CN105814210A - 生物合成途径和产物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容描述了经生物合成的化合物，其包括脱水甲羟戊酸内酯和β?甲基?δ?戊内酯。本公开内容进一步描述了制备这些化合物的生物合成方法。在某些实施方案中，所述生物合成方法可包括产生β?甲基?δ?戊内酯的生物合成和化学步骤的组合。最后，本公开内容描述了可用于这些化合物的生物合成的重组细胞。

Description

生物合成途径和产物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年4月18日提交的美国临时专利申请顺序号61/813,354和2013年8月15日提交的美国临时专利申请顺序号61/866,233的优先权，其各自通过引用结合到本文中。
概述
本公开内容一方面描述了经生物合成的化合物，其包括脱水甲羟戊酸内酯和β-甲基-δ-戊内酯。另一方面，本公开内容进一步描述了制备这些化合物的生物合成方法。在某些实施方案中，所述生物合成方法可包括产生β-甲基-δ-戊内酯的生物合成和化学步骤的组合。再一方面，本公开内容描述了可用于这些化合物的生物合成的重组细胞。
本发明的以上概述无意描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施。以下描述更具体地举例说明了说明性的实施方案。在本申请全文的若干处，通过实例列表提供指导，可以不同组合使用所述实例。在每种情况下，所记载的列表仅作为代表性的群组，而不应视为排他性的列表。
附图简述
图1. β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的基于生物的路线。(I) 全人工合成的途径。atoB: 乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶；mvaS: HMG-辅酶A合酶；mvaE: HMG-辅酶A还原酶；sidI: 酰基-辅酶A连接酶；sidH: 烯酰-辅酶A水合酶；ter: 烯酰-辅酶A还原酶。(II) 混合途径。经生物合成的甲羟戊酸通过催化性脱水和氢化而转化为βMδVL。(III) 中间体脱水甲羟戊酰-辅酶A可以自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯。
图2. 用于测试βMδVL产生而构建的质粒。
图3. β-甲基-δ-戊内酯的总的基于生物的产生和该单体的半合成的路线。(A)来自MvaS和MvaE的不同组合的甲羟戊酸的发酵。I: 来自粪肠球菌(E. faecalis)的MvaS, 来自粪肠球菌的MvaE；II: 来自金黄色葡萄球菌(S. aureus)的MvaS，来自粪肠球菌的MvaE；III: 来自干酪乳杆菌(L. casei)的MvaS，来自粪肠球菌的MvaE；IV: 来自干酪乳杆菌的MvaS，来自金黄色葡萄球菌的MvaE；V: 来自干酪乳杆菌的MvaS，来自干酪乳杆菌的MvaE；VI: 来自干酪乳杆菌的MvaS，来自海沼甲烷球菌(M. maripaludis)的MvaE；VII: 来自干酪乳杆菌的MvaS，来自沃氏甲烷球菌(M. voltae)的MvaE。(B) 用来自以下的铁载体酶SidI和SidH进行的脱水甲羟戊酸内酯发酵：A, 烟曲霉(A. fumigatus)；B, 粗糙脉孢菌(N.crassa)；C, 颖枯壳针孢(P. nodorum)；D, 油菜菌核病菌(S. sclerotiorum)。(C) 通过用以下烯醇-还原酶(enoate-reductase)进行的发酵对β-甲基-δ-戊内酯的产生：1, 来自酿酒酵母(S. cerevisiae)的Oye2；2, 来自酿酒酵母的Oye3；3, 来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的野生型YqjM；4, 来自枯草芽孢杆菌的突变型YqjM (C26D和I69T)。(D) 在1.3L生物反应器中通过葡萄糖发酵的甲羟戊酸的产生。
图4. 通过折射率(RI)监测的甲羟戊酸变为脱水甲羟戊酸内酯的酸催化脱水。
图5. 通过硫酸催化的甲羟戊酸发酵样品脱水变为脱水甲羟戊酸内酯。(A) 用不同的硫酸浓度的反应。(B) HPLC测定。
图6. 提取的脱水甲羟戊酸内酯的NMR谱。
图7. 脱水甲羟戊酸内酯的氢化样品的NMR谱。
图8. 产生β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的替代的基于生物的路线。atoB: 乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶；mvaS: HMG-辅酶A合酶；mvaE: HMG-辅酶A还原酶；sidI: 酰基-辅酶A连接酶；sidH: 烯酰-辅酶A水合酶；OYE2: 烯醇-还原酶。
图9.用于测试β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)的产生而构建的质粒。
图10. 500 L发酵曲线。
说明性实施方案的详述
本公开内容涉及生物合成途径和具有这些途径的遗传修饰的微生物，其用于产生β-甲基-δ-戊内酯。本公开内容描述了自可再生碳源生物合成3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的全生物合成途径。如图1所示，3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A自发地转化为终产物β-甲基-δ-戊内酯。或者，如图8所示，脱水甲羟戊酰-辅酶A自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯，其可被还原为β-甲基-δ-戊内酯。本公开内容也描述了产生β-甲基-δ-戊内酯的整合工艺，其包括将脱水甲羟戊酰-辅酶A或甲羟戊酸转化为脱水甲羟戊酸内酯，然后脱水甲羟戊酸内酯经化学加工而产生β-甲基-δ-戊内酯。
目前，聚交酯(PLA)是基于生物的可再生的聚合物的实例，其具有重要的市场冲击。然而，PLA的半晶体性质限制了其应用。本公开内容描述了新的聚合物单体的新颖的发酵工艺的开发，所述单体可聚合为无定形结构。
设计和构建新的合成的代谢途径
天然存在的微生物代谢途径不能直接自碳水化合物碳源(例如葡萄糖)产生β-甲基-δ-戊内酯。我们已经设计和改造了β-甲基-δ-戊内酯的非天然代谢途径(图1和图8)。
首先，我们将异源途径引入微生物宿主以产生非天然代谢物甲羟戊酸。(图1, 路线I)。甲羟戊酸途径存在于哺乳动物和古生菌(Archaea)中，用于脂质生物合成。因为许多微生物例如大肠杆菌(E. coli)天然地具有乙酰基-辅酶A代谢池，在两步酶促步骤中可完成甲羟戊酸向脱水甲羟戊酰-辅酶A的转化。我们进一步设计和改造了涉及克隆酰基-辅酶A连接酶(sidI)和烯酰-辅酶A水合酶(sidH)的途径。最后，我们改造了微生物，以通过反式-2-烯酰-辅酶A还原酶(ter)催化而还原脱水甲羟戊酰-辅酶A的双键，形成3-甲基-5-羟基-戊酰-辅酶A。3-甲基-5-羟基-戊酰-辅酶A可以自发地环化为β-甲基-δ-戊内酯。
我们也已设计了一种混合方法，以产生β-甲基-δ-戊内酯(图1，路线II)。首先，自可再生碳源生物合成甲羟戊酸。然后，经催化性脱水将甲羟戊酸转化为脱水甲羟戊酸内酯。自反应混合物中提取脱水甲羟戊酸内酯并通过催化性氢化将其还原为β-甲基-δ-戊内酯。我们也观察到中间体脱水甲羟戊酰-辅酶A可自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯(图1，路线III)，因此提供了产生β-甲基-δ-戊内酯的另一条生物合成/化学混合路线。
我们也已设计了非天然途径以产生β-甲基-δ-戊内酯(图8)。在这里我们又是将异源途径引入微生物宿主以产生非天然代谢物甲羟戊酸。我们也利用了sidI和sidH的活性以产生脱水甲羟戊酰-辅酶A，其可以自发地环化为脱水甲羟戊酸内酯。最后，我们将烯醇还原酶(例如，OYE2, YqjM；Bougioukou等人, 2009, Advanced Synthesis & Catalysis 351:3287-3305)引入以还原脱水甲羟戊酸内酯的双键，形成β-甲基-δ-戊内酯。
在摇瓶中的甲羟戊酸的产生的优化
甲羟戊酸是我们的人工生物合成途径的中间代谢前体。尽管先前已经试图在大肠杆菌中产生该化合物，但是生产收率和水平对于工业生产而言不切实际地低。在此，我们报告了甲羟戊酸的重组产生。具体地讲，我们研究了HMG-辅酶A合酶(MvaS)和HMG-辅酶A还原酶(MvaE)的不同组合的作用。当使用干酪乳杆菌的mvaS替代粪肠球菌的mvaS时，在摇瓶中甲羟戊酸滴度增加14% (图3A)。通过取代不同mvaE基因，进一步优化了携带来自干酪乳杆菌的mvaS的菌株。具有均来自干酪乳杆菌的mvaS和mvaE的菌株产生14.6 g/L甲羟戊酸，这比具有干酪乳杆菌的mvaS和具有粪肠球菌的mvaE的原始菌株高36% (图3A)。具有来自干酪乳杆菌的mvaS和mvaE的组合产生的甲羟戊酸比具有来自粪肠球菌的mvaS和mvaE的先前报告的构建体多50%。(Tabata等人，2004, Biotechnol Lett 26:1487-1491)。
在1.3 L生物反应器中的甲羟戊酸的产生
选择携带来自干酪乳杆菌的mvaS和mvaE的菌株，在1.3L生物反应器中进行放大发酵。24小时后生物量增加到38 g/L，然后在发酵期间逐步降低(图3D)。在头6小时内因快速生长率，乙酸积累至2.3 g/L，然后降低和维持在非常低水平，直到32小时。当甲羟戊酸浓度达到51 g/L时，葡萄糖消耗率降低和乙酸逐步增加。当48小时后乙酸达到3.5 g/L时，发酵停止。在整个发酵过程中，甲羟戊酸生产率大约为2 gL-1h-1。48小时后的甲羟戊酸的最终滴度是88.3 g/L，自葡萄糖的收率大约为0.26 g/g。甲羟戊酸滴度增加了87.9%，相比先前的报告。(Tabata等人，2004, Biotechnol Lett 26:1487-1491)。
当将第二质粒pZAlac-sidI-sidH-ter引入产生甲羟戊酸的大肠杆菌后，我们检测到了大约20 mg/L脱水甲羟戊酸内酯，但在发酵液中未见β-甲基-δ-戊内酯或其水解酸形式。
催化性脱水和提取
尽管脱水甲羟戊酸内酯可以通过催化性氢化转化为β-甲基-δ-戊内酯，但其发酵浓度对于工业应用而言仍然太低了。因此，我们通过将甲羟戊酸化学转化为β-甲基-δ-戊内酯开发了一种替代方法(路线II, 图1)。选择硫酸作为催化剂，使脱水反应能够进行。将加入0.1-0.6 mL硫酸的5 mL发酵样品放入15 mL试管。在加压釜内进行反应达1小时(121℃, 15psi)。当使用5 mL H2SO4时，几乎所有甲羟戊酸都转化为脱水甲羟戊酸内酯(图5A和5B)，这表明酸是将叔醇基团脱水的选择性催化剂。
