CN103484508B - 一种提高l-苯丙氨酸基因工程菌产l-苯丙氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种增强大肠杆菌柠檬酸吸收以提高L-苯丙氨酸产量的方法，采用大肠杆菌citT基因并在citT基因上游采用组成性表达启动子，连接至L-苯丙氨酸工程载体中，形成构建质粒，最后将所述构建质粒导入大肠杆菌中，组成性表达citT基因，在培养基中添加柠檬酸或柠檬酸盐，提高工程菌发酵生产苯丙氨酸的能力。含有citT基因的构建质粒通过组成性表达柠檬酸转运蛋白citT基因，可以在好氧条件下吸收柠檬酸，在培养基中添加廉价易得的柠檬酸或柠檬酸盐，大肠杆菌通过三羧酸循环反应生成草酰乙酸，避免乙酸过量积累，同时强化三羧酸循环可为菌体生长提供能量，有利于生产苯丙氨酸。

Description

一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产L-苯丙氨酸的方法

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种大肠杆菌加强柠檬酸或柠檬酸盐吸收调控L-苯丙氨酸合成的方法。

技术背景：

芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，只能由微生物和植物经莽草酸途径合成。L-苯丙氨酸作为人体必需氨基酸，是氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分，也是用于商业生产上的重要氨基酸。其中L-苯丙氨酸目前最主要的用途是合成阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲酯），在其消费构成中约占90%。阿斯巴甜已在全球100多个国家和地区获准使用，应用于6000多种饮料、食品和医药等产品中，对于L-苯丙氨酸年需求量已超过1.5万吨。

大肠杆菌作为基因工程的重要宿主，其遗传背景清楚，经过代谢改造已成为发酵生产苯丙氨酸的主要方法。目前研究L-苯丙氨酸生产菌株代谢改造许多都是增加PEP和E4P的供给，将代谢流导向DAHP，提高产量。苯丙氨酸的生成大量消耗PEP，减少PEP生成草酰乙酸的代谢流，从而影响大肠杆菌的三羧酸循环与菌体生长，最终影响苯丙氨酸的生成量。如何让大肠杆菌在培养基中有效吸收利用柠檬酸，增强三羧酸循环，可提高循环过程中草酰乙酸的生成，草酰乙酸与乙酰辅酶A通过缩合反应有效将代谢流导入三羧酸循环，同时减少乙酰辅酶A生成乙酸流量，有利于苯丙氨酸的合成。

发明内容

本发明拟对大肠杆菌导入柠檬酸转运蛋白基因citT基因，加强柠檬酸吸收调控苯丙氨酸合成。在大肠杆菌以葡萄糖为碳源发酵生产苯丙氨酸的过程中，当苯丙氨酸大量生成时，大部分前体物质PEP流向苯丙氨酸代谢途径，PEP向三羧酸循环流量减少，这样直接导致草酰乙酸量减少，同时葡萄糖吸收过程中会产生大量丙酮酸，丙酮酸进一步转化乙酰辅酶A，草酰乙酸量的大量减少使得与乙酰辅酶A的缩合反应减缓，在生长的一定阶段会使得乙酰辅酶A积累，并转化为乙酸，乙酸作为一种副产物会限制菌体生长和目的产物合成。若大肠杆菌利用外加的柠檬酸可加强三羧酸循环，从而提高循环过程中草酰乙酸的生成，使得草酰乙酸的与乙酰辅酶A通过缩合反应有效将代谢流导入三羧酸循环，同时减少乙酰辅酶A生成乙酸流量，有利于苯丙氨酸的合成。但大肠杆菌在好氧条件下并不能从细胞外吸收柠檬酸而加以利用。本发明拟通过基因改造，使得大肠杆菌组成性表达柠檬酸转运蛋白基因citT基因，可在好氧条件下吸收柠檬酸或柠檬酸盐，加强三羧酸循环反应，从而提高苯丙氨酸产量。

一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产L-苯丙氨酸的方法：采用大肠杆菌citT基因，并在citT基因上游加上组成性启动子，连接至L-苯丙氨酸工程载体中，形成构建质粒，最后将所述构建质粒导入大肠杆菌中，组成性表达citT基因，在培养基中添加柠檬酸或柠檬酸盐，发酵生产苯丙氨酸。

