CN113088510B - 根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法 - Google Patents

根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法。提供了一种根瘤土壤杆菌，已于2020年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805。还提供固定化菌体包括根瘤土壤杆菌，以及包裹所述根瘤土壤杆菌的海藻酸钠。并且提供根瘤土壤杆菌或降解菌剂或固定化菌剂在降解阿奇霉素中的应用。在阿奇霉素与湿菌体重量比为1:3～1:7，经24～36小时降解，阿奇霉素降解率为100％，湿菌体重复利用3次，阿奇霉素降解率仍高达85％以上，而菌体经固定化后，菌体重复利用6次，降解率可达90％以上。该方法具有简单、快速、高效降解高浓度阿奇霉素的特点，在环境保护领域具有潜在应用价值。

Description

根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法。
背景技术
在现代社会，抗生素被使用的越来越多。生物体摄入大量抗生素类药物后除部分被机体代谢外，有40％～90％以原药或初级代谢产物的形式随粪便和尿液排出体外，最终又通过施肥等方式进入土壤环境或者通过渗漏和污水排放进入水体环境。在水体、沉积物和土壤，甚至在蔬菜、奶类和肉类等产品中也发现了抗生素污染和残留。抗生素的污染已经成为了影响人类健康的重大问题，去除环境中的抗生素问题迫在眉睫。
阿奇霉素是一种半合成15元环大环内酯类抗生素，随着阿奇霉素广泛应用于临床，已经产生了阿奇霉素耐药菌，为了去除环境中的阿奇霉素，减少对环境污染。目前对大环内酯类抗生素残留的处理方法主要有高级氧化法、活性炭吸附法、光降解、膜处理法以及微生物法等，而阿奇霉素残留的处理方法集中在高级氧化法。高级氧化法处理阿奇霉素虽然降解率高，但这些理化法处理所需成本高、管理复杂，而微生物降解法相较于其他物理化学的方法，更为简单、成本低廉、二次污染少等显著优点，是一种处理环境污染较好的方法，具有广阔的应用前景。目前还没有有关采用单一微生物高效降解阿奇霉素的方法报道。
发明内容
针对现有技术中未有采用单一微生物高效降解阿奇霉素的现状，本发明提供一种根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，首先提供一种根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，命名为bioyzj0010，已于2020年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌是从梅花根部分离得到的。具体而言是从梅花树根冠处分离得到的纯菌株。
本发明提供的根瘤土壤杆菌不属于现已公开专利和文献菌种中的任何一种，该菌株具有降解阿奇霉素的能力，可用于废水中阿奇霉素的降解。
本发明第二方面，还提供所述根瘤土壤杆菌的16S rDNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
根据本发明中根瘤土壤杆菌的16S rDNA，经blast比对，发现该菌在基因库中相似性高于99.5％的菌株均为根瘤杆菌属，将相似度高于99.5％菌株建立系统发育树，可知该菌为根瘤土壤杆菌属中的Agrobacterium tumefaciens。
本发明第三方面，提供所述根瘤土壤杆菌的获得方法：采集梅花根部肿瘤清洗研磨后涂布含甘露醇的分离培养基上，在30℃培养3-5d，挑取不同菌落划线接种纯化3次，得到纯的菌株。
在本发明的一个实施方式中，所述含甘露醇的分离培养基为：甘露醇10g，NaNO35g，KH2PO40.3g，NaCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.1g，0.1％生物素0.1mL，0.1％结晶紫2mL，0.1％Fe-EDTA 2mL，琼脂15g，水1L。
在本发明的一个实施方式中，采集梅花根部肿瘤清洗研磨的方法为：采集梅花根部肿瘤清洗干净，刮除根表面老化组织，用解剖刀切取新鲜组织1g，用无菌水将表面清洗干净，用8％的次氯酸钠溶液浸泡3分钟，再用75％的酒精浸泡30s，用无菌水清洗3次。经组织置于研钵中研磨后，加入无菌水静置5min，制成悬浊液。
本发明第四方面，提供一种降解菌剂，其基于所述根瘤土壤杆菌获得，将所述根瘤土壤杆菌经种子培养、发酵培养后得到所述降解菌剂。
在本发明的一个实施方式中，进行种子培养所需的种子培养基为：牛肉浸出膏5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.24g，水lL，pH7.0，灭菌后倒斜面备用。
在本发明的一个实施方式中，进行发酵培养所需的发酵培养基为：牛肉浸出膏5g，酵母浸出膏1g，蛋白胨5g，可溶性淀粉3g，蔗糖3g，MgSO4.7H2O 0.24g，ZnSO4.7H2O 0.24g，水lL，pH7.0，灭菌后备用。
