CN113373077B - 一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用，属于生物降解技术领域。本发明所述的氯霉素高效降解菌的分类命名为海藻希瓦氏菌(Shewanella algae),代号为SA‑cd1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21690。该菌株从花甲螺中分离筛选得到，可以制成菌剂应用在氯霉素的降解中。该降解菌对氯霉素的降解效率极高，且降解条件宽泛，其代谢物可以独立进行快速降解反应，不需要依赖于菌体的生长代谢，具有较大的应用优势和价值。

Description

一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物降解技术领域，具体涉及一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用。

背景技术

氯霉素是一种高效广谱的氯代硝基芳香族抗生素，自1949年大规模人工合成以来，已被广泛应用于人类医药、畜禽及水产兽药等领域。然而，研究者们发现氯霉素可对人体造血机能产生损害而引起再生障碍性贫血，同时对人类具有潜在的致癌性和遗传毒性。氯霉素滥用还会导致耐药细菌及其抗性基因的发生和传播，对生态环境造成严重影响。因此，我国于2002年禁止氯霉素用于食源性动物，但由于其价格低廉、抗菌效果好以及容易获得，所以仍然被大量违法使用。据报道，我国南明河，长江、珠江、芦江、扬子江、博斯腾湖和乌伦古湖等主要水域及其沉积物中均不同程度检出氯霉素残留。含有高浓度氯霉素的工业废水、医院废水以及养殖废水等未经处理或处理效果未达到排放标准即排放至环境中，是引起地表水受氯霉素污染的最主要原因。因此，如何对这些废水中的高浓度氯霉素进行有效的降解清除成为当前急需解决的环境污染防治问题。

目前，降解消除废水中氯霉素的方法包括物理法、化学法和生物法。传统的废水处理工艺(包括絮凝、沉淀、过滤、吸附等)并不能有效去除氯霉素。常见的电催化、光催化、过硫酸盐、亚硫酸盐等高级氧化还原法则需要大量氧化还原试剂和额外的能量投入，且去除效率不高。新型的生物电化学法如微生物燃料电池法和生物阴极法可有效去除氯霉素，但这种方法操作复杂、能耗巨大，不适用于污水的大规模净化处理。而特异性降解菌群处理法，不仅具有高效的降解消除能力，而且操作简单、经济、环保，有些菌群甚至能将氯霉素矿化而不产生任何副产物。

近年来，人们通过驯化分离筛选获得了一些具有氯霉素降解功能的微生物群落或菌株，然而这些菌株或菌群的降解条件苛刻，严重依赖于菌体的生长条件，而且降解时间较长、降解效率较低，难以获得广泛应用。因此，筛选出降解效率更高、降解条件更简单的氯霉素降解菌是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种氯霉素高效降解菌，该降解菌对氯霉素的降解效率极高，且降解条件宽泛，其代谢物可以独立进行快速降解反应，不需要依赖于菌体的生长代谢，具有较大的应用优势和价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种氯霉素高效降解菌，经鉴定属于海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)，代号为SA-cd1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21690，保藏时间为2021年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该氯霉素高效降解菌SA-cd1来源于花甲螺，从花甲螺肉中分离和筛选得到；菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面湿润，细菌革兰氏染色呈阴性，呈短杆状。

本发明的氯霉素高效降解菌对氯霉素具有较高的降解效率，其代谢物也具有很强的降解能力，可以应用在氯霉素的降解中，不仅可以直接应用于工业废水、污水、粪肥、土壤等环境中氯霉素的生物降解，还可作为氯霉素降解工程菌及降解酶研发生产的基础菌源，为环境中氯霉素污染的防治提供宝贵资源。

本发明还提供一种氯霉素高效降解菌剂，是指由所述的氯霉素高效降解菌菌落或保存所述降解菌的瓷珠或所述降解菌的菌悬液在营养肉汤培养基中扩增培养而成的菌悬液。

本发明还提供该氯霉素高效降解菌剂的制备方法，所述培养的条件为，于36℃振荡培养12～48小时，即获得氯霉素高效降解菌剂。其中所述营养肉汤培养基的成分为：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，溶剂为蒸馏水。

