CN114657103B - 一种水谷鞘氨醇杆菌及其应用 - Google Patents

一种水谷鞘氨醇杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种水谷鞘氨醇杆菌，该水谷鞘氨醇杆菌的分类命名为水谷鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii.)，所述水谷鞘氨醇杆菌的保藏编号为CGMCC NO.18204。利用该菌株能够有效降解四环素类抗生素，对于降低抗生素引起的环境污染和生态失衡具有重要意义。

Description

一种水谷鞘氨醇杆菌及其应用
技术领域
本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种水谷鞘氨醇杆菌、一种微生物菌剂及其在降解四环素类抗生素中的应用。
背景技术
抗生素是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，是能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。其中，四环素类抗生素是一种广谱抗生素，被广泛应用于农牧养殖业中，其结构稳定，能够在环境中长期赋存，而且不能完全被人体和动物完全代谢。当前已经在多种环境中检测到四环素类抗生素的残留，但是目前获得的四环素类抗生素相关降解菌株和降解基因都十分有限，特别是关于中间代谢产物的进一步降解和残留问题的相关研究尚属空白，四环素类抗生素残留造成的药害问题已经严重影响土壤生态环境健康安全，严重影响了农业绿色可持续发展。
因此，亟需提供一种能够同时降解多种四环素类抗生素的菌株，利用该菌株降解四环素类抗生素使用方法简单、成本低廉，对于降低抗生素引起的环境污染和生态失衡具有重要意义。
发明内容
为了满足实际需要，本公开提供了一种水谷鞘氨醇杆菌、一种微生物菌剂，以及该菌株和微生物菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。
一方面，本公开提供了一种水谷鞘氨醇杆菌，该水谷鞘氨醇杆菌的分类命名为水谷鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)，所述水谷鞘氨醇杆菌的保藏编号为CGMCCNO.18204。
根据本公开，其中，所述水谷鞘氨醇杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和/或培养基，所述菌体含有上述水谷鞘氨醇杆菌。
根据本公开，其中，所述培养基包括LB液体培养基、无碳源无机盐培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、TSA培养基和R2A培养基中的至少一种。
根据本公开，其中，所述LB液体培养基中的成分包括：胰蛋白胨8-12g/L、NaCl 8-12g/L、酵母提取物4-6g/L。
根据本公开，其中，所述无碳源无机盐培养基中的成分包括：NH4Cl 0.8-1.2g/L、Na2HPO4·12H2O 0.8-1.2g/L、KH2PO4 0.4-0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L。
根据本公开，其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中的成分包括：牛肉膏4-6g/L、蛋白胨9-11g/L、NaCl 9-11g/L。
根据本公开，其中，所述TSA培养基中的成分包括：胰蛋白胨14-16g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、氯化钠4-6g/L。
根据本公开，其中，所述R2A培养基中的成分包括：酵母浸粉0.4-0.6g/L、蛋白胨0.4-0.6g/L、酪蛋白水解物0.4-0.6g/L、葡萄糖0.4-0.6g/L、可溶性淀粉0.4-0.6g/L、KH2PO40.2-0.4g/L、MgSO4 0.02-0.03g/L、丙酮酸钠0.2-0.4g/L。
另一方面，本公开提供了上述水谷鞘氨醇杆菌和/或上述微生物菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。
根据本公开，其中，降解抗生素的条件包括：降解温度为25-40℃，优选为30-35℃；降解时间为3-7天，优选为4-5天；降解pH为6-10，优选pH为7-8。
根据本公开，其中，所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素和金霉素。
通过上述技术方案，本公开获得了一种水谷鞘氨醇杆菌S121，利用该菌株能够有效降解四环素类抗生素，对于降低抗生素引起的环境污染和生态失衡具有重要意义。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏信息
水谷鞘氨醇杆菌S121，分类命名水谷鞘氨醇杆(Sphingobacterium mizutaii.)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月9日，菌种保藏号为：CGMCC NO.18204。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为水谷鞘氨醇杆菌S121的形态。
图2为水谷鞘氨醇杆菌S121的显微镜下菌落形态。
图3为菌株种属关系树图。
图4为水谷鞘氨醇杆菌S121对四环素类降解效果图。
图5为响应面优化水谷鞘氨醇杆菌S121的四环素降解条件。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供了一种水谷鞘氨醇杆菌，该水谷鞘氨醇杆菌的分类命名为水谷鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii.)，所述水谷鞘氨醇杆菌的保藏编号为CGMCCNO.18204。
根据本公开，其中，所述水谷鞘氨醇杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和/或培养基，所述菌体含有上述水谷鞘氨醇杆菌。
根据本公开，其中，所述培养基包括LB液体培养基、无碳源无机盐培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、TSA培养基和R2A培养基中的至少一种。
