CN106085869B - 一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法 - Google Patents

一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，该方法经过孢子的制备,孢子悬浮液的制备,以及在菌株液体培养时,在发酵培养基中加入β‑谷甾醇和甜菜碱，从而增加极细链格孢菌激活蛋白的产量；采取本发明，一是优化的培养基和培养条件使激活蛋白产量提高四倍多；二是培养基成分均源自植物，来源方便安全，价格便宜，便于规模化生产；三是研究了摇瓶发酵的动态参数，获得了适宜菌株生长的发酵培养基；研究了接种量、发酵培养基初始pH值、摇瓶装液量和温度等对发酵的影响，确定了极细链格孢菌产激活蛋白培养基组成，以及最适摇瓶发酵培养条件。

Description

一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法
技术领域
本发明涉及一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，尤其涉及在极细链格孢菌培养基中加入β-谷甾醇与甜菜碱，提高其激活蛋白产量的方法。
背景技术
极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)作为自然生态系统和农业生态系统中的重要成员，既可引起植物病害，又可作为有用的生物资源为人类所利用。其在生物防治、生物除草剂、环境废弃物处理、品种选育等方面显现出可利用的广阔前景。研究表明，细极链格孢菌对环境污染物具有较强的降解作用，能产生酸性蛋白酶和β-l,3葡聚糖酶，分解硫化橡胶并能在合成纤维上存活；此外，还能产生具有抗病增产功能的多种蛋白激发子【邱德文，微生物蛋白农药研究进展，中国生物防治，2004，20(2)：91-94】。
激活蛋白有较强的诱导植物抗病，促进植物生长以及抗旱、抗逆的生物活性。不同来源的激活蛋白在理化性质上略有差异，但生物活性相近或相似。该类激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力；激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长，从而达到提高作物产量的目的。随着可持续农业的不断发展以及化学农药抗性和污染问题的日益严重，生物农药越来越受到重视，并成为综合防治的主要部分。植物激活蛋白农药是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型蛋白质农药，产品安全无毒，对植物有显著抗病增产作用，同时能提高作物品质【邱德文，杨秀芬，蛋白质农药研究与产业化进展，中国农业科技导报，2006，8(6)：1-4】，生产上可以减少或不使用化学农药，生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，特别是在有机蔬菜和果品生产中将发挥重要作用，符合当前我国农业产业结构调整，有利于提高农产品附加值，具有非常广阔的市场前景和良好的市场竞争力。
极细链格孢菌是一种好氧微生物，一般在马铃薯蔗糖培养基上采用菌丝块接种培养，这种方法获得的激活蛋白产量低。培养出的种子往往形成较大的团块，不利于进一步发酵培养。而采用孢子悬浮液的方法可以弥补上述不足。如金鑫等人在马铃薯液体培养基上培养极细链格孢菌，60h后获得激活蛋白1.39 g/L（金鑫，产激活蛋白极细链格孢菌发酵工艺优化和中试生产技术，硕士学位论文，中国农业科学院研究生院，2007），经过优化培养基和培养条件后，激活蛋白产量为5.17 g/L 【金鑫，提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化. 微生物学杂志，2009，29(2): 6-11】。
极细链格孢菌在对数生长期生长速度较快，产生较多的菌丝，之后到达静止期、衰亡期。由于激活蛋白是一类初级代谢产物，本发明为了增大激活蛋白的产量，设想延长极细链格孢菌的生长期。细胞衰老必然会涉及膜结构的变化，其中β-谷甾醇在细胞膜结构中起着支架的作用，能阻止细胞双层膜由流动相向凝胶相的转变，保持细胞膜完整性，从而延缓细胞的衰老【吴时敏，吴谋成，植物甾醇的研究进展与趋向，中国油脂，2002，27(2)：73-75】。甜菜碱有维持细胞渗透压的作用。当受盐碱或水分胁迫时，细胞质中积累大量有机渗透调节剂如甜菜碱，而将细胞质中的无机渗透调节剂挤向液泡，使细胞质与细胞内液泡环境维持渗透平衡，这样避免了细胞质高浓度无机离子对酶和代谢的毒害（王欢，BADH基因转化羊草的研究，硕士学位论文，吉林农业大学, 2008）。甜菜碱的溶解度很高，不带净电荷，其高浓度对许多酶及其他生物大分子没有影响，甚至有保护作用。
发明内容
本发明针对上述技术现状，往培养基中加入了β-谷甾醇和甜菜碱，与现有技术相比，使激活蛋白的产量增加了四倍以上，同时公开了适合极细链格孢菌发酵产激活蛋白的培养基和产孢条件，提供了一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法。
本发明采取的技术方案是：一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于具体步骤如下：（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢；（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，取出培养皿中的PSA培养基平板，在PSA培养基平板上打取菌丝块，将一定量的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，之后将菌悬液过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌环境中备用；（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有75～200mL发酵培养基的500 mL器皿中，每瓶接种3～20 mL，将接种后的器皿放入旋转式恒温摇床中，转速为120～200 r/min，培养温度为20～35℃，培养50～70h后即得；（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL器皿中培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液，振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白粗提液中激活蛋白的含量。