在本发明的一个实施方式中，所述降解菌剂的获得方法为：将所述根瘤土壤杆菌经种子培养后所得种子液按体积5％接种量接种到发酵培养基中，于28-35℃(优选为30℃)、搅拌下(优选为200-300rpm，更优选为220rpm)培养24～48(优选为24～36)小时得到降解菌剂，备用。
在本发明的一个实施方式中，所述种子液的获得方法为：挑取1环根瘤土壤杆菌斜面接种到种子培养基中，28-35℃(优选为30℃)、搅拌下(优选为200-300rpm，更优选为220rpm)培养24～36小时后得到种子液，备用。
本发明第五方面，提供一种固定化菌体，包括所述根瘤土壤杆菌，以及包裹所述根瘤土壤杆菌的海藻酸钠。
在本发明的一个实施方式中，所述固定化菌体地获得方法为：
配制海藻酸钠溶液，加热溶解；
配制含CaCl2溶液作为交联剂；
将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；
将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠溶液中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，进行交联，然后清洗，得到固定化菌体。
在本发明的一个实施方式中，所述固定化菌体地获得方法具体为：配制5％海藻酸钠溶液，加热溶解；配制含4％CaCl2作为交联剂；将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，在4℃冰箱交联一段时间后，用无菌水清洗小球后至4℃冰箱中备用。
本发明第六方面，提供所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素的方法为：将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂添加到含有阿奇霉素的样品中，以所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂中的湿菌体计，阿奇霉素与所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂按照重量比1:3～1:7的比例，30℃、150～220rpm降解24～36小时。
在本发明的一个实施方式中，利用高效液相色谱检测阿奇霉素的降解率。
所述高效液相色谱条件为：乙腈：0.05mol/L、pH7.0磷酸盐水溶液(V:V＝10：90)，色谱柱为Hypersil ODS2(5μm、4.6*250mm)，检测波长为210nm，柱温为30℃。阿奇霉素的出峰时间为4.023min，可测定样品中阿奇霉素的含量，并计算出菌株对阿奇霉素的降解率。
在本发明的一个实施方式中，抗菌活性检测的方法为：以进金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希氏菌ATCC25922为测试菌，采用固体平板扩散法检测。
采用本发明的方法，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素的应用中，以阿奇霉素与降解菌剂(以湿菌体计算)按照重量比1:3～1:7的比例进行降解，降解24～36小时，降解率达100％，且降解后的产物无抗金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的活性。降解菌剂重复利用3次的降解率达85％以上。而而菌体经固定化后，即利用固定化菌剂降解阿奇霉素时，菌体重复利用6次，降解率仍达90％以上。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素时，阿奇霉素浓度为0.0％～0.7％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提供了一种利用所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂快速、高效降解阿奇霉素的方法，在阿奇霉素浓度0.0～0.7％，抗生素与湿菌体比为1:3～1:7，经24～36小时降解，阿奇霉素降解率为100％，湿菌体重复利用3次，阿奇霉素降解率仍高达85％以上，而菌体经固定化后，菌体重复利用6次，降解率可达90％以上。该方法具有简单、快速、高效降解高浓度阿奇霉素的特点，可应用于阿奇霉素生产废水处理或被阿奇霉素污染的废水处理，在环境保护领域具有潜在应用价值。
同时，本发明为研究开发抗生素的降解提供了一条高效、经济、环保的方法，为环境中抗生素残留处理提供了一条有益的方法，可应用于抗生素企业、医用或畜牧业废水的处理，降低环境中抗生素的残留。
附图说明
图1、bioyzj0010菌株显微镜观察照片；
图2、bioyzj0010菌株的平板菌落形态图；
图3、bioyzj0010菌株电镜照片；
图4、阿奇霉素及其降解后的HPLC分析。
具体实施方式
本发明第一方面，首先提供一种根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，命名为bioyzj0010，已于2020年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌是从梅花根部分离得到的。具体而言是从梅花树根冠处分离得到的纯菌株。