本发明的上述氯霉素高效降解菌剂可以应用在氯霉素的降解中。使用时，将氯霉素高效降解菌剂或降解菌的代谢物加入含氯霉素的废水进行降解，或者向粪肥、土壤喷施所述菌剂或降解菌的代谢物进行降解。

进一步地，所述降解的适宜温度条件为36～50℃，适宜的pH条件为6.0～9.0。

进一步地，本发明还提供氯霉素高效降解菌剂的代谢物，该代谢物是上述的降解菌剂通过高速离心去除菌体后的上清液。该代谢物也具备很强的氯霉素降解能力，因此，该氯霉素高效降解菌剂的代谢物也可以应用于氯霉素的降解中。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明首次从花甲螺中分离和筛选得到海藻希瓦氏菌SA-cd1，该海藻希瓦氏菌SA-cd1降解氯霉素的效率极高，0.1mg/L氯霉素5min的降解率达83.8％，降解率随菌液浓度升高而升高，随时间延长而升高；10mg/L氯霉素1h内降解率为92.5％。

2、海藻希瓦氏菌SA-cd1菌剂对氯霉素适宜的降解反应温度和pH条件宽泛，适宜温度范围为36～50℃，50℃为最佳温度，适宜pH范围为6.0～9.0，6.0为最佳pH。与现有文献报道的降解菌相比，无论是在降解效率方面还是降解条件方面均具有更明显的优势。

3、SA-cd1的代谢产物具有独立降解氯霉素的功能，利用其代谢物进行降解反应可不依赖于菌体的生长，具有较大的应用优势和价值。

附图说明

图1是本发明的氯霉素高效降解菌株SA-cd1的革兰氏染色结果；

图2是本发明的SA-cd1菌剂对氯霉素的时间-降解率关系图；

图3是本发明的SA-cd1菌剂对氯霉素的温度-降解率关系图；

图4是本发明的SA-cd1菌剂对氯霉素的pH-降解率关系图；

图5是本发明的SA-cd1菌剂对氯霉素的氯霉素菌剂浓度-降解率关系图；

图6是本发明的SA-cd1菌剂对氯霉素的菌剂含量-降解率关系图。

图7是本发明的SA-cd1菌剂去除菌体后的上清液组与菌剂组的降解率对比图。

图8是本发明的SA-cd1菌剂降解污水时，不同反应时间不同菌剂含量-降解率关系图。

具体实施方式

为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

一、海藻希瓦氏菌SA-cd1的分离和鉴定

1、SA-cd1的分离

(1)样品处理：将含有氯霉素的花甲螺样品去壳，螺肉匀浆后备用。

(2)氯霉素降解菌的驯化培养：取3g匀浆后的螺肉测定氯霉素含量，另取10g匀浆后的螺肉至空培养皿，并置于36℃培养箱中进行驯化培养，每培养24h后取3g匀浆后的螺肉测定氯霉素含量，分析氯霉素的降解情况。

(3)花甲螺螺肉中氯霉素含量的测定方法：参照文献(汪文龙,黄大新,刘军义,罗兆飞,吴玉杰.2009.UPLC-MS/MS测定水产品中氯霉素残留量[J].中国卫生检验杂志,08:1767-1769.)方法进行测定。

(4)螺肉中氯霉素的降解情况：螺肉于36℃驯化培养48h后，其氯霉素含量由4.3mg/kg下降至0.0045mg/kg，降解率达99.9％。证明经过驯化培养后的花甲螺螺肉中产生了高效降解氯霉素的菌株或菌群。

(5)氯霉素降解菌的筛选分离：将培养48h后的螺肉接种至营养琼脂(NA，其成分为蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏3.0g/L，氯化钠5.00g/L，琼脂150g/L，溶剂为蒸馏水，其中另加入氯霉素至其浓度为10mg/L)平板上，于36℃培养24h，挑取单个优势菌落接种至新的营养琼脂NA平板(成分同上)，于36℃培养24h，重复接种筛选2次，挑取单菌落接种至100mL营养肉汤培养基(其成分为：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，溶剂为蒸馏水)，于36℃振荡培养24h，即获得氯霉素高效降解菌菌株，取代号为SA-cd1，用瓷珠法保存该菌株。

2、SA-cd1的鉴定

(1)鉴定处理方法：将SA-cd1菌株革兰氏染色后，用显微镜进行形态学观察。用全自动微生物分析系统对菌株进行生化分析，并利用细菌16S rDNA序列测序来鉴定其种属。