所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于按质量组份，发酵培养基为：1～5 g/L β-谷甾醇，1～5 g/L甜菜碱，12～18 g/L蔗糖，2～8 g/L玉米淀粉，15～25 g/L土豆淀粉，7～13 g/L谷氨酸，2～8 g/L胰蛋白胨，7～13 g/L黄豆粉，2～8 g/L硝酸钾。
所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于按质量组份，发酵培养基优选为：4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾。
所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于发酵培养基起始pH5.5～8.5，用HCl或NaOH调成不同的pH值。
所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于激活蛋白提取缓冲液为0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0。
所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于极细链格孢菌激活蛋白的生物活性的测试方法为：将提取的极细链格孢菌激活蛋白用蒸馏水稀释成1～20 μg/mL的蛋白液，将小麦种子用蛋白液浸泡7～9h，每处理20粒种子，置于铺有至少两层湿纱布的培养皿中，以蒸馏水浸泡为空白实验，每个处理均重复2～4次，期间喷水使纱布保湿，至少2天后观察记录小麦的发芽率，若各处理发芽率明显高于空白对照，则认为该蛋白处理有激活蛋白活性。
采取本发明，具有如下有益效果：一是优化的培养基和培养条件使激活蛋白产量提高四倍多，从原来（马铃薯蔗糖培养基）的1.35 g/L提高到10.85 g/L以上；二是培养基成分均源自植物，来源方便安全，价格便宜，便于规模化生产；三是研究了摇瓶发酵的动态参数，获得了适宜菌株生长的发酵培养基；研究了接种量、发酵培养基初始pH值、摇瓶装液量和温度等对发酵的影响，确定了极细链格孢菌产激活蛋白培养基组成，以及最适摇瓶发酵培养条件。
附图说明
图1是本发明在极细链格孢菌激活蛋白的生物活性测定中，八个实验组激活蛋白产量（g/L）和种子发芽率（%）的对比图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
一、实施例一。具体包括如下步骤：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，之后将菌悬液用两层纱布过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，在四个500 mL三角烧瓶中中分别加入75mL，100mL，150mL，200mL发酵培养基，每瓶接种孢子悬浮液8mL，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，设置转速为120～200 r/min（优选180 r/min），培养温度为20～35℃（优选28℃），培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
其中的发酵培养基为：1～5g/L （优选3 g/L）β-谷甾醇（优选3 g/L），1～5 g/L（优选3 g/L）甜菜碱，12～18 g/L（优选15 g/L）蔗糖，2～8 g/L（优选5 g/L）玉米淀粉，15～25g/L（优选20 g/L）土豆淀粉，7～13 g/（优选10 g/L）L谷氨酸，2～8 g/L（优选5 g/L）胰蛋白胨，7～13 g/L（优选10 g/L）黄豆粉，2～8 g/L（优选5 g/L）硝酸钾；且发酵培养基用HCl或NaOH调成起始 pH7.0。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）实验结果表明75mL，100mL，150mL，200mL装液量，激活蛋白产量分别为9.9g/L，9.74g/L，9.72g/L，8.62g/L；所以培养基装液量在75 mL比较适宜。
二、实施例二。具体包括如下步骤：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，后将菌悬液用两层纱布过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有100mL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中，接入不同体积（3%、5%、10%、15%、20%）的孢子悬浮液，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，设置转速为120～200 r/min（优选180r/min），培养温度为20～35℃（优选28℃），培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
其中的发酵培养基为：1～5g/L （优选3 g/L）β-谷甾醇（优选3 g/L），1～5 g/L（优选3 g/L）甜菜碱，12～18 g/L（优选15 g/L）蔗糖，2～8 g/L（优选5 g/L）玉米淀粉，15～25g/L（优选20 g/L）土豆淀粉，7～13 g/（优选10 g/L）L谷氨酸，2～8 g/L（优选5 g/L）胰蛋白胨，7～13 g/L（优选10 g/L）黄豆粉，2～8 g/L（优选5 g/L）硝酸钾；且发酵培养基用HCl或NaOH调成起始 pH7.0。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）实验结果表明3%、5%、10%、15%、20%的接种量，激活蛋白产量分别为6.84 g/L，7.9 g/L，9.66 g/L，9.64 g/L，9.32 g/L；所以10%的接种量的发酵结果激活蛋白产量最大。
三、实施例三。具体包括如下步骤：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，后将菌悬液用两层纱布过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有100mL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中，接入10mL的孢子悬浮液，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，分别设置转速为120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，培养温度为20～35℃（优选28℃），培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
