CN115927511A

CN115927511A - 一种制备壳寡糖的方法

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Publication number: CN115927511A
Application number: CN202210956120.3A
Authority: CN
Inventors: 苏海鹏; 毛相朝; 孙建安; 贾真荣; 王永臻; 赵强; 郭超然; 贺晨曦
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种制备壳寡糖的方法：（1）取壳聚糖，在2.0～2.5 MPa的蒸汽压力下爆破4分钟后快速降压，得到预处理的壳聚糖；（2）向浓度为2%～10%的预处理的壳聚糖溶液中加入SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶CsnBUT，在50～58℃条件下孵育20～80小时，得到降解产物，降解产物中包括壳二糖、壳三糖和壳四糖，以壳三糖为主。本发明的壳寡糖的制备方法，可高效地降解壳聚糖，过程中不使用酸，绿色无污染；制备得到的壳寡糖中壳三糖的纯度高，可大大减少寡糖精制过程后期产品分离纯化的耗时和操作成本。本发明的方法可一步制备生产具有理想DP的COS，具有巨大的经济效益。

Description

一种制备壳寡糖的方法

技术领域

本发明涉及一种制备壳寡糖的方法，属于壳寡糖的制备技术领域。

背景技术

壳聚糖酶作为一类糖苷水解酶，常用于酶法水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键，并导致生成壳寡糖（COSs）。COSs是功能性生物活性物质，在植物生长中表现出优异的功能，在促进人体健康方面，如抗肿瘤、降低胆固醇、增强免疫等，也表现出优异的功能，已广泛应用于医药、食品、农业、化妆品等领域。COSs的功能很大程度上取决于它们的聚合度（DPs）。然而，在壳聚糖生物转化生产COSs的过程中，具有挑战性的问题是：由于高聚合度、高疏水性、结构的高度有序性及广泛的氢键网络结构，导致壳聚糖在具有晶体结构的水中的溶解度差，这形成了防御直接酶降解的堡垒。因此，为提高壳聚糖的酶促可及性，使其更容易促进壳聚糖转化，预处理成为降低壳聚糖结晶度和提高孔隙率的关键步骤。现有技术中普遍采用的预处理方法是溶解在稀酸溶液中制备胶体壳聚糖，然而，由于酸对环境的污染，酶解前制备胶体壳聚糖的应用受到限制。因此，开发绿色的壳聚糖加工技术，对于壳聚糖的酶解和COSs的高质和高值转化具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种制备壳寡糖的方法，该方法效率高，所得壳寡糖的纯度高，聚合度特定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：

（1）取壳聚糖，在2.0～2.5 MPa的蒸汽压力下爆破4分钟后快速降压，得到预处理的壳聚糖；

（2）向浓度为2%～10%的预处理的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，在50～58℃条件下孵育20～80小时，得到降解产物，降解产物中包括壳二糖、壳三糖和壳四糖，以壳三糖为主；

所述壳聚糖酶选自壳聚糖酶 CsnBUT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述爆破压力为2.4 MPa。

进一步地，所述预处理的壳聚糖溶液的浓度为2%、4%或6%。

进一步地，所述预处理的壳聚糖溶液是将预处理的壳聚糖加入pH为5.0的乙酸盐缓冲液中而得到的。

进一步地，所述壳聚糖酶 CsnBUT的用量为6～12 U/mL。

进一步地，壳聚糖酶 CsnBUT的降解条件为：55℃、220 rpm摇床条件下孵育48小时。

最优选的，步骤如下：

（1）取脱乙酰度为90%的壳聚糖，在2.4 MPa的蒸汽压力下爆破4分钟后快速降压，得到预处理的壳聚糖；

（2）向90μl的浓度为6%的预处理的壳聚糖溶液中加入10μl的比酶活为89.78 U/mL的壳聚糖酶 CsnBUT溶液，在55℃、220 rpm摇床条件下孵育48小时，得到降解产物，降解产物中壳三糖的纯度为98.6%；