(2)分离鉴定结果：本试验分离筛选获得的菌株代号为SA-cd1，该菌株对氯霉素具有很强的降解能力，菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面湿润，其形态学鉴定结果如图1所示，细菌革兰氏染色呈阴性，呈短杆状。全自动微生物鉴定系统鉴定结果为Shewanella algae(海藻希瓦氏菌)。PCR扩增获得的16S rDNA序列长度为1407bp，如SEQ ID No:1所示，经Gen-Bank比对，结果与海藻希瓦氏菌的同源性高达100％，该菌株已保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21690，代号为SA-cd1，保藏时间为2021年1月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

二、实验室降解实验

1、氯霉素高效降解菌剂的制备

实施例1

将氯霉素高效降解菌SA-cd1的菌落接种至100ml营养肉汤培养基中，于36℃振荡培养24小时，振荡速度为150r/min，即获得氯霉素高效降解菌剂。

实施例2

将保存氯霉素高效降解菌SA-cd1的瓷珠接种至100ml营养肉汤培养基中，于36℃振荡培养24小时，振荡速度为150r/min，即获得氯霉素高效降解菌剂。

实施例3

将氯霉素高效降解菌SA-cd1的100μL菌悬液接种至100ml营养肉汤培养基中，于36℃振荡培养12小时，振荡速度为150r/min，即获得氯霉素高效降解菌剂。

2、SA-cd1菌剂对氯霉素的降解试验

(1)降解反应物中氯霉素含量的测定方法

降解反应物加入乙酸乙酯终止反应后，加入100ng氯霉素-D5内标，加入5g无水硫酸钠，涡旋振荡5min，4000r/min离心5min，取0.5mL上清液于45℃水浴氮气吹干，加入1mL水复溶，过0.22μm滤膜装瓶，用高效液相色谱-串联质谱仪测定，测定条件及参数参照文献(汪文龙,黄大新,刘军义,罗兆飞,吴玉杰.2009.UPLC-MS/MS测定水产品中氯霉素残留量[J].中国卫生检验杂志,08:1767-1769.)方法，用同位素内标法进行定量分析。

(2)反应时间对氯霉素降解率的影响

取10mL实施例1制备的菌剂于50mL无菌管中，共6管，每管加入5mg/L的氯霉素0.2mL，分别于36℃反应1、5、10、20、30、60min后立即加入10mL乙酸乙酯终止反应，测定反应物中氯霉素的含量。另取10mL NB(即营养肉汤，成分与营养肉汤培养基相同)，加入等量氯霉素作为对照组(Ctrl)。重复试验3次。计算氯霉素降解率，绘制菌剂对氯霉素的时间-降解率关系图，结果见图2。可以看出，SA-cd1菌剂对氯霉素的降解率随着反应时间延长而逐渐升高，5min后的降解率即可达到83.8％以上，表明SAcd1降解氯霉素的效率很高。

(3)温度对氯霉素降解率的影响

取10mL实施例1制备的菌剂，共7剂，分别置于4、15、30、40、45、50、60℃适温5min，加入5mg/L的氯霉素0.2mL，于36℃培养10min后加入10mL乙酸乙酯终止反应，测定反应物中氯霉素的含量。另取10mL NB，加入等量氯霉素作为对照组(Ctrl)。试验重复3次。计算氯霉素降解率，绘制菌剂对氯霉素的温度-降解率关系图，结果见图3。结果显示：SA-cd1对氯霉素的降解率随着温度升高而逐渐升高，当温度超过50℃后，降解率开始下降，达到80℃时，降解率接近0，在36～50℃范围内的降解率均较高。

(4)pH对氯霉素降解率的影响

取10mL实施例1制备的菌剂，共7剂，分别用0.2mol/L NaOH溶液或2mol/L HCl溶液调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，然后加入5mg/L的氯霉素0.2mL，于36℃培养10min后加入乙酸乙酯终止反应，测定氯霉素含量。另取10mL NB，加入等量氯霉素作为对照组(Ctrl)。试验重复3次。计算氯霉素降解率，绘制菌剂对氯霉素的pH-降解率关系图，结果见图4。结果显示：在6.0～9.0的pH范围内，SA-cd1的降解率均较高(大于85.7％)，pH继续降低或升高，其降解率均明显下降。