通过用不同有机溶剂提取，也研究了脱水甲羟戊酸内酯的纯化(表1)。当使用1:1体积比的氯仿时，提取了大约96%脱水甲羟戊酸内酯。脱水甲羟戊酸内酯在氯仿和水之间的分配系数Kd为25。NMR分析表明脱水甲羟戊酸内酯呈内酯形式，而不是与其羟基酸形式平衡(图6)。
表1. 不同溶剂的提取效率和Kd
溶剂 脱水甲羟戊酸内酯提取效率(%) Kd
MIBK 79.90 3.97
DIBK 44.15 0.79
Oley 35.56 0.55
乙酸乙酯 79.67 3.92
CHCl3 96.14 24.89
苯 65.26 1.88
氢化
将脱水甲羟戊酸内酯(5.7 g)溶于700 mL甲醇。加入催化剂Pd/C (2g)。H2压力维持在4巴。在25℃过夜(~14小时)反应后，将产物过柱纯化并得到油状β-甲基-δ-戊内酯，收率87.93% (图7)。
脱水甲羟戊酸内酯和甲羟戊酸内酯的替代生物合成
产生脱水甲羟戊酸内酯的替代途径包括进一步修饰微生物以包含来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)或油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的sidI和sidH。表2显示了当将含有sidI-sidH的质粒引入产生甲羟戊酸的大肠杆菌时，脱水甲羟戊酸内酯发酵结果。携带来自烟曲霉的sidI和sidH的菌株产生730 mg/L脱水甲羟戊酸内酯；携带来自粗糙脉孢菌的sidI和sidH的菌株产生540 mg/L脱水甲羟戊酸内酯。
表2. 脱水甲羟戊酸内酯发酵结果(g/L)
菌株 甲羟戊酸 脱水甲羟戊酸内酯
BW25113，具有pMEV-7和pAML-1 12.36±1.18 0.73±0.06
BW25113，具有pMEV-7和pAML-2 13.59±0.24 0.54±0.02
烯醇还原酶例如来自酿酒酵母的OYE2和OYE3或来自枯草芽孢杆菌的yqjM可以使用3-甲基环己烯酮和/或3-甲基环己酮作为天然底物催化反应。我们将OYE2、OYE3、野生型yqjM、或突变型yqjM的编码区引入产生脱水甲羟戊酸内酯的微生物，以测定各构建体是否能够合成最终的甲羟戊酸内酯的单体。结果见表3。
表3. βMδVL发酵结果(g/L)
菌株 甲羟戊酸 脱水甲羟戊酸内酯 βMδVL
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-1 10.19±0.61 0.34±0.03 0.18±0.03
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-2 6.77±0.58 0.48±0.03 0
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-3 8.85±0.56 0.55±0.01 0
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-4 9.39±0.48 0.31±0.01 0.27±0.02
因此，一方面，本公开内容描述了经生物合成的化合物、产生所述经生物合成的化合物的重组微生物、以及产生所述经生物合成的化合物的方法。本文使用的“经生物合成的化合物”是这样的化合物：其中其合成的至少一个步骤是由微生物进行。在某些情况下，经生物合成的化合物可以是β-甲基-δ-戊内酯。如图1和图8所示，有多条路线都可产生经生物合成的β-甲基-δ-戊内酯化合物。路线I包括由微生物自培养基中的碳源生物合成β-甲基-δ-戊内酯。图1所示的路线II和路线III显示可以收获中间体化合物(例如，经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯)并让其经历一个或多个化学步骤以产生经生物合成的β-甲基-δ-戊内酯。图8所示的途径包括β-甲基-δ-戊内酯的替代的全生物合成路线。
可以通过化合物样品中的14C与12C的比例，区分本文所述的经生物合成的化合物与经常规化学方法自例如基于石油的材料产生的类似化合物。经生物合成的化合物样品具有掺入化合物分子中的可检测量的14C同位素，而自基于石油的材料产生的化合物样品具有可忽略的14C水平。因此，包括经生物合成的化合物(例如β-甲基-δ-戊内酯或脱水甲羟戊酸内酯)的样品或组合物具有的14C/12C比例大于零。在某些情况下，包括经生物合成的化合物的样品或组合物的14C/12C比例可大于0.25×10−12，例如，14C/12C比例为0.25×10−12至1.2×10−12。
本文所述的经生物合成的化合物，无论是β-甲基-δ-戊内酯和/或脱水甲羟戊酸内酯，是通过如下更详细描述的方法产生的，其中将宿主细胞修饰为重组细胞，其相比野生型对照可表现出生物合成化合物的生物合成的增加。在某些情况下，野生型对照可以不能产生生物合成化合物，因此生物合成化合物的生物合成的增加可以反映出该化合物的任何可检测的生物合成。在某些实施方案中，生物合成化合物的生物合成的增加可包括足以使微生物细胞培养物积累生物合成化合物到预定浓度的生物合成。
所述预定浓度可以是生物合成化合物的适于指定应用的任何预定浓度。因此，预定浓度可以是例如至少0.1 g/L，例如，至少0.25 g/L、至少0.5 g/L、至少1.0 g/L、至少2.0g/L、至少3.0 g/L、至少4.0 g/L、至少5.0 g/L、至少6.0 g/L、至少7.0 g/L、至少8.0 g/L、至少9.0 g/L、至少10 g/L、至少20 g/L、至少50 g/L、至少100 g/L、或至少200 g/L的浓度。
因此，另一方面，本公开内容描述了制备包括例如β-甲基-δ-戊内酯和/或脱水甲羟戊酸内酯在内的经生物合成的化合物的方法。图1说明了产生β-甲基-δ-戊内酯的3种不同的示例性生物合成路线。图8说明了产生β-甲基-δ-戊内酯的替代的示例性生物合成路线。
图1的路线I所示的一种方法包括重组细胞对3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的生物合成，3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A自发地转化为β-甲基-δ-戊内酯。因此，在某些实施方案中，所述方法包括在对重组细胞表现出相比野生型对照增加的3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的生物合成而言有效的条件下，培养合适的重组细胞(更详细描述于下文)，然后允许3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A自发地转化为β-甲基-δ-戊内酯。
在替代的实施方案中，所述方法可包括组合的生物合成-化学方法。在图1的路线III所示的这些实施方案中的一些中，可将经修饰而表现出相比野生型对照增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成的重组细胞，在对所述重组细胞产生脱水甲羟戊酰-辅酶A而言有效的条件下培养。可以收获脱水甲羟戊酰-辅酶A并让其自发地转化为脱水甲羟戊酸内酯。脱水甲羟戊酸内酯可以经由下文更详细描述的一个或多个化学步骤转化为β-甲基-δ-戊内酯。
在图1的路线II所示的另一个组合的生物合成-化学方法中，可将经修饰而表现出相比野生型对照增加的甲羟戊酸(或其内酯形式甲羟戊酸内酯)的生物合成的重组细胞，在对所述重组细胞产生甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)而言有效的条件下培养。可收获甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)并将其转化为脱水甲羟戊酸内酯。脱水甲羟戊酸内酯可以经由下文更详细描述的一个或多个化学步骤转化为β-甲基-δ-戊内酯。
在再另外的实施方案中，所述方法可包括脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成，脱水甲羟戊酰-辅酶A可以自发地转化为脱水甲羟戊酸内酯，后者又可经酶促转化为β-甲基-δ-戊内酯。因此，在某些实施方案中，所述方法包括在对重组细胞表现出增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成和增加的脱水甲羟戊酸内酯向β-甲基-δ-戊内酯的转化而言有效的条件下，培养下文更详细描述合适的重组细胞。
在某些实施方案中，甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)向脱水甲羟戊酸内酯的转化可包括使用脱水催化剂，在对脱水催化剂使甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)脱水为脱水甲羟戊酸内酯合适的条件下，使甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)脱水。示例性的脱水催化剂可包括例如对甲苯磺酸、硫酸和磷酸，或固体酸催化剂，例如沸石、Amberlyst 70和Amberlyst 15。在某些实施方案中，可以以相对于甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)至少0.1当量的催化量提供脱水催化剂。在这些实施方案中的一些中，可以以相对于甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)不超过20.0当量的催化量提供脱水催化剂。在某些实施方案中，脱水可以在不低于室温的温度例如至少20℃、至少30℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、或至少100℃进行。
经修饰而表现出相比野生型对照的增加的甲羟戊酸(或其内酯形式甲羟戊酸内酯)的生物合成的重组细胞可以是任何合适的重组细胞。尽管本文所述的示例性的实施方案包括经遗传修饰的大肠杆菌宿主细胞，但是可以构建本文所述的重组细胞，并可使用任何合适的宿主细胞，进行制备和使用重组细胞的方法。因此，所述重组细胞可以是或源自任何合适的微生物，包括例如原核微生物或真核微生物。本文使用的与微生物关联的术语“或源自”只是允许“宿主细胞”在经修饰而表现出指定的增加的生物合成活性之前具有一个或多个遗传修饰。因此，术语“重组细胞”包括“宿主细胞”，其在经修饰而表现出指定的生物合成活性之前可含有来自不止一种物种的核酸物质。
在某些实施方案中，可选择宿主细胞，以具有一种或多种天然生理活性。例如，所述宿主细胞可以是光合的(例如，蓝细菌)或可以是水解纤维素的(例如，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)。