所述预处理的壳聚糖溶液是通过以下方法制备得到的：将预处理的壳聚糖加入pH为5.0的乙酸盐缓冲液中，均质化，即得。

本发明的壳寡糖的制备方法，通过蒸汽爆破方法对壳聚糖粉末进行处理，强大的爆炸穿透力改变了壳聚糖纤维的微观结构，并产生了微小的裂纹，而对壳聚糖分子没有实质性的破坏，便于进一步水解（与爆破处理前相比，爆破处理后的壳聚糖48小时的水解效率提高了5.4倍）。采用壳聚糖酶CsnBUT降解蒸汽爆破处理后的壳聚糖，效率高，且降解产物以壳三糖为主。本发明采用枯草芽孢杆菌表达系统制备壳聚糖酶CsnBUT，发酵液离心即可直接获得壳聚糖酶CsnBUT，无需复杂的提取纯化过程。

本发明的壳寡糖的制备方法，可高效地降解壳聚糖，过程中不使用酸，绿色无污染；制备得到的壳寡糖中壳三糖的纯度高（可达98.6%），可大大减少寡糖精制过程后期产品分离纯化的耗时和操作成本。本发明的方法可一步制备生产具有理想DP的COS，是壳三糖生产的理想选择，具有巨大的经济效益和低环境影响。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：壳聚糖酶CsnBUT的最适条件示意图，其中，（a）为最适温度和温度稳定性；（b）为最适pH和pH稳定性。

图2：壳聚糖酶CsnBUT降解壳四糖、壳五糖和壳六糖的产物TLC示意图，其中，（a）为壳四糖；（b）为壳五糖；（c）为壳六糖。

图3：壳聚糖粉末经蒸汽爆破预处理后的扫描电镜示意图，其中，（a）表示0 MPa处理的样品（×500）；（b）表示0 MPa处理的样品（×5000）；（c）表示1.6 MPa处理的样品（×500）；（d）表示1.6 MPa处理的样品（×5000）；（e）表示1.8 MPa处理的样品（×500）；（f）表示1.8 MPa处理的样品（×5000）；（i）表示2.0 MPa处理的样品（×500）；（j）表示2.0 MPa处理的样品（×5000）；（k）表示2.2 MPa处理的样品（×500）；（l）表示2.2 MPa处理的样品（×5000）；（m）表示2.4 MPa处理的样品（×500）；（m）表示2.4 MPa处理的样品（×5000）。

图4：未经处理和处理过的壳聚糖的结构表征，其中，（a）为FTIR光谱；（b）为X射线衍射图谱。

图5：壳聚糖酶降解蒸汽爆破处理的壳聚糖粉末的示意图，（a）壳聚糖酶酶解不同爆破压力下（0、1.6MPa、1.8MPa、2.0MPa、2.2MPa、2,4MPa）处理的壳聚糖粉末24 h和48 h时的还原糖生成量示意图；（b）壳聚糖酶水解2.4 MPa压力下处理的壳聚糖的时间进程曲线示意图。

图6：液质分析蒸汽爆破处理壳聚糖（浓度2%）获得的水解产物，峰上标记的数字表示具有不同 DP的COS。

图7：液质分析蒸汽爆破处理壳聚糖（浓度4%）获得的水解产物，峰上标记的数字表示具有不同 DP的COS。

图8：液质分析蒸汽爆破处理壳聚糖（浓度6%）获得的水解产物，峰上标记的数字表示具有不同 DP的COS。

图 9：液相分析蒸汽爆破处理壳聚糖（浓度6%）获得的水解产物，Standard为标准品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