(5)氯霉素底物浓度不同对氯霉素降解率的影响

取10mL实施例1制备的菌剂，共7剂，调pH至6.0，分别加入浓度为0、0.5、1、2.5、5、50、500mg/L氯霉素溶液0.2mL，于50℃培养60min后加入10mL乙酸乙酯终止反应，测定反应物中氯霉素的含量。另取10mL NB，加入5mg/L的氯霉素0.2mL作为对照组(Ctrl)。重复试验3次。计算氯霉素降解率，绘制菌剂对氯霉素浓度-降解率关系图，结果见图5。结果表明：尽管随着底物浓度升高，氯霉素降解率有所降低，但是SAcd1对0.01mg/L～10mg/L浓度范围的氯霉素降解效果均较好，1h内降解率达到92.5％～99.5％。结果提示SAcd1的降解能力较强，可耐受并降解较高浓度的氯霉素。

(6)菌剂含量不同对氯霉素降解率的影响

分别取0、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10mL实施例1制备的菌剂，分别加入10、9.75、9.5、9、7.5、5、0mL NB混匀，则菌剂含量分别为0、2.5％、5％、10％、25％、50％、100％，然后加入5mg/L的氯霉素0.2mL，于36℃培养10min后加入乙酸乙酯终止反应，测定反应物中氯霉素的含量。重复试验3次。计算氯霉素降解率，绘制菌剂对氯霉素的菌剂含量-降解率关系图，结果见图6。结果表明：氯霉素降解率随着菌液含量的增加而逐渐升高，添加含量至10％时，降解率即达91.9％，菌液含量升至25％时，降解率达到最高。

(7)菌剂去除菌体后对氯霉素降解率的影响

取10mL实施例1制备的菌剂于无菌管中作为菌液组，再取10mL菌剂，10000r/min离心10min，将上清液转移至另1无菌管作为上清液组，菌体用10mL无菌水冲洗混匀，高速离心后将水弃去，再加入10mL营养肉汤培养基混匀菌体作为菌体组，另取10mL营养肉汤培养基作为对照组(Ctrl)。向各组加入0.2mL氯霉素(5mg/L)，于36℃培养60min后，加入10mL乙酸乙酯终止，测定反应物中氯霉素的含量。重复试验3次。计算氯霉素降解率，绘制各组的降解率对比图，结果见图7。结果显示：与菌液组比较，尽管去除菌体的上清液组氯霉素降解率出现下降，但仍有47.3％的降解率，而菌体组降至了3.8％。该结果表明C-AS菌剂去除菌体后的上清液，即菌体的代谢物，仍然具有很强的氯霉素降解能力。

以上降解试验是以实施例1制备的菌剂进行的，利用实施例2和3制备的菌剂也能达到同样的降解率变化规律和较好的降解效率。

3、SA-cd1菌的降解机制分析

根据以上SA-cd1菌剂对氯霉素的降解试验研究结果，可以发现SA-cd1菌降解氯霉素的反应具有以下几个特点：第一，降解反应非常快速和高效。0.1mg/L氯霉素5min的降解率达83.8％，10mg/L氯霉素1h内降解率达92.5％，延长反应时间可以小幅度提高降解率。第二，降解反应需要适宜的温度和pH条件。SA-cd1菌降解氯霉素反应的适宜温度范围为36～50℃，适宜pH范围为6.0～9.0，在该范围内降解率随着温度升高而升高，50℃为最佳温度；随着PH值增大而有所降低，6.0为最佳pH。当温度过低时，由于参与降解反应的相关酶类物质活性降低从而导致氯霉素降解率显著降低。当温度过高或强酸强碱时，酶类物质活性下降甚至失活，所以降解率显著降低。第三，降解反应效率与底物浓度和菌液含量相关。相同条件下SA-cd1菌的降解率随菌液浓度升高而升高，提高底物浓度，其降解率有小幅度下降。第四，代谢产物具有独立降解氯霉素功能，可不依赖于菌体的生长代谢。这些SA-cd1菌降解氯霉素的反应特征与酶促反应的特征相吻合。由此可以推断，SA-cd1菌降解氯霉素的机制可能是通过产生能够促使氯霉素发生降解反应的酶类物质来达到降解氯霉素的作用。