在某些实施方案中，所述重组细胞可以是或源自真核微生物，例如真菌细胞。在这些实施方案中的一些中，所述真菌细胞可以是或源自酵母科(Saccharomycetaceae)的成员，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)或白色假丝酵母(Candida albicans)。在这些实施方案中的一些中，可以通过至少部分地敲除宿主细胞的天然甲羟戊酸消耗途径的活性而改善收率。
在其它实施方案中，所述重组细胞可以是或源自原核微生物，例如细菌。在这些实施方案中的一些中，所述细菌可以是变形菌门(Protobacteria)的成员。示例性的变形菌门的成员包括例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))和例如假单胞菌科(Pseudomonaceae)的成员(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。在其他情况下，所述细菌可以是厚壁菌门(Firmicutes)的成员。示例性的厚壁菌门的成员包括例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)的成员(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、梭菌科(Clostridiaceae)的成员(例如解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)和例如链球菌科(Streptococcaceae)的成员(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))。在其他情况下，所述细菌可以是蓝细菌门(Cyanobacteria)的成员。在此再次地，在这些实施方案中的一些中，可以通过至少部分地敲除宿主细胞的天然甲羟戊酸消耗途径的活性而改善收率。
在某些实施方案中，相比野生型对照，所述重组细胞可以表现出参与产生甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)的代谢生物合成途径的一种或多种酶的增加的活性。对于特定的酶，本文使用的术语“活性”是指多肽(无论其常用名称或天然功能如何)催化该酶的底物转化为产物的能力，而无论“活性”是否小于、等于或大于所标识的酶的天然活性。测定细胞的生物合成活性的方法是对本领域普通技术人员是常规的和众所周知的。
本文使用的催化活性的增加可以被定量测定并描述为合适的野生型对照的催化活性的百分率。经遗传修饰的多肽所表现的催化活性可以是例如，合适的野生型对照的活性的至少110%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200% (2倍)、至少250%、至少300% (3倍)、至少400% (4倍)、至少500% (5倍)、至少600% (6倍)、至少700% (7倍)、至少800% (8倍)、至少900% (9倍)、至少1000% (10倍)、至少2000% (20倍)、至少3000% (30倍)、至少4000% (40倍)、至少5000% (50倍)、至少6000% (60倍)、至少7000% (70倍)、至少8000% (80倍)、至少9000% (90倍)、至少10,000% (100倍)、或至少100,000% (1000倍) 。
或者，催化活性的增加可以表示为kcat的增加，例如，酶促转化的kcat值的至少2倍增加、至少3倍增加、至少4倍增加、至少5倍增加、至少6倍增加、至少7倍增加、至少8倍增加、至少9倍增加、至少10倍增加、至少15倍增加、或至少20倍增加。
催化活性的增加也可以表示为Km的降低，例如，酶促转化的Km值的至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低、或至少20倍降低。
催化活性的降低可以被定量测定并描述为合适的野生型对照的催化活性的百分率。经遗传修饰的多肽所表现的催化活性可以是例如，合适的野生型对照的活性的至多95%、至多90%、至多85%、至多80%、至多75%、至多70%、至多65%、至多60%、至多55%、至多50%、至多45%、至多40%、至多35%、至多30%、至多25%、至多20%、至多15%、至多10%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、或0%。
或者，催化活性的降低可以表示为催化常数的合适变化。例如，催化活性的降低可以表示为kcat的降低，例如，酶促转化的kcat值的至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低、或至少20倍降低。
催化活性的降低也可表示为Km的增加，例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少230倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、或至少400倍的Km增加。
可以作为这类工程化生物合成途径的组成部分的示例性的酶包括，例如，硫解酶、3-羟基-3-甲基-戊二酰(HMG)-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶。所述硫解酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的硫解酶。在某些实施方案中，所述硫解酶可包括AtoB，例如，由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自大肠杆菌的atoB编码区。所述HMG-辅酶A合酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的HMG-辅酶A合酶。在某些实施方案中，所述HMG-辅酶A合酶可包括MvaS，例如由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自以下的myaS编码区：肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。所述HMG-辅酶A还原酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的HMG-辅酶A还原酶。在某些实施方案中，所述HMG-辅酶A还原酶可包括MvaE，例如由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自以下的myaE编码区：肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。
在某些实施方案中，所述方法可以通过在细胞培养物中培养所述重组细胞而进行，所述培养物包括具有作为碳源的以下的一种或多种的培养基：葡萄糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、葡糖二酸、乳糖二酸、半乳糖醛酸、藻酸盐、淀粉、蔗糖、或纤维素。
无论是按照路线II、路线III、还是产生脱水甲羟戊酸内酯的一些其它代谢路线，脱水甲羟戊酸内酯都可以通过脱水甲羟戊酸内酯的催化性氢化而被转化为β-甲基-δ-戊内酯。在某些实施方案中，可在有机溶剂中在异质催化剂或同质催化剂存在时氢化脱水甲羟戊酸内酯。示例性的异质催化剂包括例如，披钯活性炭、二氧化硅载镍(nickel on silica)和氧化铝载镍(nickel on alumina)。示例性的同质催化剂包括例如，NaBH4、LiAlH4、硫酸、磷酸、和甲羟戊酸。脱水甲羟戊酸内酯的催化性氢化可以在任何合适的条件组下进行。例如，脱水甲羟戊酸内酯的催化性氢化可以在至多100℃的温度和/或在至多100巴的氢压力下进行。
可通过任何合适得到方法收集如此产生的β-甲基-δ-戊内酯，所述方法包括例如，蒸馏β-甲基-δ-戊内酯，例如通过在至多1个大气压的压力下使用分级蒸馏柱(stageddistillation column)。
在某些实施方案中，可以至少70%例如至少75%、至少80%、至少85%或至少90%的回收率得到β-甲基-δ-戊内酯。
在某些实施方案中，所述方法可包括在催化性脱氢之前提取脱水甲羟戊酸内酯的步骤。这样的步骤可以增加脱水甲羟戊酸内酯的催化性脱氢的效率，并因此，增加β-甲基-δ-戊内酯的最终收率。在某些实施方案中，可以使用与水不混溶的提取剂例如酰胺、醚、酮、烷烃、醇、酯、苯、二甲苯、氯仿、或两种或更多种与水不混溶的提取剂的任何组合进行提取。在这些实施方案中的一些中，所述提取可以回收至少70%脱水甲羟戊酸内酯，例如，至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%脱水甲羟戊酸内酯。即使回收小于100%脱水甲羟戊酸内酯，提取步骤所致的脱水甲羟戊酸内酯的增加的浓度可以改善β-甲基-δ-戊内酯的最终收率。
在某些实施方案中，脱水甲羟戊酸内酯可以经生物合成地转化为β-甲基-δ-戊内酯。可以催化脱水甲羟戊酸内酯向β-甲基-δ-戊内酯的生物合成转化的示例性的酶包括例如烯醇还原酶。在某些实施方案中，所述烯醇还原酶可包括例如OYE2或OYE3，例如由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自酵母科成员例如酿酒酵母的oye2或oye3编码区。在其它实施方案中，所述烯醇还原酶可包括例如YqjM，例如由多核苷酸分离自芽孢杆菌科成员例如枯草芽孢杆菌的yqjM编码区所编码的酶。
以上描述了可用于甲羟戊酸的生物合成的重组细胞。如上所述，这样的重组细胞可以用于经由图1所示的路线II而产生本文所述的生物合成化合物，例如，脱水甲羟戊酸内酯和/或β-甲基-δ-戊内酯。或者，可用于甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)的生物合成的重组细胞可以被进一步修饰，从而经由图1所示的路线I或路线III而生物合成脱水甲羟戊酸内酯(脱水甲羟戊酸)和/或β-甲基-δ-戊内酯。因此，另一方面，本公开内容描述了可用于按照图1所示的路线I或路线III的生物合成的重组细胞。
在某些实施方案中，所述重组细胞可以被修饰以表现出相比野生型对照的增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成。这样的重组细胞可以表现出相比野生型对照的增加的硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和/或HMG-辅酶A还原酶的活性，如上所述地关于可用于甲羟戊酸(或甲羟戊酸内酯)的生物合成的重组细胞。另外，可用于脱水甲羟戊酰-辅酶A和/或脱水甲羟戊酸内酯(或脱水甲羟戊酸)的生物合成的重组细胞可以被修饰以相比野生型对照表现出酰基-辅酶A连接酶和/或烯酰-辅酶A水合酶增加的活性。