其中的发酵培养基为：1～5g/L （优选3 g/L）β-谷甾醇（优选3 g/L），1～5 g/L（优选3 g/L）甜菜碱，12～18 g/L（优选15 g/L）蔗糖，2～8 g/L（优选5 g/L）玉米淀粉，15～25g/L（优选20 g/L）土豆淀粉，7～13 g/（优选10 g/L）L谷氨酸，2～8 g/L（优选5 g/L）胰蛋白胨，7～13 g/L（优选10 g/L）黄豆粉，2～8 g/L（优选5 g/L）硝酸钾；且发酵培养基用HCl或NaOH调成起始 pH7.0。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）实验结果表明转速120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，激活蛋白产量分别为6.42 g/L，8.1 g/L，9.66 g/L，9.62 g/L；所以转速为180 r/min比较适宜。
四、实施例四。具体包括如下步骤：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，后将菌悬液用两层纱布过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有100mL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中，接入10mL的孢子悬浮液，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，设置转速为120～200 r/min（优选180 r/min）180 r/min，分别在20℃，25℃，28℃，31℃，35℃的温度下培养，培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
其中的发酵培养基为：1～5g/L （优选3 g/L）β-谷甾醇（优选3 g/L），1～5 g/L（优选3 g/L）甜菜碱，12～18 g/L（优选15 g/L）蔗糖，2～8 g/L（优选5 g/L）玉米淀粉，15～25g/L（优选20 g/L）土豆淀粉，7～13 g/（优选10 g/L）L谷氨酸，2～8 g/L（优选5 g/L）胰蛋白胨，7～13 g/L（优选10 g/L）黄豆粉，2～8 g/L（优选5 g/L）硝酸钾；且发酵培养基用HCl或NaOH调成起始 pH7.0。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）实验结果表明培养温度20℃，25℃，28℃，31℃，35℃，激活蛋白产量分别为8.28 g/L，9.04 g/L，9.66 g/L，9.24 g/L，8.1 g/L；所以培养温度28℃较为适宜。
五、实施例五。具体包括如下步骤：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，后将菌悬液用两层纱布过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有100mL发酵培养基的七个500 mL三角烧瓶中，接入10mL的孢子悬浮液，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，设置转速为120～200 r/min（优选180 r/min）180 r/min，培养温度为20～35℃（优选28℃），培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
其中的发酵培养基为：1～5g/L （优选3 g/L）β-谷甾醇（优选3 g/L），1～5 g/L（优选3 g/L）甜菜碱，12～18 g/L（优选15 g/L）蔗糖，2～8 g/L（优选5 g/L）玉米淀粉，15～25g/L（优选20 g/L）土豆淀粉，7～13 g/（优选10 g/L）L谷氨酸，2～8 g/L（优选5 g/L）胰蛋白胨，7～13 g/L（优选10 g/L）黄豆粉，2～8 g/L（优选5 g/L）硝酸钾；且发酵培养基用HCl或NaOH调成起始分别设置发酵培养基起始pH值为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）实验结果表明pH值5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，激活蛋白产量分别为5.76 g/L，7.68 g/L，9.58 g/L，9.66 g/L，9.7 g/L，8.42 g/L，8.06 g/L；所以培养基起始pH6.5-7.5较为适宜。
六、制得的极细链格孢菌激活蛋白的生物活性测定：
1、本实验分为8组（所述发酵培养基起始pH7.0）：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
发酵培养基为1 g/L β-谷甾醇，5 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure 659751DEST_PATH_IMAGE002
发酵培养基为2 g/L β-谷甾醇，4 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
发酵培养基为3 g/L β-谷甾醇，3 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure 332083DEST_PATH_IMAGE004
发酵培养基为4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
发酵培养基为5 g/L β-谷甾醇，1 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure 395854DEST_PATH_IMAGE006
发酵培养基为15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
发酵培养基为200 g/L马铃薯，20 g/L蔗糖；
Figure 391491DEST_PATH_IMAGE008
空白组为蒸馏水。
2、上述中的～组按照以下步骤分别进行实验提取激活蛋白，测定生物活性，具体如下：
