18 2016-01-27 中国农业科学院饲料研究所 一种提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105238704A (zh) * 2015-11-18 2016-01-13 中国农业科学院饲料研究所 一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
CN105274011A (zh) * 2015-11-18 2016-01-27 中国农业科学院饲料研究所 一种提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "GenBank: KJ955477.1：Penicillium oxalicum cellulose monooxygenase gene，complete cds", 《GENBANK》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753741A (zh) * 2018-03-28 2018-11-06 天津科技大学 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用
CN108753741B (zh) * 2018-03-28 2020-01-10 天津科技大学 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用
CN110093326A (zh) * 2019-05-06 2019-08-06 南京林业大学 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yadav et al. Production, purification, and characterization of thermostable alkaline xylanase from Anoxybacillus kamchatkensis NASTPD13
Kluepfel et al. Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans
CN101573440B (zh) 针对微生物生长调节生物量
Ji et al. Synergy of crude enzyme cocktail from cold-adapted Cladosporium cladosporioides Ch2-2 with commercial xylanase achieving high sugars yield at low cost
Sudan et al. Production and biochemical characterization of xylanase from an alkalitolerant novel species Aspergillus niveus RS2
CN105431534A (zh) β－1，3－葡聚糖酶、多核苷酸、重组载体、转化体、β－1，3－葡聚糖酶的制造方法、酶制剂及低分子化裸藻淀粉的制造方法
Odeniyi et al. Production characteristics and properties of cellulase/polygalacturonase by a Bacillus coagulans strain from a fermenting palm-fruit industrial residue
Yoo et al. Understanding β‐mannanase from Streptomyces sp. CS147 and its potential application in lignocellulose based biorefining
CN104975039A (zh) 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
CN106544329A (zh) 一种胞外多糖单加氧酶PoLPMO1及其应用
Adıgüzel et al. Production and characterization of partially purified thermostable endoxylanase and endoglucanase from novel Actinomadura geliboluensis and the biotechnological applications in the saccharification of lignocellulosic biomass
US9074200B2 (en) Method for recycling enzyme
AU2013279289B2 (en) Production of enzymes for ligno-cellulosic biomass
Elshafei et al. Purification and properties of an endoglucanase of Aspergillus terreus DSM 826
CN106520726B (zh) 一种胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用
CN103275954A (zh) 一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用
Lepcha et al. Thermoxylanolytic and thermosaccharolytic potential of a heat adapted bacterial consortium developed from goat rumen contents
Cruz et al. Optimization of food-waste based culture medium for cellulase production by thermophilic Bacillus sp SMIA-2 and effect of divalent metal ions on activity and stability of the enzyme at higher temperatures
Sajith et al. Production and partial purification of cellulase from a new isolate, Penicillium verruculosum BS3
Kumar et al. Purification, characterization and gene encoding of xylanase produced from Bacillus tequilensis SH0 isolated from compost using low cost wheat bran as substrate
KR101482663B1 (ko) 신규한 다당류 분해활성을 갖는 셀룰로파가 속 균주 및 이의 용도
Magrey et al. Cellulases for biofuel: A review
Sujatha et al. Optimization and characterization of cellulases from thermophilic strain of Scytalidium thermophilum SKESMBKU01
Mosina et al. Screening, Production and Partial Characterization of Xylanases from Woodchips Fungi with Potential Application in Bioethanol Production
Malik Degradation of Plant Polymers by Cellulase and Xylanase Haloextremozymes from Marine Haloarchaea

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170329

RJ01 Rejection of invention patent application after publication