本发明提供的根瘤土壤杆菌不属于现已公开专利和文献菌种中的任何一种，该菌株具有降解阿奇霉素的能力，可用于废水中阿奇霉素的降解。
本发明第二方面，还提供所述根瘤土壤杆菌的16S rDNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
根据本发明中根瘤土壤杆菌的16S rDNA，经blast比对，发现该菌在基因库中相似性高于99.5％的菌株均为根瘤杆菌属，将相似度高于99.5％菌株建立系统发育树，可知该菌为根瘤土壤杆菌属中的Agrobacterium tumefaciens。
本发明第三方面，提供所述根瘤土壤杆菌的获得方法：采集梅花根部肿瘤清洗研磨后涂布含甘露醇的分离培养基上，在30℃培养3-5d，挑取不同菌落划线接种纯化3次，得到纯的菌株。
在本发明的一个实施方式中，所述含甘露醇的分离培养基为：甘露醇10g，NaNO35g，KH2PO40.3g，NaCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.1g，0.1％生物素0.1mL，0.1％结晶紫2mL，0.1％Fe-EDTA 2mL，琼脂15g，水1L。
在本发明的一个实施方式中，采集梅花根部肿瘤清洗研磨的方法为：采集梅花根部肿瘤清洗干净，刮除根表面老化组织，用解剖刀切取新鲜组织1g，用无菌水将表面清洗干净，用8％的次氯酸钠溶液浸泡3分钟，再用75％的酒精浸泡30s，用无菌水清洗3次。经组织置于研钵中研磨后，加入无菌水静置5min，制成悬浊液。
本发明第四方面，提供一种降解菌剂，其基于所述根瘤土壤杆菌获得，将所述根瘤土壤杆菌经种子培养、发酵培养后得到所述降解菌剂。
在本发明的一个实施方式中，进行种子培养所需的种子培养基为：牛肉浸出膏5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.24g，水l L，pH7.0，灭菌后倒斜面备用。
在本发明的一个实施方式中，进行发酵培养所需的发酵培养基为：牛肉浸出膏5g，酵母浸出膏1g，蛋白胨5g，可溶性淀粉3g，蔗糖3g，MgSO4.7H2O 0.24g，ZnSO4.7H2O 0.24g，水lL，pH7.0，灭菌后备用。
在本发明的一个实施方式中，所述降解菌剂的获得方法为：将所述根瘤土壤杆菌经种子培养后所得种子液按体积5％接种量接种到发酵培养基中，于28-35℃(优选为30℃)、搅拌下(优选为200-300rpm，更优选为220rpm)培养24～48(优选为24～36)小时得到降解菌剂，备用。
在本发明的一个实施方式中，所述种子液的获得方法为：挑取1环根瘤土壤杆菌斜面接种到种子培养基中，28-35℃(优选为30℃)、搅拌下(优选为200-300rpm，更优选为220rpm)培养24～36小时后得到种子液，备用。
本发明第五方面，提供一种固定化菌体，包括所述根瘤土壤杆菌，以及包裹所述根瘤土壤杆菌的海藻酸钠。
在本发明的一个实施方式中，所述固定化菌体地获得方法为：
配制海藻酸钠溶液，加热溶解；
配制含CaCl2溶液作为交联剂；
将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；
将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠溶液中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，进行交联，然后清洗，得到固定化菌体。
在本发明的一个实施方式中，所述固定化菌体地获得方法具体为：配制5％海藻酸钠溶液，加热溶解；配制含4％CaCl2作为交联剂；将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，在4℃冰箱交联一段时间后，用无菌水清洗小球后至4℃冰箱中备用。
本发明第六方面，提供所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素的方法为：将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂添加到含有阿奇霉素的样品中，以所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂中的湿菌体计，阿奇霉素与所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂按照重量比1:3～1:7的比例，30℃、150～220rpm降解24～36小时。
在本发明的一个实施方式中，利用高效液相色谱检测阿奇霉素的降解率。
所述高效液相色谱条件为：乙腈：0.05mol/L、pH7.0磷酸盐水溶液(V:V＝10：90)，色谱柱为Hypersil ODS2(5μm、4.6*250mm)，检测波长为210nm，柱温为30℃。阿奇霉素的出峰时间为4.023min，可测定样品中阿奇霉素的含量，并计算出菌株对阿奇霉素的降解率。
在本发明的一个实施方式中，抗菌活性检测的方法为：以进金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希氏菌ATCC25922为测试菌，采用固体平板扩散法检测。