（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，之后放入培养皿中将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢。
（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝块，将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，用已灭菌的玻璃涂布棒轻轻扫过菌落表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，后将菌悬液用两层纱布过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有100mL发酵培养基的500 mL三角烧瓶中，每瓶接种10mL，将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中，设置转速为120～200 r/min（优选180 r/min）180 r/min，培养温度为20～35℃（优选28℃），培养50～70h（优选60 h）后提取激活蛋白。
（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼在研钵中研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液（0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0），振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白提取液中激活蛋白的含量。
（5）将
Figure 870380DEST_PATH_IMAGE001
～
Figure 872971DEST_PATH_IMAGE007
组提取的激活蛋白分别用蒸馏水稀释成1～20 μg/mL（优选3μg/mL）的蛋白液，将小麦种子分别用蛋白液浸泡7～9 h（优选8 h），其它条件保持相同，每处理20粒种子，置于铺有两层湿纱布的培养皿中于5℃培养，以蒸馏水浸泡为空白实验，每个处理均重复2～4次；期间喷水使纱布保湿，至
少2天，一般3天后观察记录各组小麦的发芽率，结果如附图1所示。
（6）从附图1结果分析，各处理批次发芽率相差无几，但明显高于空白组，表明培养基中加入β-谷甾醇与甜菜碱与否，不影响激活蛋白的活性。
（７）从附图1结果分析，发酵培养基的优选配方为：4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾。

Claims (5)

1.一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于具体步骤如下：（1）孢子的制备：在无菌操作台中，火焰保护下用接种针将-90～-70℃冻存管中保存的极细链格孢菌菌丝，涂布在PSA培养基平板上，放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死，在20～35℃的恒温条件下，在培养箱中倒置培养，直到其变黑产孢；（2）孢子悬浮液的制备：在无菌操作台中，取出培养皿中的PSA培养基平板，在PSA培养基平板上打取菌丝块，将一定量的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面，将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中，之后将菌悬液过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌环境中备用；（3）极细链格孢菌液的培养：在无菌操作台中，将制备好的孢子悬浮液接入装有75～200mL发酵培养基的500 mL器皿中，每瓶接种3～20 mL，将接种后的器皿放入旋转式恒温摇床中，转速为120～200 r/min，培养温度为20～35℃，培养50～70h后即得；其中，按质量组份，发酵培养基为：1～5 g/L β-谷甾醇，1～5 g/L甜菜碱，12～18 g/L蔗糖，2～8 g/L玉米淀粉，15～25 g/L土豆淀粉，7～13 g/L谷氨酸，2～8 g/L胰蛋白胨，7～13 g/L黄豆粉，2～8 g/L硝酸钾；（4）激活蛋白的提取和含量测定：将500mL器皿中培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上，将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55～65℃干燥至恒重，将干燥后的菌饼研磨成粉末，加入激活蛋白提取缓冲液，振荡均匀，在2～6℃冰箱中放置10～30 min，在沸水浴中加热10～30 min，之后12000～14000 r/min离心10～20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用双缩脲方法测定激活蛋白粗提液中激活蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于按质量组份，发酵培养基优选为：4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜碱，15 g/L蔗糖， 5 g/L玉米淀粉，20g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黄豆粉，5 g/L硝酸钾。
3.根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于发酵培养基起始pH5.5～8.5，用HCl或NaOH调成不同的pH值。
4.根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于激活蛋白提取缓冲液为0.02 mol/L Tris缓冲液，用HCl调pH到8.0。
5.根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法，其特征在于极细链格孢菌激活蛋白的生物活性的测试方法为：将提取的极细链格孢菌激活蛋白用蒸馏水稀释成1～20 μg/mL的蛋白液，将小麦种子用蛋白液浸泡7～9h，每处理20粒种子，置于铺有至少两层湿纱布的培养皿中，以蒸馏水浸泡为空白实验，每个处理均重复2～4次，期间喷水使纱布保湿，至少2天后观察记录小麦的发芽率，若各处理发芽率明显高于空白对照，则认为该蛋白处理有激活蛋白活性。
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