该方法包括以下几个步骤：

（1）：采用大肠杆菌citT基因并在citT基因上游采用组成性表达启动子，连接至L-苯丙氨酸工程载体中，形成构建质粒，所构建的质粒为包含citT基因的质粒。citT基因及上游启动子可采用已知的实验方法获得，包括但不限于化学合成或PCR（聚合酶链式反应）；质粒构建可采用已知的实验方法进行。

（2）：将所构建的含有citT基因的质粒导入大肠杆菌中，在培养基中添加柠檬酸或柠檬酸盐发酵生产苯丙氨酸，柠檬酸或柠檬酸盐浓度范围为大于0g/L小于30g/L。

本发明具有以下有益效果：

含有citT基因的构建质粒通过组成性表达柠檬酸转运蛋白citT基因，可以在好氧条件下吸收柠檬酸，在培养基中添加廉价易得的柠檬酸或柠檬酸盐，大肠杆菌通过三羧酸循环反应生成草酰乙酸，避免乙酸过量积累，同时强化三羧酸循环可为菌体生长提供能量，有利于生产苯丙氨酸。

附图说明

图1为大肠杆菌苯丙氨酸的合成代谢途径：G6P：6-磷酸葡萄糖；PYR：丙酮酸；PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：赤藓糖-4-磷酸；DAHP：3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；OAA：草酰乙酸；AcoA：乙酰辅酶A；CIT：柠檬酸；TCA：三羧酸循环；pck：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；ppc：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pykA：丙酮酸激酶II；pykF：丙酮酸激酶I

具体实施方式：

步骤一：含citT基因的质粒构建，具体方法如下：

（1）扩增citT基因

根据NCBI公布大肠杆菌的基因组序列，设计citT基因扩增引物如下，并委托生物工程（上海）有限公司利用DNA合成仪合成：

CitF1:GGAAGCTAAAATGTCTTTAGCAAAAGATAATA

CitR2:CAGTCTAGAGGAACTCATACATACACTGAATAC

采用基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组DNA，以此为模板进行PCR，扩增citT基因，反应体系如下：

反应条件如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸3min30s，扩增30个循环，72℃10min。

PCR扩增反应结束后，对PCR产物进行电泳切胶回收，得PCR产物1。

(2)启动子PCR扩增

设计引物，以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素抗性基因上游的组成型启动子，引物如下：

citPF:AGTGATTCTAAATCCTGGTGTCC

citPR:CTAAAGACATTTTAGCTTCCTTAGCTC

反应体系如下：

反应条件如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，扩增25个循环，72℃10min。

PCR扩增反应结束后，对PCR产物进行电泳切胶回收得PCR产物2。

（3）overlapPCR（重组PCR）

采用overlapPCR连接PCR产物1和PCR产物2，反应体系如下：

反应条件如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸3分30秒，扩增30个循环，72℃10min。

PCR扩增反应结束后，对PCR产物进行电泳切胶回收得PCR产物3。

（4）质粒载体和目的片段的酶切、连接

将质粒载体PMCW与PCR产物3分别采用EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切，其中PMCW为L-苯丙氨酸工程载体，含L-苯丙氨酸合成所需的功能基因。将酶切产物进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，将平板上长出来的菌落挑取单菌落进行提质粒测序，测序结果显示正确，证明构建成功。将构建好的质粒命名为PMCC。

步骤二：发酵检测

将构建好的质粒PMCC转入大肠杆菌中，以葡萄糖为碳源并在培养基中添加柠檬酸进行摇瓶发酵培养，以含质粒PMCW的大肠杆菌为对照，发酵培养36小时后取上清进行L-苯丙氨酸含量测定。平行实验重复3次。结果显示，含citT基因的菌株比不含citT基因的菌株苯丙氨酸产量有明显提高，提高幅度在5-10%以上。

Claims (1)

1.一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：采用大肠杆菌citT基因并在citT基因上游采用组成性表达启动子，连接至L-苯丙氨酸工程载体中，形成构建质粒，最后将所构建质粒导入大肠杆菌中，组成性表达citT基因，在培养基中添加柠檬酸或柠檬酸盐，发酵生产苯丙氨酸，在大肠杆菌以葡萄糖为碳源发酵生产苯丙氨酸的过程中，柠檬酸或柠檬酸盐浓度范围为大于0g/L小于30g/L。