酰基-辅酶A连接酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的酰基-辅酶A连接酶。在某些实施方案中，所述酰基-辅酶A连接酶可包括SidI，例如，由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物的sidI编码区。因此，合适的示例性的酰基-辅酶A连接酶可包括由多核苷酸的编码区所编码的酰基-辅酶A连接酶，所述多核苷酸分离自曲霉属成员，例如烟曲霉。同样，所述烯酰-辅酶A水合酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的烯酰-辅酶A水合酶。在某些实施方案中，所述烯酰-辅酶A水合酶可包括SidH，例如，由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物的sidH编码区。因此，合适的示例性的烯酰-辅酶A水合酶可包括由多核苷酸编码区所编码的烯酰-辅酶A水合酶，所述多核苷酸分离自曲霉属成员，例如烟曲霉。
在某些实施方案中，所述重组细胞可以被更进一步修饰为表现出相比野生型对照的增加的3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的生物合成。在某些实施方案中，这样的重组细胞可以表现出相比野生型对照增加的在培养中积累β-甲基-δ-戊内酯的能力。在这样的实施方案中，所述重组细胞可以被修饰以表现出相比野生型对照的增加的如上所述的硫解酶、HMG)-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、酰基-辅酶A连接酶、和/或烯酰-辅酶A水合酶的活性。另外，可用于3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A(其自发地转化为β-甲基-δ-戊内酯)的生物合成的重组细胞可被修饰以表现出相比野生型对照增加的烯酰-辅酶A还原酶活性。所述烯酰-辅酶A还原酶可以是由任何生物体天然表达的任何合适的烯酰-辅酶。在某些实施方案中，所述烯酰-辅酶A还原酶可包括Ter，例如，由多核苷酸所编码的酶，所述多核苷酸包括分离自齿垢密螺旋体(T. denticola)的ter编码区。
在本文所述的各种重组细胞的构建中，可将编码异源多肽的异源多核苷酸插入载体。本文使用的载体是复制型多核苷酸，例如质粒、噬菌体、或粘粒，另一多核苷酸可以插入其中，从而导致所插入的多核苷酸的复制。含有本发明的多核苷酸的载体的构建使用本领域已知的标准连接技术。参见例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A LaboratoryManual., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。载体可以允许例如进一步克隆(即克隆载体)或表达(即表达载)体由编码区所编码的多肽。术语载体包括但不限于，质粒载体、病毒载体、粘粒载体、或人工染色体载体。在一个实施方案中，所述载体是质粒。载体的选择可以取决于所得构建体中的各种所需性质，例如选择标记、载体复制率等。
表达载体任选地包括与编码区操作性连接的调节序列。本文所述的多核苷酸不受任何具体启动子使用的限制，并且各种各样的启动子是已知的。启动子充当调节信号，其结合细胞中的RNA聚合酶，启动下游(3'方向)编码区的转录。所用的启动子可以是组成型的或是诱导型的启动子。对于宿主细胞而言，其可以是、但不必是异源的。示例性的启动子包括例如trp、tac和T7。
“编码序列”或“编码区”是指编码多肽、并且当处于合适的调节序列控制之下时表达所编码的多肽的核苷酸序列。编码区的边界通常由在其5'端的翻译起始密码子和在其3'端的翻译终止密码子所决定。本文使用的术语“多肽”广泛地指通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物。术语“多肽”也包括含有通过二硫键、离子键或疏水性相互作用而连接的不止一个多肽或共价或非共价地连接在一起作为多聚体(例如二聚体、四聚体)的多肽复合物的分子。因此，术语肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定义之内，可互换使用这些术语。术语“多肽”不意味着氨基酸聚合物的具体长度，也不暗示或辨别是否使用重组技术、化学或酶促合成产生该多肽、或该多肽是天然存在的。
“调节序列”是指调节它所操作性连接的编码区的表达的核苷酸序列。调节序列的非限制性实例包括例如启动子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点和终止子。“操作性连接”是指这样的毗邻：其中元件处于允许其以它们预定的方式运行的关系。当调节序列以使得在与调节序列相容的条件下实现编码区的表达这一方式连接时，调节序列与编码区“操作性连接”。
术语“和/或”是指所列要素中的一个或全部或者任何两个或更多个所列要素的组合；在术语“包含”及其变化出现于说明书和权利要求中时，这些术语不具有限制性含义；除非另有说明，“一个(a)”、“一个(an)”、“所述(the)”和“至少一个”可以互换使用并且意为一个或多于一个；并且通过端点对数值范围的记载包括该范围内包含的全部数值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
在前文描述中，具体的实施方案可以为了清楚而单独描述。除非另有明确地指定具体的实施方案的特征与另一实施方案的特征是不相容的，否则某些实施方案可以包括本文关于一个或多个实施方案描述的相容特征的组合。
对任何本文公开的包括离散的步骤的方法，所述步骤可以以任何可行的顺序实施。并且，合适的话，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。
本发明通过以下实施例进行说明。应理解的是具体的实施例、材料、量和程序应根据本文陈述的本发明的范围和精神广泛地解释。
实施例
实施例1
细菌和生长条件
BW25113 (rrnBT14 ΔlacZWJ16hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78)用于产生(R)-甲羟戊酸和βMδVL (Datsenko等人, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645)。所有克隆程序都在大肠杆菌菌株XL10-gold (Stratagene, Agilent Technologies, Inc.,Santa Clara, CA)中进行。除非另有说明，否则将这些大肠杆菌菌株在试管中在37℃在补充有合适抗生素(氨苄青霉素100 μg/mL和卡那霉素50 μg/mL)的2X YT丰富培养基(16 g/L细菌用胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl)中培养。
质粒构建
已经构建了多个质粒，用于βMδVL的生物合成(图2和图9)。质粒pZElac-atoB-mvaE-mvaS负责甲羟戊酸的产生。质粒pZAlac-sidI-sidH-ter负责将甲羟戊酸转化为β-甲基-δ-戊内酯。质粒pZAlac-sidI-sidH负责将甲羟戊酸转化为脱水甲羟戊酸内酯。质粒pZAlac-sidI-sidH-OYE2及其变体负责将脱水甲羟戊酸内酯转化为β-甲基-δ-戊内酯。
用于质粒构建的引物列于表4。
表4. 使用的引物
为了构建pZElac-atoB-mvaS-mvaE (图2)，使用引物atoBAcc-F和atoBPst-R自大肠杆菌基因组DNA扩增atoB，使用引物mvaSPst-F和mvaSBam-R自粪肠球菌基因组DNA扩增mvaS，使用引物mvaEBam-F和mvaEXba-R自粪肠球菌基因组DNA扩增mvaE。使用引物VecAcc-R和VecXba-F自质粒pIVC3扩增pZE的载体片段(Xiong等人, 2012, Scientific reports 2:311)。然后将atoB、mvaS、mvaE和pZE的扩增片段分别用Acc65I/PstI、PstI/BamHI、BamHI/XbaI、和Acc65I/ XbaI消化。这些经消化的片段用T4 DNA连接酶连接，形成质粒pZElac-atoB-mvaS-mvaE。
为了构建具有不同的mvaS和mvaE的组合的质粒，分别使用引物对SA.mvaSPst-F/SA.mvaSBam-R、LC.mvaSPst-F/ LC.mvaSBam-R、Mm.mvaSPst-F/ Mm.remPst-R和Mm.remPst-F/Mm.mvaSBam-R、Mv.mvaSPst-F/Mv.remPst-R和Mv.remPst-F/Mv.mvaSBam-R，自其相应的基因组DNA扩增来自金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、海沼甲烷球菌和沃氏甲烷球菌的mvaS基因。然后替换质粒pMEV-1中的mvaS，形成质粒pZElac-atoB-Sa.mvaS-mvaE、pZElac-atoB-Lc.mvaS-mvaE、pZElac-atoB-Bt.mvaS-mvaE、pZElac-atoB-Mm.mvaS-mvaE和pZElac-atoB-Mv.mvaS-mvaE。
因为用质粒pZElac-atoB-Lc.mvaS-mvaE转化的大肠杆菌菌株产生最高水平的MEV，所以基于pMEV-3，构建具有不同的mvaE的更多质粒。分别使用引物对Sa.mvaEBam-F/Sa.mvaEXba-R、Lc.mvaEBam-F/Lc.mvaEXba-R、Mm.mvaEBam-F/Mm.mvaEXba-R、和Mv.mvaEBam-F/Mv.mvaEXba-R，自其相应的基因组DNA扩增来自金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、海沼甲烷球菌和沃氏甲烷球菌的mvaE基因。然后替换质粒pZElac-atoB-Lc.mvaS-mvaE中的mvaE，形成pZElac-atoB-Lc.mvaS-Sa.mvaE、pZElac-atoB-Lc.mvaS-Lc.mvaE、pZElac-atoB-Lc.mvaS-Mm.mvaE和pZElac-atoB-Lc.mvaS-Mv.mvaE。