实施例1 壳聚糖酶CsnBUT的枯草表达

本发明的壳聚糖酶CsnBUT的产酶基因为人工合成序列。表达在大肠杆菌中的美国能源部联合基因组研究所（JGI）测序的 Butyrivibrio sp. MC2013（ID：2524614713）的壳聚糖酶基因，发明人根据宿主枯草芽孢杆菌的密码子偏好性，进行了密码子优化，用于在枯草芽孢杆菌中进行高效表达。优化后的壳聚糖酶OUC-CsnPa基因包含有903个碱基，如SEQ IDNO.2所示，编码301个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MRKEKNKLSM VLLAAAILAA VILRFGTDEL LASRYLHDRT SASDPARQGD DPDRASGENISEGRLRQTVM SLVTSAENSS LDYTRQYGYI EDIGDGRGYT GGIIGFTTGT ADLLDVVEVY VALKPDNNGLKKYIPALQSA IGSDTHKGLG QAFVNAWKAA AQDREMIEAQ DTILDEMYMK PSVEMAVKDG LSPLGQYIYYDAMVVHGPGE DGLSFGGIRK EAMKNEKTPS QGGDEAEYLR AFLTARTSVM LTEEAHSDLS RLQAQSKFIDEGKYNLELPL KWNMYGDDFE LTEAKLKAIA K。

SEQ ID NO.2：

5’- TTTAGCGATAGCTTTCAGTTTAGCTTCGGTCAGTTCGAAGTCGTCACCGTACATGTTCCATTTCAGCGGCA

GTTCCAGGTTGTATTTACCTTCGTCGATGAATTTAGACTGAGCCTGCAGACGAGACAGGTCAGAGTGAGCTTCTTCGGTCAGCATAACAGAGGTACGAGCGGTCAGGAAAGCACGCAGGTATTCAGCTTCGTCACCACCCTGAGACGGGGTTTTTTCGTTTTTCATAGCTTCTTTACGGATACCACCGAAAGACAGACCGTCTTCACCCGGACCGTGAACAACCATAGCGTCGTAGTAGATGTACTGACCCAGCGGAGACAGACCGTCTTTAACAGCCATTTCAACAGACGGTTTCATGTACATTTCGTCCAGGATGGTGTCCTGAGCTTCGATCATTTCACGGTCCTGAGCAGCAGCTTTCCAAGCGTTAACGAAAGCCTGACCCAGACCTTTGTGGGTGTCAGAACCGATAGCAGACTGCAGAGCCGGGATGTATTTTTTCAGACCGTTGTTGTCCGGTTTCAGAGCAACGTAAACTTCAACAACGTCCAGCAGGTCAGCGGTACCGGTGGTGAAACCGATGATACCACCGGTGTAACCACGACCGTCACCGATGTCTTCGATGTAACCGTACTGACGGGTGTAGTCCAGAGAAGAGTTTTCAGCAGAGGTAACCAGAGACATAACGGTCTGACGCAGACGACCTTCAGAGATGTTTTCACCAGAAGCACGGTCCGGGTCGTCACCCTGACGAGCCGGGTCAGAAGCAGAGGTACGGTCGTGCAGGTAACGAGAAGCCAGCAGTTCGTCGGTACCGAAACGCAGGATAACAGCAGCCAGGATAGCAGCAGCCAGCAGAACCATAGACAGTTTGTTTTTTTCTTTACGCAT -3’。

全基因合成上述基因片段。然后以合成的基因片段为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物片段。

PCR扩增得到的基因片段与pP43NMK（+）载体无缝连接，转入大肠杆菌进行电泳和DNA测序确认。将重组载体电转化至枯草芽孢杆菌WB800，筛选得到阳性转化子，即为产壳聚糖酶CsnBUT的工程菌。工程菌接种至LB液体培养基中，30℃培养30小时。发酵液在4℃、8500 g条件下离心20分钟，得上清液，其中含有壳聚糖酶CsnBUT，备用。