根据本公开，其中，所述LB液体培养基中的成分包括：胰蛋白胨8-12g/L、NaCl 8-12g/L、酵母提取物4-6g/L。
根据本公开，其中，所述无碳源无机盐培养基中的成分包括：NH4Cl 0.8-1.2g/L、Na2HPO4·12H2O 0.8-1.2g/L、KH2PO4 0.4-0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L。
根据本公开，其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中的成分包括：牛肉膏4-6g/L、蛋白胨9-11g/L、NaCl 9-11g/L。
根据本公开，其中，所述TSA培养基中的成分包括：胰蛋白胨14-16g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、氯化钠4-6g/L。
根据本公开，其中，所述R2A培养基中的成分包括：酵母浸粉0.4-0.6g/L、蛋白胨0.4-0.6g/L、酪蛋白水解物0.4-0.6g/L、葡萄糖0.4-0.6g/L、可溶性淀粉0.4-0.6g/L、KH2PO40.2-0.4g/L、MgSO4 0.02-0.03g/L、丙酮酸钠0.2-0.4g/L。
另一方面，本公开提供了上述水谷鞘氨醇杆菌和/或上述微生物菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。
根据本公开，其中，降解四环素类抗生素的条件包括：降解温度为25-40℃，优选为30-35℃；降解时间为3-7天，优选为4-5天；降解pH为6-10，优选pH为7-8。
本公开提供的水谷鞘氨醇杆菌S121可以在添加了四环素类抗生素的培养基中生长，同时降解四环素类抗生素，具有良好的降解效果。
根据本公开，其中，所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素和金霉素。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例用于说明菌株S121分离与鉴定
四环素：盐酸四环素(C22H24N2O8·HCl)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司CAS:64-75-5。土霉素：盐酸土霉素(C22H24N2O9·HCl)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司CAS:2058-46-0。
取1g样品(样品来源于河北某药厂污染土壤)，接种至100mL含有50mg/L四环素的无碳源无机盐培养基(NH4Cl 1.1g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH 7.0)中进行富集培养，稀释至107涂布到20mL的含有50mg/L四环素的LB液体培养基上(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)，分离得到多株能耐受四环素的细菌，鉴定其中一株为水谷鞘氨醇杆S121。该菌株呈现浅黄色、表面光滑、有凸起、呈现边缘齐整的单菌落形态，如图1所示。显微照片显示该菌株细胞呈短杆状，宽0.2-0.7μm，长1.0-2.5μm，如图2所示。该菌株的生理生化特征为：革兰氏阴性菌，不运动，不产芽孢，产生吲哚，Voges–Proskauer实验阳性，氧化酶和过氧化氢酶阳性。菌株生长温度范围：20～40℃(optimal：30℃)；pH的适应范围：6.0-10.0(optimal：7.0)；盐度耐受范围：0-3％NaCl(optimal：0.5％NaCl)；主要脂肪酸(>10％)组分为anteiso-C15:0 and iso-C15:0,iso-C17:03-OH和summed features 3(iso-C15:0 2-OH and/or C16:1ω7c)。
对水谷鞘氨醇杆菌S121扩增得到的16S rRNA DNA进行测序，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，在EzBioCloud网站比对菌株序列得知最相近菌种为水谷鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)，相似度为99.86％。通过MEGA 7.0软件neighbour-joining方法建立菌株种属关系树图，如图3所示，菌株与水谷鞘氨醇杆菌属聚在一起，进一步鉴定为水谷鞘氨醇杆菌，并命名为水谷鞘氨醇杆菌S121。
实施例2
本实施例用于说明水谷鞘氨醇杆菌S121能够降解四环素类抗生素。
将水谷鞘氨醇杆菌S121接种至100mL的含有50mg/L四环素的LB液体选择培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)，置于30℃、150r/min恒温摇床中培养7d，每隔24h取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定不同培养时间下培养液中四环素残留量，并取5，10，20，50，100，200mg/L浓度四环素绘制四环素标准曲线(CK)。
利用相同的方法将水谷鞘氨醇杆菌S121接种至含有50mg/L土霉素的上述LB液体选择培养基中，测定不同培养时间下培养液中土霉素的残留量。
HPLC测定方法参照国标方法；色谱条件为Agi-lent 1100Series HPLC色谱仪；Agilent HC-C18(2)，5μm，4.6mm×250mm色谱柱；流动相：草酸(0.01mol/L)：乙腈：甲醇＝84：8：8(体积比)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：355nm；进样量20μL。
四环素类抗生素降解率(％)＝(初始浓度-剩余浓度)/初始浓度×100％。
结果如图4所示，本公开所提供的水谷鞘氨醇杆菌S121菌株对于四环素类抗生素具有良好的降解能力，对四环素、土霉素的降解率能够分别达到72.4％和73.0％。
实施例3
本实施例用于优化水谷鞘氨醇杆菌S121降解四环素类抗生素的降解条件。
利用实施例3所述的方法，在其他培养参数相同的条件下，水谷鞘氨醇杆菌S121在含有5-20mg/L四环素的LB培养基中，对四环素的降解速率最高；
在其他培养参数相同的条件下，在四环素为20mg/L的LB培养基中，菌株S121在30-35℃下对四环素降解率最高，5天后能够实现完全降解；