为了构建pZAlac-sidI-sidH-ter，对来自烟曲霉的sidI和sidH进行密码子优化并由Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)合成。然后，将分别用Acc65I-HindIII、和HindIII-NheI消化的sidI和sidH插入质粒pIVC1的相应位点(Xiong等人,2012, Scientific reports 2:311)，形成pZAlac-sidI-sidH。使用齿垢密螺旋体基因组DNA (Shen等人, 2011, Appl Environ Microbiol 77:2905-2915)作为模板通过引物对terNhe-F/terBam-R经PCR扩增基因ter。将ter片段插入质粒pZAlac-sidI-sidH的相应位点，形成pZAlac-sidI-sidH-ter。
为了构建用于合成脱水甲羟戊酸内酯的质粒，对来自烟曲霉、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢和油菜菌核病菌的sidI和sidH(Grundlinger等人, 2013, Mol Microbiol 88:862-875)进行密码子优化并由GenScript USA, Inc. (Tulsa, OK)合成。然后，将分别用Acc65I-HindIII和HindIII-NheI消化的sidI和sidH插入质粒pIVC1的相应位点(Xiong等人, 2012, Scientific reports 2:311)，分别形成pZAlac-afsidI-afsidH、pZAlac-ncsidI-ncsidH、pZAlac-pnsidI-pnsidH和pZAlac-sssidI-sssidH。
为了构建pZAlac-sidI-sidH-OYE2，使用引物SidHind-F和SidHsal-R，利用质粒pZAlac-sidI-sidH作为模板将sidH经PCR扩增。使用引物OYE2sal-F和OYE2-Vec，利用酿酒酵母基因组DNA作为模板将OYE2经PCR扩增。扩增后的sidH用HindIII和SalI消化；OYE2用SalI和NheI消化，然后用于替换质粒pZAlac-afsidI-afsidH中的sidH，形成pZAlac-afsidI-afsidH-OYE2。
为了构建额外的变体质粒，使用引物OYE3sal-F和OYE3-Vec，利用酿酒酵母基因组DNA作为模板将OYE3经PCR扩增。使用引物yqjM-F和yqjM-Vec，利用枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板将YqjM经PCR扩增。扩增后的OYE3用于替代pZAlac-sidI-sidH-OYE2的OYE2，产生pZAlac-sidI-sidH-OYE3。扩增后的YqjM用于替代pZAlac-sidI-sidH-OYE2的OYE2，产生pZAlac-afsidI-afsidH-YqjM。
为了在YqjM编码区内引入2个点突变，使用引物对yqjM-F/yqjMC26D-R、yqjMC26D-F/yqjMI69T-R和yqjMI69T-F/yqjM-Vec，利用枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板将3个片段经PCR扩增。使用引物yqjM-F和yqjM-vec，利用最后的3个PCR片段作为模板进行另一轮PCR。PCR产物用于替代pZAlac-afsidI-afsidH-OYE2的OYE2，产生pZAlac-afsidI-afsidH-YqjM(mt)。
摇瓶发酵
为了进行小规模发酵，将装有0.5 g CaCO3的125 mL锥形瓶高压灭菌并干燥。然后向瓶中装入补充有5 g/L酵母提取物、40 g/L葡萄糖和抗生素的5 mL M9培养基。将200 μL孵育在2X YT培养基中的过夜培养物移入瓶中并放入速率250 rpm的摇床。加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)后，在30℃将发酵进行48小时。
在生物反应器中的补料-分批发酵
用于生物反应器培养物的发酵培养基以克/升计含有以下组成：葡萄糖, 10；K2HPO4,7.5；柠檬酸一水合物, 2.0；酵母提取物, 0.5；MgSO4.7H2O, 2.0；盐酸硫胺素, 0.008；D-(+)-生物素, 0.008；烟酸, 0.008；吡哆醇, 0.032；氨苄青霉素, 0.1；浓H2SO4, 0.8 mL；和1 mL/L微量金属溶液。微量金属溶液以克/升计含有：NaCl, 10；柠檬酸, 40；ZnSO4.7H2O,1.0；MnSO4.H2O, 30；CuSO4.5H2O, 0.1；H3BO3, 0.1；Na2MoO4.2H2O, 0.1；FeSO4.7H2O, 1.0；CoCl2.6H2O, 1.0。补料溶液以克/升计含有：葡萄糖, 600；K2HPO4, 7.4；和10 mL消泡剂。
大肠杆菌培养物的培养使用起始工作体积0.5 L在1.3 L Bioflo 115发酵罐(NBS, Edison, NJ)中进行。发酵罐中接种10%过夜预培养物和2XYT培养基。培养条件设定在34℃，溶解氧水平(DO) 30%，pH 7.0。当OD600达到6.0后，加入0.2 mM IPTG，产生甲羟戊酸。通过自动加入26%氢氧化铵将pH控制在7.0。在整个过程中将气流速率维持在1 vvm。通过提升搅拌器速度(从300至1200 rpm)将DO维持在大约20%的空气饱和度。按照葡萄糖消耗率，手动测定葡萄糖的补料-分批率。发酵过程在IPTG加入2天后终止。定期对发酵培养物取样以测定细胞密度和生产水平。
化学反应和提取
通过离心收获来自生物反应器的发酵液，然后通过活性炭脱色。在试管中装入5 mL发酵液和浓H3PO4或H2SO4，然后高压灭菌1小时以制备脱水甲羟戊酸，然后通过HPLC测定甲羟戊酸和脱水甲羟戊酸的浓度。不混溶的有机溶剂用于自反应混合物中提取脱水甲羟戊酸。
代谢物分析和细胞干重测定
使用装备有Aminex HPX 87H柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)和折射率检测器(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)的Agilent 1260Infinity HPLC (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)，分析发酵产物。流动相是0.01N H2SO4，流速0.6 mL/min。柱温度和检测温度分别是35℃和50℃。通过将5 mL培养物经由0.45 μm预称重的玻璃纤维滤器过滤，测定细胞干重。在除去培养基后，滤器用15 mL蒸馏的去离子水洗涤，在300 W微波炉中干燥20分钟，然后称重。一式三份地测定细胞干重。
从1L至500L的发酵放大
用于生物反应器培养物的发酵培养基含有以下组成：10 g/L葡萄糖、7.5 g/L K2HPO4、2.0 g/L柠檬酸一水合物、0.5 g/L酵母提取物、2.0 g/L MgSO4.7H2O、0.008 g/L盐酸硫胺素、0.008 g/L D-(+)-生物素、0.008 g/L烟酸、0.032 g/L吡哆醇、0.1 g/L氨苄青霉素、0.8mL浓H2SO4、和1 mL/L微量金属溶液(10 g/L NaCl、40 g/L柠檬酸、1.0 g/L ZnSO4.7H2O、30g/L MnSO4.H2O、0.1 g/L CuSO4.5H2O, 0.1；H3BO3, 0.1 g/L Na2MoO4.2H2O、1.0 g/LFeSO4.7H2O、和1.0 g/L CoCl2.6H2O)。补料溶液含有：600 g/L葡萄糖、7.4 g/L K2HPO4、和10mL消泡剂。500 L培养条件是pH 6.8和温度34℃。
将大肠杆菌BW25113的培养物无菌地转移入250 mL带有挡板的摇瓶，其中含有50mL 2X YT种子培养基(S0培养物)。将培养物在34℃和200 rpm孵育8小时，然后30 mL S0培养物用于接种6L带有挡板的摇瓶，其中含有2升无菌2X YT培养基。将培养物在34℃和200rpm孵育5小时。在5小时孵育后，将瓶中的全部内容物用于接种75L生物反应器(NewBrunswick Scientific, Eppendorf, Inc., Enfield CT)。在4小时后，通过经蒸汽灭菌的转移管线将培养物自75L生物反应器移入550L生物反应器(DCI-Biolafitte, St. Cloud,MN)。在3.5小时，OD600达到6.80，此时培养物用IPTG (终浓度0.4 mM)诱导。此时开始补料。使用以下公式，以指数方式补充葡萄糖达9.25小时的运行。
补料率(L/h) = (CDW * V * µmax e^µmax*t)/(补料浓度*细胞收率)
使用的参数：CDW = 1 g/L；V = 200 L；µmax = 0.27；补料浓度= 600 g/L；细胞收率 =0.45 g/g, 和t=EFT。
使用离线监测器(YSI, Inc., Yellow Springs, OH)监测葡萄糖水平。在9.75小时指数变为0.35，有助于将培养物的葡萄糖浓度控制在5-10g/L。
在6.75、7.75和8.75小时EFT，将搅拌设定在250 rpm，气流在200 slpm和反压在15psi，以控制溶解氧水平。在9.75 EFT，将补料指数增加至0.29，以将葡萄糖维持在所需水平。在10.25 EFT，打开溶解氧控制并在开始时设定在15%，随后在该运行的剩余时间内都设定在20%。补料泵在每个时间点不同，以试图和维持葡萄糖在5-10 g/L之间。在观察到扁平的培养物生长和减缓葡萄糖消耗后，将反应器冷却并准备在36小时EFT收获。
葡萄糖、乙酸、甲羟戊酸和生物量的浓度见图10。
实施例2
细菌和生长条件
BW25113 (rrnBT14 ΔlacZWJ16hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78)用于产生甲羟戊酸(MEV)和β-甲基-δ-戊内酯(βMδVL)。(Datsenko等人, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645)。所有克隆程序都在大肠杆菌菌株XL10-gold (Stratagene, AgilentTechnologies, Inc., Santa Clara, CA)中进行。除非另有说明，否则将这些大肠杆菌菌株在试管中在37℃在补充有合适的抗生素(氨苄青霉素100 μg/mL和卡那霉素50 μg/mL)的2X YT加富培养基(16 g/L细菌用胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl)中培养。
质粒构建
构建了3个质粒，用于βMδVL的生物合成(图9)。第一个质粒，pMEV-1，负责MEV产生。第二个质粒，pAML-1，用于产生脱水甲羟戊酸内酯(AML)；第三个质粒用于将AML转化为βMδVL。用于质粒构建的引物是列于上表4的那些。