实施例2 壳聚糖酶CsnBUT比酶活的测定

使用二硝基水杨酸（DNS）法检测还原糖的释放来确定壳聚糖酶的活性，具体操作如下：将10μl的上清液（实施例1制备）、190μl的胶体壳聚糖溶液（向醋酸溶液中加入壳聚糖制备而成，其中，醋酸的浓度为0.01 g/ml，壳聚糖的浓度为0.02 g/ml）和800μl的缓冲液（pH为5.0的柠檬酸盐缓冲液）混合，在55℃下孵育15分钟。取200μl反应液，添加300μl的DNS试剂停止孵育，沸水浴煮沸10分钟以显色，检测540 nm处的吸光度值。一个单位（U）的壳聚糖酶活性定义为：每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量。经测定，上清液的壳聚糖酶活力为89.78 U/mL，大于大肠杆菌表达的19.08 U/mL。

实施例3 壳聚糖酶CsnBUT最适反应条件的测定

最适温度的测定：在30～80℃范围内，按照实施例2的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同温度下的相对酶活力，结果如图1所示，最适反应温度为55℃。

温度稳定性的测定：将上清液与缓冲液（pH为5.0的柠檬酸盐缓冲液）混合，在30～80℃范围内保温3小时，然后加入胶体壳聚糖溶液，按照实施例2的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同温度下保温3小时后的相对酶活力，结果如图1所示。

最适pH的测定：在pH 3.0～10.0范围内（所使用的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），按照实施例2的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同pH下的相对酶活力，结果如图2所示，最适pH为5.0。

pH稳定性的测定：将上清液与不同pH的缓冲液（pH 3.0～10.0范围内）混合，37℃下保温3小时，然后加入胶体壳聚糖溶液，按照实施例2的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同pH下存放3小时后的相对酶活力，结果如图2所示。

实施例4 壳聚糖酶CsnBUT降解产物的测定

使用壳四糖、壳五糖、壳六糖作为底物表征水解产物来研究壳聚糖酶CsnBUT的水解模式，具体操作如下：

分别将壳四糖、壳五糖、壳六糖加入缓冲液（pH为5.0的柠檬酸盐缓冲液）中，制备浓度为2 mg/ml的壳寡糖溶液，备用。

5μl的实施例1的上清液，与95μl的壳寡糖溶液混合，在50℃条件下孵育不同时间（0.5 h，1 h，2 h，4 h），煮沸10分钟以终止反应。将等分试样点在以异丙醇/氨水（体积比2:1）作为溶剂展开的TLC板上。喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，110℃加热5分钟，使产品可视化，结果如图2所示，壳聚糖酶CsnBUT的最小酶解底物为壳五糖。

实施例5 蒸汽爆破处理壳聚糖

壳聚糖粉末样品（上海源叶，BR，脱乙酰度90%）在 QB-200B ICSE 装置（GentleScience & Technology Co., Ltd.，河南，中国）中、在不同蒸汽压力（1.6、1.8、2.0、2.2 和2.4 MPa）下通过蒸汽预处理。将等量（100 g）的壳聚糖粉末样品放入装有饱和蒸汽的腔室中，并分别在上述蒸汽压力下处理4分钟，然后快速卸压（时间0.0875 s内）。反应器从室温到爆炸温度的加热时间尽可能短。得到的处理后的样品置于通风干燥箱中，在 60℃下干燥至恒重。作为对照，对原料壳聚糖粉末在0 MPa下进行相同的干燥程序。结果如图3所示。

实施例6 蒸汽爆破壳聚糖的表征

对实施例5制备的处理壳聚糖继续表征：壳聚糖粉末经受不同爆炸压力，系统研究了其结构和形态特性的变化。图3显示了原始壳聚糖粉末和由蒸汽爆破的处理样品的SEM显微照片。两种放大倍数下的观察和比较表明，蒸汽爆破处理引起了明显的形态变化。未经处理的壳聚糖粉末，其表面致密有序，表现出紧凑的形态，具有相对光滑、平坦和整洁的结构，限制了壳聚糖酶的可及性。1.6 MPa处理的样品具有轻微卷曲裂纹以及纤维网络松动的特征（图 3 c、d）。当压力增加到2.0 MPa时，处理过的样品出现纤维细枝和无定形以及纤维组织的紧密裂缝（图3 i、j）。当蒸汽爆破过程的严重程度增加时，SE过程中获得的粗糙度会更加强烈，并且壳聚糖样品会随着更高的压力而被破坏并变得不均匀、凸起和凌乱。在2.4MPa的 SE处理后，更高放大倍数的图像（图3 n）显示带刺的纤维树枝排列成不规则且明显撕裂的表面。处理对结构带来了脉冲影响，导致分离和暴露的纤维含有多个空洞和撕裂，从而提高了壳聚糖对酶的可及性。