在其他培养参数相同的条件下，pH 7-10下菌株对四环素5天后完全降解，pH为6时四环素的降解率为87％；
在其他培养参数相同的条件下，菌株的接种量在0.5-5％(v/v)范围内对四环素降解率影响不显著；
三维响应面绘制显示温度和pH值对于四环素的生物降解影响理论最大值点是温度32℃，pH值8.2，固定值接种生物量(非显著因素变量)为5.0％(v/v)，如图5所示。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 一种水谷鞘氨醇杆菌及其应用
<130> 25032CAAS-A
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1516
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ctaatacatg caagtcggac 60
gggatccatc ggtagcttgc taccgatggt gagagtggcg cacgggtgcg taacgcgtga 120
gcaacctgcc catatcaggg ggatagcccg gagaaatccg gattaacacc gcatgacact 180
gctttccggc atcgggaggc agtcaaatat tcataggata tggatgggct cgcgtgacat 240
tagctagttg gtggggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg tctaggggct ctgagaggag 300
aatcccccac actggtactg agacacggac cagactccta cgggaggcag cagtaaggaa 360
tattggtcaa tgggggcaac cctgaaccag ccatgccgcg tgcaggacga ctgccctatg 420
ggttgtaaac tgcttttgtt agggaataaa ccccgctacg tgtagcgggc tgaatgtacc 480
taaagaataa ggatcggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga ggatccgagc 540
gttatccgga tttattgggt ttaaagggtg cgtaggcggc actttaagtc aggggtgaaa 600
gacggcagct caactgtcgc agtgcccttg atactgaagt gcttgaatgc ggttgaagac 660
ggcggaatga gacaagtagc ggtgaaatgc atagatatgt ctcagaacac cgattgcgaa 720
ggcagctgtc taagccgtta ttgacgctga tgcacgaaag cgtggggatc gaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgatgactcg atgtttgcga tataccgtaa 840
gcgtccaagc gaaagcgtta agtcatccac ctggggagta cgcccgcaag ggtgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg aggagcatgt ggtttaattc gatgatacgc 960
gaggaacctt acccgggctt gaaagttact gaagggcgca gagacgcgcc cgtccttcgg 1020
gacaggaaac taggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ctatgtttag ttgccagcac gtcaaggtgg ggactctaaa 1140
cagactgcct gcgcaagcag agaggaaggc ggggacgacg tcaagtcatc atggccctta 1200
cgtccggggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacagcg ggcagctaca cagcaatgtg 1260
gtgccaatct cgaaaagcca ttcacagttc ggatcggggt ctgcaactcg accccgtgaa 1320
gttggattcg ctagtaatcg cgtatcagca atgacgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcaagcc atgaaagctg ggggtaccta aagcatgtaa ccgcaaggag 1440
cgtgttaggg taaaaccggt aattggggct aagtcgtaac aaggtagccg taccggaagg 1500
tgcggctgga atacct 1516

Claims (6)

1.一种水谷鞘氨醇杆菌，其特征在于，该水谷鞘氨醇杆菌的分类命名为水谷鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium mizutaii.），所述水谷鞘氨醇杆菌的保藏编号为CGMCC NO.18204。
2.根据权利要求1所述的水谷鞘氨醇杆菌，其中，所述水谷鞘氨醇杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1-2中任意一项所述的水谷鞘氨醇杆菌。
4.权利要求1-2中任意一项所述水谷鞘氨醇杆菌和/或权利要求3所述微生物菌剂在降解四环素类抗生素中的应用；
所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素和金霉素。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，降解四环素类抗生素的条件包括：降解温度为25-40℃；降解时间为3-7天；降解pH为6-10。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，降解四环素类抗生素的条件包括：降解温度为30-35℃；降解时间为4-5天；降解pH为7-8。
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