为了构建pMEV-1 (图9)，使用引物atoBAcc-F和atoBPst-R自大肠杆菌基因组DNA扩增atoB，并且使用引物mvaSPst-F和mvaSBam-R、mvaEBam-F和mvaEXba-R自粪肠球菌基因组DNA扩增mvaS和mvaE。用引物 VecAcc-R和VecXba-F自质粒pIVC3(Xiong等人, 2012,Scientific reports 2:311)扩增pZE的载体片段。然后将atoB、mvaS、mvaE和pZE的扩增后的片段分别用Acc65I/PstI、PstI/BamHI、BamHI/ XbaI、和Acc65I/ XbaI消化。这些经消化的基因用T4 DNA连接酶连接，形成质粒pMEV-1。
为了构建具有不同的mvaS和mvaE的组合的质粒，分别使用引物对SA.mvaSPst-F/SA.mvaSBam-R、LC.mvaSPst-F/ LC.mvaSBam-R、Mm.mvaSPst-F/ Mm.remPst-R和Mm.remPst-F/Mm.mvaSBam-R、Mv.mvaSPst-F/Mv.remPst-R和Mv.remPst-F/Mv.mvaSBam-R，自其相应的基因组DNA扩增来自金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、海沼甲烷球菌和沃氏甲烷球菌的mvaS基因。然后替换质粒pMEV-1的mvaS，分别形成质粒pMEV-2、pMEV-3、pMEV-4、和pMEV-5。
因为用质粒pMEV-3转化的大肠杆菌菌株产生最高水平的MEV，所以基于pMEV-3，用不同的mvaE构建更多质粒。分别使用引物对Sa.mvaEBam-F/Sa.mvaEXba-R、Lc.mvaEBam-F/Lc.mvaEXba-R、Mm.mvaEBam-F/Mm.mvaEXba-R、和Mv.mvaEBam-F/Mv.mvaEXba-R，自其相应的基因组DNA扩增来自金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、海沼甲烷球菌和沃氏甲烷球菌的mvaE基因。然后替换质粒pMEV-3中的mvaE，分别形成pMEV-6、pMEV-7、pMEV-8、和pMEV-9。
为了构建合成脱水甲羟戊酸内酯(AML)的质粒，对烟曲霉、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢、油菜菌核病菌的sidI和sidH (Grundlinger等人, 2013, Mol Microbiol 88:862-875)进行密码子优化并由GenScript USA, Inc. (Tulsa, OK)合成。然后，将用Acc65I/HindIII和HindIII/NheI消化的sidI和sidH插入质粒pIVC1的相应位点(Xiong等人, 2012,Scientific reports 2:311)，分别形成pAML-1、pAML-2、pAML-3和pAML-4。
为了构建pMVL-1，使用引物SidHind-F和SidHsal-R和使用质粒pAML-1作为模板将sidHPCR扩增。使用引物OYE2sal-F和OYE2-Vec，利用酿酒酵母基因组DNA作为模板将OYE2经PCR扩增。扩增后的sidH用HindIII和SalI消化；OYE2用SalI和NheI消化，然后用于替代质粒pAML-1中的sidH，形成pMVL-1。
为了构建pMVL-2，使用引物OYE3sal-F和OYE3-Vec，利用酿酒酵母基因组DNA作为模板将OYE3经PCR扩增。扩增后的OYE3用于替代pMVL-1的OYE2，产生pMVL-2。
为了构建pMVL-3，使用引物yqjM-F和yqjM-Vec，利用枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板将YqjM经PCR扩增。扩增后的YqjM用于替代pMVL-1的OYE2，产生pMVL-3。
为了在YqjM内引入2个点突变，使用引物yqjM-F/yqjMC26D-R、yqjMC26D-F/yqjMI69T-R和yqjMI69T-F/yqjM-Vec，利用枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板将3个片段经PCR扩增。使用引物yqjM-F和yqjM-vec，利用最后的3个PCR片段作为模板进行另一轮PCR。将PCR产物插入pAML-1，产生pMVL-4。
摇瓶分批发酵
为了进行小规模发酵，将装有0.5 g CaCO3的125 mL锥形瓶高压灭菌并干燥。向瓶中装入补充有5g/L酵母提取物、40 g/L葡萄糖和抗生素的5 mL M9培养基。将200 μL孵育在2XYT培养基中的过夜培养物移入瓶中并放入速率250 rpm的摇床。加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)后，在30℃将发酵进行48小时。在摇瓶中的甲羟戊酸的产生、脱水甲羟戊酸内酯的产生、和β-甲基-δ-戊内酯的产生的发酵结果在表5-7中提供。
表5.甲羟戊酸的产生的分批发酵结果
菌株 乙酸(g/L)* MEV (g/L)*
BW25113，具有pMEV-1 0.45±0.28 10.75±0.28
BW25113，具有pMEV-2 3.11±0.07 5.05±0.28
BW25113，具有pMEV-3 0.20±0.03 12.57±0.15
BW25113，具有pMEV-4 6.48±0.49 0
BW25113，具有pMEV-5 8.80±1.51 0
BW25113，具有pMEV-6 0.13±0.05 13.37±0.54
BW25113，具有pMEV-7 0.17±0.01 14.62±0.24
BW25113，具有pMEV-8 0.13±0.05 10.90±0.39
BW25113，具有pMEV-9 0.18±0.02 11.48±0.28
*n=3, 数据显示为平均值± s.d.
表6. 脱水甲羟戊酸内酯的产生的分批发酵结果
菌株 MEV (g/L)* AML (g/L)*
BW25113，具有pMEV-7和pAML-1 12.36±1.18 0.73±0.06
BW25113，具有pMEV-7和pAML-2 13.59±0.24 0.54±0.02
*n=3, 数据显示为平均值± s.d.
表7. βMδVL的产生的分批发酵结果
菌株 MEV (g/L)* AML (g/L)* βMδVL (g/L)*
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-1 10.19±0.61 0.34±0.03 0.18±0.03
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-2 6.77±0.58 0.48±0.03 0
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-3 8.85±0.56 0.55±0.01 0
BW25113，具有pMEV-7和pMVL-4 9.39±0.48 0.31±0.01 0.27±0.02
*n=3, 数据显示为平均值± s.d.
在生物反应器中的补料-分批发酵
用于生物反应器培养物的发酵培养基含有以下组成：10 g/L葡萄糖、7.5 g/L K2HPO4、2.0 g/L柠檬酸一水合物、0.5 g/L酵母提取物、2.0 g/L MgSO4.7H2O、0.008 g/L盐酸硫胺素、0.008 g/L D-(+)-生物素、0.008 g/L 烟酸、0.032 g/L 吡哆醇、0.1 g/L氨苄青霉素、0.8 mL 浓H2SO4、和1 mL/L微量金属溶液 (10 g/L NaCl、40 g/L柠檬酸、1.0 g/LZnSO4.7H2O、30 g/L MnSO4.H2O、0.1 g/L CuSO4.5H2O, 0.1；H3BO3、0.1 g/L Na2MoO4.2H2O、1.0 g/L FeSO4.7H2O、和1.0 g/L CoCl2.6H2O)。补料溶液含有：600 g/L 葡萄糖、7.4 g/LK2HPO4、和10 mL消泡剂。
大肠杆菌培养物的培养使用起始工作体积0.5 L在1.3 L BIOFLO 115发酵罐(NewBrunswick Scientific, Eppendorf, Inc., Enfield CT)中进行。发酵罐中接种10%过夜预培养物和2X YT培养基。培养条件设定在34℃，溶解氧水平(DO) 30%，pH 7.0。当OD600达到5.2后，加入0.2 mM IPTG，产生甲羟戊酸(MEV)。通过自动加入26%氢氧化铵将pH控制在7.0。在整个过程中将气流速率维持在1 vvm。通过提升搅拌速度(从300至1200 rpm)将溶解氧维持在大约20%的空气饱和度。按照葡萄糖消耗率，手动测定葡萄糖的补料-分批率。发酵过程在IPTG加入2天后终止。定期对发酵培养物取样以测定细胞密度和生产水平。详细的发酵结果列于表8。
表8. 在1.3L生物反应器中的甲羟戊酸的产生的补料-分批发酵结果
时间(h) 生物量(g/L) 葡萄糖(g/L) 乙酸(g/L) MEV (g/L)
0 1.3 4.6 0.85 0
5.5 6.9 12.9 2.25 1.7
16 30.0 0 1.39 24.5
19 34.0 14.3 0.48 34.4
24.5 37.8 24.8 0.35 40.5
31 29.8 34.2 0.33 50.0
40.5 27.0 27.3 1.09 69.6
43 24.5 12.5 1.50 77.1
48 24.0 0 3.48 88.3
脱水和提取
通过离心收获来自生物反应器的发酵液，然后通过活性炭过滤以除去有色污染物。为了测定用于脱水的催化剂的最优水平，反应试管中装入5 mL发酵液和0-12%浓H2SO4，然后高压灭菌1小时(121℃, 15 psi)以产生脱水甲羟戊酸内酯。通过HPLC测定甲羟戊酸(MEV)和脱水甲羟戊酸内酯(AML)的浓度。氯仿用于自反应混合物中提取AML。脱水结果见图5A和表9。
表9. 使用不同浓度的H2SO4的脱水结果
H 2 SO 4 (%) MEV (g/L)* AML (g/L)* 转化(%)* 选择性(%)*
0 88.3 0 - -
2 66.9±4.2 2.5±0.7 24.2±4.7 15.5±1.3
4 54.6±1.8 23.5±1.6 38.2±2.0 91.9±1.3
6 10.6±0.1 51.6±1.8 88.0±0.1 87.7±3.1
8 2.7±0.1 55.7±0.7 97.0±0.1 86.0±0.9
10 1.7±0.0 58.2±0.6 98.1±0.0 88.8±0.9
12 1.6±0.0 58.1±2.7 98.2±0.0 88.5±4.2
*n=3, 数据显示为平均值 ± s.d.