ATR-FTIR 对压力 (MPa 0, 1.6, 2.0, 2.4) 处理样品的表征（如图4 a）表明了壳聚糖的所有特征峰（即O-H、C-H和 C-O伸缩振动），观察到，包含3277 cm^-1处的吸收峰归因于氢键 OH拉伸或NH振动，这表明壳聚糖的功能组分在SE预处理后没有被破坏。特别是，壳聚糖对应的光谱在2871 cm^-1处呈现C-H拉伸振动，在1651cm^-1处出现的谱带对应于酰胺Ⅰ的C=O。观察到的特征振动谱带在1599 cm^-1附近和1378 cm^-1通常分配给酰胺Ⅱ的N-H弯曲振动和酰胺Ⅲ的C-N拉伸振动。经不同压力SE处理的样品在3200 cm^-1～3400 cm^-1处的谱带强度减弱归因于氢键O-H拉伸和N-H振动，因为酰胺Ⅱ的特征峰强度降低，说明氨基之间的氢键断裂。随着处理强度从0增加到2.4 MPa，在处理过的PC样品中，归因于对称-NH³⁺弯曲区域的1418 cm^-1附近的谱带强度降低，这可以评估PC样品分子间氢键的损失。这些结果表明，蒸汽爆破处理后壳聚糖的功能成分没有被破坏，而是有效地破坏了氢键网络。然而，与原生壳聚糖粉末的光谱相比，蒸汽爆破预处理壳聚糖粉末差异很小，说明蒸汽爆破对壳聚糖的草图没有造成明显的破坏。

结晶度显著影响壳聚糖形成的紧密结晶区域的强度和刚度。如不同壳聚糖样品的XRD谱图所示（如图4 b），在12°和20°处观察到两个显着的2θ峰，分别对应于（020）和（110）平面，这表明壳聚糖的晶体结构致密很难直接酶解。蒸汽爆破处理后，12°和 20°峰向左移动，表明壳聚糖中两个相邻晶格平面之间的间距略有增加。在SE处理后，上述峰的相对强度降低，半峰全宽（FWHM）值（Jade 6.5）的增量n很明显，表明壳聚糖的结晶度在SE过程中被破坏。应注意预处理过程的控制，否则结晶度可能会增加。

实施例7 蒸汽爆破壳聚糖的酶解

为了评估蒸汽爆破的效率，使用壳聚糖酶 CsnBUT 水解蒸汽爆破处理的样品，具体操作如下：

将实施例5中用不同压力预处理的样品，加入醋酸盐缓冲液（pH 5.0）中，样品浓度为0.02 g/ml，使用便携式均质器进行均质化，以保持均匀性，作为底物溶液。

向90μl的底物溶液中加入10μl的上清液（实施例1制备）（加入后壳聚糖酶 CsnBUT的酶活为8.978 U/mL），在55℃、220 rpm摇床条件下孵育72小时，在第24小时、48小时时取样，使用DNS测定法测量还原糖含量，进行三次平行试验，取平均值。不同处理压力下，以最高还原糖量作为100%，其他处理压力下还原糖的产生量作百分比值，结果如图5 a所示。

图5a结果表明，蒸汽爆破处理后的壳聚糖粉末转化产生的还原糖量显著增加，2.4MPa处理达到了最佳水解，其产量相比原始壳聚糖粉末提高了5.4倍（24 h，6.3倍），蒸汽爆破处理对酶解结晶壳聚糖粉末有显著影响。特别是，将压力从 1.6 MPa增加到2.4 MPa显着提高了水解性能，表明蒸汽爆破有效地处理了壳聚糖粉末，从而提高了壳聚糖的酶促可及性。