采用本发明的方法，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素的应用中，以阿奇霉素与降解菌剂(以湿菌体计算)按照重量比1:3～1:7的比例进行降解，降解24～36小时，降解率达100％，且降解后的产物无抗金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的活性。降解菌剂重复利用3次的降解率达85％以上。而而菌体经固定化后，即利用固定化菌剂降解阿奇霉素时，菌体重复利用6次，降解率仍达90％以上。
在本发明的一个实施方式中，所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂在降解阿奇霉素时，阿奇霉素浓度为0.0％～0.7％。
以下实施例中所述分离培养基、斜面培养基、所述种子培养基、所述发酵培养基的配方(重量百分比)如下：
分离培养基：甘露醇10g,NaNO35g，KH2PO40.3g,NaCl 0.2g,MgSO4.7H2O 0.1g,0.1％生物素0.1mL，0.1％结晶紫2mL，0.1％Fe-EDTA 2mL，琼脂15g，水1L。
斜面培养基：牛肉浸出膏5g,蔗糖5g,MgSO4.7H2O 0.24g,水lL，pH7.0，琼脂15g。
种子培养基：牛肉浸出膏5g,蔗糖5g,MgSO4.7H2O 0.24g,水lL，pH7.0。
发酵培养基：牛肉浸出膏5g,酵母浸出膏1g,蛋白胨5g,可溶性淀粉3g，蔗糖3g，MgSO4.7H2O 0.24g，ZnSO4.7H2O 0.24g，水lL，pH7.0。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1菌株的分离和鉴定
在梅花园采集梅花根部肿瘤，清洗干净，刮除根表面老化组织，用解剖刀切取新鲜组织1g，用无菌水将表面清洗干净，用8％的次氯酸钠溶液浸泡3分钟，再用75％的酒精浸泡30s，用无菌水清洗3次。经组织置于研钵中研磨后，加入无菌水静置5min，制成悬浊液，涂布含甘露醇的分离培养基上，在30℃培养3-5d，挑取不同菌落划线接种纯化3次，得到纯的菌株。其中筛选得到了一株菌株bioyzj0010，bioyzj0010菌株显微镜观察照片如图1所示，bioyzj0010菌株的平板菌落形态图如图2所示，bioyzj0010菌株电镜照片如图3所示。菌落在分离培养基上呈圆形突起，边缘整齐，有光泽，粘稠；通过PCR扩增得到一条长约1028bp的16S rRNA序列，经blast比对，发现该菌在基因库中相似性高于99.5％的菌株均为根瘤杆菌属，将相似度高于99.5％菌株建立系统发育树，可知该菌为根瘤土壤杆菌属中的Agrobacterium tumefaciens。该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805。
实施例2降解菌剂的制备
将菌株CGMCC No.19805从甘油管中接种到斜面培养基上进行活化培养，于30℃恒温培养箱内培养3天后，挑取斜面接种到种子培养基中，30℃、220rpm培养24h，以5％的接种量接种于发酵培养基，30℃、220rpm再培养24h，得到了降解菌剂，备用。
实施例3阿奇霉素的高效液相分析方法
配制不同浓度的阿奇霉素标准样品，采用Hypersil ODS2(5μm、4.6*250mm)色谱柱进行分离，以乙腈：0.05mol/L、pH8.2磷酸盐水溶液(V:V＝15：85)洗脱，检测波长为210nm，柱温为30℃，进样10μl。阿奇霉素的出峰时间为4.023min，阿奇霉素线性范围为0.01～8.0g/L,R2为0.995。降解率％＝(降解前阿奇霉素峰面积-降解后峰面积)/降解前峰面积×100％。
实施例4菌体的固定化方法
配制5％海藻酸钠溶液，加热溶解；配制含4％CaCl2作为交联剂；将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；将实施例2中得到的降解菌剂离心后以湿菌体：海藻酸钠溶液1:10(W:W)加入到海藻酸钠溶液中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，在4℃冰箱交联一段时间后，用无菌水清洗小球后至4℃冰箱中备用。
实施例5阿奇霉素降解方法1
将实施例2中得到的降解菌剂中加入阿奇霉素，以阿奇霉素与降解菌剂(以湿菌体计算)按照重量比分别为1:3、1:5、1:7加入阿奇霉素，阿奇霉素的浓度均为0.5％，30℃、220rpm分别降解24、24、24小时，取样经高效液相色谱检测分析，结果见表1，另取一份样品离心后，待测活性，样品编号为1～4(1为降解前0.5％浓度的阿奇霉素，2-4分别为阿奇霉素:菌体＝1:3/1:5/1:7降解后的样品)；从表1可知，阿奇霉素的残留量均为0，即降解率均为100％。
表1菌体比例不同对降解的影响*
阿奇霉素:菌体 降解前峰面积 降解后峰面积 降解率％
1:3 2752 0 100.0
1:5 2752 0 100.0
1:7 2752 0 100.0
实施例6阿奇霉素降解方法2