代谢物分析和细胞干重测定
使用装备有Aminex HPX 87H柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)和折射率检测器(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)的Agilent 1260Infinity HPLC (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)，分析发酵产物。流动相是0.01N H2SO4，流速0.6 mL/min。柱温度和检测温度分别是35℃和50℃。通过将5mL培养物经由0.45 μm预称重的玻璃纤维滤器过滤，测定细胞干重。在除去培养基后，滤器用15 mL蒸馏的去离子水洗涤，在300 W微波炉中干燥20分钟，然后称重。一式三份地测定细胞干重。
氢化
在使用前，将未还原的披钯活性炭(10% w/w；Acros Organics, Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA)在原位干燥。四氢呋喃(THF) (Fisher Chemical,Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)原样使用。在典型的氢化程序中，将10g催化剂加入带夹套温度控制和机械搅拌的300 mL高压容器中。在80℃在真空下将钯催化剂保留1小时，然后冷却至环境温度。
分别地，将50 mL脱水甲羟戊酸移入溶液递送容器并用氩气喷射至少15分钟。将溶液递送容器连接到反应器和施加50 psig氩气以将内容物转移至冷却的反应器中。释放氩气，并将溶液递送容器分离，开始搅拌，容器中充满H2至大约350 psig的压力。随着氢化的进行，定期给容器中的压力重新加压，直至压力在容器中保持不变。然后在H2下允许反应物在室温搅拌过夜，以确保定量转化。
减压后，在反应器中充入氩气并用THF稀释反应器内容物，以促进总体转移。通过含有0.45 μm HVHP 膜(Millipore Corp., Billerica, MA)的过滤瓶过滤，从溶液中除去催化剂。通过旋转蒸发除去THF，得到粗制β-甲基-δ-戊内酯，典型收率为大约93% (转化>99%，经1HNMR测定)。
β-甲基-δ-戊内酯纯化
在真空下在300℃将碱性氧化铝(60-325目, Thermo Fisher Scientific, Inc.,Waltham, MA)干燥3小时，然后在氩气下冷却。将环己烷通过溶剂纯化系统，其包括在氮气正压力下操作的活性氧化铝柱和分子筛柱。粗制β-甲基-δ-戊内酯经氢化钙(CaH2)粉(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)干燥12小时，然后在真空下蒸馏(50 mTorr, 30℃)。使用环己烷为洗脱剂，将蒸馏后的产物通过干燥碱性氧化铝。在真空下除去环己烷，得到纯化的β-甲基-δ-戊内酯。
本文引用的全部专利、专利申请和出版物及电子可获取材料(包括例如在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及从GenBank和RefSeq中注释的编码区得到的翻译物)的全部公开内容都通过引用以其整体结合到本文中。在本申请的公开内容与通过引用结合到本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性时，应以本申请的公开内容为准。前面的详述和实施例仅仅为了清楚理解而提供。不必要的限制不应从其中理解。本发明不限于已显示和描述的确切细节，因为对本领域技术人员而言明显的改变将包括在由权利要求书所限定的发明内。
除非另有说明，否则用于本说明书和权利要求书的表示组分的量、分子量等的所有数值，要理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另外有相反的说明，否则本说明书和权利要求书所示数值参数是近似值，其可根据本发明寻求获得的所需性质而改变。丝毫无企图限制与权利要求书范围的等同物的原则，每个数值参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通舍入技术来解释。
尽管陈述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能准确地报告具体实施例给出的数值。然而，所有数值固有地包含必然产生于在其各自测量中存在的标准差的范围。
所有标题出于读者便利，不应用来限制该标题下的文本的含义，除非另有说明。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1
GGGCCCGGTACCATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTGC
SEQ ID NO:2
GGGCCCCTGCAGTTAATTCAACCGTTCAATCACCATCG
SEQ ID NO:3
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG
SEQ ID NO:4
GGGCCCGGATCCTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGTAT
SEQ ID NO:5
GGGCCCGGATCCAGGAGAAATTAACTATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC
SEQ ID NO:6
GGGCCCTCTAGATTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAA
SEQ ID NO:7
GGGCCCGGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTCGGTCAGT
SEQ ID NO:8
GGGCCCTCTAGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTC
SEQ ID NO:9
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGACAATAGGTATCGACAAAATAAA
SEQ ID NO:10
GGGCCCGGATCCTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAA
SEQ ID NO:11
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGAAAATCGGGATTGATGCAATCGC
SEQ ID NO:12
GGGCCCGGATCCTTACCGCTGCTGATATTGACGTTCTT
SEQ ID NO:13
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGCCGGTCGGTATTGAGGCCATGAA
SEQ ID NO:14
GGGCCCGGATCCTTATGACCAGACGTACTCGCGGTGGA
SEQ ID NO:15
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGAAAGAAGTAGGTATTGTAGGATA
SEQ ID NO:16
TTAGCACCGATGATGTATGCAGCACCACCAGCAGCAGCAGTGTATTCAAGAGCATCTCC
SEQ ID NO:17
GGAGATGCTCTTGAATACACTGCTGCTGCTGGTGGTGCTGCATACATCATCGGTGCTAA
SEQ ID NO:18
GGGCCCGGATCCTTACATTCTAATTTTTCCTCTGTATTTC
SEQ ID NO:19
GGGCCCCTGCAGAGGAGAAATTAACTATGAACGAAGTGGGTATCGTAGGATA
SEQ ID NO:20
CCTACAAGTCCCATACACATTTGTATACCAGCAGTACCTGCTTTACAAGCAAATTCTAA
SEQ ID NO:21
TTAGAATTTGCTTGTAAAGCAGGTACTGCTGGTATACAAATGTGTATGGGACTTGTAGG
SEQ ID NO:22
GGGCCCGGATCCTTACATTCTAATTTTTTCTCTGTATT
SEQ ID NO:23
GGGCCCGGATCCAGGAGAAATTAACTATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCG
SEQ ID NO:24
GGGCCCTCTAGATTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAA
SEQ ID NO:25
GGGCCCGGATCCAGGAGAAATTAACTATGAAATTTTACGAGTTGTCTCCAGA
SEQ ID NO:26
GGGCCCTCTAGATTAATCCCGATTTTCATCTTTTGATT
SEQ ID NO:27
GGGCCCGGATCCAGGAGAAATTAACTATGGAAAATAACGTTAATATTGAAGA
SEQ ID NO:28
GGGCCCTCTAGATTATCTTCCAAGTTCAGAATGCGCTT
SEQ ID NO:29
GGGCCCGGATCCAGGAGAAATTAACTATGAACAATATAAAAAATAATAATGA
SEQ ID NO:30
GGGCCCTCTAGATTACCTTCCTAATTCCGAATGTGCTT
SEQ ID NO:31
GGGCCCGGTACCATGGAACACTCGGGTTTCCAGCCGGA
SEQ ID NO:32
GGGCCCAAGCTTTTACCCCTTGTTCATGCGCTCACGCA
SEQ ID NO:33
GGGCCCGGTACCATGGCTGAACTCATCCATTCCACAAT
SEQ ID NO:34
GGGCCCAAGCTTTTATTGACTTGATGATAAGTTGAACATT
SEQ ID NO:35
GGGCCCGGTACCATGACGATGCAGGCCGAGTCCTCTCC
SEQ ID NO:36
GGGCCCAAGCTTTTAGGCCGTCCTGGATTCGCTGAGTT
SEQ ID NO:37
GGGCCCGGTACCATGGATATCATTGGCGGACAACATCT
SEQ ID NO:38
GGGCCCAAGCTTTTATTTCAGATTCTTTCTAATTATTT
SEQ ID NO:39
GGGCCCGGTACCATGCTTTTTACAAACGATACCCTTGG
SEQ ID NO:40
TGGCTGTACTCTGCAATAAACATGGTTGGCACCCCATAAAGGGCAGTACACTTTTCTTT
SEQ ID NO:41
AAAGAAAAGTGTACTGCCCTTTATGGGGTGCCAACCATGTTTATTGCAGAGTACAGCCA
SEQ ID NO:42
GGGCCCAAGCTTTTATAATTCTTCCGTTTCTTTTTTCA
SEQ ID NO:43
GGGCCCGCTAGCAGGAGAAATTAACTATGATTATCAAACCGATGATTCGCAG
SEQ ID NO:44
GGGCCCGGATCCTTAAACAACGTCCATGCGCTCGACAT
SEQ ID NO:45
GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGAGCACCGAGGCTCATCCTACTGT
SEQ ID NO:46
GGGCCCGTCGACTTACAACTTGCTCGGGCGCCATTGCG
SEQ ID NO:47
GGGCCCGTCGACAGGAGAAATTAACTATGCCATTTGTTAAGGACTTTAAGCC
SEQ ID NO:48
GAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGAGCTAGCTTAATTTTTGTCCCAACCGAGTTT
SEQ ID NO:49
GGGCCCGTCGACAGGAGAAATTAACTATGCCATTTGTAAAAGGTTTTGAGCC
SEQ ID NO:50
GAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGAGCTAGCTTAGTTCTTGTTCCAACCTAAATC
SEQ ID NO:51
GGGCCCGTCGACAGGAGAAATTAACTATGGCCAGAAAATTATTTACACCTAT
SEQ ID NO:52
GAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGAGCTAGCTTACCAGCCTCTTTCGTATTGAAC
SEQ ID NO:53
TTCCGTCCTTTTCATGAGAAGAATACATGTCCATTGGCGACATGACAATGCGGTTTTTT
SEQ ID NO:54