三、SA-cd1菌剂在污水中氯霉素的降解应用

采集的污水(采自南宁市竹排冲内河)经过氯霉素含量检测(参照降解反应物中氯霉素的含量测定方法)，结果为未检出(<0.1μg/L)。在该污水中添加氯霉素，终浓度为1mg/L，然后取100mL污水于锥形瓶中，共5瓶，分别加入0ml、1ml、2ml、5ml、10ml实施例1中的SA-cd1菌剂，于36℃进行降解反应，每2h取1mL反应物测定氯霉素含量并计算降解率，绘制不同反应时间不同菌剂含量-降解率关系图。结果如图8所示：1％菌剂反应2h，氯霉素降解率为37.9％，反应时间延长，降解率有所上升，6h后上升不再明显，提示菌剂含量较低时，其中的酶物质含量较少，短时间内只能部分降解氯霉素；当菌剂含量增加到5％和10％时，反应2h，氯霉素降解率即可达到96.4％和98.1％，可见随着菌剂含量增加，酶物质增加，污水中氯霉素降解率和降解速率均显著升高。该结果表明SA-cd1菌剂适用于水体中氯霉素的降解净化，使用少量菌剂即可在短时间内达到很高的降解率。利用实施例2和3制备的菌剂也能达到同样的降解效果和降解规律。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 南宁海关技术中心

<120> 一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 海藻希瓦氏菌（Shewanella algae）

<400> 1

atgcagtcga gcggtaacat ttcaaaagct tgcttttgaa gatgacgagc ggcggacggg 60

tgagtaatgc ctgggaattt gcccatttgt gggggataac agttggaaac gactgctaat 120

accgcatacg ccctacgggg gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgctg atggataagc 180

ccaggtggga ttagctagta ggtggggtaa tggctcacct aggcaacgat ccctagctgg 240

tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300

gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca gccatgccgc gtgtgtgaag 360

aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc gaggaggaaa gggtgtaagt taatacctta 420

catctgtgac gttactcgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacggagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggtttgt 540

taagcgagat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaaccg catttcgaac tggcaaacta 600

gagtcttgta gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag 660

gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga cgctcaggca cgaaagcgtg 720

gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc tactcggagt 780

ttggtgtctt gaacactggg ctctcaagct aacgcattaa gtagaccgcc tggggagtac 840

ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900

gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg acatccagag aactttccag 960

agatggattg gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 1020

gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cctatcctta cttgccagcg 1080

ggtaatgccg ggaactttag ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggacgac 1140

gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga 1200

gggttgcgaa gccgcgaggt ggagctaatc tcataaagcc ggtcgtagtc cggattggag 1260

tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgccacggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gctgcaccag 1380

aagtagatag cttaaccttc gggaggg 1407

Claims (9)

1.一种氯霉素降解菌，其特征在于：其分类命名为海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)，代号为SA-cd1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21690。

2.如权利要求1所述的氯霉素降解菌在氯霉素降解中的应用。

3.一种氯霉素降解菌剂，其特征在于：所述菌剂主要是由权利要求1所述的氯霉素降解菌菌落或保存所述降解菌的瓷珠或所述降解菌的菌悬液在营养肉汤培养基中扩增培养而成的菌悬液。

4.如权利要求3所述的氯霉素降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述培养的条件为，于36℃振荡培养12～48小时，即获得氯霉素降解菌剂。

5.如权利要求3所述的氯霉素降解菌剂在氯霉素降解中的应用。

6.如权利要求5所述的氯霉素降解菌剂在氯霉素降解中的应用，其特征在于：所述降解的适宜温度条件为36～50℃，适宜的pH条件为6.0～9.0。

7.如权利要求6所述的氯霉素降解菌剂的应用，其特征在于：所述应用包括将所述氯霉素降解菌剂应用于污水中氯霉素的降解。

8.氯霉素降解菌剂的代谢物，其特征在于：所述代谢物是权利要求3所述的降解菌剂通过高速离心去除菌体后的上清液。

9.如权利要求8所述的氯霉素降解菌剂的代谢物在氯霉素降解中的应用。

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