用2.4 MPa的蒸汽爆破处理的样品的水解过程的代表性时间曲线如图5 b 所示。在初始阶段，COSs的生成量迅速增加，48 h后达到平衡，最高COSs含量达到2 g/L。可以认为，壳聚糖酶促降解成COS的显著改善可能与壳聚糖的外表面、孔隙率和结晶度有关。与传统方法相比，这种绿色预处理可以减少最初需要的导致环境污染和产品分离的酸。

实施例8 壳寡糖的定向制备

通过壳聚糖酶CsnBUT降解2.4 MPa处理的壳聚糖粉末可控地制备具有理想聚合度的COS，具体操作如下：

将实施例5中用2.4 Mpa预处理的样品，加入醋酸盐缓冲液（pH 5.0）中，样品浓度分别为0.02 g/ml、0.04 g/ml、0.06 g/ml（即2%、4%、6%），使用便携式均质器进行均质化，以保持均匀性，作为底物溶液。

向90μl的底物溶液中加入10μl的上清液（实施例1制备）（加入后壳聚糖酶 CsnBUT的酶活为8.978 U/mL），在55℃、220 rpm摇床条件下孵育48小时。煮沸终止反应，12000 rpm离心2分钟，0.22 μm Acrodisc 针头过滤器过滤，得到含有COSs的上清液，通过超高效液相色谱-电喷雾电离-质谱（UHPLC-ESI-MS）进行分析，条件为：正离子模式下的电离，乙腈/水（体积比2:1）的流动相，以及5200 u/s 的扫描速度。对于全扫描 MS分析，光谱记录在m/z 5～1500的范围内。使用Origin软件对 m/z 100～1000 范围内的数据进行分析。

图6、图7、图8显示UHPLC-EIS-MS确定的水解产物组成，来自低浓度SE处理的PC（2%）的水解产物含有二聚体 [(GlcN)₂, (m/z 363.1)]、三聚体 [(GlcN)₃, (m/z 524.1)]和四聚体 [(GlcN) 3-GlcNAc, (m/z 727.1)] 作为最终产品。与来自2%底物的水解产物相比，较高浓度底物的产物分布有一些有趣的变化。随着底物浓度的增加，虽然产物混合物的DP没有变化，但二聚体和四聚体的比例逐渐降低，三聚体成为主要的产物组成。值得注意的是，与4%底物的水解产物相比，在6%蒸汽爆破处理聚糖粉末的水解产物中可检测到(GlcN)₃的量增加。在 6%蒸汽爆破处理聚糖粉末的水解产物中，(GlcN)₃成为了主要产物，通过峰面积计算纯度可达98.6%，这表明可以在该条件下生产聚合度为3的纯度较高的COSs。本发明通过控制水解条件下的底物浓度来制备含有COSs且聚合度较高的混合物，优良的产品特性可能使绿色战略成为(GlcN)₃生产的理想选择。这是第一个展示环境友好性并通过一步制备生产（GlcN）₃作为主导产品的报告。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种制备壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）向浓度为2%～10%的预处理的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶 CsnBUT，在50～58℃条件下孵育20～80小时，得到降解产物，降解产物中包括壳二糖、壳三糖和壳四糖，以壳三糖为主；

所述壳聚糖酶 CsnBUT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述爆破压力为2.4 MPa。

3.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述预处理的壳聚糖溶液的浓度为2%、4%或6%。

4.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述预处理的壳聚糖溶液是将预处理的壳聚糖加入pH为5.0的乙酸盐缓冲液中而得到的。

5.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述壳聚糖酶 CsnBUT的用量为6～12 U/mL。

6.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：壳聚糖酶 CsnBUT的降解条件为：55℃、220 rpm摇床条件下孵育48小时。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于，步骤如下：