AAAAAACCGCATTGTCATGTCGCCAATGGACATGTATTCTTCTCATGAAAAGGACGGAA
SEQ ID NO:55
CGCTCCAAATGCCTAAGTCTTGGTCAGTCGTTCGTCCTTGAGGGTTAACCGCTGACGCC
SEQ ID NO:56
GGCGTCAGCGGTTAACCCTCAAGGACGAACGACTGACCAAGACTTAGGCATTTGGAGCG
SEQ ID NO:57
GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGCCAAGAATCTTCCGTTCTGCCGA
SEQ ID NO:58
GGGCCCGCTAGCTTAGAAGTAATAGCGGCTGATGGTCT
SEQ ID NO:59
GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGCGTACCATCGCATCGCTGGAAGA
SEQ ID NO:60
GGGCCCGCTAGCTTACCCGTAGCGGCGCGTGATCGACT
SEQ ID NO:61
GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGAGCCAGGTCCAGAACATTCCCTA
SEQ ID NO:62
GGGCCCGCTAGCTTAGCCGATGCTGATCGGCGGCAGTT。

Claims (78)

1.经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸化合物。
2.经生物合成的β-甲基-δ-戊内酯化合物。
3.组合物，其包含含有大于零的14C/12C比例的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸。
4.权利要求3的组合物，其中14C/12C比例大于0.25×10−12。
5.权利要求3或4的组合物，其中14C/12C比例为0.25×10−12至1.2×10−12。
6.组合物，其包含含有大于零的14C/12C比例的β-甲基-δ-戊内酯。
7.权利要求6的组合物，其中14C/12C比例大于0.25×10−12。
8.权利要求6或7的组合物，其中14C/12C比例为0.25×10−12至1.2×10−12。
9.重组细胞，其经修饰而表现出相比野生型对照增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成。
10.权利要求9的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的在培养中积累β-甲基-δ-戊内酯的能力。
11.权利要求9或10的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的以下一种或多种酶的活性：硫解酶、3-羟基-3-甲基-戊二酰(HMG)-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、酰基-辅酶A连接酶或烯酰-辅酶A水合酶。
12.权利要求11的重组细胞，其中所述硫解酶包含AtoB。
13.权利要求12的重组细胞，其中所述AtoB是由分离自大肠杆菌的多核苷酸所编码。
14.权利要求11的重组细胞，其中所述HMG-辅酶A合酶包含MvaS。
15.权利要求14的重组细胞，其中所述MvaS是由多肽所编码，所述多肽分离自肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。
16.权利要求11的重组细胞，其中所述HMG-辅酶A还原酶包含MvaE。
17.权利要求16的重组细胞，其中所述MvaE是由多肽所编码，所述多肽分离自肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员、或甲烷球菌属成员。
18.权利要求11的重组细胞，其中所述酰基-辅酶A连接酶包含SidI。
19.权利要求18的重组细胞，其中所述SidI是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物。
20.权利要求18的重组细胞，其中所述SidI是由分离自曲霉属成员的多核苷酸所编码。
21.权利要求20的重组细胞，其中所述曲霉属成员包括烟曲霉。
22.权利要求11的重组细胞，其中所述烯酰-辅酶A水合酶包含SidH。
23.权利要求22的重组细胞，其中所述SidH是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自产生包含脱水甲羟戊酰单元的铁载体的微生物。
24.权利要求22的重组细胞，其中所述SidH是由分离自曲霉属成员的多核苷酸所编码。
25.权利要求24的重组细胞，其中所述曲霉属成员包括烟曲霉。
26.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照增加的3-甲基-5-羟基戊酰-辅酶A的生物合成。
27.权利要求26的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的烯酰-辅酶A还原酶活性。
28.权利要求27的重组细胞，其中所述烯酰-辅酶A还原酶包含Ter。
29.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照增加的积累脱水甲羟戊酸内酯的能力。
30.权利要求9-25中任一项的重组细胞，其被进一步修饰而表现出相比野生型对照的脱水甲羟戊酸内酯向β-甲基-δ-戊内酯的转化。
31.权利要求30的重组细胞，其中所述细胞表现出相比野生型对照增加的烯醇还原酶活性。
32.权利要求31的重组细胞，其中所述烯醇还原酶包含OYE2、OYE3、YqjM、或YqjM的变体。
33.权利要求32的重组细胞，其中所述OYE2或OYE3是由分离自酵母科成员的多核苷酸所编码。
34.权利要求33的重组细胞，其中所述酵母科成员是酿酒酵母。
35.权利要求32的重组细胞，其中所述YqjM是由分离自芽孢杆菌属成员的多核苷酸所编码。
36.权利要求32的重组细胞，其中所述芽孢杆菌属成员包括枯草芽孢杆菌。
37.权利要求9-36中任一项的重组细胞，其中所述细胞包含或源自埃希氏菌属成员、沙雷氏菌属成员、芽孢杆菌属成员、短杆菌属成员、棒杆菌属成员、梭菌属成员、假单胞菌属成员、假丝酵母属成员、乳球菌属成员、酵母科成员或蓝细菌属成员。
38.权利要求9-37中任一项的重组细胞，其中相比野生型对照，所述重组细胞被修饰以降低天然甲羟戊酸消耗。
39.权利要求9-38中任一项的重组细胞，其中相比野生型对照，所述重组细胞被修饰以增加乙酰基-辅酶A流量。
40.权利要求39的重组细胞，其中增加乙酰基-辅酶A流量包括相比野生型对照而言降低TCA循环活性，相比野生型对照而言增加丙酮酸脱氢酶活性，或相比野生型对照而言缺失乙酰基-辅酶A消耗酶。
41.权利要求9-40中任一项的重组细胞，其被修饰而表现出相比野生型对照当培养在包含碳源的培养基中时增加的脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸的生物合成，所述碳源包含以下的至少一种：葡萄糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、葡糖二酸、乳糖二酸、半乳糖醛酸、藻酸盐、淀粉、蔗糖或纤维素。
42.方法，其包括：
在对权利要求27-41中任一项的重组细胞表现出相比野生型对照增加的β-甲基-δ-戊内酯的生物合成而言有效的条件下，培养所述重组细胞。
43.方法，其包括：
在对权利要求9-41中任一项的重组细胞表现出相比野生型对照增加的脱水甲羟戊酰-辅酶A的生物合成而言有效的条件下，培养所述重组细胞。
44.权利要求43的方法，其进一步包括允许至少一部分脱水甲羟戊酰-辅酶A自发地形成脱水甲羟戊酸内酯。
45.权利要求44的方法，其进一步包括收集至少一部分脱水甲羟戊酸内酯。
46.权利要求45的方法，其进一步包括氢化脱水甲羟戊酸内酯，形成β-甲基-δ-戊内酯。
47.自经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯或经生物合成的脱水甲羟戊酸制备β-甲基-δ-戊内酯的方法，其包括氢化经生物合成的脱水甲羟戊酸内酯或经生物合成的脱水甲羟戊酸，形成β-甲基-δ-戊内酯。
48.权利要求46或47的方法，其中在异质催化剂或同质催化剂存在时氢化脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸。
49.权利要求48的方法，其中所述异质催化剂包含：
披钯活性炭；
二氧化硅载镍；或
氧化铝载镍。
50.权利要求48的方法，其中所述同质催化剂包含NaBH4或LiAlH4。
51.权利要求46-50中任一项的方法，其中脱水甲羟戊酸内酯在至多300℃的温度被氢化。
52.权利要求46-51中任一项的方法，其中脱水甲羟戊酸内酯在至多100巴的氢气压力下被氢化。
53.权利要求46-52中任一项的方法，其中脱水甲羟戊酸内酯在不小于0.1巴的氢气压力下被氢化。
54.权利要求43-50中任一项的方法，其进一步包括蒸馏β-甲基-δ-戊内酯。
55.权利要求54的方法，其中所述蒸馏包括在至多10个大气压的压力下使用分级蒸馏柱。
56.权利要求43-55中任一项的方法，其表现出至少70%的β-甲基-δ-戊内酯回收率。
57.权利要求41-56中任一项的方法，其进一步包括使用与水不混溶的提取剂，提取脱水甲羟戊酸内酯。
58.权利要求57的方法，其中所述与水不混溶的提取剂包括酰胺、醚、酮、烷烃、醇、酯、苯、二甲苯、氯仿、或其两种或更多种的任何组合。
59.权利要求57或58的方法，其表现出至少70%的脱水甲羟戊酸内酯回收率。
60. 方法，其包括：
在对经修饰而表现出相比野生型对照增加的甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯的生物合成的重组细胞产生经生物合成的甲羟戊酸或经生物合成的甲羟戊酸内酯而言有效的条件下，培养所述重组细胞；和
将经生物合成的甲羟戊酸或经生物合成的甲羟戊酸内酯转化为脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸。
61.权利要求60的方法，其中自发酵液收获甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯。
62.权利要求60或61的方法，其中将甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯转化为脱水甲羟戊酸内酯或脱水甲羟戊酸包括使用脱水催化剂使甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯脱水。
63. 权利要求62的方法，其中所述脱水催化剂包括对甲苯磺酸、硫酸和磷酸，或固体酸催化剂，例如沸石、Amberlyst 70和Amberlyst 15。
64.权利要求62或63的方法，其中脱水催化剂以相对于甲羟戊酸或甲羟戊酸内酯的大于0.1当量和小于20.0当量的催化量存在。
65.权利要求62-64中任一项的方法，其中脱水是在不低于室温的温度下进行。
66.权利要求65的方法，其中脱水是在不低于100℃的温度下进行。
67.权利要求60-66中任一项的方法，其进一步包括使用与水不混溶的提取剂，提取脱水甲羟戊酸内酯。
68.权利要求67的方法，其中所述与水不混溶的提取剂包括酰胺、醚、酮、烷烃、醇、酯、苯、二甲苯、氯仿、或其两种或更多种的任何组合。
69.权利要求67或68的方法，其表现出至少70%的脱水甲羟戊酸内酯回收率。
70.权利要求60-69中任一项的方法，其中所述重组细胞表现出相比野生型对照增加的以下一种或多种酶的活性：硫解酶、3-羟基-3-甲基-戊二酰(HMG)-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶。
71.权利要求70的方法，其中所述硫解酶包含AtoB。
72.权利要求71的方法，其中所述AtoB是由分离自大肠杆菌的多核苷酸所编码。
73.权利要求70的方法，其中所述HMG-辅酶A合酶包含MvaS。
74.权利要求73的方法，其中所述MvaS是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员或甲烷球菌属成员。
75.权利要求70的方法，其中所述HMG-辅酶A还原酶包含MvaE。
76.权利要求75的方法，其中所述MvaE是由多核苷酸所编码，所述多核苷酸分离自肠球菌属成员、葡萄球菌属成员、乳杆菌属成员或甲烷球菌属成员。
77.权利要求42-76中任一项的方法，其中所述培养条件包括包含碳源的培养基，所述碳源包含以下的至少一种：葡萄糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、葡糖二酸、乳糖二酸、半乳糖醛酸、藻酸盐、淀粉、蔗糖或纤维素。
78.权利要求42-77中任一项的方法，其中相比野生型对照，所述重组细胞被修饰而降低天然甲羟戊酸消耗。
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