将实施例2中得到的降解菌剂中加入阿奇霉素，以阿奇霉素与降解菌剂(以湿菌体计算)按照重量比1:5加入不同量的阿奇霉素，阿奇霉素的浓度均为0.2％、0.5％和0.7％，30℃、220rpm分别降解24、24、36小时，经高效液相色谱检测分析，结果见表2,另取一份样品离心后，待测活性，样品编号为5～8(5为降解前0.2％浓度的阿奇霉素，6为浓度0.7％阿奇霉素，7-8分别是阿奇霉素浓度为0.2％和0.7％降解后的样品)；从表2可知，阿奇霉素的残留量均为0，即降解率均为100％。
表2阿奇霉素加量不同对降解的影响
阿奇霉素加量 降解前峰面积 降解后峰面积 降解率％
0.2％ 1122 0 100.0
0.5％ 2752 0 100.0
0.7％ 3870 0 100.0
实施例7阿奇霉素降解方法3
将实施例2中得到的降解菌剂中加入阿奇霉素，以阿奇霉素与降解菌剂(以湿菌体计算)按照重量比1:5加入阿奇霉素，阿奇霉素的浓度为0.5％，30℃、220rpm降解24小时，取样分析；再按照重量比1:5第2次加入阿奇霉素，30℃、220rpm降解24小时，取样分析；按照重量比1:5第3次加入阿奇霉素，30℃、220rpm降解24小时，取样分析。另取一份样品离心后，待测活性，样品编号为9-10(分别为阿奇霉素第2次和第3次加入降解后的样品)。液相分析结果见表3，从表3可知，降解菌剂重复利用3次，其降解率仍可达86.1％。
表3菌体循环利用次数对降解的影响
次数 降解前 降解后 降解率％
1 2752 0 100.0
2 2770 54 98.0
3 2795 386 86.2
实施例8阿奇霉素降解方法4
将实施例2中得到的降解菌剂中，按照实施例4的方法进行包埋，以阿奇霉素与固定化小球(以湿菌体计算)按照重量比1:5加入阿奇霉素，阿奇霉素的浓度为0.5％，溶剂为水，30℃、220rpm降解24小时，取样分析；再按照重量比1:5第2次加入阿奇霉素，30℃、220rpm降解24小时，取样分析；以此类推，共计6次加入阿奇霉素，取样进行高效液相色谱分析，另取一份样品离心后，待测活性，样品编号为11-15(分别为阿奇霉素第2/3/4/5/6次加入降解后的样品)。高效液相色谱分析结果见表4，从表4可知，固定化后的菌体重复利用6次，其降解率仍可达90.1％。
表4固定化菌体循环利用次数对降解的影响
次数 降解前 降解后 降解率％
1 2752 0 100.0
2 2758 0 100.0
3 2764 42 98.5
4 2810 96 96.6
5 2945 168 94.3
6 3170 315 90.1
实施例9、抑菌活性测定
采用固体平板扩散法检测。分别挑取一环金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌于3mLLB液体培养基中，220r/min，37℃培养6-12h，测量OD值，吸取该6-12h菌体培养液于LB固体培养基，菌浓为5×105cfu/ml。待凝固后，用打孔器在板上均匀打孔，孔直径为3mm。将降解后的样品和阿奇霉素对照品定量稀释后分别取20ul于孔中，37℃倒置培养20h后，以游标卡尺测量抑菌圈大小，结果见表5和表6。结果表明，当阿奇霉素完全被降解后，降解产物无抗金黄色葡萄球菌和抗大肠埃希氏菌活性。
表5降解样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性*
Figure GDA0003721039920000111
*样品均稀释100倍
表6降解样品对大肠埃希氏菌的抑菌活性
Figure GDA0003721039920000112
*样品均稀释100倍
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 根瘤土壤杆菌及其固定化菌体和用于降解阿奇霉素的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1028
<212> DNA
<213> 根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400> 1
tcnatggtta ccttgttacg acttcctgag ccaggatcaa actctatggt taccttgtta 60
cgacttcctg agccaggagc aaactgtatg gntacnttgt caccgcatca tgctgatctg 120
cgattactaa cgattccaac ttcatgcact cgagttgcag agtgcaatcc gaactgagat 180
ggcttttgga gattagctcg acatcgctgt ctcgctgccc actgtcacca ccattgtagc 240
acgtgtgtag cccagcccgt aagggccatg aggacttgac gtcatcccca ccttcctctc 300
ggcttatcac cggcagtccc cttagagtgc ccaactaaat gctggcaact aagggcgagg 360
gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc 420
agcacctgtt ctggggccag cctaactgaa ggacaatgtc tccactgccc aaaccccgaa 480
tgtcaagagc tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 540
gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc ccaggcggaa 600
tgtttaatgc gttagctgcg ccaccgaaca gtatactgcc cgacggctaa cattcatcgt 660
ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag 720
cgtcagtaat ggaccagtaa gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat atctacgaat 780
ttcacctcta cactcggaat tccacttacc tcttccatac tcaagatacc cagtatcaaa 840
ggcagttcca gagttgagct ctgggatttc acccctgact taaatatccg cctacgtgcg 900
ctttacgccc agtaattccn aacaacgcta gcccccttcg tattaccgcg gctgctggca 960
cgaagttagc cggggcttct tctccggata ccgtcattat cttctccggt gaaagagctt 1020
tacaaccc 1028

Claims (9)

1.一种固定化菌体，其特征在于，包括根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens），以及包裹所述根瘤土壤杆菌的海藻酸钠；
所述根瘤土壤杆菌已于2020年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805。
2.根据权利要求1所述一种固定化菌体，其特征在于，根瘤土壤杆菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述固定化菌体的获得方法，其特征在于，配制海藻酸钠溶液，加热溶解；
配制含CaCl2溶液作为交联剂；
将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却；
将权利要求1中所述根瘤土壤杆菌或降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠溶液中，混匀，吸取混合液，均匀滴至交联剂中，进行交联，然后清洗，得到固定化菌体；
所述降解菌剂是基于所述根瘤土壤杆菌获得，将所述根瘤土壤杆菌经种子培养、发酵培养后得到所述降解菌剂。
4.根据权利要求3所述固定化菌体的获得方法，其特征在于，配制5%海藻酸钠溶液，加热溶解；配制含4%CaCl2作为交联剂；将海藻酸钠和交联剂灭菌后，冷却至手背感觉不烫；将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂离心所得湿菌体加入到海藻酸钠中，混匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至交联剂中，在4℃冰箱交联一段时间后，用无菌水清洗小球后至4℃冰箱中备用。
5.根据权利要求3所述固定化菌体的获得方法，其特征在于，进行种子培养所需的种子培养基为：牛肉浸出膏 5g，蔗糖 5g，MgSO4·7H2O 0.24g，水l L，pH7.0，灭菌后倒斜面备用。
6.根据权利要求3所述固定化菌体的获得方法，其特征在于，进行发酵培养所需的发酵培养基为：牛肉浸出膏 5g，酵母浸出膏 1g，蛋白胨 5g，可溶性淀粉3 g，蔗糖 3 g，MgSO4·7H2O 0.24 g，ZnSO4·7H2O 0.24 g，水l L，pH 7.0，灭菌后备用。
7.根据权利要求3所述固定化菌体的获得方法，其特征在于，所述降解菌剂的获得方法为：将所述根瘤土壤杆菌经种子培养后所得种子液按体积5%接种量接种到发酵培养基中，于28-35℃、搅拌下培养24~48小时得到降解菌剂。
8.一种根瘤土壤杆菌或降解菌剂或固定化菌剂在降解阿奇霉素中的应用，其特征在于，
所述根瘤土壤杆菌已于2020年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19805；
所述降解菌剂是基于所述根瘤土壤杆菌获得，将所述根瘤土壤杆菌经种子培养、发酵培养后得到所述降解菌剂；
所述固定化菌剂包括根瘤土壤杆菌，以及包裹所述根瘤土壤杆菌的海藻酸钠。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，将所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂添加到含有阿奇霉素的样品中，以所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂中的湿菌体计，阿奇霉素与所述根瘤土壤杆菌或所述降解菌剂或所述固定化菌剂按照重量比1:3~1:7的比例，30℃、150~220 rpm降解24~36小时。
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